CN109136320B - 一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，利用β‑葡萄糖苷酶、微生物协同作用产生的多酶复合体结构，专一破坏β‑D‑葡萄糖苷键的原理，以根皮苷为原料，同时添加β‑葡萄糖苷酶和特定微生物，通过发酵一方面增大酶量，另一方面释放辅酶因子，从而增强酶促反应，再萃取、纯化后获得高纯度、高活性根皮素。其有益效果在于，所述方法成本低，产量高，操作简单，条件温和，适合大规模工业生产。

Description

一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法
技术领域
本发明属于根皮素制备技术领域，更具体地，涉及一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法。
背景技术
根皮素是根皮苷的脱糖基产物，存在于蔬菜，苹果、梨等水果中，是著名的天然二氢查尔酮之一，具有抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、抗癌、抗炎、抗菌和雌激素作用等多种生物活性。在食品、化妆品、和药品等方面应用广泛。然而，根皮素在植物中的含量较低，直接从植物中萃取，不仅产率极低，而且原材料耗费大，生产过程中很多其他生物活性物质（如黄色素/绿原酸等）被浪费。而根皮苷易于从苹果、海棠等植物中大量获取，其得率是根皮素的5-10倍，因此，利用根皮苷制备根皮素是一条经济可行的途径。
目前，利用根皮苷制备根皮素的方法主要是酸水解法（例如CN108358769 A）和化学催化法（例如CN103351291 A），但缺点是副产物多，产物纯度低，催化剂价格昂贵，催化条件难把控，不利于产物根皮素的活性保持，不利于大规模的工业化生产，对环境不友好。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，该方法针对β-葡萄糖苷酶能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基的原理，利用菌液中含有β-葡萄糖苷酶在内的丰富酶系以及促进β-葡萄糖苷酶催化作用的Fe3+、Mn2+活性因子，与外加的β-葡萄糖苷酶协同作用产生的多酶复合体结构，专一性地作用于根皮苷的β-D-葡萄糖苷键，从而将根皮苷脱糖基获得根皮素。
本发明提供一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，具体包括以下步骤：
S1发酵培养液的制备：将根皮苷10～20g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基；
S2将活化后的菌株接种到发酵培养基中，同时添加β-葡萄糖苷酶，并调节pH至5.5～7.0，通入氧气并搅拌，于37～41℃条件下反应16～20h，使根皮苷与β-葡萄糖苷酶和菌体充分反应，得菌体转化液；其中，β-葡萄糖苷酶的添加量为2000～4000U/g根皮苷，活化菌株的菌悬液浓度在104～106 CFU/ml，接种量为10～20ml；
S3将步骤S2中的菌体转化液进行细胞破碎，释放菌株胞内酶与胞内产物。重新置于37～41℃条件下继续反应2～3h，让根皮苷与释放的胞内酶继续反应，加热至100℃灭菌灭酶活终止反应10 min，得到产物转化液；
S4将产物转化液中加入0.5～1倍体积的有机溶剂萃取，取上清液浓缩后干燥，得到根皮素粗品；
S5将步骤S4)得到的根皮素粗品溶于甲醇再离心，取上清液浓缩，纯化 得到根皮素。
进一步，步骤S2中所述菌株为所有能产β-葡萄糖苷酶的酵母菌属、曲霉属或木霉属中的一种。
进一步，步骤S3中所述细胞破碎是高速匀浆破碎或超声破碎中的一种。
进一步，步骤S3中所述细胞破碎，破碎的温度为0～4℃。
进一步，步骤S4中所述有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷或乙酸丁酯中的一种。
进一步，步骤 S4中所述萃取重复3～4次，浓缩的温度为40～60℃，萃取总时间为10～20min。
进一步，步骤 S5中所述根皮苷粗品溶于甲醇再离心，重复2～4次，浓缩的温度为40～60℃，纯化总时间为10～20min。
进一步，步骤S1中根皮苷的添加量为16g/L；步骤2）中β-葡萄糖苷酶的添加量为2000U/g根皮苷，pH为6，反应温度37℃，发酵时间18h。
进一步，步骤S3中继续反应时间为2h。
本发明是利用酶、菌同时与反应物反应，相互协同促使根皮苷转化成根皮素的产率更高，相比较于单独酶解或单独的微生物转化等方法，本发明技术方案的效果更优。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
本发明方法操作简单，对生产人员要求低，产品质量比天然提取根皮素更好、含量更高。用试剂和材料简单常见，适于工业推广，产物便于回收利用和环境友好。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1.将酿酒酵母（市售）于200 m L发酵培养基，28℃、150 r/min条件下，活化48 h。
2.发酵培养液的制备：将根皮苷10g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基。
3.将活化后的酿酒酵母菌株（菌悬液浓度在104 CFU/ml），接种10ml到发酵培养基中，同时添加相对质量浓度为4000U/g根皮苷的β-葡萄糖苷酶，并调节pH至6.0，通入氧气并搅拌，溶氧量饱和度为20～40％，于37℃条件下反应18h，得菌体转化液。
4.将菌体转化液进行超声破碎，超声功率600w每超声5s间隔5s，超声破碎总时间1min，置于37℃条件下继续反应3h，加热至100℃终止反应10 min，得到产物转化液。
5.将产物转化液中加入1倍体积的乙酸乙酯反复萃取3次，浓缩后干燥，浓缩温度40℃，得到根皮素粗品7.15g。
6.将根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复3次，取上清液浓缩，浓缩温度40℃，纯化得到根皮素5.05g。
实施例2
1.将黑曲霉于200 m L发酵培养基，28℃、150 r/min条件下，活化48 h。
2.发酵培养液的制备：将根皮苷20g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基。
3.将活化后的黑曲霉菌株（菌悬液浓度在106 CFU/ml），接种10ml到发酵培养基中，同时添加相对质量浓度为3000U/g根皮苷的β-葡萄糖苷酶，并调节pH至5.5，通入氧气并搅拌，溶氧量饱和度为20～40％，于37℃条件下反应18h，得菌体转化液。
4.将菌体转化液进行超声破碎，超声功率600w每超声5s间隔5s，超声破碎总时间1min，，置于37℃条件下继续反应3h，加热至100℃终止反应10 min，得到产物转化液。
5.将产物转化液中加入1倍体积的乙酸丁酯反复萃取3次，浓缩后干燥，浓缩温度40℃，得到根皮素粗品15.28g。
6.将根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复3次，取上清液浓缩，浓缩温度40℃，纯化得到根皮素10.72g。
实施例3
1.将酿酒酵母和黑曲霉于200 m L发酵培养基，28℃、150 r/min条件下，活化48h。
2.发酵培养液的制备：将根皮苷10g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基。
3.将活化后的两种菌株（菌悬液浓度在105 CFU/ml），都接种10ml到发酵培养基中，同时添加相对质量浓度为2000U/g根皮苷的β-葡萄糖苷酶，并调节pH至7.0，通入氧气并搅拌，溶氧量饱和度为20～40％，于40℃条件下反应20h，得菌体转化液。
4.将菌体转化液进行超声破碎，超声功率600w每超声10s间隔5s，超声破碎总时间1min，置于40℃条件下继续反应3h，加热至100℃终止反应10 min，得到产物转化液。
5.将产物转化液中加入1倍体积的乙酸丁酯反复萃取3次，浓缩后干燥，浓缩温度40℃，得到根皮素粗品5.29g。
6.将根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复3次，取上清液浓缩，浓缩温度40℃，纯化得到根皮素3.77g。
对比例1
1.将酿酒酵母于200 m L发酵培养基，28℃、150 r/min条件下，活化48 h。
2.发酵培养液的制备：将根皮苷10g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基。
3.将活化后的菌株（菌悬液浓度在106 CFU/ml），接种20ml到发酵培养基中，接种到发酵培养基中，调节pH至6.0，通入氧气并搅拌，溶氧量饱和度为20～40％，于37℃条件下反应18h，得菌体转化液。
4.将菌体转化液进行超声破碎1min后，置于37℃条件下继续反应3h，加热至100℃终止反应10 min，得到产物转化液。
5.将产物转化液中加入1倍体积的乙酸乙酯反复萃取3次，浓缩后干燥，浓缩温度40℃，得到根皮素粗品4.18g。
6.将根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复3次，取上清液浓缩，浓缩温度40℃，纯化得到根皮素3.21g。
对比例1与实施例1的区别在于：没有额外添加β-葡萄糖苷酶，利用酵母菌单独发酵以及菌自身所产酶系降解根皮苷获得根皮素。
对比例2
1.将根皮苷10g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基；同时添加相对质量浓度为4000U/g根皮苷的β-葡萄糖苷酶，并调节pH至6.0，通入氧气并搅拌，溶氧量饱和度为20～40％，于37℃条件下反应21h。
2.加热至100℃终止反应10 min。
3.将产物转化液中加入1倍体积的乙酸乙酯反复萃取3次，浓缩后干燥，浓缩温度40℃，得到根皮素粗品1.62g。
4.将根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复3次，取上清液浓缩，浓缩温度40℃，纯化得到根皮素0.98g。
对比例2与实施例1的区别在于：没有酵母菌发酵，直接添加酶制剂降解根皮苷获得根皮素。

Claims (8)

1.一种酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1发酵培养液的制备：将根皮苷10～20g添加于灭菌后的1L马铃薯液体培养基，制得发酵培养基；
S2将活化后的菌株接种到步骤S1的发酵培养基中，同时添加β-葡萄糖苷酶，并调节pH至5.5～7.0，通入氧气并搅拌，于37～41℃条件下反应16～20h，得菌体转化液；其中，β-葡萄糖苷酶的添加量为2000～4000U/g根皮苷，活化菌株的菌悬液浓度在104～106 CFU/ml，接种量为10～20ml；
S3将步骤S2中的菌体转化液进行细胞破碎后重新置于37～41℃条件下继 续反应2～3h，加热至100℃终止反应10 min，得到产物转化液；
S4将产物转化液中加入0.5～1倍体积的有机溶剂萃取，取上清液浓缩后干燥，得到根皮素粗品；
S5将步骤S4得到的根皮素粗品溶于甲醇再离心，取上清液浓缩，纯化得到根皮素；
步骤S2中所述菌株为能产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母、黑曲霉中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S3中所述细胞破碎为高速匀浆破碎或超声破碎中的一种。
3.根据权利要求2所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S3中所述细胞破碎为超声破碎，超声破碎的条件为：超声功率600w每超声5s间隔5s，超声破碎总时间1min。
4.根据权利要求1所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S3中所述细胞破碎中破碎的温度为0～4℃。
5.根据权利要求1所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S4中所述有机溶剂是乙酸乙酯、二氯甲烷或乙酸丁酯中的一种。
6.根据权利要求5所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S4中所述有机溶剂是乙酸乙酯。
7.根据权利要求1所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于，步骤S4中所述萃取重复3～4次，浓缩的温度为40～60℃。
8.根据权利要求1所述酶菌复合体系转化根皮苷制备根皮素的方法，其特征在于：步骤S5中所述根皮素粗品溶于甲醇再离心，重复2～4次，浓缩的温度为40～60℃。
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