CN103805657A - 游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。它包括固定化对苯二酚的制备，黄单胞菌游离细胞的制备，反应条件优化，游离细胞和树脂的回收及循环使用和产物分离提取等工艺步骤。采用本发明生产α-熊果苷，对苯二酚转化率达到90.5-95.2%，每升反应液α-熊果苷产量为20-250g，比直接用游离对苯二酚作为反应物的产量提高了2-15倍。此外，菌体细胞的使用寿命长达5-10个周期，树脂使用寿命达50-300个周期；产物经分离纯化后纯度可达99.5％以上。本发明利用游离细胞催化固定化对苯二酚，具有产量高、工艺简单、环境友好等优点，大大降低了α-熊果苷生产成本。

Description

游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。 

背景技术

α-熊果苷具有显著抑制酪氨酸酶的活性，可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。在比较α-熊果苷与其同分异构体β-熊果苷的美白效果时，Kazuhisa等学者发现α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上，且对人体具有很好的安全。目前，α-熊果苷是国际公认的并正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。 

作为α-熊果苷合成反应物之一的对苯二酚具有杀菌作用，它可以通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态而引起细胞凋亡。当α-熊果苷合成反应体系中游离对苯二酚的浓度超过一定量时,会对菌体产生毒害作用，导致菌体催化能力显著下降，不利于α-熊果苷的合成。因此，研究一种既可以提高反应体系中对苯二酚的浓度又可以降低其毒害作用的方法，成为大规模低成本生产α-熊果苷的必然选择。 

固定化(immobilized)技术是用化学或物理手段将物体定位于限定空间区域的一门新兴技术，在化工、发酵、能源、医药等行业应用广泛。大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附树脂，有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。 

目前，由于利用化学合成方法很难合成α-熊果苷，所以关于α-熊果苷的制备方法主要通过生物转化法来实现。如今国外关于α-熊果苷合成的报道主要有Nishimura，Kitao，Kurosu，Prodanovic，Seo等；国内主要有张鹏、李群良、姜岷、庞宗文及杜刚等。但这些方法均存在以下一些问题： 

一、催化剂（菌体或酶）对对苯二酚的耐受度不高，无有效办法克服对苯二酚对催化剂的毒性，从而使反应体系中的对苯二酚浓度无法提高，导致α-熊果苷的产量普遍偏低，生产成本高居不下； 

二、催化剂使用寿命短，使用一次以后基本上就丧失了酶活力，无法实现多次循环使用，导致催化剂利用率不高； 

三、产物α-熊果苷后续分离纯化工艺复杂、设备投资及操作费用均较大； 

四、生产过程有含对苯二酚废水排放，导致环境污染。 

为了克服这些问题，利用游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷是很好的解决办法。通过把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，首先既可以大大提高反应体系中对苯二酚的浓度，又可避免反应体系中游离对苯二酚的存在，从而避免了游离对苯二酚对菌体生长代谢和酶活力抑制作用，进而极大地提高α-熊果苷的产量；其次，利用菌体游离细胞作为催化剂，具有多次重复使用的优点，提高了催化剂利用率，节约了菌体发酵原材料成本；再者，待反应结束后，固定在树脂上的产物和未反应的对苯二酚只需用简单过滤即可从反应体系中分离出来，简化了后续产物分离纯化工艺及设备投资，并减少了反应体系对苯二酚废水的排放，避免了对环境的污染。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用固定化对苯二酚消除对苯二酚对菌体细胞的毒害作用，提高反应体系中对苯二酚的浓度，从而提高α-熊果苷的产量，实现低成本大规模生产α-熊果苷的目的。其中固定化对苯二酚即采用大孔吸附树脂吸附法对对苯二酚进行固定化，并用此固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243游离细胞催化合成α-熊果苷的反应物，在最佳反应条件下催化合成α-熊果苷。该方法具有提高菌体对对苯二酚的耐受度，简化产物后续分离纯化工艺，提高菌体细胞使用寿命，减少含酚废水排放等优点，大大降低了α-熊果苷生产成本，为大规模低成本生产α-熊果苷奠定了基础。 

本发明的整体技术构思是： 

利用大孔吸附树脂对对苯二酚进行固定化，然后用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的游离细胞在缓冲溶液系统中催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成： 

（1）固定化对苯二酚的制备； 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备，其中包括种子培养和发酵罐培养； 

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应； 

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用； 

（5）α-熊果苷的分离纯化。 

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是： 

步骤（1）中固定化对苯二酚的制备： 

先配制质量百分比浓度为1-10％的对苯二酚水溶液；然后每100mL对苯二酚水溶液加入10g大孔吸附树脂进行吸附，待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.1-1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

步骤（2）中野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为25-40℃，转速为50-200r/min摇床中培养10-24h后得一级种子液；将一级种子液按1-10％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为25-40℃，转速为50-300r/min，通风量为0.1-2vvm条件下培养10-24h得二级种子液；再以1-10％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为25-40℃，通风量为0.1-2vvm，转速为50-300r/min条件下培养10-24h；最后把培养好的发酵液进行微滤或离心即可获得菌体游离细胞。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

双糖  10-60份，蛋白胨  1-10份，酵母粉  1-10份，硫酸镁  0.5-2份，磷酸氢二钾  1-3份，氯化钠  1-3份和水  1000份。 

步骤（3）中的合成反应条件为： 

往缓冲溶液中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中游离细胞质量百分比浓度为5-20g/L，大孔吸附树脂质量百分比浓度为10-100g/L，双糖的质量百分比浓度为5-720g/L；在反应温度为20-50℃，搅拌转速为50-300r/min条件下反应24-72h。 

步骤（4）中游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用： 

在游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷反应结束后，利用过滤方法即可把游离细胞和大孔吸附树脂进行回收，回收的细胞用缓冲溶液洗涤2-3次，再次投入含有反应物固定化对苯二酚和双糖的缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，实现野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞多次催化合成α-熊果苷；在此条件下，菌体游离细胞在转化了5-10个周期后，细胞仍保持70％的活力。分离出来的树脂进入步骤（5）进行产物分离纯化，待产物分离后，树脂重新用于对苯二酚的固定化，并再次作为反应物投入缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达50-300个周期。 

步骤（5）中α-熊果苷的分离纯化包括以下三个步骤： 

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为2-12h。 

本发明提供的利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞催化合成α-熊果苷反应物的方法，适用于以非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂为固定化介质的固定化对苯二酚的方法。 

本发明所用的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所（100080），保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243，保藏时间为2004年11月8日。 

本发明所取得的技术进步在于： 

本发明是通过以固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α-熊果苷的反应物，消除游离对苯二酚对菌体细胞的毒害作用，解决了反应体系中对苯二酚浓度无法提高导致α-熊果苷产量偏低，产物后续分离工艺复杂，过程中有含酚废水排放等问题。利用本发明生产α-熊果苷的方法具有如下优点： 

（1）产量高成本低：通过把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，消除了反应体系中游离对苯二酚对菌体的毒害作用，可以成倍提高反应体系中对苯二酚的浓度，从而极大提高α-熊果苷的产量，降低α-熊果苷的生产成本，使大规模生产α-熊果苷成为可能； 

（2）催化剂使用寿命长：完成一批次反应的菌体细胞依然保持很高的活力，具有循环多次使用的能力，其使用寿命长达5-10个周期，大大节约了菌体发酵原材料成本； 

（3）产物分离纯化工艺简单：在反应结束后，固定在树脂上的产物只需用简单的过滤方法就可以实现产物和反应体系有效分离，大大简化了产物后续分离纯化工艺及其设备投资； 

（4）生产过程环境友好：在反应结束后，未反应的对苯二酚依然固定在树脂上，并重新投入下一批次的反应中去，整个生产过程没有喊酚废水的排放，对环境不造成任何污染。 

采用本发明生产的α-熊果苷具有产量高，工艺步骤简单，生产成本低等优点。在最佳反应条件下，对苯二酚转化率达到70-95.2%，每升反应液中α-熊果苷产量高达20-235g，比直接用游离对苯二酚作为反应物（ZL200410090980.5与ZL200510080364.6）的产量提高了2-15倍；产物经分离纯化后，产品纯度达99.5％以上。因此，本发明具有重大工业化意义。 

本发明的方法涉及的非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂，既可用公知的方法合成，也可以是市场销售产品。作为市场销售的大孔吸附树脂的代表例子，例如下面所列举的实施例只是为了更详细地说明本发明，但本发明不受它们的任何限定。 

具体实施方式

实施例1 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先配制质量百分比浓度为5％的对苯二酚水溶液；然后每100ml对苯二酚水溶液加入10g非极性大孔吸附树脂如D201、D4020、D4006、D3520、H1020、H103、H107、HPD100、HPD700、PS、NKA、X-5或YWD01B进行吸附；待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.5g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为35℃，转速为150r/min摇床中培养15h后得一级种子液；将一级种子液按5％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为35℃，转速为125r/min，通风量为1vvm条件下培养15h得二级种子液；再以5％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为35℃，通风量为1vvm，转速为100r/min条件下培养15h；最后把培养好的发酵液进行离心即可获得菌体游离细胞。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖30份，蛋白胨5份，酵母粉5份，硫酸镁1份，磷酸氢二钾2份，氯化钠1份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往磷酸缓冲溶液中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中游离细胞质量百分比浓度为10g/L，大孔吸附树脂质量百分比浓度为50g/L，蔗糖的质量百分比浓度为156g/L；在反应温度为35℃，搅拌转速为150r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转 化为α-熊果苷的转化率达90.8％，每升反应液中含α-熊果苷56.1g。 

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用： 

在游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷反应结束后，利用过滤方法即可把游离细胞和大孔吸附树脂进行回收，回收的细胞用缓冲溶液洗涤2-3次，再次投入含有反应物固定化对苯二酚和蔗糖的磷酸缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，实现野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞多次催化合成α-熊果苷；在此条件下，菌体游离细胞在转化了8个周期后，α-熊果苷的转化率分别为：90.8％、89.5％、86.7％、84.2％、81％、78.3％、75.1％、71.2％，对应的α-熊果苷质量浓度为：56.1g/L、55.3g/L、53.6g/L、52.1g/L、50.1g/L、48.4g/L、46.4g/L、44g/L，所以游离细胞在使用8次后，细胞活力仍保持在70％以上。分离出来的树脂进入步骤（5）进行产物分离纯化，待产物分离后，树脂重新用于对苯二酚的固定化，并再次作为反应物投入缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达200个周期。 

（5）α-熊果苷的分离纯化： 

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为35%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例2 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先配制质量百分比浓度为10％的对苯二酚水溶液；然后每100ml对苯二酚水溶液加入10g极性大孔吸附树脂如NKA-9、NKA-II、S-8、HPD600或YWD06进行吸附；待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为30℃，转速为100r/min摇床中培养15h后得一级种子液；将一级种子液按10％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为30℃，转速为100r/min，通风量为1.5vvm条件下培养15h得二级种子液；再以10％接种 量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为30℃，通风量为1.5vvm，转速为80r/min条件下培养15h；最后把培养好的发酵液进行微滤即可获得菌体游离细胞。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖50份，蛋白胨5份，酵母粉1份，硫酸镁0.5份，磷酸氢二钾2份，氯化钠2份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往醋酸缓冲溶液中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中游离细胞质量百分比浓度为20g/L，大孔吸附树脂质量百分比浓度为100g/L，麦芽糖的质量百分比浓度为700g/L；在反应温度为30℃，搅拌转速为150r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达92.5％，每升反应液中含α-熊果苷228.7g。 

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用： 

在游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷反应结束后，利用过滤方法即可把游离细胞和大孔吸附树脂进行回收，回收的细胞用缓冲溶液洗涤2-3次，再次投入含有反应物固定化对苯二酚和蔗糖的磷酸缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，实现野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞多次催化合成α-熊果苷；在此条件下，菌体游离细胞在转化了5个周期后，α-熊果苷的转化率分别为：92.5％、88.2％、81.5％、76.4％、70.5％，对应的α-熊果苷质量浓度为：228.7g/L、218.1g/L、201.5g/L、188.9g/L、174.3g/L，所以游离细胞在使用5次后，细胞活力仍保持在70％以上。分离出来的树脂进入步骤（5）进行产物分离纯化，待产物分离后，树脂重新用于对苯二酚的固定化，并再次作为反应物投入缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达100个周期。 

（5）α-熊果苷的分离纯化： 

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为35%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例3 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先配制质量百分比浓度为1％的对苯二酚水溶液；然后每100ml对苯二酚水溶液加入10g弱极性大孔吸附树脂如AB-8或YWD03F进行吸附；待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonss campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为25℃，转速为200r/min摇床中培养10h后得一级种子液；将一级种子液按1％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为25℃，转速为200r/min，通风量为0.1vvm条件下培养24h得二级种子液；再以1％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为25℃，通风量为0.1vvm，转速为150r/min条件下培养24h；最后把培养好的发酵液进行离心即可获得菌体游离细胞。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖10份，蛋白胨10份，酵母粉10份，硫酸镁1份，磷酸氢二钾3份，氯化钠1份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往柠檬酸缓冲溶液中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中游离细胞质量百分比浓度为10g/L，大孔吸附树脂质量百分比浓度为100g/L，乳糖的质量百分比浓度为63g/L；在反应温度为25℃，搅拌转速为50r/min条件下反应48h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达95.2％，每升反应液中含α-熊果苷23.5g。 

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用： 

在游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷反应结束后，利用过滤方法即可把游离细胞和大孔吸附树脂进行回收，回收的细胞用缓冲溶液洗涤2-3次，再次投入含有反应物固定化对苯二酚和蔗糖的磷酸缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，实现野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞多次催化合成α-熊果苷；在此条件下，菌体游离细胞在转化了10个周期后，α-熊果苷的转化率分别为：95.2％、94.8％、93.5％、92.3％、91.2％、90.5％、87.8％、85.1％、83.6％、81.2％，对应的α-熊果苷质量浓度为：23.5g/L、23.4g/L、23.1g/L、22.8g/L、22.6g/L、22.4g/L、21.7g/L、21g/L、20.7g/L、20.1g/L，所以游离细胞在使用10次后，细胞活力仍保持在80％以上。分离出来的树脂进入步骤（5）进行产物分离纯化，待产物分离后，树脂重新用于对苯二酚的固定化，并再次作为反应物投入缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达300个周期。 

（5）α-熊果苷的分离纯化： 

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为35%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

实施例4 

（1）固定化对苯二酚的制备： 

先配制质量百分比浓度为5％的对苯二酚水溶液；然后每100ml对苯二酚水溶液加入10g中等极性大孔吸附树脂如HPD-450或YWD04进行吸附；待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.5g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备： 

挑取1环斜面保存的野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243菌株，加入到体积为250ml的液体培养基中，在温度为40℃，转速为300r/min摇床中培养10h后得一级种子液；将一级种子液按5％接种量接种到体积为1000升的发酵罐中，在温度为40℃，转速为50r/min，通风量为2vvm条件下培养10h得二级种子液；再以5％接种量接种到体积为10000升发酵罐中，在温度为40℃，通风量为2vvm，转速为50r/min条件下培养15h；最后把培养好的发酵液进行微滤即可获得菌体游离细胞。 

种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成： 

蔗糖60份，蛋白胨5份，酵母粉5份，硫酸镁2份，磷酸氢二钾1份，氯化钠3份和水1000份。 

（3）加入反应物进行合成反应： 

往硼酸缓冲溶液中加入固定了对苯二酚的大孔吸附树脂和双糖，其中游离细胞质量百分比浓度为10g/L，大孔吸附树脂质量百分比浓度为25g/L，蔗糖的质量百分比浓度为78g/L；在反应温度为40℃，搅拌转速为150r/min条件下反应72h。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达93.5％，每升反应液中含α-熊果苷28.9g。 

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用： 

在游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷反应结束后，利用过滤方法即可把游离细 胞和大孔吸附树脂进行回收，回收的细胞用缓冲溶液洗涤2-3次，再次投入含有反应物固定化对苯二酚和蔗糖的磷酸缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，实现野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞多次催化合成α-熊果苷；在此条件下，菌体游离细胞在转化了9个周期后，α-熊果苷的转化率分别为：93.5％、92.8％、89.5％、85.9％、83.5％、81.3％、77.5％、73.3％、70.5％，对应的α-熊果苷质量浓度为：28.9g/L、28.7g/L、27.7g/L、26.6g/L、25.8g/L、25.1g/L、24g/L、22.7g/L、21.8g/L，所以游离细胞在使用9次后，细胞活力仍保持在70％以上。分离出来的树脂进入步骤（5）进行产物分离纯化，待产物分离后，树脂重新用于对苯二酚的固定化，并再次作为反应物投入缓冲溶液体系中进行反应；如此重复循环，树脂的使用寿命可达250个周期。 

（5）α-熊果苷的分离纯化： 

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净； 

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为35%的酒精进行洗脱，收集洗脱液； 

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为50℃，结晶时间为12h。 

Claims (10)

1.游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法,其特征在于:用大孔吸附树脂对对苯二酚进行固定化，然后用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞在缓冲溶液系统中催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成：

（1）固定化对苯二酚的制备；

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243游离细胞的制备，其中包括种子培养和发酵罐培养；

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应；

（4）游离细胞和大孔吸附树脂的回收及循环使用；

（5）α-熊果苷的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（1）步骤中固定化对苯二酚的制备是利用大孔吸附树脂吸附法制备，其步骤是：先配制质量百分比浓度为1-10％的对苯二酚水溶液；然后每100mL对苯二酚水溶液加入10g大孔吸附树脂进行吸附，待树脂达到吸附平衡后进行过滤；最后用蒸馏水洗净树脂表面残留的对苯二酚；制得吸附量为0.1-1g对苯二酚/g树脂的固定化对苯二酚。

3.根据权利要求1或2所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的用于固定化对苯二酚的大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，弱极性大孔吸附树脂，中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（2）步骤中的种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成：双糖10-60份，蛋白胨1-10份，酵母粉1-10份，硫酸镁0.5-2份，磷酸氢二钾1-3份，氯化钠1-3份和水1000份。

5.根据权利要求1或4所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：种子液培养的工艺条件为培养温度为25-40℃，摇床转速为50-200r/min，发酵时间为10-24h；发酵液培养的工艺条件为种子液接种量为1-10％，培养温度为25-40℃，通风量为0.1-2vvm，搅拌转速为50-300r/min，发酵时间为10-24h；把培养后的发酵液进行微滤或离心即可获得菌体游离细胞。

6.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（3）步骤中的反应条件为：在一定体积的缓冲溶液中，游离细胞质量百分比浓度为5-20g/L，固定化了对苯二酚的大孔吸附树脂质量百分比浓度为10-100g/L，双糖的质量百分比浓度为5-720g/L，反应温度为20-50℃，搅拌转速为50-300r/min，反应时间为24-72h。

7.根据权利要求1或6所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，醋酸缓冲溶液，柠檬酸缓冲溶液，碳酸缓冲溶液，硼酸缓冲溶液，巴比妥酸缓冲溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。

8.根据权利要求1或6所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的双糖为蔗糖，麦芽糖或乳糖。

9.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（4）步骤中的游离细胞的使用寿命为5-10个周期，固定化对苯二酚的大孔吸附树脂的使用寿命为50-300个周期。

10.根据权利要求1所述的游离细胞催化固定化对苯二酚合成α-熊果苷的方法，其特征在于：所述的（5）步骤中的α-熊果苷的分离纯化包括以下三个步骤：

①将反应完成后的反应液进行过滤得到大孔吸附树脂，然后用蒸馏水把树脂表面的缓冲溶液洗干净；

②把经过①步骤的大孔吸附树脂用体积百分比浓度为1-90%的酒精进行洗脱，收集洗脱液；

③把经过②步骤的洗脱液进行真空浓缩，当浓缩到产品处于饱和状态时，放入温度为0-4℃条件下进行结晶，晶体经干燥后得到纯度为99.5％以上的α-熊果苷产品；真空浓缩温度为40-60℃，结晶时间为2-12h。