CN104059913A - 一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启动子 - Google Patents
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Abstract
本课题组前期筛选获得一株灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌JNB5-1，该菌株合成灵菌红素受温度的影响，即在相对低温(28℃)条件下发酵培养时产灵菌红素，而相对高温(37℃)条件下发酵培养不产灵菌红素。本发明在2DE的基础上首次研究了一种与灵菌红素合成受温度调控相关的温控型启动子，即灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)基因上游的启动子。将该启动子导入大肠杆菌在不同温度条件(28℃和37℃)处理下，能够促进下游基因的表达，并且在28℃时的强度是37℃时的2.1倍。本发明中的温控型启动子为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为构建高产灵菌红素菌株、提高菌株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种源于灵菌红素高产菌株粘质沙雷氏菌的温度调控型启动子。
背景技术
启动子(promoter)是一段RNA聚合酶识别、结合和起始转录的特定DNA序列。启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达的空间、时间和表达强度等；是人们定向改造生物的重要限制因素。生物在生长发育中可以根据自身和环境来定时、定位和定量的表达特定基因，这种能力是通过生物体的DNA顺式作用元件(启动子、增强子、沉默子)、反式作用因子和光、热等外界环境因素的相互作用来实现的，其中启动子的作用尤为关键。因此，研究启动子的功能对于生物的生长发育和探讨生物适应环境的机制等均有重要意义。
报告基因(reporter gene)是一种编码易被检测的蛋白质或酶的基因，其与目的基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控。作为一种简便有效的方法，报告基因在微生物检测和调控研究中正发挥着越来越重要的作用。报告基因在基因时空表达调控中发挥着重要的作用，它是一种分析结构基因旁侧区域潜在的顺式作用元件和反式作用因子相互作用的强有力的工具。其优点是简单方便、可靠、灵敏度高、适用于大规模的检测。报告基因主要有氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶、半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶和荧光蛋白等。目前，在动物、植物、微生物和医学等领域广泛应用的有氯霉素乙酰转移酶、半乳糖苷酶和荧光蛋白。其中，氯霉素乙酰转移酶最早应用于检测生物体基因表达，其表达产物较稳定，且在活性很低的水平就能被检测出来。
本课题组前期从土壤中筛选获得一株灵菌红素(prodigiosin，PG)高产菌株粘质沙雷氏菌(Serratia marcecens)JNB5-1，其灵菌红素的产量为6.14g/L，达国内最高产量之一。研究发现该菌株合成灵菌红素受温度的影响：在相对低温(28℃)条件下发酵培养时产灵菌红素，而相对高温(37℃)条件下发酵培养不产灵菌红素。并且利用双向电泳和质谱鉴定初步探究了温度对该菌合成灵菌红素受温度影响的原因，结果发现了灵菌红素合成途径中的氧甲基转移酶(PigF)在不同温度(28℃和37℃)条件下的表达水平具有显著差异性。
本发明在以上基础上首次利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因作为报告基因，通过克隆氧甲基转移酶基因(pigF)上游启动子序列、构建启动子探测载体、转化大肠杆菌。获得重组菌后对启动子进行功能验证，结果发现：携带氧甲基转移酶基因上游启动子(P-pigF)的重组大肠杆菌在28℃条件下CAT酶活力是5.02U/mg；37℃条件下CAT酶活力是2.39U/mg。因此，P-pigF具有启动子的活性，并且28℃条件下比37℃条件下的强度高2.1倍，即P-pigF受温度的调控。
以上研究为粘质沙雷氏菌合成灵菌红素受温度影响的原因提供了新线索；为进一步研究粘质沙雷氏菌灵菌红素合成代谢奠定了基础；也为构建高产灵菌红素菌株、提高菌株产灵菌红素的温度适应性提供了理论指导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种温控型启动子，即氧甲基转移酶基因上游的启动子。该启动 子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在本发明中简称为P-pigF。P-pigF能在不同温度(28℃和37℃)条件下驱动报告基因(cat)的表达；并且该启动子受温度的调控，即它在28℃时的强度是37℃时的2.1倍。本发明还提供了含有目标启动子的核苷酸编码序列的重组载体，它是通过将氧甲基转移酶基因上游的启动子插入载体的多克隆位点而得。
本发明的技术方案：
主要试剂：乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)和5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等购于Sigma公司。
氧甲基转移酶(PigF)基因上游启动子重组探测载体的构建：
1.粘质沙雷氏菌基因组DNA的提取
1)挑取粘质沙雷氏菌单菌落接种于10mL LB培养基中，28℃200r/min培养至对数生长期。
2)取上述菌液1.5mL于离心管中，8000×g离心5min，去上清。
3)用0.5mL TE缓冲液(pH8.0)洗涤细胞2次，重悬细胞。
4)加20μL(10mg/mL)溶菌酶，混匀，37℃水浴30min。
5)加100μL10％SDS，混匀，37℃水浴30min。
6)加50μL蛋白酶K，65℃反应3h(每隔半小时混匀1次)。
7)加入等体积的饱合酚，混匀，离心。上层溶液移入新的离心管中。
8)重复上步骤1次，然后加入等体积的氯仿抽提2次，离心。
9)上层溶液移入新的离心管中(注：尽量不要带入下层液体)。加入2倍体积的无水乙醇沉淀，同时加入1/10KAc。等待沉淀。
10)离心去上清，用70％乙醇悬浮洗涤1次，离心，空离除尽液体，晾干。
11)用50μLTE缓冲液溶解，-20℃保藏。
2.目标启动子片段的克隆及序列分析
利用S.marcecens JNB5-1染色体DNA和pACYCDuet-1，P-pigF和cat的上、下游引物进行PCR扩增(扩增条件参照Ex Taq DNA聚合酶说明书)。将扩增出的目标启动子和cat基因片段进行胶回收(参照胶回收试剂盒说明书)，然后将回收产物分别与pMD18-T载体连接，转化E.coli JM109感受态细胞，筛选阳性转化子。提取重组质粒，酶切验证后送上海生工测序。登陆http://www.fruitfly.org/seq-tools/promoter.html，利用在线软件(Berkeley Drosophila Genome Project)检测可能的启动子功能区域并分析其保守序列。
3.携带目标启动子重组探测载体的构建
将pMD18-T-cat用Pst I和Hind III双酶切后，胶回收cat片段与经相同限制性内切酶线性化的质粒pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接过夜。转化E.coli JM109感受态细胞，筛选阳性转化子。重组质粒进行酶切和PCR验证。
4.大肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化
1)将E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)过夜活化，然后转接并在37℃震荡培养至OD600约为0.3-0.4。
2)将上述菌液置于冰上，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约10min(注：甘油和CaCl2溶液同样置于冰上)。
3)冷却后的菌液分装至1.5mL离心管中(装液量约1.2mL)，离心管迅速置于冰上10min。
4)上述菌液4℃5000×g离心30s，迅速置于冰上静置2min。弃上清，用400μL预冷的CaCl2重悬菌体，然后置于冰上放置15min。
5)重复4)步骤一次。
6)4℃5000×g离心30s，弃上清。用80μL预冷的CaCl2重悬菌体，然后加40μL50％甘油，混匀，-40℃保藏备用。
7)将基因连接产物(约10μL)和感受态细胞混匀，迅速置于冰上放置45min。
8)将上述混合物进行热击(42℃水浴1min30s)，冰上放置5min。
9)加入800μL LB培养基，37℃震荡培养60min。5000×g离心2min，弃上清(保留约200μL细胞培养物)。涂布抗生素平板，筛选阳性转化子。
启动子功能分析(不同温度下启动子强度分析)：
挑取上述重组大肠杆菌菌落(在100μg/mL的氨苄青霉素平板上生长)接到10mL LB培养基中，37℃160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28℃和37℃，160r/min培养12h，收集发酵液。4℃5000×g离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl(pH7.8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎((工作3秒间歇2秒))5min，离心，取上清用于CAT酶活的测定。E.coli JM109作为阴性对照。
CAT酶活测定参考文献，反应体系包括250mmol/L Tris-HCl(pH7.8)，0.1mmol/L acetyl-CoA，0.4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37℃水浴中温育2min，加入氯霉素至终浓度为0.1mmol/L，混匀后立即测定光吸收值A412；以未加氯霉素的反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1μmol氯霉素所需的酶量为一个活力单位(U)。总蛋白含量采用Bradford法测定。
附图说明
图1启动子和报告基因PCR产物电泳图；
图2pMD18-T-PpigF-cat的酶切验证
图3启动子重组探测载体PCR验证
图4CAT酶活测定的结果
具体实施方式
实施例1：pigF上游启动子序列分析
根据GenBank中报道的序列确定pigF的转录起始点，选取其上游579bp的序列，并将其命名为P-pigF。登陆http://www.fruitfly.org/seq-tools/promoter.html，利用在线软件(Berkeley Drosophila Genome Project)预测可能的启动子功能区域并分析其保守序列。分析结果表明，一段得分为0.79的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示
(gcgcctttgccacggtgtgcgaggaactctccacctttttatacttagggagccagcaatg)中存在与细菌标准的-10区(TATAAT)和-35区(TTGACA)相似的序列，说明核心启动子区的可靠性很高。目标启动子序列越接近上述保守序列，启动子的强度可能越高。
实施例2：启动子和报告基因的克隆
根据启动子和报告基因的序列设计PCR引物。以S.marcecens JNB5-1染色体DNA为模版，利用P-pigF上下游引物进行PCR扩增，得到大小约为579bp的目的基因片段(图1)；以pACYCDuet-1为模版，利用cat基因上下游引物进行PCR扩增，得到大小约654bp的cat片段(图1)。
P-pigF引物序列为：F：5’-ACCCGTCTAGAAAAAAGCCTATGGCACGGCGG-3’
R：5’-CGCCTGCAGTGCTGGCTCCCTAGTCTAAAAAGG-3’
cat引物序列为：F：5’-CGCCTGCAGATGGAGAAAAAAATCACTGG-3’
R：5’-CCCAAGCTTTCATTCTTCG TCACCTCC-3’
扩增产物采用上海生工胶回收试剂盒回收，然后与pMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T-PpigF和pMD18-T-cat，酶切验证后送上海生物工程有限公司测序。
实施例3：启动子重组探测载体的构建
将pMD18-T-cat用Pst I和Hind III酶切，胶回收后与用相同限制性内切酶线性化的pMD18-T-PpigF经T4DNA连接酶连接，构建重组载体pMD18-T-PpigF-cat，转化E.coli JM109感受态细胞，提取重组质粒进行酶切和PCR验证，如图2、3所示，pMD18-T-PpigF-cat用Pst I和Hind III双酶切后得到3269bp和649bp的片段，表明启动子探测载体构建成功。以携带启动子的重组质粒为模板进行PCR，扩增出启动子片段，与阳性对照(以S.marcecens JNB5-1基因组DNA为模板)的片段大小一致，而阴性对照(以pMD18-T-cat为模板)中无条带显示，表明启动子探测载体构建成功。
实施例4：不同温度条件下启动子强度分析
挑取上述在100μg/mL的氨苄青霉素平板上生长的重组大肠杆菌菌落，接到10mL LB培养基中，37℃160r/min培养12h，然后转接到50mL培养基中，分别在28℃和37℃，160r/min培养12h，收集发酵液。4℃5000×g离心5min收集菌体，用100mmol/L Tris-HCl(pH7.8)洗涤2遍。重悬细胞后在冰浴中超声破碎(工作3秒间歇2秒)5min，离心，取上清用于CAT酶活的测定。E.coli JM109作为阴性对照。
CAT酶活测定反应体系包括250mmol/L Tris-HCl(pH7.8)，0.1mmol/L acetyl-CoA，0.4mg/mL DTNB和适量的粗酶液。将上述反应混合物置于37℃水浴中温育2min，加入氯霉素至终浓度为0.1mmol/L，混匀后立即测定光吸收值A412；以未加氯霉素的反应液为对照。CAT酶活单位定义：在上述条件下，每分钟乙酰化1μmol氯霉素所需的酶量为一个活力单位(U)。蛋白含量采用Bradford法测定。不同温度(28℃和37℃)条件下测定CAT酶活力的结果如图4所示，阴性对照E.coli JM109无CAT活性；E.coli JM109/pMD18-T-PpigF-cat在28℃和37℃下的酶活分别为5.02U/mg和2.39U/mg；因此，P-pigF具有启动子的功能，并且在28℃时的强度是37℃时的2.1倍，即P-pigF受温度的调控。
Claims (8)
1.PigF基因启动子，其中包含下述(a)～(d)中任意一项DNA：
(a)SEQ ID NO：1所示的DNA；
(b)包含SEQ ID NO：1所示的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；
(c)包含在SEQ ID NO：1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA；
(d)与SEQ ID NO：1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有启动子活性/来源于沙雷氏菌属细菌的DNA。
2.一种质粒，其中含有权利要求1所述的PigF基因启动子。
3.权利要求2所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF。
4.一种质粒，将氯霉素乙酰转移酶基因cat与权利要求3所述的质粒连接构建而获得。
5.权利要求4所述的质粒，该质粒为pMD18-T-PpigF-cat。
6.一种转化细胞，其通过往宿主细胞中导入权利要求2、3、4或5所述的质粒而获得。
7.权利要求6所述的转化细胞，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.扩增权利要求1所述DNA分子全长或任以片段的引物对。
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