CN102392055A

CN102392055A - 一种2-苯乙醇的制备方法

Info

Publication number: CN102392055A
Application number: CN2011103246692A
Authority: CN
Inventors: 荣绍丰; 丁保妹; 管世敏; 陈奕涵; 张晓丽
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2011-10-24
Filing date: 2011-10-24
Publication date: 2012-03-28

Abstract

本发明公开了一种2-苯乙醇的制备方法。即通过选取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以L-苯丙氨酸为底物，以乙醇为唯一碳源进行发酵生产2-苯乙醇。发酵过程控制温度为25～38℃，转速为100～800rpm/min，时间15～60h，乙醇初始浓度2～30g/L，发酵结束后产物2-苯乙醇浓度可达到0.68～3.81g/L。本发明通过活性干酵母氧化降解乙醇并进一步转化为2-苯乙醇，克服了发酵液中高浓度乙醇对产物2-苯乙醇合成的抑制，又降低了生物转化过程染菌的可能性，也降低了2-苯乙醇发酵液中有机杂质的含量，显著提高了碳源的利用率，同时本发明的制备方法具有操作方便，生产成本低，工业化应用前景广等特点。

Description

一种2-苯乙醇的制备方法

技术领域

本发明涉及一种2-苯乙醇的生物制备方法。

背景技术

2-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE）,又名β-苯乙醇、二苯基乙醇，是一种具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅细腻，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、饼干、葡萄酒等食品中的风味物质，该物质在碱性环境以及对空气的氧化作用稳定，其衍生酯类物质，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香产品。由于2-苯乙醇香气轻柔甜和，不仅是所有玫瑰香型香气的基本组分，还具有协同增效作用，是多种香型配方所需成分。目前2-苯乙醇为第二大香料产品，其用量仅次于香兰素，广泛应用于食品、烟草、化妆品和洗涤日化用品中。

目前生物转化2-苯乙醇的前体为发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸，碳源一般采用常见的葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖类物质，由于葡萄糖、蔗糖等代谢产生大量乙醇，从而对2-苯乙醇的生物转化产生明显的抑制和毒害，研究表明除了单独存在的乙醇对2-苯乙醇生物合成产生抑制外，乙醇与2-苯乙醇同时存在于生物转化体系中时，对产物2-苯乙醇的协同抑制更加显著，最终导致2-苯乙醇的产率较低。发酵结束时包括乙醇在内的副产物含量达30%-70%，发酵液中残留的乙醇副产物含量较高，一般达到10g/L以上，糖类物质为碳源对产物2-苯乙醇生成的利用效率（以下以Y_2-PE/sugar表示）较低，如以葡萄糖作为碳源，Y _2-PE/Glucose一般低于0.1（g/g)。

发明内容

本发明为解决上述的技术问题而提供了一种以乙醇替代葡萄糖等糖类物质发酵生产2-苯乙醇的方法。即通过选取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以L-苯丙氨酸为底物，以乙醇为唯一碳源发酵生产2-苯乙醇。发酵过程控制温度为25～38℃，时间15～60h，乙醇初始浓度2～30g/L，发酵结束后2-苯乙醇浓度可达到0.68～3.81g/L。同时发酵过程产生的副产物种类和浓度明显降低，碳源的利用率明显提高。

本发明的技术方案

一种2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：

（1）、将活性干酵母接入到发酵培养基，控制发酵过程的温度为25～38℃，发转速为100～800rpm/min，时间为15～60h，发酵结束；

当使用摇瓶发酵时，转速100～300rpm/min；

当使用发酵罐发酵时，转速100～800rpm/min，且采用发酵罐进行生产时，发酵过程通入的空气量按照通气速率比发酵液体积为0.3～1.5V/Vmin；

所述的高活性干酵母包括安琪耐高糖型高活性干酵母、丹宝利高活性干酵母或番禺梅山-马利高活性干酵母等具备氧化降解乙醇能力的酵母。

所述活性干酵母接入发酵培养基的量按其与发酵培养基的重量体积比计算，即活性干酵母：发酵培养基为0.5～3.0%（W/V）；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为：L-苯丙氨酸5～30g，乙醇2～30g，K₂HPO_4·3H₂O 0.3～1.5g，MgSO_4·7H₂O 0.1～1.5g，NaCl 0.5～1g，余量为水，pH自然；

（2）、分离纯化

步骤（1）发酵结束后所得的发酵液先以4000～5000r/min离心，去除菌体后的上清液中加入活性碳进行吸附，吸附0.5～1.5h达到平衡，然后用洗脱剂对活性碳进行洗脱或解吸，采用1MNaOH或HCl将洗脱液或解吸液的pH控制在3.5～10.0；对洗脱液进行检测，直到2-苯乙醇的含量低于0.1g/L，洗脱后的洗脱液或解吸液再依次经常压、减压蒸馏和精馏，收集115℃馏分，最终得到2-苯乙醇；

所用的活性炭为颗粒活性炭，粒度0.5-4mm，加入的活性炭的量按每升发酵液16~50g计算；

所述的洗脱剂为无水乙醇或95%（V/V)的乙醇;

所述的常压蒸馏温度控制在80℃；

所述的减压蒸馏过程控制压力为-0.01~-0.05MPa，温度为78～160℃；

所述的精馏过程控制压力-0.05—-0.09MPa。

本发明的有益效果

本发明的一种2-苯乙醇的制备方法，采用乙醇作为葡萄糖、蔗糖等碳源的替代物，通过乙醇的氧化降解，提供艾氏途径所需的还原力NADH，从而推动2-苯乙醇的顺利合成。由此，可从源头解除由葡萄糖、蔗糖等糖类物质代谢蓄积的乙醇对2-苯乙醇转化产生的抑制，最终发酵液中2-苯乙醇的产率达0.68～3.81g/L。

此外，本发明采用乙醇为碳源时，发酵结束后发酵液中副产物的含量为7.8%～15.2%，残留的乙醇浓度为0~2.58g/L，相较以蔗糖、葡萄糖等为碳源时，发酵结束后，显著降低了发酵液中副产物的含量，使得碳源的利用率得到了提高，Y _2-PE/Ethanol介于0.11～0.34（g/g）之间。

同时，本发明的一种2-苯乙醇的制备方法，采用活性干酵母进行生物转化生产2-苯乙醇，代替了传统的菌种培养发酵方式，减少了酵母菌生长繁殖的过程，使得发酵过程更易于控制又降低了发酵过程染菌的可能性，操作方便，生产成本低，工业化应用前景广阔。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步详细描述，但本发明的保护范围不局限于此。

发酵液中2-苯乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法（HPLC）分析（Shaofeng Rong, Baomei Ding, Xiaoli Zhang, Xuesong Zheng, Yifei Wang. Enhanced Biotransformation of 2-Phenylethanol with Ethanol Oxidation in a Solid–Liquid Two-Phase System by Active Dry Yeast [J]. Curr Microbiol, 2011, 63: 503-509），具体如下：将发酵液样品进行离心，4000rpm/min，离心后的上清液再用0.45μm 微孔滤膜过滤处理，滤液立即上Agilent 1100型高效液相色谱仪(Agilent Technologies, Ltd, USA）分析，色谱柱为C18柱(Dikma DiamonsilC18，250mm×4.6mm,5μm），DAD检测器，检测波长260nm，柱温30℃，流动相为甲醇：水＝60∶40（v/v），流动相流速1mL/min，进样10μL，外标法定量。

发酵液中乙醇的测定方法，采用5890A气相色谱仪(Agilent Technologies, Ltd, USA)分析（参考文献同上），GC条件为：色谱柱 19091J-413 HP-5 30m×0.32mm×0.25μm；进样量1 μL；进样口温度250℃；检测器温度：250℃；程序升温过程：柱温30℃保持3min，再以20℃/min升至280℃保持5min。

实施例1

本实施例所用的高活性干酵母为市售安琪耐高糖型高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，商品名“安琪高活性干酵母”。

一种2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：

（1）、将0.25g的高活性干酵母接入到含有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，控制发酵过程的温度为25℃，转速为100rpm/min，时间为15h，发酵结束；

所述活性干酵母粉接入发酵培养基的量按其与发酵培养基的重量体积比计算，即活性干酵母：发酵培养基为0.5%（W/V）；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸5g，乙醇2g，K₂HPO_4·3H₂O 0.3g，MgSO_4·7H₂O 0.1g，NaCl 0.5g，余量为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行2-苯乙醇含量的检测，经过HPLC分析，发酵液中的2-苯乙醇的浓度为0.68g/L；

取步骤（1）发酵结束后发酵结束后所得的发酵液进行乙醇含量的检测，经过GC分析，消耗的乙醇浓度为2g/L，发酵液中几乎没有乙醇剩余，Y _2-PE/Ethanol为0.34（g/g）；杂质含量为7.79%。

（2）、分离纯化

将步骤（1）发酵结束后所得到的发酵液以4000rpm/min离心，去除菌体后加入0.82g活性碳（粒度0.5mm）进行震摇吸附0.5h后将活性碳滤出，用去离子水洗涤2次，然后将获得的活性碳抽滤，抽滤后的活性碳加入到装有50mL无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，摇瓶速度50rpm/min，时间2h，振摇结束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的浓度为0.65g/L。

实施例2

本实施例所用的高活性干酵母为丹宝利高活性干酵母，广州丹宝利酵母有限公司，商品名“丹宝利高活性干酵母”。

一种2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：

（1）、将1.5g的高活性干酵母接入到50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，控制发酵过程的温度为38℃，转速为300rpm/min，时间为60h，发酵结束；

所述活性干酵母粉接入发酵培养基的量按其与发酵培养基的重量体积比计算，即活性干酵母：发酵培养基为3%（W/V）；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸30g，乙醇30g，K₂HPO_4·3H₂O 1.5g，MgSO_4·7H₂O 1.5g，NaCl 1g，余量为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行2-苯乙醇含量的检测，经过HPLC分析，发酵液中的2-苯乙醇的浓度为3.21g/L；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行乙醇含量的检测，经过GC分析，消耗的乙醇浓度为28.52g/L，发酵液中剩余的乙醇浓度为1.48g/L，Y _2-PE/Ethanol为0.11（g/g）；杂质含量为15.21%。

（2）、分离纯化

将步骤（1）发酵结束后所得到的发酵液以5000rpm/min离心，去除菌体后加入2.53g活性碳（粒度0.5mm）进行振摇吸附1h后将活性碳滤出，用去离子水洗涤2次，然后将获得的活性碳抽滤，抽滤后的活性碳加入到装有50mL无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，摇瓶速度100rpm/min，时间4h，振摇结束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的浓度为3.15g/L。

实施例3

本实施例所用的高活性干酵母为番禺梅山-马利即发高活性干酵母，番禺梅山-马利酵母有限公司，商品名“梅山即发干酵母”。

一种2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：

（1）、将0.6g的高活性干酵母接入到50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，控制发酵过程的温度为36℃，转速为200rpm/min，时间为48h，发酵结束；

所述活性干酵母粉接入发酵培养基的量按其与发酵培养基的重量体积比计算，即活性干酵母：发酵培养基为1.2%（W/V）；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸10g，乙醇20g，K₂HPO_4·3H₂O 1g，MgSO_4·7H₂O 1.5g，NaCl 0.75g，余量为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行2-苯乙醇含量的检测，经过HPLC分析，发酵液中的2-苯乙醇的浓度为3.52g/L；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行乙醇含量的检测，经过GC分析，消耗的乙醇浓度为18.02g/L，发酵液中剩余的乙醇浓度为1.98g/L，Y _2-PE/Ethanol为0.2（g/g）；杂质含量为10.31%。

（2）、分离纯化

将步骤（1）发酵结束后所得到的发酵液以4000rpm/min离心，去除菌体后加入2.42g活性碳（粒度2mm）进行振摇吸附1h后将活性碳滤出，用去离子水洗涤2次，然后将获得的活性碳抽滤，抽滤后的活性碳加入到装有50mL无水乙醇的摇瓶中振摇解吸，摇瓶速度100rpm/min，时间3h，振摇结束后采用HPLC分析，解吸液中2-苯乙醇的浓度为3.35g/L。

实施例4

一种2-苯乙醇的制备方法，包括下列步骤：

（1）、将52.5g的活性干酵母接入到装有3.5L发酵培养基的5L机械搅拌发酵罐（NBS BIOFLO 3000）中，控制发酵过程的温度为36℃，转速为300rpm/min，通入空气量按照通气速率比发酵液体积为1 V/V·min，时间为48h，发酵结束；

所述活性干酵母粉接入发酵培养基的量按其与发酵培养基的重量体积比计算，即活性干酵母：发酵培养基为1.5%（W/V）；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸8g，乙醇20g，K₂HPO_4·3H₂O 0.75g，MgSO_4·7H₂O 0.5g，NaCl 1g，余量为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行2-苯乙醇含量的检测，经过HPLC分析，发酵液中的2-苯乙醇的浓度为3.81g/L；

取步骤（1）发酵结束后所得的发酵液进行乙醇含量的检测，经过GC分析，消耗的乙醇浓度为17.42g/L，发酵液中剩余的乙醇浓度为2.58g/L，Y _2-PE/Ethanol为0.22（g/g）；杂质含量为8.31%。

（2）、分离纯化

将步骤（1）发酵结束后所得到的3.5L发酵液以4000rpm/min离心，去除菌体后加入150g活性碳（粒度4mm）进行搅拌吸附1.5h，温度25℃，再用0.3mm的筛网过滤出活性碳，用去离子水洗涤3次，将活性碳抽滤；

将所述抽滤后的活性碳装柱，柱内径3.5cm，柱高65cm，柱体积580ml,采用95%乙醇洗脱，流速2.0ml/min，当乙醇洗脱收集液为1.8L时，取柱下端流出液样进行HPLC分析，至柱下端流出液中2-苯乙醇的浓度为0.08 g/L，结束洗脱；

将所述收集的1.8L洗脱液摇匀，取样进行HPLC分析，洗脱液中2-苯乙醇的浓度为6.91 g/L，换算为发酵液2-苯乙醇的终浓度为3.55g/L。

将收集到的1.8L洗脱液进行常压蒸馏，蒸馏温度80℃，蒸馏浓缩到约400ml时，蒸馏瓶内壁可见少量粘稠物附着，将浓缩液转入另外一个2L烧瓶中，取样按本发明实施例1的方法进行HPLC分析，2-苯乙醇浓度为31.28g/L，继续常压蒸馏，直到蒸馏塔顶温度达到95℃，停止常压蒸馏；

将所述常压蒸馏所得的浓缩液56ml进行下一步的减压蒸馏，采用油泵对蒸馏釜内抽真空，控制真空度-0.01MPa以下，蒸馏温度从80℃缓慢升温，到130℃基本粗蒸完毕，获得蒸馏粗品液为21ml，采用HPLC分析蒸馏粗品中2-苯乙醇浓度为590.28g/L，所述蒸馏粗品液准备进行精馏操作；

将待精馏粗品进料后，油泵预真空，先将表压力降至-0.05MPa以下，缓慢升高蒸馏釜温度，先将粗品中少量水蒸出，连续抽真空，压力可至-0.09MPa，收集115℃馏分。按所述气相分析方法，产品纯度99.5%。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于通过选取可氧化降解乙醇的活性干酵母，以L-苯丙氨酸为底物，以乙醇为唯一碳源进行发酵生产2-苯乙醇。

2.如权利要求1所述2-苯乙醇的制备方法，其特征在于所述的可氧化降解乙醇的活性干酵母为安琪耐高糖型高活性干酵母、丹宝利高活性干酵母或番禺梅山-马利高活性干酵母。

3.如权利要求1或2所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于具体包括下列步骤：

（1）、将高活性干酵母接入到发酵培养基中，控制发酵过程的温度为25～38℃，转速100～800rpm/min，时间为15～60h，发酵结束；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸5～30g，乙醇2～30g，K₂HPO_4·3H₂O 0.3～1.5g，MgSO_4·7H₂O 0.1～1.5g，NaCl 0.5～1g，余量为水；

（2）、分离纯化

步骤（1）发酵结束后所得的发酵液先以4000～5000r/min离心，去除菌体后的上清液中加入活性碳进行吸附；

然后用洗脱剂对活性碳进行洗脱或解吸，采用1MNaOH或HCl将洗脱液或解吸液的pH控制在3.5～10.0；

所得洗脱液或解吸液再依次经常压、减压蒸馏和精馏，收集115℃馏分，最终得到2-苯乙醇；

所述的洗脱剂为无水乙醇或95%（V/V)的乙醇。

4.如权利要求3所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于步骤（2）中：

所述的常压蒸馏温度控制在80℃；

所述的精馏过程控制压力-0.05—-0.09MPa。

5.如权利要求4所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于步骤（1）中使用摇瓶发酵时，转速100～300rpm/min。

6.如权利要求4所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于步骤（1）中使用发酵罐发酵时，转速100～800rpm/min。

7.如权利要求6所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于步骤（1）中使用发酵罐进行生产时，发酵过程通入空气，其中通气量按照通气速率比发酵液体积为0.3～1.5V/Vmin。

8.如权利要求7所述的一种2-苯乙醇的制备方法，其特征在于步骤（1）中发

酵过程中控制温度为36℃，转速为300rpm/min，通入空气量按照通气速率比发酵液体积为1 V/V·min，时间为48h；

所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸8g，乙醇20g，K₂HPO_4·3H₂O 0.75g，MgSO_4·7H₂O 0.5g，NaCl 1g，余量为水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。

9.如权利要求3所述的一种2-苯乙醇的制备方法所用的发酵培养基，其特征在于所述的发酵培养基按每升计算，其组成为，L-苯丙氨酸5～30g，乙醇2～30g，K₂HPO_4·3H₂O 0.3～1.5g，MgSO_4·7H₂O 0.1～1.5g，NaCl 0.5～1g，余量为水。