CN104726502A - 一种纤维素废弃物生物制备乙醇并联产壳聚糖的方法 - Google Patents

一种纤维素废弃物生物制备乙醇并联产壳聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，纤维素废弃物经稀硫酸蒸汽爆破、水洗、过滤得到富含纤维素的固体渣和富含木糖的预水解液，固体渣经纤维素酶糖化和酿酒酵母发酵制备乙醇，预水解液作为培养基培养米根霉并从米根霉中提取壳聚糖。本发明实现了纤维素废弃物中纤维素和半纤维素的全值利用，有利于降低纤维素废弃物生物炼制的成本。

Description

一种纤维素废弃物生物制备乙醇并联产壳聚糖的方法
技术领域
本发明属生物化工技术领域，具体涉及一种纤维素废弃物生物制备乙醇并联产壳聚糖的方法。
背景技术
植物纤维资源是地球上最丰富的可再生资源，随着地球上化石资源的日趋枯竭，利用可再生的植物纤维资源替代化石原料生产能源、化学品和材料是人类社会可持续发展战略的重要举措之一。目前，植物纤维资源中的纤维素废弃物由于具有资源量大、价格低廉、利用率低等特点而被公认为是生产替代能源、化学品和材料的潜在原料。纤维素废弃物生物炼制能源、化学品和材料主要包括原料预处理、纤维素糖化和糖液发酵三个过程，其中原料预处理过程的目的是破坏纤维素废弃物中纤维素、半纤维素和木质素之间的致密结构，实现纤维素、半纤维素和木质素的有效分离，从而提高纤维素对纤维素酶的可及度及纤维素糖化效率。稀酸蒸汽爆破是常用的纤维素废弃物的预处理方法，纤维素废弃物经稀酸蒸汽爆破预处理后，大多数半纤维素木聚糖在预处理过程中以单糖木糖的形式溶出，实现了纤维素、半纤维素和木质素的有效分离，同时，在蒸汽爆破过程中，部分碳水化合物（纤维素、半纤维素）和木质素在酸与热的作用下发生降解和分解作用，形成一批对后续发酵有抑制作用的物质。
壳聚糖是自然界中存在的一种碱性同聚高分子多糖物质，在食品、药品、污水处理、化妆品、农业等方面应用广泛。此外，由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物安全性，壳聚糖作为新型功能材料的原料，近年来在药学和材料学领域的应用得到广泛的研究。目前，壳聚糖工业化生产的原料主要来源于虾、蟹等水生动物的甲壳，随着海洋环境和集约化养殖环境的污染，重金属、抗生素等有害物质在虾、蟹中的累积限制了壳聚糖的应用领域。部分微生物含有丰富的壳聚糖，与虾、蟹来源的壳聚糖相比，微生物来源的壳聚糖具有更好的安全性和更广泛的应用领域，且微生物来源的壳聚糖生产不受季节的限制。米根霉中含有丰富的壳聚糖，利用微生物培养的方法生产米根霉菌体并提取壳聚糖，不仅拓宽了壳聚糖生产的原料来源，而且可获得高品质壳聚糖材料。
纤维素废弃物经稀硫酸蒸汽爆破预处理、洗涤、过滤后，可获得易于酶解、富含纤维素的固体渣和富含木糖的预水解液。固体渣可经纤维素酶糖化、酵母发酵制备乙醇。预水解液的利用目前研究主要集中在用于发酵制备乙醇上，但含发酵抑制物质的预水解液的木糖乙醇发酵技术尚未完全成熟，有待于进一步研究。米根霉属于丝状真菌，具有较好的抗抑制物能力，可利用纤维素废弃物稀酸蒸汽爆破预水解液中的木糖和葡萄糖为碳源良好生长。因此，纤维素废弃物稀酸蒸汽爆破预水解液可用于培养米根霉，继而可从米根霉菌体中提取高品质壳聚糖材料。
发明内容
发明目的：针对纤维素废弃物稀硫酸蒸汽爆破预水解液难以利用的问题，本发明的目的是提供一种纤维素废弃物制备乙醇并联产壳聚糖的方法，有效综合利用生物质原料。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，包括以下步骤：
1）纤维素废弃物于质量浓度0.5-1.0%的硫酸溶液中浸泡2-4 h，转入蒸汽爆破器中于1.5-2.2 MPa下处理1-15 min，用固液比为1:10-1:20的水洗涤预处理物料，过滤得到预水解液和固体渣；
2）将步骤1）产生的固体渣与纤维素酶混合，加入水，pH缓冲液或酸、碱，混合至底物浓度5-20%，控制pH值在4.6-5.0，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-40 FPU、β-葡萄糖苷酶用量3-20 U，于45-55 ℃条件下酶解反应36 h以上；
3）酶解结束后，在酶解体系中加入酿酒酵母，并于28-30 ℃下发酵12-24h制备乙醇；
4）将步骤1）产生的预水解液中和至pH值6.0-7.0后作为培养基于25-40℃培养米根霉24 h以上，获得富含壳聚糖的米根霉菌体；
5）从步骤4）获得的米根霉菌体中提取壳聚糖。
所述的纤维素酶是木霉、曲霉或其它细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。
所述的纤维素废弃物包括农作物秸秆、含纤维素的工业加工废弃物和城市纤维垃圾。
步骤1）中，用蒸馏水数次洗涤、过滤预处理物料；合并洗涤液得到预水解液，并蒸发浓缩至含木糖20g/L以上。
步骤3）中，在所述酶解液中加入尿素、硫酸镁、氯化锌、氯化钙和活性酿酒酵母干粉使酵母OD520nm值为15，在搅拌转速80转/分、30℃条件下发酵24h。
步骤4）中，将预水解液浓缩后加入碳酸钙中和至pH 6.5，离心取上清，加入尿素、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4，按10%的接种量接入米根霉种子，于35 ℃、220转/分的摇床中培养24h以上，获得米根霉菌体。
步骤5）中，将含米根霉菌体的培养液抽滤，并用蒸馏水洗涤菌体，用1M NaOH于121℃条件下处理米根霉菌体15 min，水洗沉淀至中性，随后使用2%的醋酸于95 ℃条件下处理24 h，过滤，取上清液，用50% NaOH调节上清液pH至11，固液分离，水洗沉淀至中性，乙醇洗涤，冷冻干燥即得到壳聚糖。
上述方法中，所用的纤维素酶可以是木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）或其它细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。
本发明提出的纤维素废弃物经稀硫酸蒸汽爆破预处理、洗涤、过滤后，得到易于酶解、富含纤维素的固体渣和富含木糖的预水解液。固体渣可经纤维素酶糖化、酵母发酵制备乙醇；预水解液作为培养基用于培养米根霉，并从米根霉中提取壳聚糖。
有益效果：与现有技术相比，本发明提出的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的技术方法，通过稀硫酸蒸汽爆破预处理分离纤维素和半纤维素，纤维素通过纤维素酶糖化、乙醇发酵步骤制备乙醇，富含木糖的预水解液作为培养基培养米根霉并从米根霉中提取壳聚糖。本技术方法可解决纤维素废弃物稀硫酸蒸汽爆破预水解液难以利用的问题，实现纤维素废弃物中纤维素和半纤维素的全值利用，有利于降低纤维素废弃物生物炼制的成本。
附图说明
图1是玉米秸秆稀酸蒸汽爆破预处理物料纤维素酶水解历程图；
图2是纤维素酶水解糖液乙醇发酵历程图；
图3是预水解液米根霉培养历程图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例中，葡萄糖、木糖、纤维二糖和乙醇浓度均采用高效液相色谱法进行测定。
实施例1
一种纤维素废弃物制备乙醇并联产壳聚糖的方法，具体步骤如下：
1、玉米秸秆稀酸蒸汽爆破预处理、洗涤、过滤
100 g绝干玉米秸秆机械粉碎至3-5 cm，于质量分数为1.00%的稀硫酸溶液中浸泡2 h，转入3.5 L蒸汽爆破预处理装置中于1.9 MPa下处理4 min，用固液比为1:15（w/v）的蒸馏水分三次洗涤、过滤预处理物料。合并洗涤液得到预水解液，并蒸发浓缩至含木糖32.68 g/L、葡萄糖10.40 g/L；预处理物料洗涤后的固体渣装入密封袋中，于4 ℃条件下平衡水分2天，备用。固体渣中纤维素含量50.10%（w/v）。
2、固体渣酶解、发酵
分别称取绝干重为10 g的固体渣于250 mL圆底烧瓶中，在烧瓶中加入1 mol/L柠檬酸缓冲液5.0 mL、按纤维素酶用量20 FPU/g纤维素和β-葡萄糖苷酶用量3U/g纤维素加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，在烧瓶中添加适量的蒸馏水使酶解体系中水分总体积为100 mL，于150转/分、50 ℃条件下酶解72 h。酶解结束后，测定其中的葡萄糖浓度和纤维二糖浓度，并计算酶水解得率。其中，纤维素酶解得率（%）=（水解液中葡萄糖浓度g/L×0.9+水解液中纤维二糖浓度g/L×0.95）×0.1÷（底物绝干重g×纤维素含量）×100%。式中：0.9为葡萄糖与纤维素的转换系数，0.95为纤维二糖与纤维素的转换系数， 0.1 为酶解液体积，L。酶反应历程如图1。结果表明，酶解72h，酶解体系中葡萄糖浓度44.69 g/L，酶水解得率85.42%。
在上述酶解液中加入0.48 g尿素、0.016 g硫酸镁、0.016 g氯化锌、0.4 g氯化钙和活性酿酒酵母干粉使酵母OD520nm值为15，在搅拌转速80转/分、30 ℃条件下发酵24 h。发酵历程如图2。结果表明，发酵24 h，发酵体系中乙醇浓度18.54 g/L，乙醇得率81.78%。
3、稀酸蒸汽爆破预水解液培养米根霉制备壳聚糖
预水解液浓缩液中加入碳酸钙中和至pH 6.5，离心取上清。取90 mL预水解液上清液于250 mL三角瓶中，加入尿素0.4 g、KH2PO4 0.066 g、MgSO4 0.113 g、ZnSO4 0.00193 g、FeSO4 0.00012 g，按10%的接种量接入米根霉种子，于35 ℃、220转/分的摇床中培养48 h（如图3），获得米根霉菌体浓度10.96 g/L，米根霉中壳聚糖含量13.6%。将含米根霉菌体的培养液抽滤，并用1:15（v/w）的蒸馏水洗涤菌体，用1M NaOH于121℃条件下处理米根霉菌体15 min，水洗沉淀至中性，随后使用2%（w/v）的醋酸于95 ℃条件下处理24 h，过滤，取上清液，用50% NaOH调节上清液pH至11，固液分离，水洗沉淀至中性，乙醇洗涤，冷冻干燥即得到壳聚糖0.99g。

Claims (7)

1.一种纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）纤维素废弃物于质量浓度0.5-1.0%的硫酸溶液中浸泡2-4 h，转入蒸汽爆破器中于1.5-2.2 MPa下处理1-15 min，用固液比为1:10-1:20的水洗涤预处理物料，过滤得到预水解液和固体渣；
2）将步骤1）产生的固体渣与纤维素酶混合，加入水，pH缓冲液或酸、碱，混合至底物浓度5-20%，控制pH值在4.6-5.0，反应体系中每克纤维素的纤维素酶用量为10-40 FPU、β-葡萄糖苷酶用量3-20 U，于45-55 ℃条件下酶解反应36 h以上；
3）酶解结束后，在酶解体系中加入酿酒酵母，并于28-30 ℃下发酵12-24h制备乙醇；
4）将步骤1）产生的预水解液中和至pH值6.0-7.0后作为培养基于25-40℃培养米根霉24 h以上，获得富含壳聚糖的米根霉菌体；
5）从步骤4）获得的米根霉菌体中提取壳聚糖。
2.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，所述的纤维素酶是木霉、曲霉或其它细菌产生的能降解纤维素成葡萄糖的纤维素酶的一种或多种酶的复合物。
3.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，所述的纤维素废弃物包括农作物秸秆、含纤维素的工业加工废弃物和城市纤维垃圾。
4.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，步骤1）中，用蒸馏水数次洗涤、过滤预处理物料；合并洗涤液得到预水解液，并蒸发浓缩至含木糖20g/L以上。
5.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，步骤3）中，在所述酶解液中加入尿素、硫酸镁、氯化锌、氯化钙和活性酿酒酵母干粉使酵母OD520nm值为15，在搅拌转速80转/分、30℃条件下发酵24h。
6.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，步骤4）中，将预水解液浓缩后加入碳酸钙中和至pH 6.5，离心取上清，加入尿素、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4，按10%的接种量接入米根霉种子，于35 ℃、220转/分的摇床中培养24h以上，获得米根霉菌体。
7.根据权利要求1所述的纤维素废弃物制备乙醇联产壳聚糖的方法，其特征在于，步骤5）中，将含米根霉菌体的培养液抽滤，并用蒸馏水洗涤菌体，用1M NaOH于121℃条件下处理米根霉菌体15 min，水洗沉淀至中性，随后使用2%的醋酸于95 ℃条件下处理24 h，过滤，取上清液，用50% NaOH调节上清液pH至11，固液分离，水洗沉淀至中性，乙醇洗涤，冷冻干燥即得到壳聚糖。
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