CN105838745A - 一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法 - Google Patents

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刘杰超
张春岭
王雪晖
陈大磊
杨文博
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Abstract

本发明公开了一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，适用于以根皮苷为原料制备水溶性黄色素。该方法在根皮苷酶促氧化反应体系中同时加入β‑葡萄糖苷酶和多酚氧化酶，使部分根皮苷先行被β‑葡萄糖苷酶分解为根皮素，提高其反应活性，然后再在多酚氧化酶作用下进行酶促氧化，反应的速率和效率得到大幅提高。经进一步萃取、纯化后得到水溶性的黄色素，在pH2～5条件下呈亮丽的黄色，并且具有抗氧化等生物活性。利用本发明制备苹果黄色素，既有效提高了根皮苷的酶促转化速率，又避免了直接采用根皮素作为氧化底物原料成本过高的问题，具有较好的应用前景。

Description

一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法
技术领域
本发明涉及食用色素的酶法合成技术领域，具体的说是一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法。
背景技术
随着社会的进步和人民生活水平的提高，食用合成色素对人体健康的影响和危害愈来愈受到关注，对天然食用色素的需求越来越大。黄色素是食品和化妆品工业非常需要的一种色素，过去通常用人工合成的酒石黄替代，但这种合成色素容易引起人们患哮喘和风疹，因此已在许多国家被禁止使用。然而，寻找天然水溶性的黄色素一直是个难题，并且为数不多的天然黄色素还会因为种种缺陷而使其应用受到极大的限制。如姜黄色素的水溶性较差，栀子黄色素虽易溶于热水为橙色溶液，但其耐酸性较差也会使其在酸性食品、饮料中的应用受到限制，红曲黄色素的耐光性差。在苹果汁、苹果酒加工过程中，苹果中的根皮苷在多酚氧化酶的催化下缓慢氧化成为对光、热稳定的亮黄色，构成了苹果汁的主要颜色。据此，国外已有从氧化苹果汁中分离黄色素的报道，但由于苹果汁中黄色素含量太低、分离工艺复杂而无法实现产业化。研究开发低成本、高效的苹果黄色素的生产工艺技术成为苹果黄色素产业化发展的关键。
苹果黄色素的形成过程本质上就是苹果中根皮苷酶促转化为氧化产物的过程。因此，以提纯的苹果根皮苷为原料，采用体外转化法模拟苹果汁中黄色素形成过程制备苹果黄色素可以使转化过程得到较好的控制并可对黄色素产生一定的富集作用，因此可能成为苹果黄色素的产业化生产方式。但由于根皮苷相对比较稳定，其酶促氧化反应进行较慢，以其为底物制备黄色素需要时间较长。如何提高根皮苷的转化速率和效率是根皮苷酶促转化制备黄色素的关键所在。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、高效的根皮苷酶促转化体系与方法，获得一种安全、稳定的食用黄色素。
为达上述目的，本发明采用双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，具体包括以下步骤：
1)将根皮苷、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶共同溶于pH为5.5～7.0的磷酸盐缓冲液中，通入氧气并进行搅拌，于25～35℃条件下进行酶促转化反应，反应结束后加热至80℃灭酶5min，得到转化液。
2)将步骤1)所得转化液中加入1∶1的乙酸乙酯进行萃取，除去未反应完全的根皮苷，下层水相经真空浓缩后进行干燥，得到黄色素粗品。
3)将步骤2)所得黄色素粗品溶解于甲醇中，离心除去不溶性的缓冲盐，上清液减压蒸发除去甲醇，得到精制黄色素。
步骤1)中所述的β-葡萄糖苷酶的添加量为2000～20000U/g根皮苷，多酚氧化酶的添加量为5000～50000U/g根皮苷，反应液中溶氧量饱和度为20～40％，酶促反应时间为2～24h。
步骤2)中所述的萃取过程需重复3～4次，浓缩温度为40～60℃。
步骤3)中所述的除盐过程需重复进行2～4次，以彻底去除其中的缓冲盐。
利用本发明所提供的方法制备得到的黄色素为水溶性黄色素，纯度高，在pH2～5条件下呈亮丽的黄色，并且具有抗氧化等生物活性，是一种功能性黄色素。由于在根皮苷酶促转化体系中同时加入β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶，使部分根皮苷先行被β-葡萄糖苷酶分解为根皮素，提高其反应活性，然后再在多酚氧化酶作用下进行酶促氧化，反应的速率和效率得到大幅提高。同等条件下(相同温度、相同底物浓度、相同酶用量)，达到相同转化率的时间可较单独采用多酚氧化酶酶促转化节约50％以上。利用本发明制备苹果黄色素，既有效提高了根皮苷的酶促转化速率，又避免了直接采用根皮素作为氧化底物原料成本过高的问题，具有明显的社会效益和经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，包括以下步骤：
1)将5g根皮苷溶于5L pH为6.5的0.01M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，同时加入25000Uβ-葡萄糖苷酶、100000U蘑菇多酚氧化酶，通入氧气并进行搅拌，使反应液中溶氧量饱和度达到30％左右，于30℃条件下进行酶促转化反应，4h后加热至80℃灭酶5min，得到转化液。
2)将步骤1)所得转化液中加入1∶1的乙酸乙酯进行萃取，反复操作4次，除去未反应完全的根皮苷，下层水相在50～55℃条件下减压浓缩后冷冻干燥，得到黄色素粗品。
3)将步骤2)所得黄色素粗品溶解于甲醇中，离心除去不溶性的缓冲盐，上清液在40℃条件下减压蒸发除去甲醇，反复操作3次，得到精制黄色素6.6g。
实施例2
一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，包括以下步骤：
1)将3g根皮苷溶于3L pH为6.0的0.01M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，同时加入10000Uβ-葡萄糖苷酶、30000U蘑菇多酚氧化酶，通入氧气并进行搅拌，使反应液中溶氧量饱和度达到35％左右，于28℃条件下进行酶促转化反应，8h后加热至80℃灭酶5min，得到转化液。
2)将步骤1)所得转化液中加入1∶1的乙酸乙酯进行萃取，反复操作4次，除去未反应完全的根皮苷，下层水相在45～50℃条件下减压浓缩后冷冻干燥，得到黄色素粗品。
3)将步骤2)所得黄色素粗品溶解于甲醇中，离心除去不溶性的缓冲盐，上清液在40℃条件下减压蒸发除去甲醇，反复操作4次，得到精制黄色素3.4g。

Claims (5)

1.一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将根皮苷、β-葡萄糖苷酶、多酚氧化酶共同溶于pH为5.5～7.0的磷酸盐缓冲液中，通入氧气并进行搅拌，于25～35℃条件下进行酶促转化反应，反应结束后加热至80℃灭酶5min，得到转化液；
2)将步骤1)得到的转化液中加入1∶1的乙酸乙酯进行萃取，除去未反应完全的根皮苷，下层水相经真空浓缩后进行干燥，得到黄色素粗品；
3)将步骤2)得到的黄色素粗品溶解于甲醇中，离心除去不溶性的缓冲盐，上清液减压蒸发除去甲醇，得到精制黄色素。
2.根据权利要求1所述的一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，其特征在于：步骤1)中所述的β-葡萄糖苷酶的添加量为2000～20000U/g根皮苷，多酚氧化酶的添加量为5000～50000U/g根皮苷，反应液中溶氧量饱和度为20～40％，酶促反应时间为2～24h。
3.根据权利要求1所述的一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，其特征在于：步骤2)中所述的萃取过程需重复3～4次，浓缩温度为40～60℃。
4.根据权利要求1所述的一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，其特征在于：步骤3)中所述的除盐过程需重复进行2～4次，以彻底去除其中的缓冲盐。
5.根据权利要求1所述的一种双酶法转化根皮苷制备黄色素的方法，其特征在于：步骤3)中所得到的黄色素为水溶性黄色素，在pH2～5条件下呈亮丽的黄色，并且具有抗氧化等生物活性，是一种功能性黄色素。
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