CN105505972B - 一种利用聚乙烯亚胺提高dna连接酶连接效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括以下步骤：对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；配置聚乙烯亚胺溶液备用；在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应；在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。本发明可以显著地提高T4DNA连接酶的连接效率，填补了将电正性高分子聚合物(聚乙烯亚胺)应用于提高T4DNA连接酶连接效率这一领域的空白。

Description

一种利用聚乙烯亚胺提高DNA连接酶连接效率的方法

【技术领域】

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种利用电正性高分子聚合物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)提高T4DNA连接酶连接效率的方法。

【背景技术】

体外DNA重组技术是指在体外将来源相同或不相同的两个或多个DNA片段连接成新的重组DNA分子，并转化到受体菌中进行自主复制，最后筛选鉴定正确的克隆的过程。该技术是基因工程中的基本技术。

体外DNA重组技术的基本程序包括：外源目的DNA片段的获取，载体的选择，连接，转化和克隆化。其中连接一步是获得重组体DNA的关键环节。连接最常用的方法是在DNA连接酶的作用下，有Mg²⁺、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经相同的限制酶酶切的载体分子和外源DNA分子进行连接。其中，DNA连接酶(ligase)的作用是催化DNA片段之间的5'磷酸基和3'羟基之间形成3'5'-磷酸二酯键，主要用于连接两个独立的DNA片段或修复双链DNA中一条链上的切口。目前常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。这两种DNA连接酶都有将两个带有互补粘性末端的DNA分子连接在一起的功能，但T4噬菌体DNA连接酶还拥有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能将两个平末端的双链DNA分子连接起来，因而得到了更为广泛的应用。然而在使用T4噬菌体DNA连接酶的过程中，仍然存在连接效率不高的问题，尤其是当连接的DNA片段太长或欲连接的载体分子和外源DNA片段的浓度比偏高或偏低时。

目前，有一种通过增加T4DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高连接效率的方法，但该方法的促进效果不是特别明显，而且不够经济。Pheiffer和Zimmerman等人提出在连接反应体系中加入可促进大分子群聚作用的多聚物来提高连接效率，诸如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，聚蔗糖(Ficoll),牛血浆白蛋白(bovine plasma albumin)或糖原(glycogen)；Rusche和Howard-Flanders将化合物氯化六氨合钴(hexamine cobaltchloride，HCC)加入连接反应中，同样也起到了促进T4DNA连接酶连接效率的作用。然而这些增效剂均是电中性的。迄今为止国内外还没有关于利用电正性高分子聚合物来有效提高T4DNA连接酶连接效率的报道。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，其可以显著地提高T4DNA连接酶的连接效率，且操作简单，成本低。

本发明是这样实现的：

一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括以下步骤：

步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；

步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；

步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；

步骤(4)配置聚乙烯亚胺溶液备用；

步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应；

步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。

进一步地，所述步骤(4)中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为5×10^-7(w/v)～5×10^-8(w/v)。

进一步地，所述步骤(5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4DNA连接酶、聚乙烯亚胺溶液、T4DNA ligase buffer以及适量ddH₂O混合成20ul体系，22℃1h，65℃10min，4℃∞进行连接。

进一步地，所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙烯亚胺溶液加入的量为0.5ul。

进一步地，所述步骤(6)使用BL21(DE3)感受态细胞进行转化。

本发明具有如下优点：

本发明中使用的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)是电正性高分子聚合物，可以通过静电作用将分散在连接体系中的载体分子和外源DNA片段聚集起来，提高了两者的相对浓度，增加了二者间的连接几率，在很大程度上解决了T4DNA连接酶连接效率低的问题；另外本发明方法操作简单，成本低，经济适用性高。本发明可以显著地提高T4DNA连接酶的连接效率，填补了有关利用电正性高分子聚合物(聚乙烯亚胺)来提高T4DNA连接酶连接效率的方法和应用领域的空白。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是本发明实施例一片段A的电泳检测图。

图2是本发明实施例二双酶切后片段A及双酶切后质粒PET22b电泳检测图。

图3是本发明实施例三不同浓度PEI对T4连接酶连接效率影响效果图。

【具体实施方式】

本发明所涉及的一种利用聚乙烯亚胺提高T4DNA连接酶连接效率的方法，包括以下步骤：

步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；

步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；

步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；

步骤(4)配置聚乙烯亚胺溶液备用；

步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应；

步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆。

进一步地，所述步骤(4)中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为5×10^-7(w/v)～5×10^-8(w/v)。

所述步骤(5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4DNA连接酶、聚乙烯亚胺溶液、T4DNA ligase buffer以及适量ddH₂O混合成20ul体系，22℃1h，65℃10min，4℃∞进行连接。

所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙烯亚胺溶液加入的量为0.5ul。

所述步骤(6)使用BL21(DE3)感受态细胞进行转化。

请参阅图1～3所示，对本发明的实施例进行详细的说明。

实施例一DNA目的片段准备(片段A)

1.PCR体系(100ul体系)如下

PUC19-片段A(6ng/ul)	2ul
		引物1-片段A正引物	1ul
引物2-片段A反引物	1ul
		2×Master Mix	50ul
ddH2O	46ul

引物1序列：gtgaattcgagctcggtacccggaattcTTAGTTTACCGCGTCTT。

引物2序列：TgcaggtcgactctagaggatccatatgAATAAATCTCAATTGATCG。

其中：gaattc为EcoRI酶切位点，Catatg为NdeI酶切位点。

2.按以下条件进行PCR反应：95℃1min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，34个循环；72℃5min；4℃∞。

3.使用胶回收试剂盒对片段A进行回收纯化。胶回收产物检测：取3ul胶回收产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，具体电泳结果见图1。

图1中M为100bp DNA Ladder Maker。片段A为引入EcoRI/NdeI双酶切位点的目的片段，符合实际大小。

上述片段A为大肠杆菌(Escherichia coli)中所提取。

实施例二双酶切片段A和PET22b质粒

1NdeI酶切

1.1NdeI酶切片段A体系

NdeI酶切PET22b质粒体系

ddH<sub>2</sub>O	21ul
		Fast Digest Buffer	4ul
PET22b	33ul
		Fast Digest Enzyme(NdeI)	2ul
	60ul

1.2按照以下程序进行酶切反应：37℃1h30min,65℃5min,4℃∞.

1.3使用快速纯化回收试剂盒回收一次酶切产物。

2EcoRI酶切

2.1EcoRI酶切片段A体系

ddH<sub>2</sub>O	29ul
		Fast Digest Buffer	4ul
片段A	25ul
		Fast Digest Enzyme(EcoRI)	2ul
	60ul

EcoRI酶切PET22b质粒体系

ddH<sub>2</sub>O	21ul
		Fast Digest Buffer	4ul
PET22b	33ul
		Fast Digest Enzyme(EcoRI)	2ul
	60ul

2.2酶切程序如下：37℃1h30min，65℃5min，4℃∞。

2.3 1％琼脂糖凝胶进行电泳检测

2.4使用胶回收试剂盒对双酶切后的片段A以及PET22b质粒进行回收纯化。胶回收产物检测：取3ul胶回收产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，具体电泳结果见图2。

图2中M1为100bp DNA Ladder Maker，片段A为经过EcoRI/NdeI双酶切后的回收片段，符合实际大小，M2为1Kb DNA Ladder Maker，PET22b为经过EcoRI/NdeI双酶切后的回收片段。

实施例3连接体系中加入不同浓度聚乙烯亚胺并转化

1T4Sticky-end Ligation

1.1在T4连接酶体系(20ul)中分别加入不同浓度PEI0.5ul。

1.2连接程序如下：22℃1h，65℃10min，4℃∞。

2转化：分别取10ul连接液加入100ul BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴75s，冰浴5min，随后置于超净台内加入300ulSOC培养基，37℃、225rpm摇菌1h，取150ul菌液涂布加入amp的平板，37℃过夜培养。

实验结果如图3所示，其中3-1：对照(不加PEI的T4连接酶连接反应液)的菌落生长情况；3-2：加入0.5ul 5×10^-7M PEI的菌落生长情况。3-3：加入0.5ul10^-8M PEI的菌落生长情况。3-4：加入0.5ul 5×10^-8M PEI的菌落生长情况。

结果显示，加入浓度5×10^-7(w/v)～5×10^-8(w/v)PEI的连接液转化后平板内菌落生长数量明显多于不加PEI的对照组。

综上，在使用中T4连接酶构建重组质粒的过程中，加入适当浓度的聚乙烯亚胺可以显著提高T4连接酶的连接效率，获得更多的重组子。本技术操作简单，且聚乙烯亚胺价格低廉，可以有效解决现有T4DNA连接酶连接效率低的问题。

本发明中所涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)中的IHF-β蛋白基因序列如SEQID NO：1所示，引物1序列如SEQ ID NO：2所示，引物2序列如SEQ ID NO：3所示，具体情况参见序列表。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种利用聚乙烯亚胺提高T4 DNA连接酶连接效率的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤(1)对目的DNA片段设计带有酶切位点的引物；

步骤(2)通过PCR反应获得两端带有酶切位点的目的DNA片段；

步骤(3)经酶切得到待连接的线性化载体和目的DNA片段；

步骤(4)配置聚乙烯亚胺溶液备用；

步骤(5)在连接体系中添加预设体积的聚乙烯亚胺溶液进行连接反应；

步骤(6)在大肠杆菌中进行转化和克隆，得到重组DNA分子的克隆；

所述步骤(4)中的聚乙烯亚胺溶液的浓度为5×10^-7(w/v)～5×10^-8(w/v)；

所述步骤(5)中，连接体系中加入的聚乙烯亚胺溶液加入的量为0.5ul。

2.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺提高T4 DNA连接酶连接效率的方法，其特征在于：所述步骤(5)中反应条件是将待连的DNA片段、T4 DNA连接酶、聚乙烯亚胺溶液、T4 DNA ligase buffer以及适量ddH₂O混合成20ul体系，22℃1h，65℃10min，4℃进行连接。

3.根据权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺提高T4 DNA连接酶连接效率的方法，其特征在于：所述步骤(6)使用BL21(DE3)感受态细胞进行转化。