CN104131017A - 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用 - Google Patents

一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104131017A
CN104131017A CN201410362681.6A CN201410362681A CN104131017A CN 104131017 A CN104131017 A CN 104131017A CN 201410362681 A CN201410362681 A CN 201410362681A CN 104131017 A CN104131017 A CN 104131017A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pet
gene
phenylalanine deaminase
pal
phenylalanine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410362681.6A
Other languages
English (en)
Inventor
周哲敏
朱龙宝
崔文璟
周丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201410362681.6A priority Critical patent/CN104131017A/zh
Publication of CN104131017A publication Critical patent/CN104131017A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物技术领域。苯丙氨酸脱氨酶基因的克隆对采用酶法生物合成L-苯丙氨酸具有重要的作用。本发明所述的苯丙氨酸脱氨酶基因是通过提取粘红酵母的RNA，反转录获得全长的苯丙氨酸脱氨酶基因，该基因全长2121bp，编码705个氨基酸。本发明进一步扩大了苯丙氨酸脱氨酶基因资源，为分子改造苯丙氨酸脱氨酶，提高酶的稳定性和催化活性提供了科学依据。

Description

一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在pH8.0时催化L-苯丙氨酸(L-phe)脱氨生成反式肉桂酸和氨，pH11.0时能催化逆向反应合成L-phe，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸L-phe和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是红酵母属中。其中粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。
为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得PAL的部分cDNA，缺少5'端的基因序列。由于该基因的5'端序列的GC含量高，容易形成发夹结构，传统的反转录很难成功。
为此，本发明提供了一种粘红酵母PAL全长的基因序列，经表达，获得4.2U/mg PAL。
发明内容
本发明的目的是提供一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述苯丙氨酸脱氨酶基因是以工业生产用菌株粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长为2121bp的基因序列，编码706个氨基酸，酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。
苯丙氨酸脱氨酶基因编码的苯丙氨酸脱氨酶可用于催化生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种表达所述苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌。优选以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21。
本发明要解决的第三个技术问题是提供一种表达所述基因获得苯丙氨酸脱氨酶的方法。优选以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21后诱导表达该基因。
所述方法进一步优选将带有pET-28-pal的重组大肠杆菌培养至OD600为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，于24℃培养12h后离心收集菌体，用含有10mM的咪唑、150mM氯化钠，pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30min后离心收集上清，上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mM NaC，pH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱脱盐得到纯化后的PAL。
本发明提供了一种完整的新的粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，编码的苯丙氨酸脱氨酶酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。该基因的获得为进一步利用分子生物学手段对酶进行改造，以提高酶活及其稳定性提供了基础。所得苯丙氨酸脱氨酶及相应基因工程菌都可以应用于生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。
附图说明
图1为粘红酵母总RNA的电泳图。
图2为反转录后PCR扩增全长基因的电泳图。
图3为粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的阅读框及翻译的氨基酸序列。
图4为重组酶的表达；M，蛋白marker；1，不带重组质粒pET-28-pal的E.coil BL21全细胞电泳；2，带重组质粒pET-28-pal，未用IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳；3，带重组质粒pET-28-pal，IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳。
图5SDS-PAGE检测纯化的蛋白；M，为蛋白marker；1，全细胞电泳；2，采用His纯化柱纯化后获得的PAL。
图60.5mM反式肉桂酸标样的HPLC图(出峰时间为6.35min)。
图7重组酶催化L-苯丙氨酸后HPLC分析(在6.25min出现产物峰，与标样出峰时间一致)。
具体实施方式
实施例1 提取粘红酵母总RNA
(1)以工业生产用菌株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CCTCC NO:M2011490为出发菌株，从粘红酵母平板上挑取单菌落至5mL的种子培养基中于30℃培养24h后，取50μL的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃培养18-20h至OD600＝1.0，1500g离心5min收集菌体，用冷水将菌体洗涤2次，弃上清。
(2)用400μL的TES(10mM Tris-HCI，10mM EDTA，0.5％SDS,pH7.5)缓冲液重悬细胞，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，65℃温育1h，不时用涡旋振荡器短暂震荡。
(3)冰育5min，于4℃，12000g离心5min。
(4)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，重复步骤(3)。
(5)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入氯仿，剧烈震荡10sec，于4℃，12000g离心5min。
(6)将水相移到新的1.5mL离心管中，加入40μl的3M NaAc及1ml冰冷的无水乙醇，于4℃，12000g离心5min。
(7)加入1mL，75％乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。
(8)沉淀于无菌操作台上风吹15min至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水50μL重悬，-80℃保藏备用，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量(图1)。
实施例2 反转录获得cDNA
(1)于0.5mL的离心管中加入50ng总RNA，1μL5’-CDS(5’-(T)25VN(N＝A,C,G,T；V＝A,G,C)-3’)和1μL SMARTer II A Oligonucleotide(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG–3')，加水至4.75μL混匀。
(2)72℃温育3min后于42℃温育2min，1500g离心10sec。
(3)加入2μL5×buffer(250Mm Tris-HCl,375mM KCl,30mM MgCl2)，1μL的DTT(20mM)，1μL dNTP(10mM)，0.25μL RNase抑制剂和1μL SMARTerTM反转录酶，42℃温育90min后于70℃变性10min，冷却至室温加入20μL无菌水，获得cDNA。
实施例3 获得pal5'端的序列
(1)往0.25mL的离心管加入1μL cDNA、5μL Mix引物(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3')，1μL GSP特异性引物(5'-GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3')，5μL10×buffer，5μL dNTP(2mM)，0.5μL pfu DNA聚合酶，3μL MgSO4(25mM)，加去离子水至50μL。
(2)进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)往0.25mL的离心管中加入5μL PCR产物，1μL10×Taq buffer，1μL dATP(2mM)，1μL Taq酶(5U/μL)加水至10μL，70℃反应30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，无菌操作台风吹15min至酒精挥发完全，用10μL无菌水重悬。
(4)取上一步反应液5μL，加入1μL连接buffer，1μL50％PEG，1μL pUCm-T载体，1μL T4连接酶，加去离子水至10μL，于16℃过夜连接。
(5)取连接产物10μL，10μL5×KCM(0.5M KCl，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2)，去离子水30μL，加至50μL的E.coli JM109感受态中，冰浴30min，42℃热击90sec，冰浴2min，加入100μL的新鲜LB培养基，37℃培养30-60min，取100μL涂布含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板，37℃培养10h，挑取单菌落，接入5mL含50ug/mL的氨苄青霉素LB培养基中37℃培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得5'端的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例4 构建克隆载体pUCm-T-pal
(1)根据步骤3获得的5'端序列，设计一对特异性引物(primer F：5'-GGAATTCCATATGATGGCCCCC TCCGTCGACTCGATC-3'；primer R：5'-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3')，0.25mL的离心管加入1μL cDNA，primer F和R各1μL，5μL10×buffer，5μL dNTP(2mM)，0.5μL pfu DNA聚合酶，加去离子水至50μL。
(2)进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。
(3)参照实施例3，将扩增到全长基因序列与pUCm-T连接，转入E.coli JM109，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑单菌落至LB培养基中37℃培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得全长的序列，采用PCR验证构建的pUCm-T-pal，分析阅读框(图3)，从图中可知该酶的阅读框全长2121bp，编码706个氨基酸。
实施例5 构建表达载体pET-28a(+)-pal表达PAL
Ndel和EcoRl分别对pUCm-T-pal和空载体pET-28a(+)进行双酶切，胶回收后于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑阳性重组子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证，阳性克隆即pET-28a(+)-pal。
取1μL pET-28a(+)-pal，转入E.coli BL21，取100μL涂布含有卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养10h，挑取单菌落至5mL的LB培养基中37℃培养10h，取1mL培养液至100mL的LB培养基中37℃培养至OD600为0.6时加入终浓度为0.4mM的IPTG，26℃诱导表达12h后离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测表达情况，结果见图4，从图中可知，该基因成功表达。目的条带的分子量70kD左右，与理论分子量大小一致。
实施例6 重组PAL的纯化
将带有pET-28a(+)-pal的重组大肠杆菌培养至OD600为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，于24℃培养12h后离心收集菌体，用50mM的磷酸缓冲液(含有10mM的咪唑，150mM氯化钠，pH7.5)洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30min后离心收集上清，上清用带有His标签的亲和层析柱(HisTrap FF crude column 1mL)纯化，用含58.3％咪唑的磷酸缓冲液(250mM咪唑,150mM NaC，pH7.5)进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱(HiPrep26/10desalting column)脱盐。SDS-PAGE检测纯化的蛋白，结果如图5，从图中可知，获得高纯度的PAL蛋白，蛋白的大小与理论一致。
实施例7 HPLC测定酶的活性
取适量的实施例6得到纯酶与40mM的L-苯丙氨酸于40℃下反应30min后加入50％的甲醇终止反应，反应结束后用0.22μm的纤维素膜过滤后进行HPLC分析。HPLC测定条件：日立C18柱，50％甲醇作为流动相，流速0.5ML/min，进样10μL。标准样品及酶催化后的HPLC图谱如图6和7，从图中可知，该重组酶具有催化苯丙氨酸生成肉桂酸的功能。纯酶的比酶活达到4.2U/mg，是目前已报道的最高活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种苯丙氨酸脱氨酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的苯丙氨酸脱氨酶。
3.携带权利要求1所述基因的载体、重组细胞或基因工程菌。
4.一种获得权利要求1所述基因的方法，其特征在于，以粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长基因序列。
5.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的基因工程菌，其特征在于，将苯丙氨酸脱氨酶基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21，筛选获得阳性菌株。
6.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将编码丙氨酸脱氨酶的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21后诱导表达该基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将带有pET-28a(+)-pal的重组大肠杆菌培养至OD600为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，于24℃培养12h后离心收集菌体；用含有10mM的咪唑、150mM氯化钠、pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤，然后超声波破碎细胞后离心收集上清；上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mMNaCl、pH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白脱盐得到纯化后的PAL。
9.权利要求2所述苯丙氨酸脱氨酶在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。
10.权利要求5所述基因工程菌在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。
CN201410362681.6A 2014-07-28 2014-07-28 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用 Pending CN104131017A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410362681.6A CN104131017A (zh) 2014-07-28 2014-07-28 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410362681.6A CN104131017A (zh) 2014-07-28 2014-07-28 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104131017A true CN104131017A (zh) 2014-11-05

Family

ID=51803870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410362681.6A Pending CN104131017A (zh) 2014-07-28 2014-07-28 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104131017A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087387A (zh) * 2015-07-14 2015-11-25 厦门欧米克生物科技有限公司 一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法
CN106497905A (zh) * 2016-12-14 2017-03-15 江南大学 一株鱼腥藻来源的苯丙氨酸脱氨酶的突变体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101532026A (zh) * 2009-04-17 2009-09-16 西南大学 粘毛黄芩苯丙氨酸解氨酶蛋白编码序列
CN103060352A (zh) * 2012-09-18 2013-04-24 江南大学 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法
CN103409449A (zh) * 2012-09-18 2013-11-27 江南大学 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101532026A (zh) * 2009-04-17 2009-09-16 西南大学 粘毛黄芩苯丙氨酸解氨酶蛋白编码序列
CN103060352A (zh) * 2012-09-18 2013-04-24 江南大学 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法
CN103409449A (zh) * 2012-09-18 2013-11-27 江南大学 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087387A (zh) * 2015-07-14 2015-11-25 厦门欧米克生物科技有限公司 一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法
WO2017008482A1 (zh) * 2015-07-14 2017-01-19 厦门欧米克生物科技有限公司 一株酵母菌及利用其发酵生产天然肉桂酸的方法
US10392672B2 (en) 2015-07-14 2019-08-27 Xiamen Oamic Biotechnology Co., Ltd. Yeast strain and method for producing natural cinnamic acid using the yeast strain for fermentation
CN106497905A (zh) * 2016-12-14 2017-03-15 江南大学 一株鱼腥藻来源的苯丙氨酸脱氨酶的突变体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109486794B (zh) 一种酶活提高的甲壳素酶突变体
CN104560927B (zh) 一种突变的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
CN105331642B (zh) 一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法
CN105671010A (zh) 一种醛酮还原酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN103361326B (zh) 一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法
CN103627685A (zh) 一种活性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用
CN103060352A (zh) 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法
CN107227284B (zh) 一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌
CN102776157A (zh) 改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞
CN104131017A (zh) 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用
CN105950596B (zh) 一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用
CN105002192A (zh) 一种苹果酸酶基因rkme1及其重组表达载体
CN103898083A (zh) 一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用
CN111334488A (zh) 昆布多糖酶ouc-l1及其编码基因与应用
CN103382464B (zh) 来源于超嗜热古菌的酰胺酶及其编码基因与应用
CN106544336A (zh) 一种对脂肪族二腈区域选择性提高的腈水合酶
CN103589695B (zh) N-乙酰葡糖胺转移酶突变体及其应用
CN103409449A (zh) 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达方法
CN109022406A (zh) 一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1及其应用
CN106701800B (zh) 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用
CN103923889A (zh) 一种苯乙醛还原酶突变体
CN107739733A (zh) 天冬氨酸转氨酶及其制备方法
CN106085993B (zh) 一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用
CN105349507B (zh) 一种脂肪酶LIPDa6及其编码基因和应用
CN103468664B (zh) 一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20141105