CN104152523A - 一种生产高光学纯度d-苯丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产高光学纯度D-苯丙氨酸的方法，属于酶学与酶工程技术领域。本发明采用介孔材料MCM-41为载体固定苯丙氨酸脱氨酶，不对称拆分DL-苯丙氨酸生产高光学纯度的D-苯丙氨酸。通过构建重组菌，高效表达，获得大量的重组酶，将重组酶进行固定化，制备高稳定性的酶催化剂，搭建填充床反应器，半连续生产D-苯丙氨酸。采用本方法可以获得高纯度的D-苯丙氨酸，以满足工业化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产高光学纯度D-苯丙氨酸的方法，尤其是一种利用重组苯丙氨酸脱氨酶不对称拆分DL-苯丙氨酸生产高光学纯度D-苯丙氨酸的方法，属于酶学与酶工程技术领域。
背景技术
D-苯丙氨酸广泛应用于制药工业，如用于生产治疗2型糖尿病“那格列奈的”。D-苯丙氨酸的生产主要是化学合成，由于化学合成路线复杂，反应步骤多，副产物多，导致生产成本高昂。酶学方法由于其专一性高，副产物少，反应条件温和，产率高等优点，是一种绿色生产工艺。工业上采用转氨酶不对称转化对消旋的DL-苯丙氨酸中的L-苯丙氨酸，生成α-酮酸，提纯获得D-苯丙氨酸。由于转氨酶催化需要辅因子NADH，在催化过程中，辅因子需要多批次添加以维持酶的活性，而且转氨酶的稳定性差，半衰期短，生产过程控制复杂，导致D-苯丙氨酸生产的成本高。为此，需要寻找新的不对称转化DL-苯丙氨酸的新方法。苯丙氨酸脱氨酶能立体选择性催化L-苯丙氨酸转化生成反式肉桂酸，肉桂酸的溶解度较低，容易通过调节pH沉淀除去肉桂酸，从而获得高纯度的D-苯丙氨酸。
本方法是通过构建重组大肠杆菌，异源高效表达粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶，获得工业级应用的酶，然后将酶固定化，构建填充床酶反应器，用于D-苯丙氨酸的生产。目前固定化酶采用的载体有海藻酸钠、壳聚糖、树脂等材料，这些固定化材料由于机械强度低，高度扩散限制，固定化酶的重复利用次数低。
本发明采用酵母来源的苯丙氨酸脱氨酶具有高活性、高稳定性等优点，一步催化获得D-苯丙氨酸，生产过程与转氨酶相比更加简单。以介孔二氧化硅材料MCM-41作为固定化材料，采用化学修饰，将氨基嫁接在MCM-41的表面上，提供酶固定化的锚定位点，与酶进行共价连接，提高酶的稳定性、重复利用次数。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用固定化苯丙氨酸脱氨酶(PAL)生产D-苯丙氨酸的方法，主要是以DL-苯丙氨酸溶液为底物，将固定化苯丙氨酸脱氨酶填装入固定床得到固定床酶反应器，催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸和氨，最终得到高光学纯的D-苯丙氨酸。
所述固定床酶反应器优选将固定化酶与硅藻土混匀后填充玻璃柱得到。
所述固定床酶反应器进一步优选将100-200个酶活单位的固定化苯丙氨酸脱氨酶(MCM-41-NH-GA-RgPAL)与100-120g的硅藻土充分混合，装进径高比为5:1，体积为450mL的玻璃柱中。所述固定化苯丙氨酸脱氨酶与硅藻土的用量分别优选100U和100g。
所述固定床酶反应器的温度优选以循环夹套控制。
所述固定化苯丙氨酸脱氨酶的获得方法，主要包括以下步骤：(1)MCM-41载体的修饰：以介孔二氧化硅MCM-41为载体，将氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羟基上得到MCM-41-NH2，提供共价固定的锚定位点；(2)制备MCM-41-NH-GA：取适量的载体MCM-41-NH2与0.5％戊二醛在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤，尽可能洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制备成MCM-41-NH-GA；(3)固定化酶：1g MCM-41-NH-GA与含有50mg酶活为4.2U/mg的酶溶液进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。
所述MCM-41载体的修饰优选以下步骤：将1g MCM-41、50mL无水甲苯、2mL3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用无水甲醇洗涤三次，真空干燥后备用，获得修饰的载体MCM-41-NH2。
所述制备MCM-41-NH-GA优选以下步骤：取1g MCM-41-NH2载体与0.5％戊二醛(GA)在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤三次，尽可能洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制备成MCM-41-NH-GA。
所述固定化酶优选以下步骤：取1g MCM-41-NH-GA与50mg的酶活性为3-5U/mg的酶溶液(Tis-HlC缓冲液溶液，50mM,pH8.5)进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。
所述催化生产高光学纯度D-苯丙氨酸的方法优选以下步骤：以12mL/min的流速往固定床酶反应器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，温度控制在50℃，当L-苯丙氨酸转化率达到80％时，调整反应液的pH至5，沉淀产物肉桂酸后再调整至初始pH8.5，反应液泵入反应器继续反应，直至光学纯度超过99％时，反应结束。
所述苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的获得方法是将来源于红粘酵母的苯丙氨酸脱氨酶在大肠杆菌中进行表达。
所述苯丙氨酸脱氨酶的获得方法优选将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列以pET-28a(+)为表达载体，在E.coli BL21中进行表达得到。
所述苯丙氨酸脱氨酶的获得方法还包括对酶进行纯化的步骤：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为35％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8.7，静置半小时后低温离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为55％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在25mMTris-HCl pH8.7的缓冲液中并且4℃透析数小时。
本发明提供了一种生产高光学纯的D-苯丙氨酸的生产工艺，通过分离粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，构建高效表达的大肠重组菌，大量表达重组酶。采用硫酸铵一步提纯重组酶，获得工业纯的苯丙氨酸脱氨酶，将其固定在介孔材料MCM-41上，制备固定化酶催化剂，将制备的固定化酶填装入固定床，搭建高效催化的固定床酶反应器应用于DL-苯丙氨酸的拆分，生产高光学纯的D-苯丙氨酸。固定化酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为8.5，重复催化反应30次后，固定化酶的酶活仅损失15％。D-苯丙氨酸的产率达到0.32gL-1h-1，光学纯度超过99％，与化学合成和转氨酶催化相比，光学纯度、产率更高。
附图说明
图1：重组酶的高效表达，M，蛋白marker；1，空白对照；2，重组菌未添加诱导剂；3，重组菌加入IPTG诱导
图2：固定化酶的流程图
图3：红外光谱分析MCM-41氨基的嫁接；上方曲线：载体MCM-41；下方曲线：载体MCM-41-NH2。
图4：重复利用次数对固定化酶活性的影响
图5：填充床反应器
图6：填充床拆分DL-苯丙氨酸生产D-苯丙氨酸的过程
具体实施方式
肉桂酸测定方法：采用HPLC测定产物肉桂酸，色谱柱C18,5μm,250mm×4.6mm；流动相为5％的甲醇；流速1mL/min；检测波长290nm；柱温为室温。
苯丙氨酸脱氨酶酶活定义：40℃，每分钟转化L-Phe生成1μmol反式肉桂酸所需酶量为1U。
D-苯丙氨酸的光学纯度(eeD)计算公式如下：
eeD＝[([Dphe,out-Lphe,out])/(Dphe,out+Lphe,out)]×100％；Lphe,in表示泵入反应器中底物中L-苯丙氨酸的浓度(mM)；Lphe,out反应过程中流出反应器的产物中残余的L-苯丙氨酸的浓度(mM)；Dphe, out是泵入反应器中底物中D-苯丙氨酸的浓度。
实施例1 构建高效表达粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的工程菌；
1、获得粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的基因序列(pal)
(1)装有50mL培养基的250mL的三角瓶中接入粘红酵母，30℃培养18-20h至生长对数期(OD600＝1.0)，采用酸性酚提取总RNA
(2)RNA的提取按照分子克隆实验手册(第三版)方法进行；
(3)反转录克隆粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶(pal)的基因
以引物primer F：5'-GGAATTCCATATGATGGCCCCCTCCGTCGACTCGATC-3'；primerR：5'-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3'，PCR扩增目的基因，PCR的条件是：94℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火30sec，72℃延伸2min，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测。所得苯丙氨酸脱氨酶的基因(pal)序列如SEQ ID NO.1所示。
2、构建克隆载体pUCm-T-pal
0.25mL离心管中加入5μL上述PCR产物，1μL 10×Taqbuffer，1μL dATP(2mM)，1μLTaq酶(5U/μL)加水至10μL，70℃反应30min采用磁珠法提纯，10μL无菌水重悬。取5μL，加入1μL连接buffer，1μL 50％PEG，1μL pUCm-T载体，1μL T4连接酶，加去离子水至10μL，于16℃过夜连接。然后加入10μL 5×KCM(0.5M KCl，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2)，去离子水30μL混匀后加入至50μL的E.coli JM109感受态中，冰浴30min，42℃热击90sec，冰上2min，加入100μL的新鲜LB培养基，37℃培养30-60min，取100μL涂布含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板，37℃培养10h，挑取单菌落，接入5mL含50ug/mL的氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养10h，取2mL菌液，提质粒，PCR验证构建的pUCm-T-pal，样品进行测序。
3、构建表达载体pET-28a(+)-pal
Ndel和EcoRl分别对pUCm-T-pal和空载体pET-28a(+)进行双酶切，胶回收后于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑阳性重组子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证，阳性克隆即pET-28a(+)-pal。
实施例2 苯丙氨酸脱氨酶的生产
1、诱导表达
取1μL pET-28a(+)-pal，转入E.coli BL21，取100μL涂布含有卡那霉素(50ug/mL)的LB平板，37℃培养10h，挑取单菌落至5mL的LB培养基中37℃培养10h，取1mL培养液至100mL的LB培养基中37℃培养至OD600为0.6时加入至终浓度为0.4mM的IPTG，26℃诱导表达12h后离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测和酶活性测定(图1)。
2、工业纯酶的制备
重组菌发酵液离心去上清后，菌体洗涤2次，菌体采用超声波破碎，10000g离心5min，取上清，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为35％，缓慢搅拌使其完全溶解。调节pH值，使酶液的pH保持在8.7，静置半小时后10000×g低温离心10min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为55％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀。将沉淀溶解在25mMTris-HCl pH8.7的缓冲液中并且4℃透析数小时后检测酶的活性，活性达到4.2U/mg。
实施例3 固定化酶的制备
1、载体的化学修饰
以介孔二氧化硅MCM-41为载体，将氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羟基上，提供共价固定的锚定位点。具体地，将1g MCM-41、50mL无水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用无水甲醇洗涤三次，真空干燥后备用。获得修饰的载体MCM-41-NH2，采用红外光谱进行分析，确定氨基的嫁接(图2，3)，由图3可知，氨基成功嫁接在介孔材料MCM-41上。
2、固定化酶的制备
取1g的载体MCM-41-NH2与0.5％戊二醛(GA)在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤三次，尽可能洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制备成MCM-41-NH-GA。取1g MCM-41-NH-GA与50mg的酶活性为4.2U/mg的酶溶液(Tis-HlC缓冲液溶液，50mM,pH8.5)进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL，流程如图2所示。获得的固定化酶的活力达到4.08U/mg。
3、固定化酶的酶学性质
取适量的固定化酶和游离酶分别加入至250μL Tris-HlC缓冲溶液(50Mm，pH8.5)，然后加入250μL的40mM的L-苯丙氨酸溶液，于50℃反应30min后，测定反式肉桂酸的含量。酶单位的定义为：在50℃下每min形成1μmol的反式肉桂酸所需的酶为1个单位。固定化PAL的酶活为游离酶的92％，酶活为4.08U/mg。酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为8.5，重复催化反应30次后，固定化酶的酶活仅损失15％(图4)，表面该方法制备的酶稳定好，能适应工业化的应用。
实施例4 固定化酶催化DL-苯丙氨酸产D-苯丙氨酸
填充床酶反应器的构建：100个酶活单位的MCM-41-NH-GA-RgPAL与100g的硅藻土充分混合，装进50cm×25cm的玻璃柱中，反应液从底部由蠕动泵泵入酶床，反应液从柱上部流出，反应液循环进出填充床反应器，反应器的温度由循环夹套控制在50℃(图5)。
生产工艺：以12mL/min的流速往填充床酶反应器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，温度控制在50℃，每隔4h取样分析反应液中D-苯丙氨酸的光学纯度和L-苯丙氨酸的转化率，当L-苯丙氨酸转化率达到80％时，调整反应液的pH至5，沉淀产物肉桂酸后再调整至初始pH8.5，反应液泵入反应器继续反应，直至光学纯度(ee值)超过99％时，反应结束，反应过程中D-苯丙氨酸的光学纯度变化图6所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种应用固定化苯丙氨酸脱氨酶生产D-苯丙氨酸的方法，其特征在于，以DL-苯丙氨酸溶液为底物，将固定化苯丙氨酸脱氨酶填装入固定床得到固定床酶反应器，催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，得到高光学纯的D-苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反应器是由固定化苯丙氨酸脱氨酶与硅藻土混匀后填充玻璃柱得到。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反应器是将100-200个酶活单位的固定化苯丙氨酸脱氨酶与100-120g的硅藻土充分混合，装进径高比为5:1，体积为450mL的玻璃柱中，固定床酶反应器的温度以循环夹套控制。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述固定化苯丙氨酸脱氨酶主要通过以下步骤获得：(1)MCM-41载体的修饰：以介孔二氧化硅MCM-41为载体，将氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羟基上得到MCM-41-NH2，提供共价固定的锚定位点；(2)制备MCM-41-NH-GA：取适量的载体MCM-41-NH2与0.5％戊二醛在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤，洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制备成MCM-41-NH-GA；(3)固定化酶：取适量的MCM-41-NH-GA与酶溶液进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体是将1g MCM-41、50mL无水甲苯、2mL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用无水甲醇洗涤三次，真空干燥后获得修饰的载体MCM-41-NH2；所述步骤(2)取1g MCM-41-NH2载体与0.5％戊二醛在室温下反应1h，然后用双蒸水洗涤三次，洗去多余的戊二醛，室温下干燥，制成MCM-41-NH-GA。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)取1g MCM-41-NH-GA与50mg的酶活性为3-5U/mg的酶溶液进行混合，在室温下反应2h，获得共价固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。
7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸包括以下步骤：以12mL/min的流速往固定床酶反应器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，温度控制在50℃，当流出的反应液中L-苯丙氨酸转化率达到80％时，调整反应液的pH至5，沉淀产物肉桂酸后再调整至初始pH8.5，将反应液泵入反应器继续反应，直至流出的反应液中D-苯丙氨酸的光学纯度超过99％时，反应结束。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脱氨酶是将苯丙氨酸脱氨酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的基因以pET-28a(+)为表达载体，在E.coli BL21中进行表达得到苯丙氨酸脱氨酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括对酶进行纯化：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为35％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8.7，静置半小时后低温离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为55％，4℃静置数小时后，低温离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在25mM Tris-HCl pH8.7的缓冲液中并且4℃透析数小时。
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