CN107217077B - 一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法 - Google Patents
一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4‑乙烯基愈创木酚的方法，具体为：米糠粕利用超声辅助弱碱提取米糠蛋白；将剩余的米糠废渣与废液混合，采用碱提阿魏酸；再利用本实验自行筛选保藏的芽孢杆菌DLF‑15161经海藻酸钙包埋后制得的微球为生物催化剂，将阿魏酸粗提液生物转化合成高档香料4‑乙烯基愈创木酚，最终实现米糠的综合利用。本发明工艺所制备的米糠蛋白品质好，合成的4‑乙烯基愈创木酚价值高，并且该工艺简单，不需要复杂或昂贵的设备，成本低廉，整个过程实现了资源的循环利用，减少了废水的产生，避免了资源浪费，对环境友好，具有良好的应用前景和工业化潜力。
Description
技术领域
本发明属于大米加工副产物综合利用技术领域，具体涉及一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法。
背景技术
米糠是稻谷加工过程中的主要副产物，虽然只占稻谷质量的6～8％，但却包含了稻谷64％的营养成分及90％以上的人体必需元素，因此被称为“天然营养宝库”。作为稻谷生产大国，我国每年产稻谷约1.85亿吨，产出约1000万吨米糠。目前对米糠利用最多的是提取米糠油，也有少部分企业将脱除米糠油后的米糠粕进一步深加工，提取植酸钙、肌醇、谷维素等价值较高的产品。但总体上，我国对米糠资源的深度开发应用尚处于较低水平，大部分都被用作畜禽饲料，高附加值米糠制品还比较少。因此，对米糠的综合利用，特别是利用米糠粕生产高附加值产品，如米糠蛋白、4-乙烯基愈创木酚等，具有重要的意义。
米糠中蛋白质含量约为12％～20％，是一种优质植物蛋白，具有独特的营养价值和食品属性，其在医药、保健品、化妆品和蛋白质工程等高新领域的应用非常广泛。例如提取出来的米糠蛋白作为低过敏性蛋白质原料可以添加于婴幼儿食品中。而且米糠蛋白及其系列水解物，也可应用于很多食品，如焙烤食品、咖啡伴侣、搅打奶油、糖果、填充料、强化饮料、小吃、汤料、酱料及其它调味品。另外也有研究表明米糠蛋白具有较好的抗癌活性。此外，米糠中还含有重要的酚酸物质-阿魏酸，它在医药和食品工业中具有广泛的用途。同时，阿魏酸作为重要的前体物质，还可以合成许多重要的食用香料，如香兰素、4-乙烯基愈创木酚等。4-乙烯基愈创木酚是较为常用的高档香料之一，具有类似于丁香类芳香气味，是决定酒类、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品质的主要香味成分，其商业价值是阿魏酸的40倍左右，具有重要的应用价值和发展前景。
目前，市场上的4-乙烯基愈创木酚多为化学法合成，化学方法制得的4-乙烯基愈创木酚其香型单一，易掺杂质，产品的安全性不确定，且在合成过程中污染严重。所以，寻找一个安全、有效的生产方法是必要的。目前认为合成4-乙烯基愈创木酚最具安全有效的方法为以阿魏酸为底物，利用生物合成法制备。现已有文献或专利关于利用一些菌株通过以阿魏酸为底物生成4-乙烯基愈创木酚的报道，如汉逊德巴氏酵母、假丝酵母、肠杆菌等。然而现已报道制备方法均是以精制后的阿魏酸纯品为原料，而阿魏酸的提取和精制过程比较复杂，整个过程繁琐费时、成本高、且废水排放量大，对环境不友好。
综上，基于这样的研究背景和现状，本发明提出采用联产技术，以米糠粕为原料，同时制备米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚，该工艺节省了阿魏酸纯化和精制的步骤，减少了废水排放量，操作简便，降低生产成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有米糠利用率低，能耗大等缺点，提供一种以米糠粕为原料，联产制备高附加值的米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，提高米糠资源的利用价值。
本发明的目的可以通过以下技术手段来实现：米糠粕采用超声辅助弱碱溶液(pH8.5～9.5)浸提，离心，上清液经酸沉(pH 4.0～5.0)、干燥获得米糠蛋白；浸提米糠蛋白后的废渣与废液混合后，以碱水解(NaOH浓度0.5～1.0％)，离心，获得粗阿魏酸提取液；然后再利用本实验自行筛选保藏的芽孢杆菌DLF-15161经海藻酸钙包埋后制得的微球为生物催化剂，将阿魏酸粗提液生物转化生产4-乙烯基愈创木酚，最终实现米糠的综合利用。该方法简单有效，从廉价的米糠粕中可以联产提取得到高附加值的米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚，不需要复杂或昂贵的设备，成本低廉，并且可以减少废水的产生，对环境保护也有着重要意义。
本发明的技术方案：
一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，包括以下步骤：
(1)提取米糠蛋白粗品
将米糠粕使用弱碱溶液按料液比1:5～15浸泡，并将其放入超声细胞破碎仪中于60～100W功率下超声2～10min得到料液，然后使用0.1M浓度的NaOH或HCl调料液的pH值，使其pH值始终维持在8.5～9.5。处理好的料液于40～45℃条件下进行碱提1～2h，边提取边搅拌，于3000～5500r/min离心15～25min得残渣和上清液，残渣水洗后离心备用，合并上清液；将合并的上清液调至pH值为4.0～5.0进行酸沉，在转速为3000～5500r/min的条件下离心15～25min得到蛋白沉淀和废液，对离心后的蛋白沉淀收集并进行干燥回收，得到米糠蛋白粗品，同时对残渣和废液进行回收。
所述的米糠粕和弱碱溶液的料液比1:5～15具体为每1g米糠粕加入5～15mL的弱碱溶液。
所述的弱碱溶液的pH为8.5～9.5的NaOH溶液。
所述的干燥方法为真空冷冻干燥、喷雾干燥或冷冻喷雾干燥。
(2)提取阿魏酸
将步骤(1)产生的残渣和废液按料液比1:5～10混合得到料液，向料液中添加NaOH，使料液中NaOH的浓度达到0.5～1.0％(w/v)，在温度为60～80℃的条件下，碱解2～4h；待碱解结束后将料液于转速为8000～10000r/min条件下离心10～20min后，将上清液浓缩后pH值调至为6.5～7.5得到阿魏酸粗提液备用。
所述的残渣和废液料液比1:5～10具体为每1g残渣加入5～10mL废液。
(3)制备海藻酸钙微球
将芽孢杆菌DLF-15161接种到液体培养基中，在转速为140～200rpm/min、温度为30～40℃的条件下培养至稳定期，然后将菌液于8000～10000r/min离心10～20min得到菌泥，将一定质量的菌泥与海藻酸钠溶液混合得到混合液，保证混合液中菌泥的质量浓度为5～10g/100mL，并将混合液均匀滴加至CaCl2溶液中，于4℃环境下反应12～24h，得到微球。
所述的芽孢杆菌DLF-15161(Bacillus sp.DLF-15161)，为本实验自行筛选，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2016年11月24日，保藏编号CCTCC NO:M 2016674。
所述的液体培养基成分为：葡萄糖5.0g/L，酵母膏2.0g/L，KH2PO4 1g/L,Na2HPO4·12H2O 4g/L,CaCl2 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,NaCl 0.2g/L。
所述的海藻酸钠溶液的浓度为2～5g/100mL，CaCl2溶液的浓度为2～5g/100mL。
(4)生物合成4-乙烯基愈创木酚
将步骤(2)得到的阿魏酸粗提液浓缩至0.5～2.0g/L，并与步骤(3)中得到的微球按体积比5～10：1进行混合，在转速为60～120rpm/min、温度为30～40℃的条件下反应12～72h，得到转化液；然后将乙酸丁酯萃取剂与转化液按体积比1:5充分混合，静置20～30min，分相得到含4-乙烯基愈创木酚的萃取相，将萃取相中的萃取剂真空蒸发，即得到4-乙烯基愈创木酚。
所述的微球与浓缩至0.5～2.0g/L的阿魏酸粗提上清液按体积比1:5～10混合具体为取AmL浓缩后的阿魏酸粗提液加入容器中，将微球加入容器内，使容器内体积上升至BmL，其中，(B-A)ml:AmL的比例为1:5～10。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明可以实现米糠粕的高附加值利用，避免了资源的浪费。首先，采用超声辅助弱碱提取米糠蛋白，提高了蛋白提取率；其次，将提取蛋白剩余的废渣与废液混合后，采用碱解提取阿魏酸，再以本实验室自行筛选保藏的芽孢杆菌DLF-15161制成海藻酸钙微球作为生物催化剂，将阿魏酸粗提液生物转化合成4-乙烯基愈创木酚，实现了米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的联产。
(2)本发明工艺中，蛋白的提取率和4-乙烯基愈创木酚转化率均较高，且采用弱碱法提取的米糠蛋白质量好；该工艺简单有效，避免了阿魏酸的精制提纯过程，不需要昂贵的设备，生产成本低，有利于实现大规模工业化生产。
(3)本发明工艺将提取蛋白产生的废水用于提取阿魏酸，再将浓缩阿魏酸粗提液回收的废水用于提取蛋白，实现了水资源的循环利用，避免了水资源的浪费，降低了生产成本。
(4)本发明工艺利用海藻酸钙微球转化阿魏酸生成4-乙烯基愈创木酚，海藻酸钙微球的重复利用率可达10次以上，避免的能源的过度消耗，降低了生物催化剂的使用成本。
附图说明
图1为本发明综合利用米糠方法的工艺流程图。
具体实施方式
在具体实施例中，米糠粕均为新鲜米糠提取米糠油后的脱脂米糠。
实施例1利用海藻酸钠包埋法制备固定化细胞微球
将芽孢杆菌DLF-15161接种到液体培养基，在180rpm/min，37℃的条件下培养至稳定期，然后菌液于9000r/min离心10min得到菌泥；一定质量的菌泥与海藻酸钠溶液混合，使菌泥质量浓度达到5g/100mL，使用注射器将混合液均匀滴至CaCl2溶液，于4℃环境下交联16h，得到微球。其中海藻酸钠浓度3g/100mL，CaCl2溶液浓度3g/100mL。
所述的液体培养基成分为：葡萄糖5.0g/L,酵母膏2.0g/L,KH2PO4 1g/L,Na2HPO4·12H2O 4g/L,CaCl2 0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,NaCl 0.2g/L。
实施例2利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚
利用弱碱(pH8.5)按料液比2g:10mL浸泡脱脂米糠，并将其放入超声细胞破碎仪中于60W功率下超声10min，然后使用0.1M浓度的NaOH或HCl调料液pH值，使其维持在8.5；处理好的料液于40℃条件下进行碱提1h(pH8.5)，于4500rpm/min离心20min得残渣和上清液，残渣水洗一次后离心，合并上清液；将上清液调至pH值4.5进行酸沉，4500r/min离心20min，对蛋白沉淀收集并进行干燥回收得到米糠蛋白粗品，蛋白提取率为51.7％。将提取蛋白产生的米糠残渣和废液按料液比4g:20mL混合，在NaOH浓度0.5％(w/v)，温度60℃的条件下，碱解2h；待碱解结束后将料液于10000r/min离心20min得上清液，将上清液调至pH值7.5，获得阿魏酸提取率为197.4mg/100g,，收集浓缩过程中的水可以用来配置弱碱溶液。利用旋转蒸发仪将阿魏酸粗提液浓缩至0.5g/L，浓缩回收的废水再用于米糠蛋白的提取；将制备的海藻酸钙微球与阿魏酸粗提液按体积比3mL:30mL混合，于60rpm/min，37℃的条件下反应72h，得到转化液，最终转化率可达到65.3％；然后将乙酸丁酯萃取剂与转化液按体积比10mL:50mL充分混合，静置20min，分相得到含4-乙烯基愈创木酚的萃取相，将萃取相中的萃取剂真空蒸发，即得到4-乙烯基愈创木酚。
实施例3利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚
利用弱碱(pH9.5)按料液比2g:30mL浸泡脱脂米糠，并将其放入超声细胞破碎仪中于100W功率下超声2min，然后使用0.1M浓度的NaOH或HCl调料液pH值，使其维持在9.5；处理好的料液于45℃条件下进行碱提1h(pH9.5)，于4500rpm/min离心20min得残渣和上清液，残渣水洗一次后离心，合并上清液；将上清液调至pH值4.5进行酸沉，4500r/min离心20min，对蛋白沉淀收集并进行干燥回收得到米糠蛋白粗品，蛋白提取率为54.6％。将提取蛋白产生的米糠残渣和废液按料液比4g:20mL混合，在NaOH浓度1.0％(w/v)，温度80℃的条件下，碱解4h；待碱解结束后将料液于10000r/min离心20min得上清液，将上清液调至pH值7.5，获得阿魏酸提取率为221.8mg/100g，收集浓缩过程中的水可以用来配置弱碱溶液。利用旋转蒸发仪将阿魏酸粗提液浓缩至2.0g/L，浓缩回收的废水再用于米糠蛋白的提取；将制备的海藻酸钙微球与阿魏酸粗提液按体积比6mL:30mL混合，于120rpm/min，37℃的条件下反应72h，得到转化液，最终转化率可达到71.5％；然后将乙酸丁酯萃取剂与转化液按体积比10mL:50mL充分混合，静置30min，分相得到含4-乙烯基愈创木酚的萃取相，将萃取相中的萃取剂真空蒸发，即得到4-乙烯基愈创木酚。
实施例4利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚
利用弱碱(pH9.5)按料液比2g:30mL浸泡脱脂米糠，并将其放入超声细胞破碎仪中于100W功率下超声5min，然后使用0.1M浓度的NaOH或HCl调料液pH值，使其维持在9.5；处理好的料液于45℃条件下进行碱提2h(pH9.5)，于4500rpm/min离心20min得残渣和上清液，残渣水洗一次后离心，合并上清液；将上清液调至pH值4.5进行酸沉，4500r/min离心20min，对蛋白沉淀收集并进行干燥回收得到米糠蛋白粗品，蛋白提取率为57.9％。将提取蛋白产生的米糠残渣和废液按料液比4g:40mL混合，在NaOH浓度1.0％(w/v)，温度70℃的条件下，碱解3h；待碱解结束后将料液于10000r/min离心20min得上清液，将上清液调至pH值7.5，获得阿魏酸提取率为232.1mg/100g，收集浓缩过程中的水可以用来配置弱碱溶液。利用旋转蒸发仪将阿魏酸粗提液浓缩至1.0g/L，浓缩回收的废水再用于米糠蛋白的提取；将制备的海藻酸钙微球与阿魏酸粗提液按体积比6mL:30mL混合，于120rpm/min，37℃的条件下反应24h，最终转化率可达到76.2％。待反应结束后，将乙酸丁酯萃取剂与转化液按体积比10mL:50mL充分混合，静置30min，分相得到含4-乙烯基愈创木酚萃取相，然后将萃取相中的萃取剂真空蒸发，即得到4-乙烯基愈创木酚产品。
Claims (10)
1.一种利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取米糠蛋白粗品
将米糠粕使用弱碱溶液按料液比1:5～15浸泡，并将其放入超声细胞破碎仪中超声得到料液，采用0.1M浓度的NaOH或HCl调料液的pH值，使其pH值始终维持在8.5～9.5；处理好的料液于40～45℃条件下进行碱提1～2h后，离心处理得到残渣和上清液，残渣水洗备用；将合并的上清液调至pH值为4.0～5.0后进行酸沉，酸沉后离心得到蛋白沉淀和废液，对蛋白沉淀干燥回收得到米糠蛋白粗品，同时对残渣和废液进行回收；
所述的米糠粕和弱碱溶液的料液比1:5～15为每1g米糠粕加入5～15mL的弱碱溶液；所述的弱碱溶液为pH为8.5～9.5的NaOH溶液；
(2)提取阿魏酸粗提液
将步骤(1)产生的残渣和废液按料液比1:5～10混合得到料液，向料液中添加NaOH，使料液中NaOH的浓度达到0.5～1.0％(w/v)，在温度为60～80℃的条件下，碱解2～4h；待碱解结束后将料液在8000～10000r/min转速下离心10～20min，离心后上清液pH值调至6.5～7.5后得到阿魏酸粗提液，备用；
(3)制备海藻酸钙微球
将保藏编号CCTCC NO:M 2016674的芽孢杆菌DLF-15161接种到液体培养基中，在转速为140～200rpm/min、温度为30～40℃的条件下培养至稳定期，得到菌液；将菌液于8000～10000r/min离心10～20min得到菌泥；将菌泥与海藻酸钠溶液混合得到混合液，混合液中菌泥的质量浓度为5～10g/100mL，并将混合液均匀滴加至浓度为2～5g/100mL的CaCl2溶液中，于4℃环境下反应12～24h得到微球；
所述的海藻酸钠溶液的浓度为2～5g/100mL，CaCl2溶液的浓度为2～5g/100mL；
(4)生物合成4-乙烯基愈创木酚
将步骤(2)得到的阿魏酸粗提液浓缩至0.5～2.0g/L，并与步骤(3)中得到的微球按体积比5～10：1进行混合，在转速为60～120rpm/min、温度为30～40℃的条件下反应12～72h，得到转化液；将萃取剂与转化液按体积比1:5充分混合，静置后分相得到含4-乙烯基愈创木酚的萃取相，将萃取相中的萃取剂真空蒸发，即得到4-乙烯基愈创木酚。
2.根据权利要求1所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的得到残渣、上清液，得到蛋白沉淀、废液的离心转速均为3000～5500r/min，离心时间均为15～25min。
3.根据权利要求1或2所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中超声细胞破碎仪的超声功率为60～100W，超声时间为2～10min。
4.根据权利要求1或2所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中液体培养基成分为：葡萄糖5.0g/L，酵母膏2.0g/L，KH2PO41.0g/L，Na2HPO4·12H2O 4.0g/L，CaCl2 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl0.2g/L。
5.根据权利要求3所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中液体培养基成分为：葡萄糖5.0g/L，酵母膏2.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 4.0g/L，CaCl2 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl0.2g/L。
6.根据权利要求1或2或5所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥或冷冻喷雾干燥。
7.根据权利要求3所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的干燥为真空冷冻干燥、喷雾干燥或冷冻喷雾干燥。
8.根据权利要求1或2或5或7所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的萃取剂为乙酸丁酯。
9.根据权利要求3所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的萃取剂为乙酸丁酯。
10.根据权利要求6所述的利用米糠粕联产米糠蛋白和4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的萃取剂为乙酸丁酯。
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