CN112063642B - 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用 - Google Patents

一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。本发明提供了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液，所述预混液包括T5核酸外切酶和反应缓冲液；所述反应缓冲液由乙酸钾、Tris‑乙酸、乙酸镁、DTT和甘油组成。该预混液试剂成分少且相应成本低，反应条件不依赖于恒温设备、冰水混合物中即可进行，反应时间较短、只需5～10min；因此，本发明预混液在构建重组质粒或点突变质粒、制备构建重组质粒或点突变质粒的试剂盒中应用前景良好。

Description

一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用
技术领域
本发明属于分子克隆生物工程技术领域。更具体地，涉及一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。
背景技术
重组质粒构建是分子生物学实验中最基础、最重要的技术之一，依赖于限制性内切酶和T4 DNA连接酶的质粒构建方法仍然是最常用的手段之一。但随着生物技术的不断发展，重组质粒、载体的构建和修饰对克隆方法的要求也越来越高，传统的酶切和酶连方法的低效、步骤繁琐、序列限制使得它已经在很多方面受限。因此，GATEWAY技术和Gibson组装技术等多种基因克隆的新技术应运而生，克服了传统的酶切和酶连方法的限制；其中，GATEWAY技术的原理是利用λ噬菌体的位点特异重组系统，实验过程包括BP反应和LR反应，BP反应将目的基因克隆到一个donor载体上，然后LR反应将目的基因克隆到目标载体中，整个过程较为繁琐；Gibson组装技术是在体外利用三种不同类型的酶(T5核酸外切酶、Phusion DNA聚合酶、Taq DNA连接酶)将目的DNA插入到线性载体中，形成完整的DNA分子。
目前，在依赖T5核酸外切酶的构建体系中，公开号为CN108841901A、公开日为2018年11月20日的中国发明专利公开了一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的试剂盒及其应用，由T5核酸外切酶和含PEG8000的缓冲体系组成，利用该试剂盒提高了DNA的组装效果，可以同时完成多个DNA片段的组装；但是，其反应温度为15℃～60℃、需要依赖于恒温设备，反应时间为10～60min、耗时长，实验流程及操作步骤较为繁琐，阳性率及获得的阳性克隆相对较低，且试剂PEG8000的成本很高。因此，提供一种成本低、不需要依赖恒温设备、反应时间短、阳性比率显著提高的方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。
本发明的目的是提供一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液。
本发明另一目的是提供所述预混液在构建重组质粒或制备构建重组质粒的试剂盒中的应用。
本发明另一目的是提供所述预混液在构建点突变质粒或制备构建点突变质粒的试剂盒中的应用。
本发明另一目的是提供一种构建重组质粒的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液，所述预混液包括T5核酸外切酶和反应缓冲液；所述反应缓冲液由乙酸钾、Tris-乙酸、乙酸镁、DTT和甘油组成。
优选地，所述乙酸钾的浓度为75～120mM。
更优选地，所述乙酸钾的浓度为100mM。
优选地，所述Tris-乙酸的浓度为30～50mM。
更优选地，所述Tris-乙酸的浓度为40mM。
优选地，所述乙酸镁的浓度为15～30mM。
更优选地，所述乙酸镁的浓度为20mM。
优选地，所述DTT的浓度为1～3mM。
更优选地，所述DTT的浓度为2mM。
优选地，所述甘油的体积分数为10％～15％。
更优选地，所述甘油的体积分数为13％。
优选地，所述T5核酸外切酶的加入浓度为0.05～0.1U/mL。
更优选地，所述T5核酸外切酶的加入浓度为0.08U/mL。
优选地，所述反应缓冲液的pH为7.5～8。
更优选地，所述反应缓冲液的pH为7.9。
本发明还提供了一种构建重组质粒的方法，扩增目的DNA片段并将pUC19载体用限制性内切酶双酶切后，将所得线性化载体和DNA片段与所述预混液混合得到反应溶液，放置于冰水混合物中进行反应，转化。
优选地，所述线性化载体和DNA片段的摩尔比为1：1～10。
更优选地，所述线性化载体和DNA片段的摩尔比为1：3。
优选地，所述反应的时间为5～10min。
更优选地，所述反应的时间为7min。
优选地，所述预混液为2x即用型预混液。即所述预混液与所述反应溶液的体积比为1：2。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种依赖T5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用。本发明预混液为2x即用型试剂，预混液成分中不需要PEG8000，试剂成分少且相应成本低，反应条件不依赖于恒温设备、冰水混合物中即可进行，反应时间较短、只需5～10min；利用本发明预混液构建重组质粒或点突变质粒能够减少实验流程及操作步骤；因此，本发明预混液能够广泛用于构建重组质粒或点突变质粒、制备构建重组质粒或点突变质粒的试剂盒中。
附图说明
图1是单基因片段克隆示意图。
图2是1k bp、5k bp、13k bp基因片段转化子菌检图；其中，(A)图为1k bp基因片段转化子菌检图；(B)图为5k bp基因片段转化子菌检图；(C)图为13k bp基因片段转化子菌检图(DNA Maker大小从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp)。
图3是1k bp、5k bp、13k bp基因片段转化平板图；其中，(A)图为1k bp基因片段转化平板图；(B)图为5k bp基因片段转化平板图；(C)图为13k bp基因片段转化平板图。
图4是两个基因片段克隆示意图。
图5是两个基因片段转化子菌检和转化平板图；其中，(A)图为两个基因片段转化子菌检图(DNA Maker大小从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp)；(B)图为两个基因片段转化子转化平板图。
图6是三个基因片段克隆示意图。
图7是三个基因片段转化子菌检和转化平板图；其中，(A)图为三个基因片段转化子菌检图(DNA Maker大小从上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、500bp)；(B)图为三个基因片段转化子转化平板图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例所用试剂和材料包括：E.coli DH5α克隆感受态细胞，E.coli str.K-12substr.MG1655基因组，pUC19质粒载体，限制性内切酶PstI、XbaI、EcoRI、HindIII，Phusion高保真DNA聚合酶，2x PCR MIX(Servicebio)，2x In-Fusion Mix，DNA Maker，琼脂糖凝胶回收试剂盒。
实施例1单个不同长度大小DNA片段克隆到pUC19载体中
1、实验方法
(1)单个DNA片段扩增引物设计原则
单基因片段克隆示意图如图1所示，插入片段与线性化载体两端都有15-25bp左右的同源臂，DNA片段扩增分别设计引物F1、R1，F1和R1分别与线性化载体有15-25bp左右同源臂。
(2)PCR扩增DNA片段
以含E.coli str.K-12substr.MG1655基因组为模板，利用以上设计的引物、按照以下反应体系和条件进行PCR扩增，得到DNA片段。引物及其序列如下：
1k bp DNA片段扩增使用引物：
引物F1k：5’-ctatgaccatgattacgccaagcttaagtcgtaacaaggtaaccgta-3’；
引物R1k：5’-ttgtaaaacgacggccagtgaattcctcccactgcttgtacgtac-3’；
5k bp DNA片段扩增使用引物：
引物F5k：5’-ttacgccaagcttgcatgcctgcagaagtcgtaacaaggtaaccgta-3’；
引物R5k：5’-ctcggtacccggggatcctctagacaggcgttgaagctggta-3’；
13k bp DNA片段扩增使用引物：
引物F13k：5’-ttacgccaagcttgcatgcctgcagaagtcgtaacaaggtaaccgta-3’；
引物R13k：5’-ctcggtacccggggatcctctagagtgggtacgaaatacatc-3’。
PCR反应体系(50μL)：
Figure BDA0002666700040000041
Figure BDA0002666700040000051
PCR反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整20s/1k bp)，25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化后定量。
(3)表达载体双酶切及预混液处理
pUC19空载体分别用PstI和XbaI或EcoRI和HindIII进行双酶切(双酶切体系pUC19质粒5μg、PstI 5U、XbaI 5U、10×Reaction Buffer 5μL、加ddH2O至50μL；pUC19质粒5μg、EcoRI 5U、HindIII 5U、10×Reaction Buffer 5μL、加ddH2O至50μL)后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收后定量。
将基因片段和线性化载体pUC19(1k bp基因片段的载体是用EcoRI和HindIII双酶切，5k bp、13k bp基因片段的载体是用PstI和XbaI双酶切)、预混液(2×In-Fusion MIX)混合，配制成如下反应体系后，放置于冰水混合物中处理5min，即可进行转化。
其中，预混液包括加入浓度为0.08U/mL的T5核酸外切酶和反应缓冲液，反应缓冲液由100mM的乙酸钾、40mM的Tris-乙酸、20mM的乙酸镁、2mM的DTT和体积分数为13％的甘油组成，反应缓冲液的pH为7.9。
反应体系(10μL，1k bp基因片段)：
Figure BDA0002666700040000052
反应体系(10μL，5k bp基因片段)：
Figure BDA0002666700040000053
反应体系(10μL，13k bp基因片段)：
Figure BDA0002666700040000061
(4)转化
2×In-Fusion MIX处理结束后，立即进行克隆转化。将10μL反应体系于冰上与100μL DH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500μL SOC(或LB)培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将适量样品涂布于抗性固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h。
(5)阳性转化子检测
从上述的的转化平板中随机挑取10个单菌落于10μL无菌水中，即为PCR模板，以M13F和M13R为引物对，进行菌落PCR。
引物M13F：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；
引物M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’。
菌落PCR体系(10μL)：
Figure BDA0002666700040000062
PCR反应条件：98℃预变性5min，然后98℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整10s/1k bp)，28个循环，最后72℃延伸5min。取5uL菌落PCR产物以1.0％的低熔点琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
2、实验结果
1k bp、5k bp、13k bp基因片段转化子菌检图如图2所示，1k bp、5k bp、13k bp基因片段转化平板图如图3所示，可以看出，菌检结果显示阳性率为100％，插入片段为1k bp、5k bp、13k bp，最大插入片段为13k bp。
实施例2两个不同长度大小DNA片段克隆到pUC19载体中
1、实验方法
(1)两个DNA片段扩增引物设计原则
两个基因片段克隆示意图如图4所示，对于两个目的基因克隆，分别设计两对引物1-F1、1-R1和2-F2、2-R2，其中1-R1与2-F2有15-25bp同源臂，1-F1和2-R2分别与载体有15-25bp同源臂。
(2)PCR扩增DNA片段
以含E.coli str.K-12substr.MG1655基因组为模板，以各自基因片段引物、按照以下反应体系和条件分别进行PCR扩增，扩增出两个基因片段，大小分别为300bp和500bp。两个基因片段扩增使用引物及其序列如下：
引物1-F1：5’-ctatgaccatgattacgccaagcttaagtcgtaacaaggtaaccgta-3’；
引物1-R1：5’-tgaagtattttttatttaatcactacagagatggtggagc-3’；
引物1-F2：5’-gattaaataaaaaatacttcagagtgtacctgcaaaggttca-3’；
引物1-R2：5’-ttgtaaaacgacggccagtgaattctccagacgcttccactaaca-3’。
PCR反应体系(50μL)：
Figure BDA0002666700040000071
PCR反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整20s/1k bp)，25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒分别纯化后定量。
(3)表达载体双酶切及预混液处理
pUC19空载体用EcoRI和HindIII进行双酶切(双酶切体系pUC19质粒5μg、EcoRI5U、HindIII 5U、10×Reaction Buffer 5μL、加ddH2O至50μL)后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收后定量。
将两个基因片段和线性化载体pUC19(EcoRI和HindIII双酶切)、预混液(2×In-Fusion MIX)混合，配制成如下反应体系后，放置于冰水混合物中处理8min，即可进行转化(基因片段与线性化载体的摩尔比为3:1，两个基因片段的摩尔比为1:1)。
其中，预混液包括加入浓度为0.05U/mL的T5核酸外切酶和反应缓冲液，反应缓冲液由75mM的乙酸钾、50mM的Tris-乙酸、15mM的乙酸镁、3mM的DTT和体积分数为10％的甘油组成，反应缓冲液的pH为8。
反应体系(10μL)：
Figure BDA0002666700040000081
(4)转化
2×In-Fusion MIX处理结束后，立即进行克隆转化。将10μL反应体系于冰上与100μL DH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500μL SOC(或LB)培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将适量样品涂布于抗性固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h。
(5)阳性转化子检测
从上述的的转化平板中随机挑取10个单菌落于10μL无菌水中，即为PCR模板，以M13F和M13R为引物对，进行菌落PCR。
引物M13F：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；
引物M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’。
菌落PCR体系(10μL)：
Figure BDA0002666700040000082
PCR反应条件：98℃预变性5min，然后98℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整10s/1k bp)，28个循环，最后72℃延伸5min。取5uL菌落PCR产物以1.0％的低熔点琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
2、实验结果
两个基因片段转化子菌检和转化平板图如图5所示，结果显示两个基因片段总大小为800bp，随机挑取10个转化子菌检显示阳性率为100％。
实施例3三个不同长度大小DNA片段克隆到pUC19载体中
1、实验方法
(1)三个DNA片段扩增引物设计原则
三个基因片段克隆示意图如图6所示，对于三个目的基因克隆，分别设计三对引物1-F、1-R、2-F、2-R和3-F、3-R，其中1-R与2-F有15-25bp同源臂，2-R与3-F有15-25bp同源臂，1-F和3-R分别与载体有15-25bp同源臂。
(2)PCR扩增DNA片段
以含E.coli str.K-12substr.MG1655基因组为模板，以各自基因片段引物、按照以下反应体系和条件分别进行PCR扩增，扩增出三个基因片段，大小分别为350bp、450bp和1200bp。三个基因片段扩增使用引物及其序列如下：
引物1-F：5’-ttacgccaagcttgcatgcctgcagaagtcgtaacaaggtaaccgta-3’；
引物1-R：5’-tgaagtattttttatttaatcactacagagatggtggagc-3’；
引物2-F：5’-gattaaataaaaaatacttcagagtgtacctgcaaaggttca-3’；
引物2-R：5’-gtacttagatgtttcagttcccccggttc-3’；
引物3-F：5’-gaaacatctaagtaccccgaggaaaagaaatcaa-3’；
引物3-R：5’-ctcggtacccggggatcctctagaggccaacatagccttctc-3’。
PCR反应体系(50μL)：
Figure BDA0002666700040000091
PCR反应条件：95℃预变性5min，然后95℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整20s/1k bp)，25个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒分别纯化后定量。
(3)表达载体双酶切及预混液处理
pUC19空载体用PstI和XbaI进行双酶切(双酶切体系pUC19质粒5μg、PstI 5U、XbaI5U、10×Reaction Buffer 5μL、加ddH2O至50μL)后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶回收后定量。
将三个基因片段和线性化载体pUC19(PstI和XbaI双酶切)预混液(2×In-FusionMIX)混合，配制成如下反应体系后，放置于冰水混合物中处理10min，即可进行转化(基因片段与线性化载体的摩尔比为3:1，三个基因片段之间摩尔比为1:1:1)。
其中，预混液包括加入浓度为0.1U/mL的T5核酸外切酶和反应缓冲液，反应缓冲液由120mM的乙酸钾、30mM的Tris-乙酸、30mM的乙酸镁、1mM的DTT和体积分数为15％的甘油组成，反应缓冲液的pH为7.5。
反应体系(10μL)：
Figure BDA0002666700040000101
(4)转化
2×In-Fusion MIX处理结束后，立即进行克隆转化。将10μL反应体系于冰上与100μL DH5α克隆感受态混合，并冰浴30mins，然后在42℃水浴锅中热激90s，立即放入冰上，3mins后在体系中加入500μL SOC(或LB)培养基，在37℃摇床中孵育1h后，将适量样品涂布于抗性固体平板，在37℃培养箱中倒置培养12h。
(5)阳性转化子检测
从上述的的转化平板中随机挑取10个单菌落于10μL无菌水中，即为PCR模板，以M13F和M13R为引物对，进行菌落PCR。
引物M13F：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’；
引物M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’。
菌落PCR体系(10μL)：
Figure BDA0002666700040000111
PCR反应条件：98℃预变性5min，然后98℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸(时间依据基因大小调整10s/1k bp)，28个循环，最后72℃延伸5min。取5uL菌落PCR产物以1.0％的低熔点琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
2、实验结果
三个基因片段转化子菌检和转化平板图如图7所示，三个基因片段总大小为2000bp，随机挑取10个转化子菌检显示阳性率为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种构建重组质粒的方法，其特征在于，扩增目的DNA片段并将pUC19载体用限制性内切酶双酶切后，将所得线性化载体和DNA片段与预混液混合得到反应溶液，放置于冰水混合物中进行反应，转化，
所述预混液包括T5核酸外切酶和反应缓冲液；所述反应缓冲液由乙酸钾、Tris-乙酸、乙酸镁、DTT和甘油组成；
所述乙酸钾的浓度为75～120mM，所述Tris-乙酸的浓度为30～50mM，所述乙酸镁的浓度为15～30mM，所述DTT的浓度为1～3mM，所述甘油的体积分数为10％～15％；
所述T5核酸外切酶的加入浓度为0.05～0.1U/mL；
所述反应缓冲液的pH为7.5～8；
所述线性化载体和DNA片段的摩尔比为1：1～10；
所述反应的时间为5～10min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预混液为2x即用型预混液，所述预混液与所述反应溶液的体积比为1：2。
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