JP2016202182A - cycA遺伝子を過剰発現した腸内細菌科の細菌を用いたL−イソロイシンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】cycA遺伝子を過剰発現するように改変した腸内細菌科に属する細菌を使用した発酵法によりL−イソロイシンを製造する。該方法によれば、L−イソロイシンの発酵生産中の副生アミノ酸の生産を減少させることができる。
【選択図】なし
Description
L−イソロイシンを製造する方法は、該細菌においてcycA遺伝子を過剰に発現させ、以て改変された該細菌によるL−ロイシン、L−バリン、L−ノルロイシン、L−ノルバリン、及びα−アミノ酪酸等の副生アミノ酸の生産を減少させることにより、改良することができる。副生アミノ酸の副生は、副生物の絶対量において、あるいはL−イソロイシンに対する相対量において、減少させることができる。従って、一態様においては、副生アミノ酸に対してより多くの量のL−イソロイシンを製造することができる。また、本明細書に記載された方法により製造されたL−イソロイシンは精製工程が単純化されることから、生産されたL−イソロイシンは高い純度を有し、低価格で製造される。
(i)L−イソロイシン生産能を有する腸内細菌科の細菌を培養培地で培養して培養培地もしくは菌体、またはその両者中にL−イソロイシンを生産させ、
(ii)培養培地もしくは菌体、またはその両者からL−イソロイシンを回収することを含む、L−イソロイシンを製造する方法であって、
前記細菌がcycA遺伝子を過剰に発現するように改変されている方法が提供される。
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む1またはそれ以上の変異を含むアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するタンパク質、及び
(C)配列番号2のアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有し、配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するタンパク質。
(A)配列番号1の塩基配列を含むDNA、
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む1またはそれ以上の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質が配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するものであるDNA、及び
(C)遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。
腸内細菌科に属し、且つcycA遺伝子を過剰発現するように改変された、任意のL−イソロイシン生産菌を使用することができる。「L−イソロイシン生産菌」の用語は、当該細菌を培養培地で培養したときに、培地及び/又は菌体中にL−イソロイシンを生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味し得る。
成経路の生産物等、またはそれらの組合せが挙げられる。中間体は、L−イソロイシンの生合成経路の中間体に限られず、その他の1種もしくは2種、またはそれ以上の物質の代謝経路の前駆体、中間体、または基質であってもよく、例えば、目的物質がL−イソロイシンである場合、分枝鎖L−アミノ酸の生合成経路の前駆体、中間体、または基質であってもよい。
agglomerans)やエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられ、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析などによりパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、またはパントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌であれば、エンテロバクター属またはパントエア属のいずれに属するものであっても使用することができる。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、及びそれらの派生株を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アナナティスに再分類されている。
L−イソロイシン生産菌の例またはL−イソロイシン生産菌を誘導するための親株の例としては、限定するものではないが、6-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシンやイソロイシンヒドロキサメート等のイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、及び、さらにDL−エチオニン及び/又はアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号)が挙げられる。さらに、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼ等のL−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もL−イソロイシン生産菌またはその親株として使用できる(特開平2-458号、EP 0356739 A1、および米国特許第5,998,178号)。L−イソロイシン生産菌またはその親株の例としては、E. coli K-12株44-3-15 Scr(VKPM B-12149)が挙げられる。
a coli K-12, J. Bacteriol., 1973, 116(1):12-18; Lee M. et al., Transport properties of merodiploids covering the dagA locus in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 1975, 122(3):1001-1005)。シクロセリンに対するCycAの輸送活性も見出されている(Wargel R.J. et al., Mechanism of D-cycloserine action: transport systems for
D-alanine, D-cycloserine, L-alanine, and glycine, J. Bacteriol., 1970, 103(3):778-788)。L−ロイシン及びL−プロリンに対する輸送活性は見出されていない(Lee M.
et al., 1975)。腸内細菌科の種々の細菌のCycAのホモログが知られており、それらの例は後記する。
icrobiol., 1995, 141(Pt 1):133-140)。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用するブラッドフォードタンパク質分析によって決定することができる(Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254)。
ロモ−ターの効果は、例えば、cycA遺伝子のプロモーター領域に変異を導入してより強いプロモ−ター機能を得ることにより増強することができ、以て、該プロモ−ターの下流に位置するcycA遺伝子の転写レベルを増加させることができる。さらに、シャイン・ダルガルノ(SD)配列、及び/又はSD配列と開始コドンの間のスペーサー、及び/又はリボソーム結合部位中の開始コドンの直ぐ上流または下流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に大きく影響することが知られている。例えば、開始コドンに先行する3つのヌクレオチドの性質に依存して、20倍の範囲の発現レベルが見出されている(Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984, 3:623-629)。
Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
相同性を有するものであってよい。
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)検索は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、及びtblastxにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin S.及びAltschul S.F.の統計学的方法 (“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features
by using general scoring schemes” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)を使用して、有意性を発見物に帰着させるものである。コンピュータプログラムBLASTは3つのパラメーター、すなわち、スコア、同一性、及び類似性、を計算する。FASTA検索法は、Pearson W.R.により記載されている(“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)。ClustalW法は、Thompson J.D. et al.によって記載されている(“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)。
、分類学データならびにNCBIデータベース(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)におけるアミノ酸配列の受託(Accession)番号及び配列記録(Sequence record)番号とともに以下に記載する(表1)。CycAタンパク質としては、さらに、CycAタンパク質の変異体タンパク質も利用できる。CycAタンパク質ホモログの変異体タンパク質については、上述した配列番号2に示すCycAタンパク質の変異体タンパク質の記載、例えば変異や配列同一性に関するもの、を準用できる。
塩基配列を意味し得る。従って、cycA遺伝子は、遺伝暗号の縮重による変異体塩基配列、例えば遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列、であってもよい。
本発明の方法は、L−イソロイシンを製造する方法を包含する。該L−イソロイシンを製造する方法は、前記細菌を培養培地で培養してL−イソロイシンを培養培地もしくは菌体、またはその両者中に生成させ、排出もしくは分泌させ、且つ/又は蓄積させる工程と、培養培地及び/又は菌体からL−イソロイシンを回収する工程を含み得る。L−イソロイシンは、遊離の形態もしくはその塩、またはそれらの混合物として生産されてよい。すなわち、「L−イソロイシン」という用語は、遊離の形態のL−イソロイシンもしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。例えば、L−イソロイシンのナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩、あるいはL−イソロイシンの両性イオン等の内部塩を、前記方法により製造することができる。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成することができることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。
培養温度は、30〜45℃、あるいは30〜37℃の範囲内に制御することができる。pHは5〜8、あるいは6〜7.5の間に調節することができる。pHは、無機もしくは有機の酸またはアルカリ性物質、およびアンモニアガスを使用することにより調節することができる。
「λRed/ ETメディエーテッドインテグレーション」と呼ばれる、Datsenko K.A.及びWanner B.L.によって開発された方法 (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)を使用して、E. coliにおいてcycA遺伝子を過剰発現させた。この方法にしたがって、cycA遺伝子に隣接する領域と、鋳型染色体中のクロラムフェニコール耐性(CmR)を付与するcat遺伝子及びPLプロモ−ターに隣接する領域の両領域に相同なPCRプライマーP1(配列番号3)及びP2(配列番号4)を構築した。ラムダファージの初期PLプロモーター領域(Giladi H. et al., Identification of an UP element within the IHF binding site at the PL1-PL2 tandem promoter of bacteriophage lambda, J. Mol. Biol., 1996, 260(4):484-491)を含む、クロラムフェニコール耐性E. coli株BW25113 cat-PL-yddGをPCRの鋳型として使用した。E. coli BW25113 cat-PL-yddG株は、EP1449918 A1に詳細に記載されているようにして構築することができる。E. coli BW25113株は、Coli Genetic Stock Center (Yale University, New Haven, USA)からCGSC7636として入手できる。
体へDNA断片を組込むために必要である。
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))において37℃で2.5時間培養し、LB培地(Sambrook, J. and Russell, D.W. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001))、寒天(1.5%)、及びクロラムフェニコール(20mg/L)を含むプレート上に置き、37℃で増殖させてCmR組換体を選択した。pKD46プラスミドを脱落させるため、クロラムフェニコール(20 mg/L)を含むL−寒天培地上で42℃で1回継代し、得られたコロニーのアンピシリン感受性を試験した。このようにしてE. coli MG1655 cat-PL-cycA株を得た。
CmR遺伝子(cat)で標識された異種起源のcycA遺伝子のプロモーター領域を含む細胞を、遺伝子座特異的プライマーP3(配列番号6)及びP4(配列番号7)を使用するPCRにより確認した。PCR条件は、95℃で3分の変性、95℃で30秒、60℃で30秒、及び72℃で2分のプロファイルを20サイクル、最後に72℃で5分の伸長とした。親株であるE. coli MG1655の染色体DNAを鋳型とする反応で得たDNA断片2は457bpの鎖長を有していた(配列番号8)。E. coli MG 1655 cat-PL-cycA株の染色体DNAを鋳型とする反応で得たDNA断片3は、2,174bpの鎖長を有していた(配列番号9)。
PLプロモ−ターの制御下のcycA遺伝子を、L−イソロイシン生産株E. coli K-12 44-3-15 Scr(米国特許第6,960,455B2号及び7,179,623B2号、ロシア特許第2212447 C2号)に導入した。E. coli K-12 44-3-15 Scr株(E. coli 44-3-15 Scrともいう)は、ブダペスト条約の規定に従い、VKPM B-12149の受託番号で2014年12月17日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, FGUP GosNII Genetika, Russian Federation, 117545 Moscow, 1st Dorozhny Proezd, 1)に寄託されている。E. coli 44-3-15 Scrは、アセトヒドロキシ酸シンターゼII活性を回復させる変異をilvG遺伝子(ilvG5)に有し、スレオニンデアミナーゼのイソロイシンによるフィードバック阻害を解除する変異をilvA遺伝子(ilvA7434)に有し(Gavrilova et al., Biotechnologiya(in Russian), 1988, 4:600-608)、クロラムフェニコール耐性(CmR)である。E. coli 44-3-15 Scrへの導入前に、発現カセットcat-PL-cycA中のPLプロモ−ターの上流のCmRマーカーは、λRedインテグレーション(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)を使用して、カナマイシン耐性(KmR)マーカーに置換した。この方法にしたがって、鋳型プラスミド中のcat遺伝子及びカナマイシン耐性を付与するkan遺伝子に隣接する両領域に相同なPCRプライマーP5(配列番号10)及びP6(配列番号11)を構築した。プラスミドpMW118(λattL-KmR-λattR)(EP2100957 A1)をPCRにおいて鋳型として使用した。
ァイルを35サイクル、最後に72℃で5分の伸長とした。得られたDNA断片4(1,541 bp、配列番号12)をアガロースゲル中で精製し、プラスミドpKD46(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)を含むE. coli MG1655
cat-PL-cycA株(実施例1.1)のエレクトロポレーションに使用した。kan-PL-cycAカセットを保持するE. coli MG1655株の細胞を、LB培地、寒天(1.5%)、及びカナマイシン(40mg/L)を含むプレート上で選択した。このようにして、カナマイシン耐性でクロラムフェニコール感受性のE. coli MG1655 kan-PL-cycA株を得た。
44-3-15 Scr kan-PL-cycAを得た。cycA遺伝子のプロモーター領域の置換は上記のようにPCRにより確認した。
改変株であるE. coli 44-3-15 Scr kan-PL-cycA株及び対照のE. coli 44-3-15 Scr株をそれぞれ32℃で18時間、LB培地(Sambrook, J. and Russell, D.W. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載の通り、溶原性ブロスあるいはLuria-Bertani培地ともいう)において培養した。その後、得られた培養物0.2 mLを20×200mm試験管中の発酵培地2 mLに接種し、250rpmの回転式振盪機上で32℃で66時間、グルコースが消費されてOD550が約29になるまで培養した。
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
L−スレオニン 4.0
CaCO3 25.0
LB培地 10%(v/v)
は、プロパン-2-オール:酢酸エチル:25%アンモニア水:水(16:16:5:10、v/v)からなる移動相で展開した。ニンヒドリン溶液(2%、w/v;アセトン中)を可視化試薬として使用した。展開後、プレートを乾燥し、Camag TLCスキャナ3を用いて、winCATSソフトウェア(バージョン1.4.2)により520nmで検出する吸光度モードで走査した。
改変株であるE. coli 44-3-15 Scr kan-PL-cycA株及び対照のE. coli 44-3-15 Scr株をそれぞれLB培地中32℃で18時間培養した。その後、得られた培養物0.2 mLを20×200mm試験管中の発酵培地2 mLに接種し、250rpmの回転式振盪機上で32℃で66時間、グルコースが消費されてOD550が約29になるまで培養した。cycAの過剰発現のα−アミノ酪酸及びノルバリンの副生に対する効果を示すため、発酵培地にはクロルスルフロン(CAS No. 64902-72-3)を補添し、以て、アセトラクテートシンターゼ(AHAS)を阻害することにより分枝鎖L−アミノ酸の生合成を減少させた(Gedi V. and Yoon M.-Y., Bacterial acetohydroxyacid synthase and its inhibitors - a summary of their structure, biological activity and current status, FEBS J., 2012, 279(6):946-963)。
グルコース 60.0
(NH4)2SO4 15.0
KH2PO4 1.5
MgSO4・7H2O 1.0
チアミン-HCl 0.1
クロロスルフロン 20μM
CaCO3 25.0
LB培地 10%(v/v)
Waters AccQ-Tag法を分析に使用した。AccQ-Tag法は、アミノ酸決定用のプレカラム誘導法である。蛍光検出器を備え、「ChemStation B.02.01 SR2」クロマトグラフィー・ソフトウェア(Agilent Technologies)を搭載したコンピューターに接続したHPLCシステム、Agilent 1100グラジエントシステム(Agilent Technologies)を使用した。検出器のセッティングは、励起波長250nm、蛍光波長395nmとした。いずれの場合においても、5μLサンプル注入ループを使用した。AccQ-Fluor Reagent Kit(Waters、WAT052880)を使用したAccQ-Fluor誘導化反応で得られたアミノ酸誘導体を、ガードカラムを備えたWaters AccQ-Tag Amino Acid Analysis Column(3.9 x 150 mm)を使用して分離した。カラムは37℃で平衡化し、移動相は0.8 mL/分の流速で通液した。移動相は、A:水性バッファーWaters AccQ-Tag Eluent A (Waters、WAT052890)、B: HPLC級アセトニトリル、及びC: Milli-Q水、の溶離液を含むものとした。グラジエントは表4に示す通りとした。曲線の番号6は直線部分に対応し、番号11はステップ関数に対応する。
Claims (10)
- (i)L−イソロイシン生産能を有する腸内細菌科の細菌を培養培地で培養して培養培地もしくは菌体、またはその両者中にL−イソロイシンを生産させ、
(ii)培養培地もしくは菌体、またはその両者からL−イソロイシンを回収することを含む、L−イソロイシンを製造する方法であって、
前記細菌がcycA遺伝子を過剰に発現するように改変されている、方法。 - 前記cycA遺伝子が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項1に記載の方法:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む1またはそれ以上の変異を含むアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するタンパク質、及び
(C)配列番号2のアミノ酸配列全体に対して70%以上の相同性を有し、配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するタンパク質。 - 前記cycA遺伝子が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群から選択されるDNAである、請求項1または2に記載の方法:
(A)配列番号1の塩基配列を含むDNA、
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含む1またはそれ以上の変異を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質が配列番号2のアミノ酸配列を有するトランスポーターの活性を有するものであるDNA、及び
(C)遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA。 - cycA遺伝子のコピー数を増加させることにより、及び/又はcycA遺伝子の発現制御領域を改変することにより、cycA遺伝子が過剰発現され、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌がエシェリヒア属に属するものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項5に記載の方法。
- 前記細菌がパントエア属に属するものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細菌がパントエア・アナナティスである、請求項7に記載の方法。
- 非改変細菌と比較して、L−イソロイシンの副生アミノ酸の量が減少する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記副生アミノ酸が、L−バリン、L−ロイシン、L−ノルバリン、L−ノルロイシン、α−アミノ酪酸、及びその組合せからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
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