CN106191009A - 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用 - Google Patents

体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106191009A
CN106191009A CN201610607681.7A CN201610607681A CN106191009A CN 106191009 A CN106191009 A CN 106191009A CN 201610607681 A CN201610607681 A CN 201610607681A CN 106191009 A CN106191009 A CN 106191009A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinase system
external multistage
multistage
following formula
assembly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610607681.7A
Other languages
English (en)
Inventor
郭天玮
钟云鹏
胡涛
李彦敏
杨平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd
Original Assignee
SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd filed Critical SUZHOU SYNBIO TECH Co Ltd
Priority to CN201610607681.7A priority Critical patent/CN106191009A/zh
Publication of CN106191009A publication Critical patent/CN106191009A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：5X pre‑assembly buffer35~45%，T5核酸外切酶0.1~0.15%，高保真Taq酶4.5~5.5%，ddH2O50~60%；其中，所述的5X pre‑assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre‑assembly buffer总体积20~30%的聚乙二醇、450~550mM的三（羟甲基）氨基甲烷、45~55mM的MgCl2、45~55mM的二硫苏糖醇、0.9~1.1mM的dNTPs。本发明的重组酶系统无需使用NAD和Taq DNA连接酶，使得整体成本降低。

Description

体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用
技术领域
本发明涉及一种体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用。
背景技术
现代分子生物学在研究基因表达和元件功能时，分子克隆每天都会用到。随着研究基因数量的增加和调控元件序列获取，通过对研究基因的快速克隆进行分析其功能的需求急剧增加。为了满足这一需求，需要选择一种简单、有效、强健、快速且能与任何DNA序列都能进行高通量克隆的方法。目前，已有许多定向克隆及多片段体外组装的方法，包括Gateway，In-fusion，Cold-fusion，T4 DNA polymerase-based Ligase IndependentCloning(LIC)，Golden Gate，Gibson Assembly等，考虑到经济及操作的简易性，成功率等因素，目前，最主要的是Gateway技术，Golden Gate，基于Ⅱ型限制性内切酶的连接方法和Gibson Assembly。
Gibson Assembly方案的酶系(2x，800ul)配置如下：
比例 试剂
128ul CBAR buffer
1ul ExoIII
20ul Taq DNA ligase
40ul Taq polymerase
610ul ddH2O
其中，CBAR buffer(4X)体系的配置如下：
比例 试剂
20％ PEG-8000
600mM Tris-HCl pH 7.5
40mM MgCl2
40mM DTT
800mM dNTPs
4mM NAD
反应温度为一步等温体系，50℃反应15-60min分钟。
其中,Gateway技术不依赖限制性内切酶而适用范围广泛，但是由于需要构建入门载体，需要花费大量时间和财力，以及限制DNA片段数量的克隆。Golden Gate适用于多片段基因的组装，然而，它依赖连接酶和Ⅱ型限制性内切酶，此类内切酶长度在6～8bp之间，很容易会出现在需克隆的目的片段序列上；Ⅱ型限制性内切酶的连接方法需要寻找合适的酶切位点，这个需要花费较多精力以及需要相应的限制性内切酶，所花费时间较多，当片段数量多时，需要较长的周期。Gibson Assembly是使用T5外切酶、DNA聚合酶及Taq连接酶而不依赖限制性内切酶点的多段重组方法，反应为一步等温法，这种简单、有效，强健、快速且适用除正向重复以外的DNA片段的组装方法，但是该组装酶价格较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种成本低的体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种体外多段重组酶系统，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assemblybuffer总体积20～30％的聚乙二醇、450～550mM的三(羟甲基)氨基甲烷、45～55mM的MgCl2、45～55mM的二硫苏糖醇、0.9～1.1mM的dNTPs。
优选地，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5Xpre-assemblybuffer总体积23.75～26.25％的聚乙二醇、475～525mM的三(羟甲基)氨基甲烷、47.5～52.5mM的MgCl2、47.5～52.5mM的二硫苏糖醇、0.95～1.05mM的dNTPs。
更优选地，按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assemblybuffer总体积24.75～25.25％的聚乙二醇、495～505mM的三(羟甲基)氨基甲烷、49.5～50.5mM的MgCl2、49.5～50.5mM的二硫苏糖醇、0.99～1.01mM的dNTPs。
优选地，所述的聚乙二醇为聚乙二醇-8000。
优选地，所述的三(羟甲基)氨基甲烷的pH为7.4～7.6。
本发明中，所述的体外多段重组酶系统为2X体外多段重组酶系统。
本发明的另一个目的是提供一种如权利要求1至6中任一项所述的体外多段重组酶系统在基因组装中的应用。
具体地，所述的基因组装的制备体系包括：19～21μL的ddH2O、9.5～10.5μL的体外多段重组酶系统、线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其中，所述的线性化克隆载体和所述的插入片段扩增产物的每片段最适使用量为(0.02×片段碱基对数)ng。
更具体地，所述的基因组装的制备体系在冰水浴中配制。
更具体地，将所述的基因组装的制备体系在PCR仪器内，在47.5～52.5℃下反应5～60min。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的重组酶系统的原料便宜易得，且无需使用NAD，使得整体成本降低，本发明的重组酶系统能够一次性组装多个DNA片段到载体上，大大缩短了组装周期，提高了生产效率，使企业在合成生物学领域提高核心竞争力。
说明书附图
图1为基因组装的流程图；
图2为载体酶切后的电泳图；
图3为扩增后的电泳图；
图4为培养后的平板图；
图5为菌检阳性率的图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。
实施例1：试验流程
1、重组酶体系的配置：
5X pre-assembly buffer的配置，其配方如表1：
表1
比例 试剂
25％(V/V) 聚乙二醇-8000(PEG-8000)
500mM 三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl(pH 7.5)
50mM MgCl2
50mM DTT
1mM dNTPs
重组酶系(2X)Mix的配置，其配方如表2：
2X Hot fusion Buffer(400ul)
表2
比例 试剂
160ul 5X pre-assembly buffer
0.5ul T5核酸外切酶
20ul 高保真Taq酶
220ul ddH2O
2.引物设计
插入片段扩增引物设计
通过在引物5’端引入同源重组序列，扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序列(20bp～25bp)。以pUC57作为克隆载体为例、进行三插入片段顺序拼接克隆(5’至3’按克隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段)为例，引物具体设计方案如下：
第一段的5’端与pUC57-Amp的EcoRⅠ酶切端有一段20～25bp一致的序列，称为重组臂(overlaps，以下用overlaps指重组臂)，第一段3’端与第二段5’端有20～25bp一致的序列，依次类推。
3.制备线性化载体
选择合适的酶切位点，并对克隆载体进行线性化，酶切后使用琼脂糖胶回收。
GC含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40％～60％范围之内时，重组效率将达到最高。
注：经选用无重复序列但GC含量高或低的区域进行阳性对照，其结果证明对重组效率无明显影响
单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
4.插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶扩增
PCR扩增的反应体系如表3中所示，PCR扩增的反应条件如表4中所示。
表3
体系组分 用量(μL)
ddH2O 35
5×PCR buffer 10
10mM dNTP 1
template 1
primer F 1
primer R 1
S15酶 1
表4
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性，将剩余部分进行回收。
5.组装
反应体系于冰浴中进行，制备体系如表5：
表5
每片段最适使用量＝[0.02×片段碱基对数]ng
例如，将长度为0.5kb、1kb、2kb三插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，各片段最适使用量为：
线性化克隆载体最适使用量：0.02×5000＝100ng
0.5kb插入片段最适使用量：0.02×500＝10ng
1kb插入片段最适使用量：0.02×1000＝20ng
2kb插入片段最适使用量：0.02×2000＝40ng
然后通过步骤4中PCR扩增所测定的每片段的浓度计算出线性化克隆载体和插入片段扩增产物的体积。
体系配制完成后，用移液器上下吹打几次混匀各组分，然后瞬离，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于PCR仪内50℃反应5～60min。
6.反应产物转化、培养
取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入400～500μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
7.菌检
用无菌枪头或者牙签挑选单菌落于230μl左右LB培养基中，放入37℃摇床1.5～2h后，取2～3μl菌液进行PCR，剩余菌检继续放入摇床。6h后将检到的菌液送测2～4个，以防止假阳性克隆。
实施例2：
1、在pUC57-Amp为载体，酶切位点EcoR I和Hind III。
其中，片段1的5’端和片段3的3’端分别与载体EcoR I酶切位点后25bp和Hind III酶切位点前25bp序列一致，片段2的5’端与片段1的3’端有25bp一致，片段2的3’端与片段3的5’段有25bp一致，片段1至3的序列参见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
2、反应酶系的配置与实施例1中相同。
3、线性化载体的制备
用EcoR I和Hind III限制性酶切位点对pUC57载体进行酶切，其体系如下表6。
表6
pUC57质粒 2ng
ddH2O Up to 50μl
10X限制性内切酶Buffer 5μl
EcoR I 2μl
Hind III 2μl
酶切完全后，进行琼脂糖凝胶回收，回收后用分光光度计测定浓度。pUC57载体酶切后电泳图如图2。
4、片段的扩增
以泓迅高保真酶(S15酶)进行扩增，扩增片段为1.0kb，PCR结束后琼脂糖凝胶电泳回收，回收后用分光光度计测定浓度。其电泳图如图3。
5、反应体系同实施例1。
6、组装
反应于冰浴中进行，制备体系如表7：
表7
反应条件同实施例1。
7、反应的转化、培养
取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入400～500μl LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养，平板图片见图4。
8、菌检
用无菌枪头或者牙签挑选单菌落于230μl左右LB培养基中，放入37℃摇床1.5～2h后，取2～3μl菌液进行PCR，剩余菌检继续放入摇床。6h后将检到的菌液送测2～4个，以防止假阳性克隆。图5为菌检阳性率，三段组装阳线概率30/32。
实施例3
基本上与实施例2相同，不同之处在于反应酶系，实施例3的重组酶体系的配置：
5X pre-assembly buffer的配置，其配方如表8：
表8
重组酶系(2X)Mix的配置，其配方如表9：
2X Hot fusion Buffer(400ul)
表9
比例 试剂
160ul 5X pre-assembly buffer
0.4ul T5核酸外切酶
18ul 高保真Taq酶
222ul ddH2O
实施例3的三段组装阳线概率为27/32。
实施例4
基本上与实施例2相同，不同之处在于反应酶系，实施例4的重组酶体系的配置：
5X pre-assembly buffer的配置，其配方如表10：
表10
比例 试剂
20％(V/V) 聚乙二醇-8000(PEG-8000)
450mM 三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl(pH 7.5)
55mM MgCl2
55mM DTT
1mM dNTPs
重组酶系(2X)Mix的配置，其配方如表11：
2X Hot fusion Buffer(400ul)
表11
实施例4的三段组装阳线概率为27/32。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
5X pre-assembly buffer 35~45%，
T5核酸外切酶 0.1~0.15%，
高保真Taq酶 4.5~5.5%，
ddH2O 50~60%；
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assemblybuffer总体积20~30%的聚乙二醇、450~550mM的三（羟甲基）氨基甲烷、45~55mM的MgCl2、45~55mM的二硫苏糖醇、0.9~1.1mM的dNTPs。
2.根据权利要求1所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
5X pre-assembly buffer 37.5~42.5%，
T5核酸外切酶 0.1~0.13%，
高保真Taq酶 4.7~5.2%，
ddH2O 52.2~57.7%；
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assemblybuffer总体积23.75~26.25%的聚乙二醇、475~525mM的三（羟甲基）氨基甲烷、47.5~52.5mM的MgCl2、47.5~52.5mM的二硫苏糖醇、0.95~1.05mM的dNTPs。
3.根据权利要求2所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：按体积百分比计，所述的体外多段重组酶系统包括如下配方：
5X pre-assembly buffer 39.5~40.5%，
T5核酸外切酶 0.12~0.13%，
高保真Taq酶 4.93~5.05%，
ddH2O 54.45~55.45%；
其中，所述的5X pre-assembly buffer包括如下配方：占所述的5X pre-assemblybuffer总体积24.75~25.25%的聚乙二醇、495~505mM的三（羟甲基）氨基甲烷、49.5~50.5mM的MgCl2、49.5~50.5mM的二硫苏糖醇、0.99~1.01mM的dNTPs。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：所述的聚乙二醇为聚乙二醇-8000。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：所述的三（羟甲基）氨基甲烷的pH为7.4~7.6。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的体外多段重组酶系统，其特征在于：所述的体外多段重组酶系统为2X体外多段重组酶系统。
7.一种如权利要求1至6中任一项所述的体外多段重组酶系统在基因组装中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的基因组装的制备体系包括：19~21µL的ddH2O、9.5~10.5µL的体外多段重组酶系统、线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其中，所述的线性化克隆载体和所述的插入片段扩增产物的每片段最适使用量为（0.02× 片段碱基对数）ng。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的基因组装的制备体系在冰水浴中配制。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的应用，其特征在于：将所述的基因组装的制备体系在PCR仪器内，在47.5~52.5℃下反应5~60min。
CN201610607681.7A 2016-07-29 2016-07-29 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用 Pending CN106191009A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610607681.7A CN106191009A (zh) 2016-07-29 2016-07-29 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610607681.7A CN106191009A (zh) 2016-07-29 2016-07-29 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106191009A true CN106191009A (zh) 2016-12-07

Family

ID=57495891

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610607681.7A Pending CN106191009A (zh) 2016-07-29 2016-07-29 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106191009A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108841901A (zh) * 2018-07-16 2018-11-20 山东大学 一种依赖t5核酸外切酶和peg8000完成dna组装的试剂盒及其应用
CN112063642A (zh) * 2020-09-04 2020-12-11 湖北大学 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604982A (zh) * 2012-03-16 2012-07-25 杭州师范大学 一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法
CN104195161A (zh) * 2014-09-12 2014-12-10 刘喜朋 基于可控型dna聚合酶和外切酶活性的dna重组酶的制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102604982A (zh) * 2012-03-16 2012-07-25 杭州师范大学 一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法
CN104195161A (zh) * 2014-09-12 2014-12-10 刘喜朋 基于可控型dna聚合酶和外切酶活性的dna重组酶的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GIBSON DG ET AL.: "Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases", 《NAT METHODS》 *
ROGER M. BENOIT ET AL.: "Seamless Insert-Plasmid Assembly at High Efficiency and Low Cost", 《PLOS ONE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108841901A (zh) * 2018-07-16 2018-11-20 山东大学 一种依赖t5核酸外切酶和peg8000完成dna组装的试剂盒及其应用
CN108841901B (zh) * 2018-07-16 2022-03-15 山东大学 一种依赖t5核酸外切酶和peg8000完成dna组装的试剂盒及其应用
CN112063642A (zh) * 2020-09-04 2020-12-11 湖北大学 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Universal TA cloning
Gibson Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments
CN107760706A (zh) Dna外切酶的应用及无缝克隆的方法
CN104911199B (zh) Dna分子克隆方法
CN106191009A (zh) 体外多段重组酶系统及其在基因组装中的应用
CN105420265B (zh) 一种过量表达atp酶的基因工程醋酸菌及其构建方法和应用
CN105505972B (zh) 一种利用聚乙烯亚胺提高dna连接酶连接效率的方法
CN104673819A (zh) 一种用于敲除l-乳酸脱氢酶1基因的载体及构建方法
CN104212827B (zh) 不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法
CN103205449B (zh) 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法
CN106906233A (zh) 一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法
CN109750032A (zh) 一种构建基因多点突变和进化的方法
CN106701738B (zh) 一种等温解开双链dna及制备单链dna的方法
CN103865951B (zh) 酿酒酵母表达载体及其构建和应用
CN102321660A (zh) 一种dna克隆方法
CN104293962A (zh) 一种筛选公共引物的方法
CN108048384B (zh) 一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用
CN113684202A (zh) 一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法
CN105950613A (zh) 一种体外快速组装非磷酸化dna片段的方法
CN105861533A (zh) 一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN101240286A (zh) 一种制备t载体的方法
CN109266671A (zh) 利用dU与endoQ进行基因克隆与点突变的方法
CN107151660A (zh) 脂肪酶变体Ala36Ser/Asp49His/Ala52Val/Asn55Asp
CN108220215B (zh) 一种GlnR蛋白结合位点突变的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Suzhou City, Jiangsu Province, Suzhou Industrial Park 215123 Xinghu Street No. 218 BioBAY C20 Building 1 floor

Applicant after: Suzhou Wang Xun biological Polytron Technologies Inc

Address before: Suzhou City, Jiangsu Province, Suzhou Industrial Park 215123 Xinghu Street No. 218 BioBAY C20 Building 1 floor

Applicant before: SUZHOU SYNBIO TECH CO., LTD.

CB02 Change of applicant information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161207

RJ01 Rejection of invention patent application after publication