CN110904160B - 一种提高β-苯乙醇单位产量的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高β‑苯乙醇单位产量的发酵调控方法，以酵母为生产菌株，苯丙氨酸为底物，通过控制发酵工艺来调控β‑苯乙醇的生产。发酵初期，向发酵罐中添加油酸，萃取发酵罐中苯乙醇，发酵中期，监测发酵罐中苯乙醇、乙醇含量，当发现二者积累到一定浓度时，打开外循环装置，含菌发酵液通过固液分离装置及吸附装置，实现乙醇和/或β‑苯乙醇的吸附，解除两者对菌体的抑制及协同抑制作用。在打开外循环装置的同时，开始使用含蛋白酶的培养基进行补料调控，可有效抑制苯丙氨酸被用于合成蛋白而造成损失，有利于苯乙醇的有效合成。该方法通过原位分离、补料调控等工艺手段，显著提高了β‑苯乙醇的产量，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高β-苯乙醇单位产量的发酵方法。
背景技术
β-苯乙醇是一种具有玫瑰香气的芳香醇，存在于玫瑰、茉莉等多种植物精油中，也是葡萄酒、黄酒、啤酒和面包等多种发酵食品的天然风味物质，因此其在食品和日化用品等领域具有非常广泛的应用。此外其还有一定的抑菌作用，在医药卫生领域有重要应用。
工业上生产β-苯乙醇的方法有化学合成法和天然法。化学合成法的产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响了产品质量，极大限制了产品的使用。目前较为常用的手段为通过微生物来转化合成β-苯乙醇。但是与其它醇类物质一样，高浓度β-苯乙醇对微生物细胞有一定的毒性。此外，酵母在发酵中还副产乙醇，乙醇和β-苯乙醇联合作用产生的毒性会较大抑制苯乙醇的生产。所以在寻求提高β-苯乙醇产量的解决办法时，必须考虑到β-苯乙醇和乙醇对酵母的毒性。另外，底物苯丙氨酸能否被有效转化也是影响β-苯乙醇产量的一个重要因素。
目前大多数发酵工艺只考虑到β-苯乙醇的毒性，尝试用各种方法将β-苯乙醇的抑制作用解除。如CN106631696A中采用被覆聚合物的大孔SiO2作为吸附剂来吸附苯乙醇，使得发酵液中苯乙醇浓度达到0.4-0.4g/kg。CN101157940A采用油酸萃取与生物转化耦合制备苯乙醇，苯乙醇产量有所提升，但未考虑到发酵罐内能够添加的油酸含量有限，因而萃取能力有限，无法达到更高的产量及实现长周期运行。较少有专利针对乙醇毒性问题的改善方法。CN102392055A选取可氧化降解乙醇的活性干酵母来生产苯乙醇，发酵过程中该活性干酵母以乙醇为唯一碳源，解决了发酵液中高浓度乙醇的抑制作用，但是目前大多数生物转化产β-苯乙醇的方法均是采用葡萄糖、蔗糖等糖类物质，能够利用乙醇做碳源的菌株较为罕见，且发酵过程中对乙醇浓度的控制要求较高，需控制其在可以被利用而不产生抑制的范围内，此外，底物转化率也未知。
综上，目前公开的β-苯乙醇发酵制备方法没有合理考虑β-苯乙醇、乙醇抑制作用及底物的有效转化的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高β-苯乙醇单位产量的发酵方法，该方法的发酵调控工艺通过在发酵不同阶段分别采用油酸萃取及树脂吸附来解除苯乙醇、乙醇的抑制作用，并通过添加蛋白酶来减少苯丙氨酸被用于合成蛋白而造成的损失，提高底物的利用率，从而有效提高了β-苯乙醇的产量，有利于工业化生产。
为实现上述发明目的和达到上述技术效果，本发明采用的技术方案如下：
一种提高β-苯乙醇单位产量的β-苯乙醇发酵方法，该方法解除乙醇和β-苯乙醇对生产菌株的抑制作用，包含三个步骤：
(1)发酵：以酵母为生产菌株，在发酵罐内添加油酸，调控工艺参数进行发酵；
(2)吸附分离：进行外循环，分离发酵液菌体，将菌体泵回发酵罐，滤液经过吸附装置吸附乙醇和/或β-苯乙醇，然后将滤液泵回发酵罐继续发酵；
(3)脱附：吸附柱达到饱和后，洗脱吸附柱，收集洗脱液。
上述方法在发酵初期采用油酸萃取来解除苯乙醇的抑制作用，保证菌体生长在处于潜伏期或对数生长期前期时，发酵处于一个相对稳定的状态，不会受外接装置的干扰；当发酵罐内油酸萃取效率下降时，菌体生长也达到了对数生长中后期，积累了一定浓度，根据罐内苯乙醇、乙醇浓度来选择对应吸附装置，来达到解除抑制作用的目的。同时，当菌体浓度积累到一定量后，一部分培养基苯丙氨酸会被用于合成蛋白而损失掉，通过在补料培养基中添加蛋白酶来抑制蛋白合成，从而使得苯丙氨酸被有效用于合成产物，从而提高β-苯乙醇产量。此外，添加油酸、二级吸附装置除了解决了β-苯乙醇的抑制作用之外，还实现了产物的分离作用，提高了分离效率。
本发明中，发酵及分离工艺流程参见附图1，其中发酵设备用于菌体培养及β-苯乙醇的合成、其后连接分离菌体装置将酵母与发酵清液分离，在分离装置之后连接两级吸附装置，用于选择吸附乙醇和/或β-苯乙醇，其中乙醇吸附装置后连接冷凝装置与真空泵用于乙醇的脱附，装置均为本领域常用的其它公知的设备。
本发明中，步骤(1)所述酵母为马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母中的一种或多种。
本发明中，步骤(1)所述接种量为初始总发酵体积的5％-40％。
本发明中，步骤(1)所述油酸添加量为初始总发酵体积的10％-50％。
本发明中，在连续生产过程中不移除步骤(1)加入的油酸，也不对油酸中的萃取物进行处理。
本发明中，步骤(1)所述调控工艺参数包含调控温度为25-37℃，pH为3.5-6.5，通风保持在0.5-4vvm。
本发明中，步骤(1)所述发酵罐内含有底物苯丙氨酸。
本发明中，步骤(2)在发酵中期监测发酵液中β-苯乙醇和乙醇含量，当二者积累到一定浓度时，打开外循环装置，此时发酵液中乙醇含量达到3-50g/L和/或β-苯乙醇含量达到2-5.5g/L。
本发明中，步骤(2)发酵液中菌体的分离手段为板框过滤、离心分离和膜过滤中的一种或多种。
本发明中，步骤(2)发酵液从发酵罐进入分离设备的流速为0.5-10倍总发酵体积/h。
本发明中，步骤(2)所述吸附装置为一级吸附装置和/或二级吸附装置，其中一级吸附装置吸附乙醇、二级吸附装置吸附β-苯乙醇；
本发明中，步骤(2)所述滤液进入吸附装置的流速与发酵液进入分离设备的流速一致。
本发明中，步骤(2)所述一级吸附装置的吸附剂为弱酸性离子交换树脂。
本发明中，步骤(2)所述一级吸附装置离子交换树脂吸附剂的质量全交换容量大于等于2mmol/g。
本发明中，步骤(2)所述二级吸附装置的吸附剂为大孔树脂。
本发明中，步骤(2)所述二级吸附装置吸附剂大孔树脂的比表面积为800-1000m2/g。
本发明中，步骤(2)中打开外循环后对发酵罐中的培养基进行补料调控，补料培养基中包含常规碳源、氮源及无机盐。补料调控可有效抑制培养基苯丙氨酸被用于合成蛋白而造成损失，有利于β-苯乙醇的有效合成。
本发明中，步骤(2)所述的补料速度为0.05-0.5倍总发酵体积/h。
本发明中，步骤(2)补料所用的培养基含有蛋白酶。
本发明中，步骤(2)所述蛋白酶为酸性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A和中性蛋白酶中的一种或多种，优选为含有羧肽酶A的多种蛋白酶，更优选为含有羧肽酶A、以及胃蛋白酶和/或糜蛋白酶。
本发明中，步骤(2)所述蛋白酶的添加量为0.1％-5％，以补料罐内补料培养基体积计。
本发明中，步骤(3)所述洗脱方法中，一级吸附装置洗脱时采用热蒸汽加热吸附柱，使柱内充满蒸汽，再抽真空将乙醇蒸汽冷凝脱附收集。
本发明中，步骤(3)一级吸附装置洗脱时的所述蒸汽温度50-100℃，蒸汽通入时间0.1-3h。
本发明中，步骤(3)所述洗脱方法中，二级吸附装置洗脱时，先用蒸馏水清洗柱床，然后采用有机溶剂洗脱。
本发明中，步骤(3)所述二级吸附装置洗脱溶剂为乙酸乙酯、甲醇、乙醇和乙酸丁酯中的一种或多种。
本发明的另一目的在于提供一种发酵方法制备的β-苯乙醇。
一种采用上述提高β-苯乙醇单位产量的发酵方法制备的β-苯乙醇。
本发明的有益效果在于：
(1)在发酵初期，菌体生长还处于迟缓期或刚达到对数生长期时，如果连接外循环装置脱除β-苯乙醇，会对发酵罐内菌体生长产生较大扰动，而本发明采用向发酵罐内添加一定量油酸的工艺，既不会扰动菌体的稳定生长，又解决了发酵初期菌体数量较少时β-苯乙醇对菌体生长的抑制作用；
(2)本发明中当菌体生长达到对数生长的中后期时，油酸萃取效率下降，此时开启吸附装置将发酵过程中的乙醇和β-苯乙醇适时移出，解决发酵中后期了它们对菌体生长生产β-苯乙醇的抑制作用，从而提高了生产能力，单位体积产量可达15g/L以上；
(3)本发明在打开外循环时采用含蛋白酶培养基进行补料工艺调控，蛋白酶的加入可有效抑制苯丙氨酸被用于合成蛋白质，从而减少底物损失，维持发酵过程稳定；
(4)本发明的方法可实现装置的长周期运转，减少了种子液培养制备过程及繁琐的灭菌操作，简化了生产工艺。
附图说明
图1为本发明发酵方法的工艺流程示意图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例仅用于示例的目的，不构成对本发明的任何限制。
菌种为酵母，其中马克斯克鲁维酵母购自广东微生物研究所，编号为GIM2.119，酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司，商品名为安琪活性干酵母，解脂耶氏酵母购自中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC，编号为CGMCC2.1305。所用试剂油酸购自科密欧，纯度AR。所采用蛋白酶均购自诺维信。
发酵培养：
发酵培养经过平板培养、种子培养、发酵罐培养三步：
平板培养：将酵母接种于平面培养基，获得平面培养菌种，平面培养基为固体YPD培养基，即酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，置于生物培养箱(上海智诚)中25-37℃培养15-24h；
种子培养：从上述平板中挑取一环菌种接种到种子培养基中，培养基为基础YPD培养基，即酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，置于摇床(infors摇床)中25-37℃培养15-24h；
发酵培养：将上述培养的种子液按接种量5％-40％(以总发酵体积计)接入发酵罐内培养，发酵培养基为碳源20-90g/L、氮源1-10g/L、钾盐0.2-8g/L、同时适当添加常规微量元素。发酵培养所用发酵罐为infors 10L罐。
苯乙醇浓度检测采用高效液相色谱法，仪器为岛津2030C，色谱柱：Zorbax SB-aQ(5μm，3.0×150mm)，柱温：35℃，流动相甲醇/水(体积比1:1)，流速：1.0mL/min，进样量10μL。
乙醇浓度检测采用气相色谱法，仪器为安捷伦7890B，色谱柱为毛细管柱，载气为氮气，流速为1.5mL/min，柱温初始温度50℃保持2min，然后以10℃/min升温至80℃，再以20℃/min升温至240℃，保持5min，FID检测器，进样量1μL。
实施例1
发酵步骤：
以酿酒酵母为菌种，经活化后按10％(以总发酵体积计)接种量接种于含1.9L发酵培养基(总发酵体积2L)的发酵罐中，向发酵罐内添加初始总发酵体积10％的油酸，发酵过程中控制温度为25℃，pH为5.5，通风4vvm。
吸附分离步骤：
实时监测发酵罐中乙醇、苯乙醇含量，发酵20h后，测得乙醇含量在5g/L，苯乙醇含量在1g/L，打开外循环装置将发酵液泵出发酵罐，发酵液出罐流速为20L/h(10倍总发酵体积/h)。
发酵液经过离心分离得到发酵清液，离心分离条件为转速8000rpm，离心10min，分离获得的酵母返回发酵罐。
打开一级吸附装置的开关，发酵清液以0.5L/h通过装有IRC50树脂(质量全交换容量大于等于3mmol/g，Rohm—Hass)的吸附柱，乙醇被选择性吸附，将不含乙醇的流出液泵回到发酵罐中继续发酵。
此时的补料培养基中有总含量0.1％中性蛋白酶、羧肽酶A混合物。两种酶的比例为1:1。补料速率为0.1L/h(0.05倍总发酵体积/h)。
脱附步骤：
吸附30h后，吸附达到饱和，排净吸附柱内液体，通入50℃热蒸汽，3h后关闭热蒸汽，打开真空泵抽真空对吸附的乙醇进行脱附，乙醇蒸汽经冷凝形成液体被收集。
经高效液相色谱检测，发酵48h时，累计单位体积产量可达15.5g/L。
实施例2
发酵步骤：
以酿酒酵母为菌种，经活化后按20％(以总发酵体积计)接种量接种于含4L发酵培养基(总发酵体积5L)的发酵罐中，向发酵罐内添加初始总发酵体积30％的油酸，发酵过程中控制温度为30℃，pH为3.5，通风1vvm。
吸附分离步骤：
实时监测发酵罐中乙醇、苯乙醇含量，发酵24h后，测得乙醇含量在1g/L，苯乙醇含量在2g/L，打开外循环装置将发酵液泵出发酵罐，发酵液出罐流速为5L/h(1倍总发酵体积/h)。
将发酵液经过板框过滤分离得到发酵清液，板框过滤分离条件为操作压力0.2mPa(表压)，分离获得的酵母返回发酵罐。
打开二级吸附装置的开关，发酵清液以5L/h通过装有H103树脂(比表面积900m2/g，南开大学化工厂)的吸附柱，β-苯乙醇被选择性吸附，不含β-苯乙醇的流出液泵回到发酵罐中继续发酵。
此时的补料培养基中有总含量1％的酸性蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶A混合物，三种酶的比例为1:1:2，补料流速为1L/h(0.2倍总发酵体积/h)。
脱附步骤：
吸附20h后，吸附达到饱和，排净吸附饱和的吸附柱内液体，用蒸馏水清洗整个柱床，采用乙酸乙酯进行脱附，收集得到β-苯乙醇洗脱液。
经高效液相色谱检测，发酵48h后，苯乙醇累计单位体积产量可达30g/L。
实施例3
发酵步骤：以马克斯克鲁维酵母为菌种，经活化后按5％(以总发酵体积计)接种量接种于含5.7L发酵培养基(总发酵体积6L)的发酵罐中，向发酵罐内添加初始总发酵体积20％的油酸，发酵过程中控制温度为35℃，pH为6.5，通风3vvm。
吸附分离步骤：
实时监测发酵罐中乙醇、苯乙醇含量，发酵30h后，测得乙醇含量在50g/L，苯乙醇含量在2.5g/L，打开外循环装置将发酵液泵出发酵罐，发酵液出罐流速为3L/h(0.5倍总发酵体积/h)。
发酵液经过离心分离得到发酵清液，离心分离条件为转速8000rpm，离心10min，分离获得的酵母返回发酵罐。
依次打开一级、二级吸附装置的开关，发酵清液以3L/h先后通过装有HD-1树脂(质量全交换容量大于等于4mmol/g，上海华震)、SP825树脂的(比表面积1000m2/g，日本三菱化成)吸附柱，不含乙醇、β-苯乙醇的流出液泵回到发酵罐中继续发酵。
此时的补料培养基中有总含量5％的胃蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶A，三种酶的比例为2:1:2。补料流速为0.6L/h(0.1倍总发酵体积/h)。
脱附步骤：
吸附10h后，吸附饱和后，对吸附柱进行洗脱，一级吸附柱的洗脱：排净吸附柱内液体，通入70℃热蒸汽，1h后关闭热蒸汽，打开真空泵抽真空对吸附的乙醇进行脱附，乙醇蒸汽经冷凝形成液体被收集。二级吸附柱的洗脱：排净吸附柱内液体，用蒸馏水清洗整个柱床，采用一级吸附装置收集到的乙醇进行脱附，收集得到β-苯乙醇洗脱液。经高效液相色谱检测，发酵48h时，累计单位体积产量可达20g/L。
实施例4
发酵步骤：
以解脂耶氏酵母为菌种，经活化后按40％(以总发酵体积计)接种量接种于含2.4L发酵培养基(初始总发酵体积4L)发酵罐中，向发酵罐内添加培养基体积50％的油酸，发酵过程中控制温度为32℃，pH为5，通风2vvm。
吸附分离：
实时监测发酵罐中乙醇、苯乙醇含量，发酵30h后，测得乙醇含量在30g/L，苯乙醇含量在0.5g/L，打开外循环装置将发酵液泵出发酵罐，发酵液出罐流速为2L/h(0.5倍总发酵体积/h)。
发酵液经过膜过滤装置得到发酵清液，膜过滤条件为0.2Mpa操作压力，50nm-200nm管式膜，20L/H过滤流速，分离获得的酵母返回发酵罐。
打开一级吸附装置的开关，发酵清液以2L/h通过装有HD-1树脂的(质量全交换容量大于等于4mmol/g，上海华震)吸附柱，乙醇被选择性吸附，不含乙醇的流出液泵回到发酵罐中继续发酵。
此时的补料培养基中有总含量2％的糜蛋白酶、羧肽酶A混合物，二者的比例为1:1。补料的流速为2L/h(0.5倍总发酵体积/h)。脱附步骤：
吸附15h后，对吸附饱和的吸附柱进行洗脱，排净吸附柱内液体，通入100℃热蒸汽，0.1h后关闭热蒸汽，打开真空泵抽真空对吸附的乙醇进行脱附，乙醇蒸汽经冷凝形成液体被收集。
经高效液相色谱检测，发酵48h时，β-苯乙醇累计单位体积产量可达25g/L。
实施例5
发酵步骤：
以马克斯克鲁维酵母为菌种，经活化后以30％(以总发酵体积计)接种量接种于含2.1L(总发酵体积3L)发酵罐中，向发酵罐内添加培养基体积25％的油酸，发酵过程中控制温度为37℃，pH为4.5，通风0.5vvm。
吸附分离：
实时监测发酵罐中乙醇、苯乙醇含量，发酵40h后，测得乙醇含量在3g/L，苯乙醇含量在5.5g/L，打开外循环装置将发酵液泵出发酵罐，发酵液出罐流速为3L/h(1倍总发酵体积/h)。
将发酵液经过膜过滤装置得到发酵清液，膜过滤条件为0.2Mpa操作压力，50nm-200nm管式膜，15L/H过滤流速，分离获得的酵母返回发酵罐。
依次打开一级、二级吸附装置的开关，发酵清液以2L/h先后通过两根装有IRC50树脂(质量全交换容量大于等于3mmol/g，Rohm—Hass)及SP850树脂(比表面积1000m2/g，日本三菱化成)的吸附柱，不含乙醇、β-苯乙醇的流出液泵回到发酵罐罐中继续发酵，
此时的补料培养基中有总含量3％的胃蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A混合物，三者比例为1:1:1，补料速度为0.9L/h(0.3倍总发酵体积/h)。
脱附步骤：
吸附一定时间后，吸附达到饱和。对吸附饱和的吸附柱进行洗脱，一级吸附柱的洗脱：排净吸附柱内液体，通入90℃热蒸汽，2h后关闭热蒸汽，打开真空泵抽真空对吸附的乙醇进行脱附，乙醇蒸汽经冷凝形成液体被收集。二级吸附柱的洗脱：排净吸附柱内液体，用蒸馏水清洗整个柱床，采用乙酸丁酯进行脱附，收集得到β-苯乙醇洗脱液经高效液相色谱检测，发酵48h后，β-苯乙醇累计单位体积产量可达40g/L。
对比例1
本对比例不加油酸，其它工艺与实施例1相同。
以酿酒酵母为菌种，经活化后按10％(以总发酵体积计)接种量接种于含1.9L发酵培养基(总发酵体积2L)的发酵罐中，发酵过程中控制温度为25℃，pH为5.5，通风4vvm，发酵48h后，停止发酵，检测发酵罐中β-苯乙醇、乙醇含量，得到苯乙醇累计产量在3.5g/L。
对比例2
本对比例为只添加油酸萃取的方法，其它条件与实施例3近似。
以马克斯克鲁维酵母为菌种，经活化后按5％(以总发酵体积计)接种量接种于含5.7L发酵培养基(总发酵体积6L)的发酵罐中，向发酵罐内添加培养基体积20％的油酸，发酵过程中控制温度为35℃，pH为6.5，通风3vvm。发酵48h后，停止发酵，检测发酵罐中β-苯乙醇、乙醇含量，得到苯乙醇累计产量在6g/L。
可见与常规发酵过程中对比，本发明所述的一种提高β-苯乙醇单位产量的发酵调控工艺，采用油酸萃取、发酵耦合原位分离装置的方法解决了乙醇、β-苯乙醇对产物的抑制作用，通过添加蛋白酶提高底物苯丙氨酸的利用率，该工艺可明显提高发酵生产效率，且可以长周期运行，简化了发酵前期的工艺流程，节约了时间成本。
Claims (23)
1.一种提高β-苯乙醇单位产量的β-苯乙醇发酵方法，其特征在于，该方法解除乙醇和β-苯乙醇对生产菌株的抑制作用，方法包含三个步骤：
(1)发酵：以酵母为生产菌株，在发酵罐内添加油酸，调控工艺参数进行发酵；
(2)吸附分离：发酵液中乙醇含量达到3-50g/L或β-苯乙醇含量达到2-5.5g/L时，开始进行外循环，分离发酵液菌体，将菌体泵回发酵罐，滤液经过吸附装置吸附乙醇和β-苯乙醇，然后将滤液泵回发酵罐继续发酵；
(3)脱附：吸附柱达到饱和后，洗脱吸附柱，收集洗脱液；
在连续生产过程中不移除步骤(1)加入的油酸，也不对油酸中的萃取物进行处理；
步骤(2)中打开外循环后对发酵罐中的培养基进行补料调控；补料所用的培养基含有蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述酵母为马克斯克鲁维酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述酵母接种量为初始总发酵体积的5％-40％。
4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述油酸添加量为初始总发酵体积的10％-50％。
5.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)所述调控工艺参数包含调控温度为25-37℃，pH为3.5-6.5，通风保持在0.5-4vvm。
6.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)发酵液中菌体的分离手段为板框过滤、离心分离和膜过滤中的一种或多种。
7.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)发酵液从发酵罐进入分离设备的流速为0.5-10倍总发酵体积/h。
8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述吸附装置为一级吸附装置和二级吸附装置，其中一级吸附装置吸附乙醇、二级吸附装置吸附β-苯乙醇。
9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)所述吸附装置为一级吸附装置或二级吸附装置，其中一级吸附装置吸附乙醇、二级吸附装置吸附β-苯乙醇。
10.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，所述一级吸附装置的吸附剂为弱酸性离子交换树脂。
11.根据权利要求10所述的发酵方法，其特征在于，所述一级吸附装置离子交换树脂吸附剂的质量全交换容量大于等于2mmol/g。
12.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，所述二级吸附装置的吸附剂为大孔树脂。
13.根据权利要求12所述的发酵方法，其特征在于，所述二级吸附装置吸附剂大孔树脂的比表面积为800-1000m2/g。
14.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述滤液进入吸附装置的流速与发酵液进入分离设备的流速一致。
15.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述蛋白酶为酸性蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A和中性蛋白酶中的一种或多种。
16.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述蛋白酶的添加量为0.1％-5％，以补料罐内补料培养基体积计。
17.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述的补料速率为0.05-0.5倍总发酵体积/h。
18.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述蛋白酶为含有羧肽酶A的多种蛋白酶。
19.根据权利要求18所述的发酵方法，其特征在于，所述蛋白酶含有羧肽酶A、以及胃蛋白酶和/或糜蛋白酶。
20.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)所述洗脱方法中，一级吸附装置洗脱时采用热蒸汽加热吸附柱，使柱内充满蒸汽，再抽真空将乙醇蒸汽冷凝脱附收集。
21.根据权利要求20所述的发酵方法，其特征在于，所述一级吸附装置洗脱时的蒸汽温度50-100℃，蒸汽通入时间0.1-3h。
22.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，所述洗脱方法中，二级吸附装置洗脱时，先用蒸馏水清洗柱床，然后采用有机溶剂洗脱。
23.根据权利要求22所述的发酵方法，其特征在于，所述二级吸附装置洗脱溶剂为乙酸乙酯、甲醇、乙醇和乙酸丁酯中的一种或多种。
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| PB01 | Publication | ||
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