JP7394868B2 - Ｌ－ヒスチジン生産能が強化された微生物及びそれを用いたヒスチジン生産方法 - Google Patents
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Description
本出願は、Ｌ－ヒスチジン生産能が強化された微生物及びそれを用いたヒスチジン生産方法に関する。
Ｌ－ヒスチジンは、２０の標準アミノ酸のうちの１つのアミノ酸であり、栄養学的な観点から見ると、成人には多くの量が必要ではないが、成長期の子供には必要な必須アミノ酸に分類される。また、Ｌ－ヒスチジンは、抗酸化や免疫調節などの重要な生理的過程に関与し、胃潰瘍治療剤、循環器系疾患治療剤の原料やアミノ酸輸液製剤として医学産業に用いられている。
ヒスチジンは、特にヘモグロビンに多く存在するので、主に血粉を原料とするタンパク質加水分解抽出法により生産される。しかし、これには低効率や環境汚染などの欠点がある。それに対して、微生物発酵法によりＬ－ヒスチジンを生産することは可能であるが、大規模工業化はいまだ行われていない。これは、Ｌ－ヒスチジンの生合成がヌクレオチド合成の前駆体であるＰＲＰＰと競合する関係であり、高エネルギーを要する複雑な生合成過程と調節メカニズムを有するからである。
従来、発酵法に用いられる微生物のＬ－ヒスチジン生産能は、突然変異の誘発、突然変異体を選択する方法、遺伝子改良により菌株の新陳代謝を調節する方法により改善していた。近年、微生物を用いるヒスチジンの生産は、ＰＲＰＰから複数のステップを経て生合成されることが知られているが、ヒスチジン生合成に関与する酵素のうち最初の酵素であるＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、最終産物であるＬ－ヒスチジン又はその誘導体によるフィードバック阻害が生じるので、工業的にＬ－ヒスチジンを大量生産する際に問題となる（特許文献１）。このような複雑な生合成過程及び調節メカニズムを有するので、Ｌ－ヒスチジンを微生物培養により生産するためには、微生物代謝に関する様々な視点からのアプローチが必要であった。
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本発明者らは、細胞外に放出されたグリシンを取り込んで用いることのできる微生物を開発するために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシントランスポーターｃｙｃＡを導入することにより、高い収率でＬ－ヒスチジンを生産する微生物を完成した。
本出願は、グリシントランスポーター活性が強化された、Ｌ－ヒスチジンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
本出願は、本出願の微生物を含むＬ－ヒスチジン生産用組成物を提供する。
本出願は、本出願の微生物を培養するステップを含むＬ－ヒスチジン製造方法を提供する。
本出願は、グリシントランスポーターの活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－ヒスチジン生産における使用を提供する。
本出願のＬ－ヒスチジン生産用微生物は、優れたヒスチジン生産能を有するので、効率的なＬ－ヒスチジンの大量生産に活用することができる。
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が制限されるものではない。
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
本出願の一態様は、グリシントランスポーター活性が強化された、Ｌ－ヒスチジン生産用コリネバクテリウム属微生物を提供する。
本出願における「グリシントランスポーター（glycine transporter）」とは、細胞内にグリシンを取り込む機能を有するタンパク質であればいかなるものでもよく、具体的にはＤ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター（D-serine/D-alanine/glycine transporter）である。前記グリシントランスポーターは、Ｄ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター又はグリシン取り込みタンパク質と混用される。
前記「Ｄ－セリン／Ｄ－アラニン／グリシントランスポーター（D-serine/D-alanine/glycine transporter）」は、セリン、アラニン及びグリシン輸送の全てに関与するタンパク質であり、公知のデータベースであるＮＣＢＩ ＧｅｎｂａｎｋなどでＤ－Ｓｅｒｉｎｅ／Ｄ－Ａｌａｎｉｎｅ／ｇｌｙｃｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ配列を検索すればその情報が得られる。前記トランスポーターは、具体的にはＣｙｃＡ、ＡａｐＡであり、より具体的にはＣｙｃＡタンパク質であるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「ＣｙｃＡタンパク質」とは、セリン、アラニン及びグリシン取り込み（uptake）に関与するタンパク質を意味する。ＣｙｃＡタンパク質は、ｃｙｃＡ遺伝子によりコードされ、ｃｙｃＡ遺伝子は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、エルウィニア・アミロボラ（Erwinia amylovora）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）などの微生物に存在することが知られている。
本出願の目的上、本出願のＣｙｃＡタンパク質は、ヒスチジン生産能を強化することができるものであればいかなるものでもよい。具体的には、前記ＣｙｃＡタンパク質はコリネバクテリウム属又はエシェリキア属微生物由来のものであり、より具体的にはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものであるが、これらに限定されるものではない。前記コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）と同種であり、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、ブレビバクテリウム・スタティオニス（Brevibacterium stationis）と同一分類群（taxon）に分類されている（非特許文献１）。また、前記ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスはコリネバクテリウム・スタティオニスともいう。
よって、本出願において、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・スタティオニス、ブレビバクテリウム・スタティオニスは混用されてもよい。
本出願のＣｙｃＡタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものであってもよく、それと７０％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
具体的には、前記ＣｙｃＡタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、前記相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
さらに、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、セリン、アラニン及びグリシン取り込み活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。
すなわち、本出願において「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質もしくはポリペプチド」又は「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質もしくはポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。
本出願における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を包括する意味で用いられ、ポリヌクレオチドにおける基本構成単位であるヌクレオチドには、天然ヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形したアナログも含まれる（非特許文献２、３参照）。
前記ポリヌクレオチドは、本出願のＣｙｃＡタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよく、本出願のＣｙｃＡタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又は同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。具体的には、例えば配列番号１又は配列番号１と７０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２又は配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチドであってもよい。
また、コドンの縮退（codon degeneracy）により、配列番号１もしくは配列番号１と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、又はそれと相同性もしくは同一性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。あるいは、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（例えば、非特許文献４、５）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性の高い遺伝子同士、７０％以上、８０％以上、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、一層具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似するポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献６］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献７）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献８）。また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献４、５）で決定されてもよい。
本出願における「タンパク質の活性強化」とは、微生物が有するタンパク質の内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することを意味する。前記活性強化は、外来タンパク質の導入と、内在性タンパク質の活性強化の両方を含むものである。すなわち、特定タンパク質の内在性活性のある微生物に外来タンパク質を導入することや、内在性活性のない微生物に前記タンパク質を導入することも含まれる。前記「タンパク質の導入」とは、特定タンパク質の活性が微生物内に導入されて発現するように改変することを意味する。これを当該タンパク質の活性強化ともいう。
本出願における「内在性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して微生物の形質が変化する場合に、形質変化の前に親株が本来有していた状態を意味する。
本出願における活性強化は、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変、３）前記タンパク質の活性を強化する染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、又は５）それらの組み合わせにより強化する改変などにより行われるが、これらに限定されるものではない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれらに限定されるものではないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われるか、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターが宿主細胞内に導入されることにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。
次に、２）ポリヌクレオチドの発現を増加させる発現調節配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記発現調節配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有する核酸配列に置換することにより行われる。前記発現調節配列には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターに代えて強力な異種プロモーターが連結され、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター（特許文献２及び３）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献４）、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡ又はａｃｅＢプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にこれらに限定されるものではないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性がさらに強化されるように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行われるか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うことができる。
さらに、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチド、又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行うことができる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列が限定されるものではない。また、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、導入された前記外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化して宿主細胞内に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、タンパク質が産生されてその活性が増加してもよい。
最後に、５）前記１）～４）の組み合わせにより強化する改変は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現を増加させる発現調節配列の改変、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチド又はそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの改変の少なくとも１つの方法を共に適用することにより行うことができる。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、染色体内で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異したポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
本出願のベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的にはｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
本出願における「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
さらに、本出願における「作動可能に連結」されたものとは、本願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微量注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願における「Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、自然にＬ－ヒスチジン生産能を有する微生物、又はＬ－ヒスチジン生産能のない親株にＬ－ヒスチジン生産能が付与された微生物を意味する。外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするＬ－ヒスチジン生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。
例えば、前記Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物は、グリシントランスポーター活性が強化された微生物であってもよい。あるいは、それに加えて、ヒスチジン生合成酵素のフィードバック阻害を解除するか、ヒスチジン生合成経路に関与する酵素を強化又は抑制するか、ヒスチジン生合成に影響を及ぼさない酵素又はタンパク質の活性を不活性化し、ヒスチジン生合成経路への代謝を円滑にすることにより、ヒスチジンを生産する微生物であってもよい。
具体的には、ＣｙｃＡタンパク質の活性を強化するか、さらにＨｉｓＧポリペプチドを変異させてヒスチジン生合成経路のフィードバック阻害を解除するか、ｈｉｓＥ、ｈｉｓＧ、ｈｉｓＡ、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＩ、ｈｉｓＤ、ｈｉｓＣ、ｈｉｓＢ、ｈｉｓＮを含むヒスチジン生合成経路の酵素群をコードする遺伝子の少なくとも１つの発現を強化した微生物であってもよい。さらに、ヒスチジン分解経路の酵素を不活性化するか、ヒスチジン生合成経路における中間体、補因子、又はエネルギー源を消費する経路におけるタンパク質もしくは酵素の活性を不活性化するか、標的産物であるヒスチジンを取り込むタンパク質を不活性化した微生物であってもよい。例えば、γ－アミノ酪酸パーミアーゼ（gamma-aminobutyrate permease, NCgl1108）を不活性化した微生物であってもよい。
また、それに加えて、微生物の生長やヒスチジン生合成に関与しないタンパク質又は酵素の活性を不活性化した微生物であってもよい。より具体的には、微生物の生長やＬ－ヒスチジン生合成に影響を及ぼさないホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ（Formyltetrahydrofolate deformylase, PurU）又はトランスポザーゼ（Transposase, NCgl2131）の活性を弱化させた微生物であってもよい。
本出願における「タンパク質活性の不活性化」とは、酵素又はタンパク質の発現が天然の野生型菌株、親株、又は当該タンパク質が改変されていない菌株に比べて全く発現しないことや、発現してもその活性がなくなるか、減少することを意味する。ここで、前記減少は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異、発現調節配列の改変、遺伝子の一部又は全部の欠損などによりタンパク質の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性より減少した場合や、それをコードする遺伝子の発現阻害、翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的なタンパク質の活性の程度が天然の菌株又は改変前の菌株より低下した場合や、それらの組み合わせを含む概念である。本出願における前記不活性化は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は弱化するようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
しかし、これらの例に限定されるものではなく、様々な公知のＬ－ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、分解経路の酵素を不活性化するか、ヒスチジン生合成経路における中間体、補因子、又はエネルギー源を消費する経路における酵素を不活性化した微生物であってもよい。前記Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物は、公知の様々な方法を用いて製造することができる。
本出願の目的上、本出願の微生物は、前記グリシントランスポーターをはじめとする、Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物であればいかなるものでもよい。
本出願における前記「Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物」は、「Ｌ－ヒスチジンを生産できる微生物」、「Ｌ－ヒスチジン生産能を有する微生物」、「Ｌ－ヒスチジン生産用微生物」と混用されてもよい。
本出願のヒスチジンを生産する微生物は、グリシン分解タンパク質の活性がさらに強化されたものであってもよい。前記「ヒスチジンを生産する微生物」、「タンパク質の活性強化」については前述した通りである。
本出願における「グリシン分解タンパク質」は、グリシン分解経路に直接又は間接的に関与するタンパク質であり、「グリシン開裂系（glycine cleavage system; GCV）」を構成する各タンパク質もしくは前記タンパク質の複合体（complex）、又は前記グリシン開裂系自体を意味するものとして用いられる。
具体的には、前記グリシン分解タンパク質は、グリシン開裂系を構成するＴ－タンパク質（ＧｃｖＴ）、Ｐ－タンパク質（ＧｃｖＰ）、Ｌ－タンパク質（ＧｃｖＬ）、Ｈ－タンパク質（ＧｃｖＨ）及び前記グリシン開裂系の補酵素であるＬｉｐＢ、ＬｉｐＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない（非特許文献９）。前記グリシン分解タンパク質は、コリネバクテリウム属微生物由来のもの、具体的にはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものであるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記ＧｃｖＰタンパク質は配列番号２６、ＧｃｖＴタンパク質は配列番号２７、ＧｃｖＨは配列番号２８、ＬｉｐＡタンパク質は配列番号２９、ＬｉｐＢタンパク質は配列番号３０、又は前記配列番号とそれぞれ７０％以上の相同性又は同一性を有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記ＧｃｖＰタンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むものであってもよく、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記相同性又は同一性については、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＬｉｐＡ、ＬｉｐＢにおいても同様である。また、前記相同性又は同一性を有し、前記タンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
さらに、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、グリシン分解活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。
前記相同性又は同一性については前述した通りである。
本出願における「Ｌ－ヒスチジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）微生物」とは、Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物であって、コリネバクテリウム属に属する微生物を意味する。前記Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物については前述した通りである。具体的には、本出願におけるＬ－ヒスチジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、本出願のグリシントランスポーターの活性が強化されるか、又は前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上したＬ－ヒスチジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。また、それに加えて、グリシン分解タンパク質の活性が強化されるか、又は前記グリシン分解タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上したＬ－ヒスチジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。前記「向上したＬ－ヒスチジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」とは、形質転換前の親株又は非改変微生物に比べてＬ－ヒスチジン生産能が向上した微生物を意味する。前記「非改変微生物」とは、天然のコリネバクテリウム属菌株自体、前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含まない微生物、又は前記グリシントランスポーターをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムである。
本出願の他の態様は、本出願のＬ－ヒスチジン生産用微生物を含むＬ－ヒスチジン生産用組成物を提供する。
前記Ｌ－ヒスチジン生産用組成物とは、本出願のＬ－ヒスチジンを生産する微生物によりＬ－ヒスチジンを生産する組成物を意味する。前記組成物は、前記Ｌ－ヒスチジンを生産する微生物を含み、前記菌株を用いてヒスチジンを生産することができるさらなる構成であればいかなるものでもよい。前記ヒスチジンを生産することができるさらなる構成は、例えば発酵用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤、又は培地の構成成分をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、グリシントランスポーターの活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－ヒスチジン生産における使用を提供する。
「グリシントランスポーター（glycine transporter）」、「活性強化」又は「コリネバクテリウム属微生物」については前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、前記微生物を培養するステップを含むＬ－ヒスチジン製造方法を提供する。
本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、具体的には好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／やビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性又は嫌気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、糖アルコール、グリセリンなどのアルコール、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、ピルビン酸、乳酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
それ以外に、前記培地は、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを含有してもよい。前記培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができるが、これらに限定されるものではない。
本出願において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に好適な方法で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。
培養物の温度は、２５℃～４０℃、より具体的には２８℃～３７℃であるが、これらに限定されるものではない。培養期間は、所望の有用物質の生成量が得られるまで続けられ、具体的には１時間～１００時間であるが、これに限定されるものではない。
前記Ｌ－ヒスチジン製造方法は、前記培養ステップの後に、前記微生物、前記培地、その培養物、培養物の上清、培養物の抽出物及び前記微生物の破砕物から選択される少なくとも１つの物質からＬ－ヒスチジンを回収するステップを含んでもよい。
前記回収ステップは、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的物質であるＬ－ヒスチジンを回収することができる。例えば、前記Ｌ－ヒスチジンの回収には、沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、結晶化などの方法が用いられる。一例として、培養物を低速で遠心分離することによりバイオマスを除去し、得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができるが、これに限定されるものではない。
前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。
以下、実施例及び実験例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。
実施例１
ヒスチジン高生産能人工突然変異株の作製
Ｌ－ヒスチジンの高生産能を有する人工突然変異株を得るために、次の方法により微生物の変異を誘導した。
ヒスチジン高生産能人工突然変異株の作製
Ｌ－ヒスチジンの高生産能を有する人工突然変異株を得るために、次の方法により微生物の変異を誘導した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のものをＮＴＧで処理して作製したヒスチジン生産菌株ＫＣＣＭ１１７９５Ｐ（特許文献５；韓国特許出願第１０－２０１６－００３００９２号）菌株を用いて突然変異株を得た。ＫＣＣＭ１１７９５Ｐ菌株を活性化培地で１６時間培養し、活性化した菌株を種培地に接種して１４時間培養し、その後培養液５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭのクエン酸緩衝液（citric buffer）で洗浄し、その後最終濃度が２００ｍｇ／ＬとなるようにＮＴＧ（N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine）を添加して２０分間処理し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（phosphate buffer）で洗浄した。ＮＴＧで処理した菌株を最小培地に塗抹して死滅率を計算したところ、死滅率は８５％であった。
Ｌ－ヒスチジンの誘導体である１，２，４－トリアゾール－３－アラニン（ＴＲＡ）に対する耐性変異株を得るために、１，２，４－トリアゾール－３－アラニンの濃度がそれぞれ０．２ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌとなるように添加した最小培地にＮＴＧで処理した菌株を塗抹し、３０℃で５日間培養した。３つの濃度で添加した変異株のうちヒスチジン生産能が最も高い１，２，４－トリアゾール－３－アラニン耐性人工突然変異株を得て、本菌株をＣＡ１４－０６８２と命名した。
＜活性化培地＞
肉汁１％，ポリペプトン１％，塩化ナトリウム０．５％，酵母エキス１％，寒天２％，ｐＨ７．２
＜種培地＞
グルコース５％，バクトペプトン１％，塩化ナトリウム０．２５％，酵母エキス１％，尿素０．４％，ｐＨ７．２
＜最小培地＞
グルコース１．０％，硫酸アンモニウム０．４％，硫酸マグネシウム０．０４％，リン酸二水素カリウム０．１％，尿素０．１％，チアミン０．００１％，ビオチン２００μｇ／Ｌ，寒天２％，ｐＨ７．０
＜活性化培地＞
肉汁１％，ポリペプトン１％，塩化ナトリウム０．５％，酵母エキス１％，寒天２％，ｐＨ７．２
＜種培地＞
グルコース５％，バクトペプトン１％，塩化ナトリウム０．２５％，酵母エキス１％，尿素０．４％，ｐＨ７．２
＜最小培地＞
グルコース１．０％，硫酸アンモニウム０．４％，硫酸マグネシウム０．０４％，リン酸二水素カリウム０．１％，尿素０．１％，チアミン０．００１％，ビオチン２００μｇ／Ｌ，寒天２％，ｐＨ７．０
選択したＣＡ１４－０６８２菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、次の方法で培養した。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。培養終了後に、ＨＰＬＣによりＬ－ヒスチジン及びＬ－グリシン生産量を測定した。
＜生産培地＞
グルコース５％，硫酸アンモニウム２％，リン酸二水素カリウム０．１％，硫酸マグネシウム７水塩０．０５％，ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）２．０％，ビオチン２００μｇ／Ｌ，炭酸カルシウム，ｐＨ７．２
＜生産培地＞
グルコース５％，硫酸アンモニウム２％，リン酸二水素カリウム０．１％，硫酸マグネシウム７水塩０．０５％，ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）２．０％，ビオチン２００μｇ／Ｌ，炭酸カルシウム，ｐＨ７．２
培養結果から、高濃度のＴＲＡに対する耐性を有する人工突然変異株ＣＡ１４－０６８２菌株が収率１５％程度のＬ－ヒスチジン生産能を有することが確認された。
前記ＣＡ１４－０６８２菌株は、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ８０１７９として安全寄託した。
実施例２
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｃａｍ））導入ベクターの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム染色体内にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＣｙｃＡタンパク質（以下、ＣｙｃＡ（Ｃａｍ）、配列番号１）をコードする遺伝子ｃｙｃＡ（以下、ｃｙｃＡ（ｃａｍ）、配列番号２）を挿入するために、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてｐｕｒＵを挿入ｓｉｔｅとして用いた（非特許文献１０）。ｐｕｒＵ欠損及びターゲット遺伝子挿入ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６のプライマー対を用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ１６０６ｂｐのｄｅｌ－ｐｕｒＵ（配列番号７）と１６２５ｂｐのｄｅｌ－ｐｕｒＵ（配列番号８）のＤＮＡ断片が得られた。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後ｐＤＺ（特許文献６）ベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐｕｒＵ欠損及びターゲット遺伝子挿入用ベクターｐＤＺΔｐｕｒＵを作製した。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｃａｍ））導入ベクターの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム染色体内にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＣｙｃＡタンパク質（以下、ＣｙｃＡ（Ｃａｍ）、配列番号１）をコードする遺伝子ｃｙｃＡ（以下、ｃｙｃＡ（ｃａｍ）、配列番号２）を挿入するために、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてｐｕｒＵを挿入ｓｉｔｅとして用いた（非特許文献１０）。ｐｕｒＵ欠損及びターゲット遺伝子挿入ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６のプライマー対を用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ１６０６ｂｐのｄｅｌ－ｐｕｒＵ（配列番号７）と１６２５ｂｐのｄｅｌ－ｐｕｒＵ（配列番号８）のＤＮＡ断片が得られた。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後ｐＤＺ（特許文献６）ベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐｕｒＵ欠損及びターゲット遺伝子挿入用ベクターｐＤＺΔｐｕｒＵを作製した。
プロモーターに連結された形態のｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ＤＮＡ断片（以下、Ｐｎ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ））を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９７０ｂｐのＰｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）ＤＮＡ断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号１１）。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後前述したように作製したｐＤＺΔｐｕｒＵベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）導入ベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を作製した。
実施例３
ＣＡ１４－０６８２菌株由来グリシントランスポーター導入菌株の作製及びヒスチジン生産能の評価
実施例２で作製したベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）をＣＡ１４－０６８２菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上のｐｕｒＵ遺伝子がＰｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）形態に置換された菌株を作製し、これをＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）と命名した。
ＣＡ１４－０６８２菌株由来グリシントランスポーター導入菌株の作製及びヒスチジン生産能の評価
実施例２で作製したベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）をＣＡ１４－０６８２菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上のｐｕｒＵ遺伝子がＰｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）形態に置換された菌株を作製し、これをＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（ｃａｍ）と命名した。
作製したＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ菌株、ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
評価の結果、親株ＣＡ１４－０６８２菌株は、Ｌ－ヒスチジン１４．８５ｇ／Ｌ程度、Ｌ－グリシン７．４１ｇ／Ｌ程度の生成能を示し、ｐｕｒＵ欠損菌株は、Ｌ－ヒスチジン生産能が親株と同等レベルであるのに対して、ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：Ｐｎ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、Ｌ－ヒスチジン生産能が４．３％増加し、Ｌ－グリシン生産量が１３．８％減少した。よって、細胞外のＬ－グリシンをグリシン取り込み遺伝子の導入により細胞内へ取り込むとＬ－ヒスチジン生成能が増加することが確認された。
実施例４
ＣｙｃＡ（Ｃａｍ）過剰発現組換えベクターの作製
細胞内のｃｙｃＡ（Ｃａｍ）をより強く発現させるために、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）過剰発現組換えベクターを作製した。公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターｐｃｊ７（特許文献２）と、公知のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡのプロモーター（以下、ＰｇｌｙＡ）を用いた。
ＣｙｃＡ（Ｃａｍ）過剰発現組換えベクターの作製
細胞内のｃｙｃＡ（Ｃａｍ）をより強く発現させるために、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）過剰発現組換えベクターを作製した。公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターｐｃｊ７（特許文献２）と、公知のセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇｌｙＡのプロモーター（以下、ＰｇｌｙＡ）を用いた。
ｐｃｊ７プロモーターＤＮＡ断片を得るために、ｐｃｊ７を含むｐ１１７－ｃｊ７－ｇｆｐを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号１２及び配列番号１３のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、３５０ｂｐの大きさのｐｃｊ７断片が得られた。
５’にｐｃｊ７配列の一部を含むｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ＤＮＡ断片を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号１４及び配列番号１０のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、５’にｐｃｊ７配列の一部を含む１６４７ｂｐの大きさのｃｙｃＡ（Ｃａｍ）断片が得られた。
前述したように得られたｐｃｊ７断片とｃｙｃＡ（Ｃａｍ）断片を鋳型とし、配列番号１２及び配列番号１０のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９６４ｂｐのｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号１５）。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後前述したように作製したｐＤＺΔｐｕｒＵベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐｕｒＵ遺伝子をｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子に置換するベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を作製した。
また、ＰｇｌｙＡ ＤＮＡ断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号１６及び配列番号１７のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、３４０ｂｐの大きさのＰｇｌｙＡ断片が得られた。
５’にＰｇｌｙＡ配列の一部を含むｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ＤＮＡ断片を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号１８及び配列番号１０のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、５’にＰｇｌｙＡ配列の一部を含む１６４７ｂｐの大きさのｃｙｃＡ（Ｃａｍ）断片が得られた。
前述したように得られたＰｇｌｙＡ断片とｃｙｃＡ（Ｃａｍ）断片を鋳型とし、配列番号１６及び配列番号１０のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９６３ｂｐのＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号１９）。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後前述したように作製したｐＤＺΔｐｕｒＵベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐｕｒＵ遺伝子をＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）遺伝子に置換するベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を作製した。
実施例５
大腸菌由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｅｃｏ））導入ベクターの作製
一方、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＣｙｃＡタンパク質とその活性を比較するために、公知の大腸菌Ｋ－１２由来のＣｙｃＡタンパク質（以下、ＣｙｃＡ（Ｅｃｏ）、配列番号２０）（非特許文献１１）をコードする遺伝子ｃｙｃＡ（以下、ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）、配列番号２１）をｐｃｊ７と作動可能に連結して導入するためのベクターを作製した。
大腸菌由来グリシントランスポーター（ＣｙｃＡ（Ｅｃｏ））導入ベクターの作製
一方、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＣｙｃＡタンパク質とその活性を比較するために、公知の大腸菌Ｋ－１２由来のＣｙｃＡタンパク質（以下、ＣｙｃＡ（Ｅｃｏ）、配列番号２０）（非特許文献１１）をコードする遺伝子ｃｙｃＡ（以下、ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）、配列番号２１）をｐｃｊ７と作動可能に連結して導入するためのベクターを作製した。
ｐｃｊ７プロモーターＤＮＡ断片を得るために、ｐｃｊ７を含むｐ１１７－ｃｊ７－ｇｆｐを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号１２及び配列番号２２のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、３５０ｂｐの大きさのｐｃｊ７断片が得られた。
５’にｐｃｊ７配列の一部を含むｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）遺伝子断片を得るために、大腸菌Ｋ－１２ Ｗ３１１０染色体を鋳型とし、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１６５９ｂｐのｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。
前記ｐｃｊ７断片とｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）断片を鋳型とし、配列番号１２及び配列番号２４のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で９０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、１９８５ｂｐのｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）遺伝子断片が得られた（配列番号２５）。その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後ｐＤＺΔｐｕｒＵベクターに、タカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｐｕｒＵ遺伝子をｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）遺伝子に置換するベクターｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）を作製した。
実施例６
ＣＡ１４－０６８２菌株由来ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）過剰発現菌株の作製及びヒスチジン生産能の比較
ＣＡ１４－０６８２菌株を親株としてｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）過剰発現菌株を作製するために、作製したベクター４種（ｐＤＺΔｐｕｒＵ，ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））をそれぞれエレクトロポレーションによりＣＡ１４－０６８２菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上のｐｕｒＵ欠失及びｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）の形態に置換された菌株を得た。前記過程により菌株４種（ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ，ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））を作製した。
ＣＡ１４－０６８２菌株由来ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）過剰発現菌株の作製及びヒスチジン生産能の比較
ＣＡ１４－０６８２菌株を親株としてｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）過剰発現菌株を作製するために、作製したベクター４種（ｐＤＺΔｐｕｒＵ，ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））をそれぞれエレクトロポレーションによりＣＡ１４－０６８２菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上のｐｕｒＵ欠失及びｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）又はｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）の形態に置換された菌株を得た。前記過程により菌株４種（ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ，ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））を作製した。
作製した菌株４種のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
評価の結果、大腸菌由来ｃｙｃＡが導入されたＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株は、Ｇｌｙ取り込み能がほとんどなく、親株に比べて同等レベル以下のヒスチジン生産能を示す。それに対して、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡが強化導入されたＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株とＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ＿ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、Ｇｌｙ生産能が減少し、ヒスチジン生産能が親株に対してそれぞれ７．１％、６．８％増加することが確認された。よって、コリネバクテリウム・グルタミカム内に導入されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡは大腸菌由来ｃｙｃＡより高いグリシン取り込み能を有し、取り込んだグリシンによりヒスチジン生産能の向上にさらに大きな効果が得られることが確認された。また、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）を導入したものにおいては、ｇｌｙＡプロモーターにより発現させると、Ｃｅｌｌｍａｓｓ確保に比較的有利であることが確認された。前記ＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株と命名した。
実施例７
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシン開裂系導入ベクターの作製
まず、ヒスチジン生産能の向上にグリシントランスポーターの活性が影響を及ぼすことが確認されたので、細胞内に取り込んだグリシンの細胞内利用能をさらに向上させる場合のヒスチジン生産能を確認した。具体的には、グリシン開裂系（Glycine Cleavage System, 以下、ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍ）を導入した。コリネバクテリウム・グルタミカム菌株においてＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを構成する６種のタンパク質のうちＬ－タンパク質、ＬｉｐＢ、ＬｉｐＡをコードする遺伝子のみ知られており、他の３種のタンパク質をコードする遺伝子は知られていない。よって、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを導入するために、Ｐ－タンパク質（配列番号２６）、Ｔ－タンパク質（配列番号２７）、Ｈ－タンパク質（配列番号２８）、ＬｉｐＡ（配列番号２９）、ＬｉｐＢ（配列番号３０）をコードする遺伝子（ｇｃｖＰ（配列番号３１），ｇｃｖＴ（配列番号３２），ｇｃｖＨ（配列番号３３），ｌｉｐＡ（配列番号３４），ｌｉｐＢ（配列番号３５））導入ベクターを作製した。前記遺伝子は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス染色体内に２組のオペロン（ｇｃｖＰ－ｇｃｖＴ，ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢ－ｌｉｐＡ）を形成している（以下、ｇｃｖＰＴ、ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ）。ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを導入するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのトランスポゾンをコードする遺伝子のうちＮＣｇｌ２１３１遺伝子を挿入ｓｉｔｅとして用いた（非特許文献１０）。ＮＣｇｌ２１３１遺伝子をｇｃｖシステム遺伝子に置換するために、ＮＣｇｌ２１３１欠損及びターゲット遺伝子挿入ベクターを作製した。ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９のプライマー対を用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ５３１ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｌ（配列番号４０）と５５５ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｒ（配列番号４１）のＤＮＡ断片が得られた。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後ｐＤＺベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠損及びターゲット遺伝子挿入用ベクターｐＤＺΔＮ２１３１を作製した。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来グリシン開裂系導入ベクターの作製
まず、ヒスチジン生産能の向上にグリシントランスポーターの活性が影響を及ぼすことが確認されたので、細胞内に取り込んだグリシンの細胞内利用能をさらに向上させる場合のヒスチジン生産能を確認した。具体的には、グリシン開裂系（Glycine Cleavage System, 以下、ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍ）を導入した。コリネバクテリウム・グルタミカム菌株においてＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを構成する６種のタンパク質のうちＬ－タンパク質、ＬｉｐＢ、ＬｉｐＡをコードする遺伝子のみ知られており、他の３種のタンパク質をコードする遺伝子は知られていない。よって、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを導入するために、Ｐ－タンパク質（配列番号２６）、Ｔ－タンパク質（配列番号２７）、Ｈ－タンパク質（配列番号２８）、ＬｉｐＡ（配列番号２９）、ＬｉｐＢ（配列番号３０）をコードする遺伝子（ｇｃｖＰ（配列番号３１），ｇｃｖＴ（配列番号３２），ｇｃｖＨ（配列番号３３），ｌｉｐＡ（配列番号３４），ｌｉｐＢ（配列番号３５））導入ベクターを作製した。前記遺伝子は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス染色体内に２組のオペロン（ｇｃｖＰ－ｇｃｖＴ，ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢ－ｌｉｐＡ）を形成している（以下、ｇｃｖＰＴ、ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ）。ＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍを導入するために、コリネバクテリウム・グルタミカムのトランスポゾンをコードする遺伝子のうちＮＣｇｌ２１３１遺伝子を挿入ｓｉｔｅとして用いた（非特許文献１０）。ＮＣｇｌ２１３１遺伝子をｇｃｖシステム遺伝子に置換するために、ＮＣｇｌ２１３１欠損及びターゲット遺伝子挿入ベクターを作製した。ベクターを作製するために、ＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３６及び配列番号３７、配列番号３８及び配列番号３９のプライマー対を用いてＰＣＲをそれぞれ行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。その結果、それぞれ５３１ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｌ（配列番号４０）と５５５ｂｐのｄｅｌ－Ｎ２１３１Ｒ（配列番号４１）のＤＮＡ断片が得られた。得られたＤＮＡ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、その後ｐＤＺベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠損及びターゲット遺伝子挿入用ベクターｐＤＺΔＮ２１３１を作製した。
プロモーターに連結された形態のｇｃｖＰＴ遺伝子断片（以下、Ｐｎ＿ｇｃｖＰＴ（ｃａｍ））を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号４２及び配列番号４３のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で５分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、プロモーターを含む４４９９ｂｐのＰｎ＿ｇｃｖＰＴ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号４４）。
プロモーターに連結された形態のｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ遺伝子断片（以下、Ｐｎ＿ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ（Ｃａｍ））を得るために、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２染色体を鋳型とし、配列番号４５及び配列番号４６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。その結果、プロモーターを含む３０５３ｂｐのＰｎ＿ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、ベクターの作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた（配列番号４７）。
前述したように得られたＰｎ＿ｇｃｖＰＴ（Ｃａｍ）断片、Ｐｎ＿ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ（Ｃａｍ）断片を鋳型とし、配列番号４２及び配列番号４６のプライマーを用いて融合（sewing）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１０分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１２分間の重合反応を行うものとした。その結果、８２５９ｂｐのＰｎ＿ｇｃｖＰＴ（Ｃａｍ）＿Ｐｎ－ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ（Ｃａｍ）遺伝子断片が得られ、その増幅産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、作製したｐＤＺΔＮ２１３１ベクターとタカラ（TaKaRa）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子をＰｎ＿ｇｃｖＰＴ（Ｃａｍ）－Ｐｎ＿ｇｃｖＨ－ｌｉｐＢＡ（Ｃａｍ）遺伝子に置換するベクターｐＤＺΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）を作製した。
実施例８
ＣＡ１４－０６８２菌株由来グリシン開裂系及びグリシントランスポーター導入菌株の作製及びヒスチジン生産能の評価
実施例７で作製したベクターｐＤＺΔＮ２１３１、ｐＤＺΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）をＣＡ１４－０６８２菌株とＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠失菌株（ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１）、グリシン開裂系単独導入菌株、及びグリシン開裂系とグリシントランスポーターの両方が導入された菌株２種（ＣＡ１４－０６８２ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ））を作製した。作製したＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１、ＣＡ１４－０６８２ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株、ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
ＣＡ１４－０６８２菌株由来グリシン開裂系及びグリシントランスポーター導入菌株の作製及びヒスチジン生産能の評価
実施例７で作製したベクターｐＤＺΔＮ２１３１、ｐＤＺΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）をＣＡ１４－０６８２菌株とＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠失菌株（ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１）、グリシン開裂系単独導入菌株、及びグリシン開裂系とグリシントランスポーターの両方が導入された菌株２種（ＣＡ１４－０６８２ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ），ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ））を作製した。作製したＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１、ＣＡ１４－０６８２ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株、ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
評価の結果、グリシントランスポーターｃｙｃＡ（Ｃａｍ）のみ導入されたＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１菌株は、ＣＡ１４－０６８２菌株に比べて、ヒスチジン生成量が７．６％増加し、グリシン生成量が１０．６％減少し、表３のＣＡ１４－０６８２ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ＿ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）（ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と命名）菌株の結果と同等レベルであることが確認された。グリシン開裂系が導入されたＣＡ１４－０６８２ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株は、ＣＡ１４－０６８２菌株に比べて、ヒスチジン生成量が９．８％増加し、グリシン生成量が３６．８％減少した。それに対して、ＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１菌株にさらにＧＣＶが導入されたＣＡ１４－０６８２－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株は、ヒスチジン生成量が１３．７％増加し、グリシン生成量が親株に対して６９．１％減少した。よって、グリシントランスポーター又はグリシン分解遺伝子のみ導入しても、ヒスチジン生産性の向上及びグリシン生産量の減少に効果があるが、グリシン開裂系と共に導入すると、細胞内で生成されるグリシンが分解されるので、ヒスチジン生成能が大幅に増加することが確認された。
実施例９
野生型コリネバクテリウム・グルタミカム由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株の作製
次に、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株におけるＣｙｃＡ導入及びＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍ導入の効果を確認するために、まず、野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株からＬ－ヒスチジン生産菌株を開発した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカム由来Ｌ－ヒスチジン生産菌株の作製
次に、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株におけるＣｙｃＡ導入及びＧＣＶ ｓｙｓｔｅｍ導入の効果を確認するために、まず、野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株からＬ－ヒスチジン生産菌株を開発した。
実施例９－１：ＨｉｓＧポリペプチド変異の導入
まず、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の最初の酵素であるＨｉｓＧポリペプチドのフィードバック阻害（Feedback inhibition）を解消するために、ＨｉｓＧのＮ末端から２３３番目と２３５番目のアミノ酸をそれぞれグリシン（Glycine）からヒスチジン（histidine）（以下、Ｇ２３３Ｈ変異）、トレオニン（Threonine）からグルタミン（Glutamine）（以下、Ｔ２３５Ｑ）に同時に置換した（配列番号４８）（非特許文献１２）。
まず、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の最初の酵素であるＨｉｓＧポリペプチドのフィードバック阻害（Feedback inhibition）を解消するために、ＨｉｓＧのＮ末端から２３３番目と２３５番目のアミノ酸をそれぞれグリシン（Glycine）からヒスチジン（histidine）（以下、Ｇ２３３Ｈ変異）、トレオニン（Threonine）からグルタミン（Glutamine）（以下、Ｔ２３５Ｑ）に同時に置換した（配列番号４８）（非特許文献１２）。
具体的には、ｈｉｓＧポリペプチド変異を挿入するためのベクターを作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５０のプライマーを用いてｈｉｓＧポリペプチドの２３３番目、２３５番目の残基の上流（Upstream）領域（以下、Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ－５’）、さらに配列番号５１及び配列番号５２のプライマーを用いてｈｉｓＧポリペプチドの２３３番目、２３５番目の残基の下流（Downstream）領域（以下、Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ－３’）の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしては、ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。
増幅されたＧ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ－５’断片とＧ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ－３’断片をｐＤＺとギブソンアセンブリ（非特許文献１３）方法でクローニングすることにより、ｈｉｓＧポリペプチド変異導入ベクターｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ）を作製した。
作製したｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ，Ｔ２３５Ｑ）ベクターを野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でＨｉｓＧポリペプチドの２３３番目、２３５番目のアミノ酸がそれぞれグリシンからヒスチジン、トレオニンからグルタミンに置換された菌株を得た。遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５３及び配列番号５４を用いたＰＣＲ法とシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、これをＣＡ１４－００１１と命名した。
実施例９－２：ヒスチジン生合成経路の強化
次に、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒに作製して導入した。具体的には、計４つのオペロン（operon）（ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ，ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ，ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ，ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ）に分離されている生合成遺伝子を公知の合成プロモーター３種（ｌｙｓＣＰ１（特許文献７）、ｐｃｊ７もしくはＳＰＬ１３（特許文献８））又はｇａｐＡ遺伝子プロモーターと作動可能に連結し、各オペロンをｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇして一度に導入した。挿入部位には、γ－アミノ酪酸パーミアーゼをコードするＮｃｇｌ１１０８遺伝子（非特許文献１４）を用いた。
次に、Ｌ－ヒスチジン生合成経路の強化のために、計４つのオペロン（operon）に分離されている生合成遺伝子をプロモーターが置換された形態のｃｌｕｓｔｅｒに作製して導入した。具体的には、計４つのオペロン（operon）（ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ，ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ，ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ，ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ）に分離されている生合成遺伝子を公知の合成プロモーター３種（ｌｙｓＣＰ１（特許文献７）、ｐｃｊ７もしくはＳＰＬ１３（特許文献８））又はｇａｐＡ遺伝子プロモーターと作動可能に連結し、各オペロンをｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇして一度に導入した。挿入部位には、γ－アミノ酪酸パーミアーゼをコードするＮｃｇｌ１１０８遺伝子（非特許文献１４）を用いた。
具体的な実験方法は次の通りである。ＮＣｇｌ１１０８遺伝子欠損ベクターを作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５及び配列番号５６のプライマーを用いてＮＣｇｌ１１０８上流（Upstream）領域（以下、Ｎ１１０８－５’）、さらに配列番号５７及び配列番号５８のプライマーを用いてＮｃｇｌ１１０８下流（Downstream）領域（以下、Ｎ１１０８－３’）の遺伝子断片をＰＣＲにより得た。ポリメラーゼとしては、ＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。ＰＣＲ増幅条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。増幅されたＮ１１０８－５’断片とＮ１１０８－３’断片をｐＤＺとギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、ＮＣｇｌ１１０８欠損ベクターｐＤＺΔＮ１１０８ベクターを作製した。
作製したｐＤＺ－ΔＮＣｇｌ１１０８ベクターをＣＡ１４－００１１菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上でＮＣｇｌ１１０８遺伝子が破砕した菌株を得た。遺伝子が破砕した相同組換えの上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５９及び配列番号６０を用いたＰＣＲ法とシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、これをＣＡ１４－０７３６と命名した。
ヒスチジン生合成ｃｌｕｓｔｅｒの強化のために、４つのオペロン遺伝子群と置換するプロモーター部分を確保した。ｌｙｓＣＰ１プロモーター断片とｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ断片、ｇａｐＡプロモーター断片とｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ断片、ＳＰＬ１３断片とｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ断片、ｐｃｊ７断片とｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ断片を得た。
ｌｙｓＣＰ１ ＤＮＡ断片を得るために、ＫＣＣＭ１０９１９Ｐ菌株（特許文献７）の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号６１及び配列番号６２のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｌｙｓＣＰ１断片が得られた。
ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ遺伝子断片を得るために、ＣＡ１４－００１１菌株の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号６３及び配列番号６４のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ断片が得られた。
コリネバクテリウム・グルタミカム由来ｇａｐＡ遺伝子のプロモーターＤＮＡ断片（以下、ＰｇａｐＡ）を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号６５及び配列番号６６のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ＰｇａｐＡ断片が得られた。
ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ遺伝子断片を得るために、ＣＡ１４－００１１菌株の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号６７及び配列番号６８のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ断片が得られた。
ＳＰＬ１３ ＤＮＡ断片を得るために、ＳＰＬ１３ ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号６９及び配列番号７０のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ＳＰＬ１３ ＤＮＡ断片が得られた。
ｐｃｊ７プロモーターＤＮＡ断片を得るために、ｐｃｊ７を含むｐ１１７－ｃｊ７－ｇｆｐを鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ反応は、配列番号７１及び配列番号７２のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で１分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｐｃｊ７断片が得られた。
ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ遺伝子断片を得るために、ＣＡ１４－００１１菌株の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号７３及び配列番号７４のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で５分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ遺伝子断片が得られた。
ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ遺伝子断片を得るために、ＣＡ１４－００１１菌株の染色体を鋳型とし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、配列番号７５及び配列番号７６のプライマーを用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で５分間の重合反応を２８サイクル行い、その後７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして増幅されたＰＣＲ産物をＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製すると、ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ遺伝子断片が得られた。
得られたｌｙｓＣＰ１ ＤＮＡ断片、ｈｉｓＥ－ｈｉｓＧ ＤＮＡ断片、ＰｇａｐＡ ＤＮＡ断片、ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦ－ｈｉｓＩ ＤＮＡ断片、ＳＰＬ１３ ＤＮＡ断片、ｈｉｓＤ－ｈｉｓＣ－ｈｉｓＢ ＤＮＡ断片、ｐｃｊ７ ＤＮＡ断片、ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮ ＤＮＡ断片をｐＤＺ－ΔＮｃｇｌ１１０８ベクターとギブソンアセンブリ方法でクローニングすることにより、Ｌ－ヒスチジン生合成強化ｃｌｕｓｔｅｒ導入ベクターｐＤＺ－ΔＮｃｇｌ１１０８：：ｌｙｓＣＰ１＿ｈｉｓＥＧ－ＰｇａｐＡ＿ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦＩ－ＳＰＬ１３＿ＨｉｓＤＣＢ－ｐｃｊ７＿ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮを作製した。
作製したｐＤＺ－ΔＮｃｇｌ１１０８：：ｌｙｓＣＰ１＿ｈｉｓＥＧ－ＰｇａｐＡ＿ｈｉｓＡ－ｉｍｐＡ－ｈｉｓＦＩ－ＳＰＬ１３＿ｈｉｓＤＣＢ－ｐｃｊ７＿ｃｇ０９１１－ｈｉｓＮベクターをＣＡ１４－００１１菌株にエレクトロポレーションにより形質転換し、その後２次交差過程を経て、染色体上で生合成遺伝子が挿入された菌株を得た。遺伝子が挿入された相同組換え上流領域及び下流領域の外部部位をそれぞれ増幅する配列番号５９及び配列番号６０を用いたＰＣＲ法とゲノムシーケンシングにより当該遺伝的操作を確認し、これをＣＡ１４－０７３７と命名した。
前記ＣＡ１４－０７３７菌株をブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１８年１１月２７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２４１１Ｐとして国際寄託した。
実施例１０
ＣＡ１４－０７３７菌株由来グリシントランスポーター及びグリシン開裂系導入菌株の作製
前述したように作製したベクター４種（ｐＤＺΔｐｕｒＵ，ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））をＣＡ１４－０７３７菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、ｐｕｒＵ遺伝子欠失菌株、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）導入菌株、ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）導入菌株を作製し、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）を作製した。作製したＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
ＣＡ１４－０７３７菌株由来グリシントランスポーター及びグリシン開裂系導入菌株の作製
前述したように作製したベクター４種（ｐＤＺΔｐｕｒＵ，ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ），ｐＤＺΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ））をＣＡ１４－０７３７菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、ｐｕｒＵ遺伝子欠失菌株、ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）導入菌株、ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）導入菌株を作製し、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）を作製した。作製したＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
評価の結果、大腸菌由来ｃｙｃＡが導入されたＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｅｃｏ）菌株は、Ｇｌｙ取り込み能がほとんどなく、親株と同等レベルのヒスチジン生産能であった。それに対して、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡが強化導入されたＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ｐｃｊ７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株は、ヒスチジン生産能が親株に対して２０．９％増加し、グリシン生成量が１１．８％減少することが確認された。ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）をｇｌｙＡプロモーターにより発現させた菌株も、ヒスチジン生産能が２０％増加し、グリシン生成量が１４％減少した。よって、コリネバクテリウム・グルタミカム内に導入されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来ｃｙｃＡは大腸菌由来ｃｙｃＡより高いグリシン取り込み能を有し、取り込んだグリシンによりヒスチジン生産能の向上にさらに大きな効果が得られることが確認された。これらのうち、ＣＡ１４－０７３７ΔｐｕｒＵ：：ＰｇｌｙＡ－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と命名した。
実施例７で作製したベクターｐＤＺΔＮ２１３１、ｐＤＺΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）をＣＡ１４－０７３７菌株とＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株に形質転換し、２次交差過程を経て、ＮＣｇｌ２１３１遺伝子欠失菌株（ＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１）、グリシン開裂系単独導入菌株、及びグリシン開裂系とグリシントランスポーターの両方が導入された菌株２種（ＣＡ１４－０７３７ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）、ＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ））を作製した。作製したＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１菌株、ＣＡ１４－０７３７ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株、ＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株のＬ－ヒスチジン生産能及びＬ－グリシン生成量を確認するために、実施例１と同様に培養した。
評価の結果、グリシントランスポーターｃｙｃＡ（Ｃａｍ）のみ導入されたＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１菌株は、親株に対してヒスチジン生成量が１７．８％増加し、グリシン生成量が１３％減少し、グリシントランスポーターｃｙｃＡ（ｃａｍ）とＧＣＶが同時に導入されたＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株は、ヒスチジン生成量が４３．９％増加し、グリシン生成量が親株に対して７８．８％減少した。グリシン開裂系が導入されたＣＡ１４－０７３７ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株は、親株に対してヒスチジン生成量が３０．６％増加し、グリシン生成量が５６．７％減少したが、依然として培養液にグリシンが蓄積され、ヒスチジン生産性もｃｙｃＡ（Ｃａｍ）と同時に導入された菌株に比べて低いことが確認された。よって、グリシントランスポーター又はグリシン開裂系のみ導入しても、ヒスチジン生産性の向上及びグリシン生産量の減少に効果があるが、グリシントランスポーターとグリシン開裂系を共に導入すると、細胞内で生成されるグリシンが分解されるので、ヒスチジン生成能が大幅に増加することが確認された。ＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ１４－０７７７と命名し、ＣＡ１４－０７３７－ｃｙｃＡ（Ｃａｍ）ΔＮ２１３１：：ＧＣＶ（Ｃａｍ）菌株をＣＡ１４－０８０９と命名し、前記２種の菌株をブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１９年４月１５日付けでそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２４８８Ｐ、ＫＣＣＭ１２４８９Ｐとして国際寄託した。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
Claims (9)
- グリシントランスポーターの活性がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣｙｃＡタンパク質が導入されていないコリネバクテリウム・グルタミカムの活性に比べて強化された、Ｌ－ヒスチジンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムであって、前記グリシントランスポーターがコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＣｙｃＡタンパク質である、微生物。
- 前記グリシントランスポーターは、配列番号１又はそれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の微生物。
- 前記微生物は、グリシン分解タンパク質の活性がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のグリシン分解タンパク質が導入されていないコリネバクテリウム・グルタミカムの活性に比べてさらに強化されたものである、請求項１に記載の微生物。
- 前記グリシン分解タンパク質は、ＧｃｖＰ、ＧｃｖＴ、ＧｃｖＨ、ＬｉｐＢ及びＬｉｐＡからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質である、請求項３に記載の微生物。
- 前記グリシン分解タンパク質は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のものである、請求項４に記載の微生物。
- 前記ＧｃｖＰは配列番号２６、ＧｃｖＴタンパク質は配列番号２７、ＧｃｖＨは配列番号２８、ＬｉｐＡタンパク質は配列番号２９、ＬｉｐＢタンパク質は配列番号３０のアミノ酸配列を含むか、又は前記配列番号とそれぞれ９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項４に記載の微生物。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物を含むＬ－ヒスチジン生産用組成物。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養するステップと、
前記微生物及び培地からＬ－ヒスチジンを回収するステップとを含む、Ｌ－ヒスチジン製造方法。 - グリシントランスポーターの活性が強化された請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物のＬ－ヒスチジン生産における使用。
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