CN103060352A

CN103060352A - 一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法

Info

Publication number: CN103060352A
Application number: CN 201210345155
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 朱龙宝; 崔文璟; 周丽; 曲娟娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开一种获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，经过提取RNA，反转录，PCR扩增，构建克隆载体pUCm-T-pal，测序，获得全长的苯丙氨酸脱氨酶基因序列，属于基因克隆技术领域。本发明方法操作简单，具有较高的效率和成功率。

Description

一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列获取方法

技术领域：

本发明在已知部分序列的基础上，采用5′-RACE(快速获取5′端序列)技术获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的全长基因，属于基因克隆技术领域。

背景技术：

苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在pH 8.0时催化L-苯丙氨酸(L-phe)脱氨生成反式肉桂酸和氨，pH 11.0时能催化逆向反应合成L-phe，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸L-phe和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是红酵母属中。其中粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得部分的cDNA。为进一步提升该酶的工业应用价值，对粘红酵母PAL进行改造，首先需要获得全长的基因序列，本专利的方法是根据已经报道部分粘红酵母PAL的cDNA序列的基础上(GenBank：DQ013364.1)，成功获得粘红酵母PAL全长的基因序列。

发明内容：

本发明的目的是提供一种获取粘红酵母PAL全长基因序列的方法。

本发明的具体步骤如下：

(1)提取粘红酵母总RNA。

(2)反转录获得cDNA。

(3)获得pal 5′端的序列

(4)构建克隆载体pUCm-T-pal，测序，获得全长的序列。

本发明的详细的步骤为

1提取粘红酵母总RNA

(1)从粘红酵母平板上挑取单菌落至5mL的种子培养基中于30℃培养24h后，取50μL的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃培养18-20h至OD₆₀₀＝1.0，1500g离心5min收集菌体，用冷水将菌体洗涤2次，弃上清。

(2)用400μL的TES(10mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.5％SDS，pH7.5)缓冲液重悬细胞，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，65℃温育1h，不时用涡旋振荡器短暂震荡。

(3)冰育5min，于4℃，12000g离心5min。

(4)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入400μL酸性酚，剧烈震荡10sec，重复步骤(3)。

(5)将水相移至另一1.5mL的离心管中，加入氯仿，剧烈震荡10sec，于4℃，12000g离心5min。

(6)将水相移到新的1.5mL离心管中，加入40ul的3M NaAc及1ml冰冷的无水乙醇，于4℃，12000g离心5min。

(7)加入1mL，75％乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。

(8)沉淀于无菌操作台上风吹15min至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水50μL重悬，-80℃保藏备用，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。

2反转录，获得cDNA

(1)于0.5mL的离心管中加入50ng总RNA，1μL 5’-CDS(5’-(T)₂₅VN(N＝A，C，G，T；V＝A，G，C)-3’)和1μL SMARTer II A Oligonucleotide(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG-3′)，加水至4.75μL混匀。

(2)72℃温育3min后于42℃温育2min，1500g离心10sec。

(3)加入2μL 5×buffer(250Mm Tris-HCl，375mM KCl，30mM MgCl₂)，1μL的DTT(20mM)，1μL dNTP(10mM)，0.25μL RNase抑制剂和1μL SMARTer^TM反转录酶，42℃温育90min后于70℃变性10min，冷却至室温加入20μL无菌水，获得cDNA。

3获得pal 5′端的序列

(1)往0.25mL的离心管加入1μL cDNA，5μL Mix引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)，1μL GSP特异性引物(5′-GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3′)，5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mM)，0.5μL pfu DNA聚合酶，3μL MgSO₄(25mM)，加去离子水至50μL。

(2)进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)往0.25mL的离心管中加入5μL PCR产物，1μL 10×Taq buffer，1μL dATP(2mM)，1μL Taq酶(5U/μL)加水至10μL，70℃反应30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，无菌操作台风吹15min至酒精挥发完全，用10μL无菌水重悬。

(4)取上一步反应液5μL，加入1μL连接buffer，1μL 50％PEG，1μL pUCm-T载体，1μL T₄连接酶，加去离子水至10μL，于16℃过夜连接。

(5)取连接产物10μL，10μL 5×KCM(0.5M KCl，0.15M CaCl₂，0.25M MgCl₂)，去离子水30μL，加至50μL的E.coli JM109感受态中，冰浴30min，42℃热击90sec，冰浴2min，加入100μL的新鲜LB培养基，37℃培养30-60min，取100μL涂布含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板，37℃培养10h，挑取单菌落，接入5mL含50ug/mL的氨苄青霉素LB培养基中37℃培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得5′端的序列。

4构建克隆载体pUCm-T-pal

(1)根据步骤3获得的5′端序列，设计一对特异性引物(primer F：5′-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3′；primer R：5′-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3′)，0.25mL的离心管加入1μL cDNA，primer F和R各1μL，5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mM)，0.5μL pfu DNA聚合酶，加去离子水至50μL。

(2)进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)参照步骤3，将扩增到全长基因序列与pUCm-T连接，转入E.coli JM109，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑单菌落至LB培养基中37℃培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得全长的序列，采用PCR验证构建的pUCm-T-pal，分析阅读框。

附图说明：

图1获取粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因序列流程图

图2.提取的粘红酵母总RNA琼脂糖凝胶电泳图

图3.PCR扩增获得pal的5′端DNA的琼脂糖凝胶电泳图

图4.PCR扩增获得全长基因的琼脂糖凝胶电泳图

具体实施方式：

材料和检测方法

(1)粘红酵母(Rhodotorula glutinis JN-1)(CCTCC NO：M2011490)，江南大学工业生物技术教育部重点实验室筛选。

(2)反转录试剂盒购自美国clontech公司。

(3)pfu酶，Taq酶，和pUCm-T，引物，均购自上海生物工程有限公司。

(4)测序由上海生物工程有限公司完成。

(5)采用Invitrogen软件拼接序列和分析阅读框。

实施例1

挑取粘红酵母单菌落至5mL的种子培养基中于30℃培养24h后，取50μL的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30℃培养至OD₆₀₀＝1.0，离心收集菌体，采用TES裂解细胞，酸性酚和氯仿提取总RNA，-80℃保藏备用，采用琼脂糖电泳检测总RNA质量。

实施例2

经琼脂糖凝胶电泳检测，提取高质量的RNA，加入反转录酶和反应缓冲液，42℃反应90min，70℃处理10min，加入20μL无菌水，获得cDNA。以5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′；5′-CTA ATACGACTCACTA TAGGGC-3′；5′-GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3′为引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，切胶回收目的条带，加入Taq酶，70℃反应30min后酚仿抽提，与pUCm-T连接，连接产物转入E.coli JM109，提质粒进行测序，获得5′端的序列。

实施例3

根据基因的5′端序列，以5′-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3′和5′-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3′引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物。PCR产物中加入Taq酶，70℃反应30min后酚仿抽提，与pUCm-T连接，连接产物转入E.coli JM109，提质粒进行PCR验证，测序，构建pUCm-T-pal，利用Invitrogen软件拼接序列和分析阅读框。

Claims

1.一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因(pal)序列获取方法；

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，苯丙氨酸脱氨酶基因(pal)来自粘红酵母(Rhodotorula glutinisJN-1)(保藏编号CCTCC NO：M2011490)；

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，采用酸性酚法提取粘红酵母总RNA；

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，采用SMARTerIIA Oligonucleotide(5′-AAGCAGT GGTATCAACGCAGAGTACGGGGG-3′)和CDS引物5’-(T)₂₅VN(N＝A，C，G，T；V＝A，G，C)-3’进行反转录；

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用Mix引物(long primer：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；Short primer：5′-CTAATACGACTCACTATAG GGC-3′)

和特异性引物GSP(10μM)：5′-GGTGATGCCGTGGTTGAG GAAGTT-3′，进行PCR扩增，获取pal的5′端的一段基因序列；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增条件是：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环；

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，构建pUCm-T-pal克隆载体，转入E.coliJM109，含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板上挑取单菌落培养，提取质粒，测序，获取全长的pal序列；

8.如权利要求2所述的方法，培养粘红酵母的种子培养基为：1％酵母提取物，1％蛋白胨，0.5％氯化钠(pH6.0)；诱导产苯丙氨酸脱氨酶培养基为在种子培养中加入0.1％的L-phe；

9.权利要求7所述的方法，用于培养E.coliJM109的LB培养基为：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠(pH7.0)。