CN111117893B - 一种产生4-o-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用 - Google Patents
一种产生4-o-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产生4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用,涉及新菌株及微生物发酵技术领域,所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06,本发明通过将所述土曲霉菌种接种到发酵培养基中发酵培养,发酵液分离纯化得到4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸,提供了一种生物生产重要化学合成中间体化合物4‑O‑去甲基巴尔巴地衣酸的方法。
Description
技术领域
本发明涉及新菌株及微生物发酵技术领域,具体涉及一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株极其应用。
背景技术
橡苔是一种稀有的地衣资源,一般指生长在橡树树干和枝条上的松萝科扁枝衣属的栎扁枝衣,橡苔浸膏和精油被广泛应用于香水、护肤品、香烟和熏香等日用品,同时,橡苔也作为食品添加剂应用于饮料、烘焙食品、布丁、软糖等。天然橡苔主要产自于欧洲中南部和北非一代地中海沿岸国家,如法国、意大利等。我国橡苔资源极其稀少,仅在云南开发了橡苔I号和II号,由于地衣原料不同使得香气有很大的区别,主要作为烟草香精使用。
橡苔浸膏和精油作为一种天然产物制品,其市场和应用存在一些先天不足。首先,天然橡苔资源稀缺,售价高昂。其次,由于原料来源、提取工艺的差异使得橡苔品质不一,而且企业为降低成本会对产品进行调配,使得市场混乱。另外,天然橡苔浸膏和精油是一种混合物,成分复杂,其中部分化合物已被认定为过敏原,欧盟化妆品法规对这些致敏原物质的使用作出了规定和限制。上述不利因素都限制了橡苔的市场应用,因此,鉴定天然橡苔的主要呈香化合物并开发其生产工艺受到了企业和科研人员的关注。研究表明2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(1CAS:4707-47-5)是橡苔中的主香化合物,因此该化合物被称为合成橡苔。关于合成橡苔的化学合成路线已经有文献和专利报道,其中大部分合成路线中都是以不同原料合成关键中间体2,5-二甲基间苯二酚(2CAS:488-87-9)和2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸(3CAS:4707-46-4)最后生成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯,制备过程如图1所示。但是,在实际生产中,这两个关键中间体的制备工艺复杂,并且收率较低、成本较高,因此采用化学方法生产合成橡苔的方法在实际应用中存在一定的缺陷,限制了合成橡苔市场的发展。
发明内容
为解决上述化学方法生产合成橡苔的方法在实际应用中存在的问题,本发明提供一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸(CAS:20372-89-8)的土曲霉菌株、该菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用,及利用上述土曲霉菌株发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的方法,同时还提供了利用4-O-去甲基巴尔巴地衣酸合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(即合成橡苔)的方法。
首先,本发明提供一种产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株,所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06,已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心登记入册编号为:CGMCC No.15890。
第二,本发明提供上述产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用,包括以下步骤:
(1)土曲霉种子液的制备,种子液接种到发酵培养基中发酵培养;
(2)发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。
步骤(1)中所述种子液的制备,具体为:将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上,28℃培养2-9天,将平板上的孢子接种到种子培养基中,接种量为106-108个/35mL,28℃、220rpm摇床培养培养1-5天,得到种子液。
步骤(1)中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35。
步骤(1)中所述发酵培养,发酵温度为28℃,220rpm摇床培养6-12天,并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡糖糖溶液,原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。
步骤(2)中所述分离提纯,具体为:菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取,合并所有有机相,浓缩有机相获得粗提物,粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液,洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。
所述将菌体与发酵液分离的方法为:采用200目的尼龙布过滤,取滤液为发酵液,取滤渣为菌体。
所述菌体萃取为:菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡,超声萃取,分离有机相,剩余菌体重复上述操作两次,合并有机相;所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中,二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1;所述超声萃取,超声频率为40kHz-100kHz,每次超声萃取时间为1-30min;每次超声萃取,混合有机溶剂与菌体的比例为(5-500)mL:(1-5)g。
所述发酵液萃取为:菌液与乙酸乙酯混匀,静置分层,分离有机相,剩余水相重复上述操作两次,合并有机相。
所述浓缩有机相,为减压蒸馏浓缩,温度为60℃以下。浓缩获得粗提物的体积为原有机相总体积的1%-90%。
所述硅胶柱层析具体为:粗提物与硅胶按质量比1:(5-10)拌样,然后与200-300目的硅胶按高度比1:(3-5)装柱过减压硅胶柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:9,洗脱剂中含有0.1%(体积分数)的甲酸或三氟乙酸,洗脱量为3-5个柱体积,洗脱剂流速为5-20ml/min。
所述重结晶具体为:洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态,冰浴冷却,结晶后过滤,滤饼用二氯甲烷冲洗3-4次,30℃干燥。
第三,本发明还提供一种利用4-O-去甲基巴尔巴地衣酸合成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的方法,技术方案为:
1)4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
2)2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
以上技术方案具体为:
1)将4-O-去甲基巴尔巴地衣酸溶于浓硫酸得到反应体系,水浴中搅拌反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相减压浓缩,干燥后获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
2)2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3共同溶于DMF中,氮气保护条件下加热搅拌,搅拌后,在相同温度下缓慢滴加CH3I,继续搅拌发生反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相,有机相采用饱和NaCl水溶液清洗,减压浓缩所得有机相,干燥获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
步骤1)所述浓硫酸为质量分数95%-98%的硫酸水溶液。
步骤1)所述4-O-去甲基巴尔巴地衣酸与浓硫酸的比例为0.22g/mL。所述水浴温度为26℃,水浴中搅拌反应时间为10-40min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水,冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍,萃取3次后合并有机相。所述减压浓缩,温度为60℃以下,浓缩至剩余体积为1-20mL。所述干燥为30-50℃条件下烘干。
步骤2)所述2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3的物质的量之比为9.2:13.8,2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与DMF的比例为0.084g/mL。所述加热搅拌,温度为40℃,搅拌时间为10min。2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与CH3I的物质的量之比为9.2:9.5。所述反应时间为85-120min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水,冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍,萃取3次后合并有机相。所述饱和NaCl水溶液清洗,每次清洗使用饱和NaCl水溶液的体积为反应体系体积的5倍,共清洗3次。所述减压浓缩,温度为45℃以下,浓缩至剩余体积为1-20mL。所述干燥为30-50℃条件下烘干。
第四,本发明还提供一种利用土曲霉菌株发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成橡苔(即2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯)的方法,技术方案包括以下步骤:
一、土曲霉种子液制备,种子液接种到发酵培养基中发酵培养;
二、发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸;
三、4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
四、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
上述步骤三具体为:将4-O-去甲基巴尔巴地衣酸溶于浓硫酸得到反应体系,水浴中搅拌反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相减压浓缩,干燥后获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
上述步骤四具体为:2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3共同溶于DMF中,氮气保护条件下加热搅拌,搅拌后,在相同温度下缓慢滴加CH3I,继续搅拌发生反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相,有机相采用饱和NaCl水溶液清洗,减压浓缩所得有机相,干燥获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
步骤一中所述种子液的制备,具体为:将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上,28℃培养4-9天,长出孢子,将平板上的孢子接种到种子培养基中,接种量为106-108个/35mL。28℃、220rpm摇床培养培养1-5天,得到种子液。
步骤一中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35。
步骤一中所述发酵培养,发酵温度为28℃,220rpm摇床培养6-12天,并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡糖糖溶液,原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。
步骤二中所述分离提纯,具体为:菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取,合并所有有机相,浓缩有机相获得粗提物,粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液,洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。
所述将菌体与发酵液分离的方法为:采用200目的尼龙布过滤,取滤液为发酵液,取滤渣为菌体。所述菌体萃取为:菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡,超声萃取,分离有机相,剩余菌体重复上述操作两次,合并有机相;所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中,二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1;所述超声萃取,超声频率为40kHz-100kHz,每次超声萃取时间为1-30min;每次超声萃取,混合有机溶剂与菌体的比例为(5-500)mL:(1-5)g。所述发酵液萃取为:菌液与乙酸乙酯混匀,静置分层,分离有机相,剩余水相重复上述操作两次,合并有机相。所述浓缩有机相,为减压蒸馏浓缩,温度为60℃以下。浓缩获得粗提物的体积为原有机相总体积的1%-90%。所述硅胶柱层析具体为:粗提物与硅胶按质量比1:(5-10)拌样,然后与200-300目的硅胶按高度比1:(3-5)装柱过减压硅胶柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:9,洗脱剂中含有0.1%(体积分数)的甲酸或三氟乙酸,洗脱量为3-5个柱体积,洗脱剂流速为5-20ml/min。所述重结晶具体为:洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态,冰浴冷却,结晶后过滤,滤饼用二氯甲烷冲洗3-4次,30℃干燥。
步骤三所述浓硫酸为质量分数95%-98%的硫酸水溶液。
步骤三所述4-O-去甲基巴尔巴地衣酸与浓硫酸的比例为0.22g/mL。所述水浴温度为26℃,水浴中搅拌反应时间为10-40min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水,冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍,萃取3次后合并有机相。所述减压浓缩,温度为60℃以下,浓缩至剩余体积为1-20mL。所述干燥为30-50℃条件下烘干。
步骤四所述2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3的物质的量之比为9.2:13.8,2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与DMF的比例为0.084g/mL。所述加热搅拌,应温度为40℃,搅拌时间为10min。2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与CH3I的物质的量之比为9.2:9.5。所述反应时间为85-120min。所述猝灭反应的方法为在反应体系中加入冰水,冰水体积为反应体系体积的5倍。所述乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯体积为反应体系体积的5倍,萃取3次后合并有机相。所述饱和NaCl水溶液清洗,每次清洗使用饱和NaCl水溶液的体积为反应体系体积的5倍,共清洗3次。所述减压浓缩,温度为60℃以下,浓缩至剩余体积为1-20mL。所述干燥为30-50℃条件下烘干。
所述土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06,已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心登记入册编号为:CGMCCNo.15890。
本发明中涉及的培养基配方为:
PDA平板培养基:39g/L马铃薯土豆琼脂培养基PDA干粉,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟,待冷却至约60℃制备平板。
PDB培养基:39g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟,待冷却至约60℃制备平板。
种子培养基:70g/L葡萄糖,40g/L蔗糖,1g/L酵母抽提物,1g/L蛋白胨,1g/L乙酸钠,0.04g/L KH2PO4,0.1g/LMgSO4,5g/L豆粕,1.5g/L碳酸钙,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟。
发酵培养基:70g/L葡萄糖,40g/L蔗糖,2.5g/L酵母抽提物,20g/L蛋白胨,7g/L乙酸钠,0.5g/L KH2PO4,0.5g/LMgSO4,5g/L豆粕,5g/L碳酸钙,0.1mL/L泡敌,pH6.6,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟。
有益效果
针对现有的在生产合成橡苔中存在的缺点,本发明提供了一种全新的微生物发酵与化学合成相结合来生产合成橡苔的方法(图2)。首先通过菌株的筛选,得到了一株产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸(4CAS:20372-89-8)的土曲霉,然后经过分离纯化获得单体化合物,再通过化学水解的方法获得关键中间体2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸(3),最后经过甲酯化反应得到合成橡苔2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(1),制备过程如图2所示。首先该方法利用微生物发酵法产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸实现了中间体的绿色环保化生产;其次通过硅胶柱层析方法即可大量回收和纯化发酵液中的中间体,既降低了成本又提高了效率;最后通过中间体进行两步化学合成即可获得合成橡苔,简化了合成步骤和工艺流程。
附图说明:
图1为传统化学合成方法制备合成橡苔的生产流程;
图2为本发明中采用微生物发酵和化学合成结合制备合成橡苔的流程;
图3为筛选的一株土曲霉菌MEFC06中发酵粗提物次级代谢产物HPLC色谱分析图;
图4为4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的HRESIMS和NMR谱图;
图5为4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的色谱峰面积与溶液的浓度标准曲线图;
图6为真菌MEFC06发酵粗提物中4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的HPLC定量分析方法色谱图;
图7为发酵优化过程中4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的产量和可溶性糖含量曲线图;
图8为4-O-去甲基巴尔巴地衣酸水解为2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸的HPLC反应监控色谱图;
图9为2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸的HRESIMS和NMR谱图;
图10为2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸酯化反应生成2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC反应监控色谱图;
图11为2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HRESIMS和NMR谱图。
具体实施方式
按以下培养基配方配制培养基备用:
PDA平板培养基:39g/L马铃薯土豆琼脂培养基PDA干粉,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟,待冷却至约60℃制备平板。
PDB培养基:39g/L马铃薯土豆培养基PDB干粉,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟,待冷却至约60℃制备平板。
种子培养基:70g/L葡萄糖,40g/L蔗糖,1g/L酵母抽提物,1g/L蛋白胨,1g/L乙酸钠,0.04g/L KH2PO4,0.1g/LMgSO4,5g/L豆粕,1.5g/L碳酸钙,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟。
发酵培养基:70g/L葡萄糖,40g/L蔗糖,2.5g/L酵母抽提物,20g/L蛋白胨,7g/L乙酸钠,0.5g/L KH2PO4,0.5g/LMgSO4,5g/L豆粕,5g/L碳酸钙,0.1mL/L泡敌,pH6.6,余量为去离子水,121℃高压灭菌20分钟。
发酵粗提物的HPLC分析方法:流动相A(100%H2O+0.05%FA)流动相B(100%ACN+0.05%FA),梯度洗脱,0-5min 95%-76%A,5-35min 76%-38%A,35-50min 38%A,50-55min 38%-0%A,55-60min 0-95%A,60-65min 95%A。色谱柱(Agilent ZORBAX EclipseXDB-C184.6mm×150mm 5μm),流速1ml/min,检测波长250nm。
4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的HPLC分析方法:流动相A(100%H2O+0.05%FA)流动相B(100%ACN+0.05%FA),等度洗脱,23%A-77%B。色谱柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184.6mm×150mm 5μm),流速1ml/min,检测波长250nm。
2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC分析方法:流动相A(100%H2O+0.05%FA)流动相B(100%MeOH),等度洗脱,23%A-77%B。色谱柱(Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184.6mm×150mm 5μm),流速1ml/min,检测波长250nm。
实施例1
一株能产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株的筛选。
将冻存于-20℃条件下的来源于烟台牟平养马岛海域的尖嘴扁颌针鱼(Ablennesanastomella)采用75%的乙醇进行表面消毒,在无菌条件下取鱼的部分内脏进行研磨,然后用无菌水做不同梯度的稀释(V/V%0,10,100,1000),将原液及不同浓度的稀释液涂布于含有氨苄青霉素(0.05g/L)和链霉素(0.03g/L)两种抗生素的PDA平板上,28℃培养,在培养的过程中隔天观察是否有真菌菌落的长出,并挑取单菌落,进行纯化。
将分离纯化获得的不同真菌分别于PDA平板中培养7天,待长出孢子后,采用血球平板计数法计算孢子浓度,以孢子接种量1-2×108个/瓶接种于PDB培养基中(35ml培养基装于250ml锥形瓶中),28℃220rpm摇床培养发酵7天,结束后分别用有机相乙酸乙酯与发酵液按体积比1:1的比例萃取3次,合并有机相并浓缩获得发酵粗提物,用甲醇溶解配制100mg/ml的溶液,0.22μm滤膜过滤,采用发酵粗提物HPLC的分析方法进行分析。
比较所有菌株的发酵产物,发现一株菌(编号MEFC06)的代谢产物种类单一且产量较高,主产物的保留时间大约是在25.9min(图3),经分离纯化后,采用NMR以及HRESIMS鉴定发现该化合物为4-O-去甲基巴尔巴地衣酸,HRESIMS和NMR图谱如图4所示。提取菌株基因组,采用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)PCR扩增菌株的ITS rDNA序列,并测序,将结果输入NCBI网站比对,鉴定该菌为土曲霉。
命名为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06,该菌株已于2018年07月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中科学院微生物研究所,100101),保藏中心登记入册编号为:CGMCC No.15890,建议分类命名土曲霉Aspergillus terreus,。
化合物4-O-去甲基巴尔巴地衣酸结构分析数据如下:
4-O-Demethylbarbatic acid(4):HRESIMS m/z 345.0980[M-H]-(calcd forC18H17O7,345.0980).1H NMR(600MHz,acetone-d6,δ,ppm)11.64(1H,s),6.69(1H,s),6.47(1H,s),2.61(3H,s),2.60(3H,s),2.08(3H,s),2.07(3H,s).13C NMR(150MHz,DMSO-d6,δ,ppm):173.2(C),169.3(C),162.1(C),161.4(C),160.8(C),151.8(C),129.1(C),129.0(C),116.1(CH),115.8(C),111.4(C),111.0(CH),108.6(C),103.6(C),23.6(CH3),22.9(CH3),9.1(CH3),8.1(CH3).
曲霉菌MEFC06(Aspergillus sp.MEFC06)ITS rDNA序列测序结果:TATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAAACAAGTTGCACAAAAAATGCGTCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGAAGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGCCGGGGGACGAGGGCCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCAAAGAATCACAACTCAGACTGCAAGCTTTCAGAACAGGGTTCATGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGCGTGACGCCCCCCGGCGGCCAGCAACGCTGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACAATAGTCACGGGTGGGAGGTTGGGCCATAAAGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTACT。
实施例2
实施例1筛选获得的产生4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用。
包括以下步骤:
(1)土曲霉种子液的制备,种子液接种到发酵培养基中发酵培养;
(2)发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。
步骤(1)中所述种子液的制备,具体为:将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上,28℃培养4-9天,长出孢子,将平板上的孢子接种到种子培养基中,接种量为106-108个/35mL,28℃、220rpm摇床培养培养2天,得到种子液。
步骤(1)中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35。
步骤(1)中所述发酵培养,发酵温度为28℃,220rpm摇床培养10天,并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡糖糖溶液,原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。
步骤(2)中所述分离提纯,具体为:菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取,合并所有有机相,浓缩有机相获得粗提物,粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液,洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。
所述将菌体与发酵液分离的方法为:采用200目的尼龙布过滤,取滤液为发酵液,取滤渣为菌体。所述菌体萃取为:菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡,超声萃取,分离有机相,剩余菌体重复上述操作两次,合并有机相;所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中,二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1;所述超声萃取,超声频率为90kHz,每次超声萃取时间为20min;每次超声萃取,混合有机溶剂与菌体的比例为100mL/g。所述发酵液萃取为:菌液与乙酸乙酯混匀,静置分层,分离有机相,剩余水相重复上述操作两次,合并有机相。所述浓缩有机相,为减压蒸馏浓缩,温度为40℃。浓缩获得粗提物的体积为原有机相总体积的10%。所述硅胶柱层析具体为:粗提物与硅胶按质量比1:5拌样,然后与200-300目的硅胶按高度比1:5装柱过减压硅胶柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:9,洗脱剂中含有0.1%(体积分数)的甲酸,洗脱剂流速为10ml/min,洗脱量为5个柱体积。所述重结晶具体为:洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态,冰浴冷却,结晶后过滤,滤饼用二氯甲烷冲洗4次,30℃干燥。经检测,所得产物纯度为98.9%,分离提纯方法回收率为88%,最终经过发酵4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的产量可以达到2.12g/L。
实施例3以4-O-去甲基巴尔巴地衣酸为原料采用化学合成制备合成橡苔的方法
1)4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
2)2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
本实施例具体为:
向三口瓶中加入2.2g(6.3mmol)4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的固体结晶,然后加入10ml催化量(将固体结晶完全溶解)的质量分数98%的浓硫酸,水浴26℃下搅拌反应,并采用2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC分析方法反应监控,结果显示10min后反应完全,后期反应监控直至40min并无副产物的产生,反应监控如图8所示。反应结束后用50ml的冰水淬灭反应,乙酸乙酯萃取(3次,每次50ml),合并有机相减压浓缩,干燥,获得白色固体2.17g,收率94.6%。经NMR及HRESIMS检测分析,HRESIMS和NMR图谱如图9所示,确定该化合物为目标化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸。
化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸结构分析数据如下:
2,4-dihydroxy-3,6-dimethyl-Benzoic acid(3):HRESIMS m/z 181.0509[M-H]-(calcd for C9H9O4,181.0506).1H NMR(600MHz,acetone-d6,δ,ppm)6.33(1H,s),2.47(3H,s),2.20(3H,s).13C NMR(150MHz,acetone-d6,δ,ppm):174.9(C),164.7(C),161.0(C),141.0(C),111.2(CH),109.2(C),104.4(C),24.1(CH3),8.0(CH3).
向三口瓶中分别加入1.68g(9.2mmol)干燥的2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸固体结晶,1.38g(13.8mmol)KHCO3,用20ml干燥的DMF溶解,氮气保护,40℃搅拌10min后缓慢滴加1.35g(0.59ml,9.5mmol)CH3I,采用2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC分析方法反应监控,结果显示反应85min后原料几乎反应完全,反应监控如图10所示。反应结束后加入100ml水淬灭反应,乙酸乙酯萃取(3次,每次100ml),有机相用饱和NaCl水溶液清洗(3次,每次100ml),有机相减压浓缩,干燥,获得白色固体1.63g,收率90.4%。经NMR及HRESIMS检测分析,HRESIMS和NMR图谱如图11所示,确定该化合物为目标化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(合成橡苔)。
化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯结构分析数据如下:
Methyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate(1):HRESIMS m/z 195.0664[M-H]-(calcd for C10H11O4,195.0663).1H NMR(400MHz,DMSO-d6,δ,ppm)11.68(1H,s),10.08(1H,s),6.28(1H,s),3.83(3H,s)2.35(3H,s),1..95(3H,s).13C NMR(100MHz,DMSO-d6,δ,ppm):172.0(C),161.9(C),160.1(C),138.9(C),110.6(CH),108.2(C),103.9(C),51.9(CH3),23.6(CH3),8.0(CH3).
实施例4
利用土曲霉菌株发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸进而合成橡苔(及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯):
一、土曲霉发酵种子液的制备,种子液接种到发酵培养基中发酵培养;
二、发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸;
三、4-O-去甲基巴尔巴地酸通过酸水解或碱水解的方法获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
四、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸通过甲酯化反应获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
上述步骤三具体为:将4-O-去甲基巴尔巴地衣酸溶于浓硫酸得到反应体系,水浴中搅拌反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相减压浓缩,干燥后获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸;
上述步骤四具体为:2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸与KHCO3共同溶于DMF中,氮气保护条件下加热搅拌,搅拌后,在相同温度下缓慢滴加CH3I,继续搅拌发生反应,反应结束后猝灭反应,乙酸乙酯萃取,收集有机相,有机相采用饱和NaCl水溶液清洗,减压浓缩所得有机相,干燥获得2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯。
本实施例中具体为:
本实施例中步骤一中所述种子液的制备,具体为:将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上,28℃培养4-9天,长出孢子,将平板上的孢子接种到种子培养基中,接种量为106-108个/35mL,28℃、220rpm摇床培养培养2天,得到种子液。
本实施例中步骤一中种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35。
本实施例中步骤一中所述发酵培养,发酵温度为28℃,220rpm摇床培养10天,并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡糖糖溶液,原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍。
本实施例中步骤二中所述分离提纯,具体为:菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取,合并所有有机相,浓缩有机相获得粗提物,粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液,洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸。所述将菌体与发酵液分离的方法为:采用200目的尼龙布过滤,取滤液为发酵液,取滤渣为菌体。所述菌体萃取为:菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡,超声萃取,分离有机相,剩余菌体重复上述操作两次,合并有机相;所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中,二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1;所述超声萃取,超声频率为90kHz,每次超声萃取时间为10min;每次超声萃取,混合有机溶剂与菌体的比例为100mL/g。所述发酵液萃取为:菌液与乙酸乙酯混匀,静置分层,分离有机相,剩余水相重复上述操作两次,合并有机相。所述浓缩有机相,为减压蒸馏浓缩,温度为40℃。浓缩获得粗提物的体积为原有机相总体积的10%。所述硅胶柱层析具体为:粗提物与硅胶按质量比1:5拌样,然后与200-300目的硅胶按高度比1:5装柱过减压硅胶柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:9,洗脱剂中含有0.1%(体积分数)的甲酸或三氟乙酸,洗脱剂流速为10ml/min,洗脱量为5个柱体积。所述重结晶具体为:洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态,冰浴冷却,结晶后过滤,滤饼用二氯甲烷冲洗4次,30℃干燥。经检测,所得产物纯度为98.9%,分离提纯方法回收率为88%,最终经过发酵4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的产量可以达到2.12g/L。
本实施例中步骤三具体为:向三口瓶中加入2.2g(6.3mmol)4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的固体结晶,然后加入10ml催化量(将固体结晶完全溶解)的质量分数98%的浓硫酸,水浴26℃下搅拌反应,并采用2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC分析方法反应监控,结果显示10min后反应完全,后期反应监控直至40min并无副产物的产生,反应监控如图8所示。反应结束后用50ml的冰水淬灭反应,乙酸乙酯萃取(3次,每次50ml),合并有机相减压浓缩,干燥,获得白色固体2.17g,收率94.6%。经NMR及HRESIMS检测分析,HRESIMS和NMR图谱如图9所示,确定该化合物为目标化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸。
本实施例中步骤四具体为:向三口瓶中分别加入1.68g(9.2mmol)干燥的2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸固体结晶,1.38g(13.8mmol)KHCO3,用20ml干燥的DMF溶解,氮气保护,40℃搅拌10min后缓慢滴加1.35g(0.59ml,9.5mmol)CH3I,采用2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸及2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯的HPLC分析方法反应监控,结果显示反应85min后原料几乎反应完全,反应监控如图10所示。反应结束后加入100ml水淬灭反应,乙酸乙酯萃取(3次,每次100ml),有机相用饱和NaCl水溶液清洗(3次,每次100ml),有机相减压浓缩,干燥,获得白色固体1.63g,收率90.4%。经NMR及HRESIMS检测分析,HRESIMS和NMR图谱如图11所示,确定该化合物为目标化合物2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(合成橡苔)。
Claims (1)
1.一种4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株在发酵生产4-O-去甲基巴尔巴地衣酸中的应用,其特征在于:所述4-O-去甲基巴尔巴地衣酸的土曲霉菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)MEFC06,已于2018年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心登记入册编号为:CGMCC No.15890;
所述应用包括以下步骤:
(1)土曲霉菌种种子液制备,种子液接种到发酵培养基中发酵培养;所述种子液制备,具体为:将土曲霉MEFC06接种到PDA平板培养基上,28℃培养4-9天;将PDA平板上的孢子接种到种子培养基中,接种量为106-108个/35mL,28℃、220rpm摇床培养1-5天,得到种子液;
种子液接种到发酵培养基的接种量为按二者体积比3:35;步骤(1)中所述发酵培养,发酵温度为28℃,220rpm摇床培养6-12天,并在第4天向发酵培养体系中补加质量分数50%葡萄糖溶液,原发酵体系体积为补加的葡萄糖溶液体积的9倍;
(2)发酵液分离纯化得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸;所述分离提纯,具体为:菌体与发酵液分别用不同的有机溶剂萃取,合并所有有机相,浓缩有机相获得粗提物,粗提物采用硅胶柱层析分离得到洗脱液,洗脱液重结晶得到4-O-去甲基巴尔巴地衣酸;
所述将菌体与发酵液分离的方法为:采用200目的尼龙布过滤,取滤液为发酵液,取滤渣为菌体;
所述菌体萃取为:菌体用二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂浸泡,超声萃取,分离有机相,剩余菌体重复上述操作两次,合并有机相;所述二氯甲烷/甲醇混合有机溶剂中,二氯甲烷与甲醇的体积比为1:1;所述超声萃取,超声频率为40kHz-100kHz,每次超声萃取时间为1-30min;每次超声萃取,混合有机溶剂与菌体的比例为(5-500)mL:(1-5)g;
所述发酵液萃取为:菌液与乙酸乙酯混匀,静置分层,分离有机相,剩余水相重复上述操作两次,合并有机相;
所述硅胶柱层析具体为:粗提物与硅胶按质量比1:(5-10)拌样,然后与200-300目的硅胶按高度比1:(3-5)装柱过减压硅胶柱层析,洗脱剂为乙酸乙酯:石油醚体积比1:9,洗脱剂中含有体积分数为0.1%的甲酸或三氟乙酸,洗脱量为3-5个柱体积,洗脱剂流速为5-20ml/min;
所述重结晶具体为:所得洗脱液在40℃条件下减压蒸馏浓缩至过饱和状态,冰浴冷却,结晶后过滤,滤饼用二氯甲烷冲洗3-4次,30℃干燥。
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Yuzuru Yamamoto等.Studies on the Metabolic Products of Aspergillus terreus. I. Metabolities of the Strain IFO6123.《Chem.Pharm.Bull》.1976,第24卷(第8期),1853-1859页. * |
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