HU224055B1 - Eljárás aszparaginsav és/vagy glutaminsav családba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, és hatóanyagok az eljárásban történő alkalmazásra - Google Patents

Eljárás aszparaginsav és/vagy glutaminsav családba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, és hatóanyagok az eljárásban történő alkalmazásra Download PDF

Info

Publication number
HU224055B1
HU224055B1 HU0004381A HUP0004381A HU224055B1 HU 224055 B1 HU224055 B1 HU 224055B1 HU 0004381 A HU0004381 A HU 0004381A HU P0004381 A HUP0004381 A HU P0004381A HU 224055 B1 HU224055 B1 HU 224055B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
pyruvate carboxylase
amino acid
carboxylase gene
leu
Prior art date
Application number
HU0004381A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Eikmanns
Petra Peters-Wendisch
Hermann Sahm
Original Assignee
Degussa Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26040582&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU224055(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DE19831609A external-priority patent/DE19831609B4/de
Application filed by Degussa Ag filed Critical Degussa Ag
Publication of HUP0004381A1 publication Critical patent/HUP0004381A1/hu
Publication of HUP0004381A3 publication Critical patent/HUP0004381A3/hu
Publication of HU224055B1 publication Critical patent/HU224055B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01001—Pyruvate carboxylase (6.4.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás aszparaginsav- és/vagy glutaminsavcsaládbatartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére. A találmány tárgyátképezi továbbá egy piruvát-karboxiláz-gén, a piruvát-karboxiláz-génttartalmazó génkonstrukció, a találmány szerinti gént vagygénkonstrukciót hordozó vektor, a találmány szerinti vektorttartalmazó, transzformált sejtek, valamint a találmány szerintipiruvát-karboxiláz-gén alkalmazása az aszparaginsav- és/vagyglutaminsavcsaládba tartozó aminosavak mikroorganizmusok általitermelésének fokozására. A találmány szerinti megoldás előnyösenalkalmazható L-lizin, L-treonin, L-homoszerin, L-glutaminsav és/vagyL- arginin fokozott mennyiségben történő termelésére.

Description

A találmány tárgya eljárás az aszparaginsav- és glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére. A találmány tárgyát képezi továbbá egy piruvát-karboxiláz-gén, a piruvát-karboxiláz-gént tartalmazó génkonstrukció, a találmány szerinti gént vagy génkonstrukciót hordozó vektor, a találmány szerinti vektort tartalmazó, transzformált sejtek, valamint a találmány szerinti piruvát-karboxiláz-gén alkalmazása az aszparaginsav- és/vagy glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak mikroorganizmusok általi termelésének fokozására.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható L-lizin, L-treonin, L-homoszerin, L-glutaminsav és/vagy L-arginin fokozott mennyiségben történő termelésére.
Az aminosavak gazdasági jelentősége széles körű, mivel számos alkalmazási területen használatosak. Például az L-lizin, L-treonin, L-metionin és L-triptofán takarmánykiegészítőként; az L-glutaminsav a gyógyszeriparban az L-izoleucin és L-tirozin gátlására szolgáló adalék anyagként; az L-arginin és L-izoleucin gyógyszerekként, míg az L-glutaminsav, L-aszparaginsav és L-fenil-alanin finomvegyipari vegyszerek szintézisének kiindulási anyagaiként alkalmazható.
E különböző aminosavak előállításának egyik előnyös eljárása a mikroorganizmusok alkalmazásával történő biotechnikai termeltetés, mivel ezen a módon a megfelelő aminosavak biológiailag hatásos és optikailag aktív alakjaihoz jutunk, továbbá egyszerű és olcsó nyersanyagok alkalmazhatók. Mikroorganizmusként például Corynebacterium glutamicum és alfajai [ssp. Flavum és ssp. Lactofermentum; Liebl és munkatársai: Int. J. System Bacteriol. 41, 255 (1991)], valamint az E. coli és rokon baktériumok alkalmazhatók. Ezek a baktériumok normális esetben is termelik a szóban forgó aminosavakat, de csak saját fejlődésükhöz szükséges mennyiségben, így felesleges aminosavak nem termelődnek, s nem is izolálhatok. Ennek oka, hogy a sejtekben az aminosavak bioszintézise többféle szabályozás alatt áll. Léteznek különféle eljárások az aminosavak termelésének fokozására, melyek a szabályozási mechanizmusok kikerülésén alapulnak. Az ilyen eljárások során például olyan aminosavanalógokat iktatnak be, amelyek kikapcsolják a bioszintézis hatásos vezérlését. Például alkalmaztak egy olyan eljárást, amely rezisztens az L-tirozin és L-fenil-alanin analógjaira (JP 19037/1976; JP 39517/1978). Feltártak továbbá egy olyan eljárást, amelyben a szabályozómechanizmus gátlására az L-lizin vagy L-fenil-alanin analógjaira rezisztens baktériumokat alkalmaztak (EP 0 205 849; GB 2 152 509).
Rekombináns DNS-technika alkalmazásával létrehoztak olyan mikroorganizmusokat, amelyekben feedback-gátlásra nem érzékeny kulcsenzimet kódoló gént expresszáltattak, s így érték el a bioszintézis vezérlésének gátlását. Például ismeretes olyan rekombináns, L-lizint termelő baktérium, amely plazmid által kódolt, feedback-rezisztens aszparaginsav-kinázt tartalmaz (EP 0 381 527). Feltártak továbbá olyan rekombináns, L-fenil-alanint termelő baktériumot, amely feedback-rezisztens prefenát-dehidrogenázt tartalmaz (JP 123475/1986;
EP 0 488 424).
Olyan gének túlzott mértékben történő expresszáltatásával, amelyek aminosavszintézisben szerepet játszó enzimekként nem feedback-érzékeny enzimeket kódolnak, fokozott aminosavtermelés érhető el. Például a lizintermelés a dihidropikolinátszlntézis fokozásával növelhető (EP 0 197 335), míg a treonin-dehidratáz fokozott mennyiségben történő szintézisével megnövelt izoleucintermelés érhető el (EP 0 436 886).
Az aminosavtermelés fokozásának további kutatásai során a központi anyagcsere elsődleges celluláris anyagcseretermékeinek javított hozzáférhetőségére összpontosítottak. Ismeretes, hogy a transzketoláz - rekombináns technikák alkalmazásával végzett - túltermeltetése az L-triptofán, L-tirozin vagy L-fenil-alanin nagyobb mennyiségű termelődését eredményezheti (EP 0 600 463). Ezenfelül, Corynebacteriumban a foszfoenol-piruvát-karboxiláz aktivitásának csökkentése az aromás gyűrűt tartalmazó aminosavak javított termelékenységét eredményezi (EP 0 3331 145), ugyanakkor, Corynebacteriumban a foszfoenol-piruvát-karboxiláz aktivitásának fokozása az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak feldúsulásához vezet (EP 0 358 940).
Szaporítási - és különösen aminosavtermelés! feltételek között a trikarbonsavciklust folyamatosan és hatékonyan négy szénatomos (C4) vegyületekkel kell ellátni (például az aminosavbioszintézisből kilépő köztes termékek helyettesítése céljából oxálecetsavval). Egészen a legutóbbi időkig úgy vélték, hogy Corynebacteriumban a foszfoenol-piruvát-karboxiláz felelős ezekért az úgynevezett anaplerotikus funkciókért [Kinoshita: „Biology of Industrial Microorganisms”, szerk.: Benjámin, Cummings Publishing Company, London (1985); Liebl: „The Prokaryotes II”, Springer Verlag N. Y. (1991); Vallino és Stephanopoulos: Biotechnoi. Bíoeng. 41, 633 (1993)].
Felismertük, hogy a foszfoenol-piruvát-karboxilázra negatív mutánsok valamennyi tápközegen azonos mértékben szaporodnak, mint a megfelelő kiindulási törzsek [Peters-Wendisch és munkatársai: FEMS Microbiol. Lett. 112, 269 (1993); Gubler és munkatársai: Appl. Microbiol. Biotechnoi. 40, 857 (1994)]. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a foszfoenol-piruvát-karboxiláz a baktériumokban a szaporodást illetően nem kulcsfontosságú, és nem (vagy csak kevéssé) játszik szerepet az anaplerotikus reakciókban. Ezen túlmenően, az eredmények arra utalnak, hogy Corynebacteriumban egy másik - a szaporodáshoz szükséges oxálecetsav szintéziséért felelős - enzimet kell biztosítani. Az utóbbi időben Corynebacterium glutamicum permeabilizált sejtjeiben piruvát-karboxiláz-aktivitást mutattak ki [Peters-Wendisch és munkatársai: Microbiology 143, 1095 (1997)]. Ez az enzim AMP-vel, ADP-vel és acetil-koenzim-A-val hatékonyan gátolható, s szénforrásként alkalmazott laktát jelenlétében fokozott mennyiségben termelődik. Mivel azt a következtetést vonhatjuk le, hogy ez az enzim a trikarbonsavciklus kielégítő lejátszódásáért felelős, várható, hogy a génexpresszió vagy az enzimatikus aktivitás fokozódá2
HU 224 055 Β1 sa az aszparaginsavcsaládba tartozó aminosavak termelődésében nem eredményez növekedést, vagy csak csekély növekedést eredményez. Ezenfelül, azt vártuk, hogy a piruvát-karboxiláz-gén-expresszió vagy enzimaktivitás fokozódása más családokba tartozó aminosavak termelődésére sem gyakorol hatást.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a piruvát-karboxiláz aktivitásának - az enzim genetikai módosításával és/vagy a piruvát-karboxilázt kódoló gén expressziójának fokozásával történő - növelésével fokozható az aszparaginsav- és/vagy glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak mikrobiális termelése. Felismertük, hogy elsősorban azok a törzsek, amelyek növelt kópiaszámú piruvát-karboxiláz-gént tartalmaznak, a tenyésztő tápközegbe kb. 50%-kal több lizint, 40%-kal több treonint és 150%-kal több homoszerint képesek kiválasztani. Felismertük továbbá, hogy a glutaminsavtermelődés, meglepő módon, szintén jelentős mértékben fokozódott (vő. 6. példa, 4. táblázat).
A piruvát-karboxiláz - enzimaktivitás fokozása céljából végzett - genetikai módosítása előnyösen az endogén gén mutagenezisével hajtható végre. Az ilyen mutációk klasszikus eljárások (mint például UV-besugárzás vagy mutációt kiváltó vegyszerek) alkalmazásával, illetve géntechnológiai eljárásokkal (például delécióval, inszercióval és/vagy szubsztitúcióval) valósíthatók meg.
A piruvát-karboxiláz-gén expressziója a gén kópiaszámának növelésével és/vagy a gén expresszióját pozitív irányban módosító szabályozófaktorok erősítésével fokozható. A szabályozóelemek erősítése - előnyösen transzkripciós szinten - elsősorban a transzkripciós szignálok javításával érhető el, ami, például a struktúrgén előtt álló promoter szekvenciájának (hatékonyságának elősegítése céljából végzett) változtatásával vagy a promoter hatékonyabb promoterekkel történő teljes helyettesítésével valósítható meg. A transzkripció mértékének fokozása a piruvát-karboxiláz-génnel összefüggő szabályozógén megfelelő módosításával is elérhető. Ehhez a szabályozógén szekvenciáját például mutációval úgy módosítjuk, hogy egy szabályozóprotein piruvát-karboxiláz-génhez történő kötődésének hatékonyságát megváltoztassuk, s ezáltal a DNStranszkripciót, s következésképpen a génexpressziót fokozzuk. A piruvát-karboxiláz-génhez úgynevezett erősítőszekvencia is kapcsolható, amely az RNS-polimeráz és a DNS közötti javított kölcsönhatás eredményeként a piruvát-karboxiláz-gén szintén fokozott mértékű expresszióját eredményezi. Mindazonáltal, az expresszió erősítése transzlációs szinten is megvalósítható, melynek során például az mRNS stabilitását növeljük.
A piruvát-karboxiláz-gén kópiaszámának növelése érdekében a gént génkonstrukcióba vagy vektorba foglaljuk. A génkonstrukció elsősorban piruvát-karboxiláz-génhez kapcsolódó szabályozószekvenciákat (előnyösen a gén expresszióját erősítő szekvenciákat) tartalmaz. A piruvát-karboxiláz-gén génkonstrukcióba történő foglalása céljából a gént megfelelő Corynebacterium-változatból izoláljuk, és aminosavtermelő mikroorganizmus (elsősorban Corynebacterium, Escherichia coli vagy Serratia marcescens) törzsébe transzformáljuk. A találmány szerinti eljárások kivitelezése szempontjából elsősorban a C. glutamicumböl, C. glutamicum ssp. flavumból vagy ssp. Iactofermentumbó\ származó gének alkalmasak. A gén izolálása és ismert vektorokkal végzett in vitro rekombinálását követően [I. például Simon és munkatársai: Bio/Technology 1, 784 (1983); Eikmanns és munkatársai: Gene 102, 93 (1991)] az aminosavtermelő törzs transzformációját elektroporációval [I. Liebl és munkatársai: FEMS Microbiology Letters 65, 299 (1991)] vagy konjugációval [Schafer és munkatársai: J. Bacteriol. 172, 1663 (1990)] hajtjuk végre.
Gazdatörzsként előnyösen olyan aminosavtermelő törzseket alkalmazunk, amelyekben a megfelelő aminosav szintézise szabályozásmentesített, és/vagy amely a megfelelő aminosavat illetően fokozott exportszállítási aktivitást mutat. Ezen túlmenően, azok a törzsek előnyösek, amelyek a központi anyagcsere
- megfelelő aminosavak szintézisében szerepet játszó - anyagcseretermékeiből fokozott mennyiséget tartalmaznak, és/vagy amelyek a központi anyagcsere
- megfelelő aminosavak szintézisében szerepet nem játszó - anyagcseretermékeiből csökkent mennyiséget tartalmaznak, különösen azok az anyagcseretermékek, amelyek tolerálják a kompetitív reakciókat; vagyis azok a törzsek előnyösek, amelyekben a megfelelő aminosav bioszintézises reakcióútjával kompetitív reakcióutak csökkent aktivitással működnek. Ilyenformán, az L-aszparaginsav-p-metil-észterre (AME) rezisztens törzsként elsősorban olyan korineform mikroorganizmustörzs alkalmas, amelyben a citrát-szintetáz-aktivitás csökkent mértékű (EP 0 551 614).
A piruvát-karboxiláz-gén izolálást követően a 2. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát, annak allélváltozatát, az 1. azonosító számú szekvencia 165-3587. nukleotidjait tartalmazó szekvenciát vagy lényegében azonos hatású nukleotidszekvenciát tartalmaz. Ezen túlmenően, a gén az 1. azonosító számú szekvencia 20-109. nukleotidjaiból álló promotert vagy azzal lényegében azonos hatású DNS-szekvenciát is tartalmaz. Az allélváltozatok, illetve az azonos hatású DNS-szekvenciák elsősorban olyan funkcionális származékok, amelyek megfelelő - delécióval, inszercióval és/vagy szubsztitúcióval módosított - nukleotidszekvenciát tartalmaznak, melynek eredményeként az enzim aktivitása változatlan marad vagy fokozódik. A találmány szerinti eljárásban előnyösen ilyen piruvát-karboxiláz-gént alkalmazunk.
Az adott esetben promoterrel és szabályozógénnel kapcsolt piruvát-karboxiláz-gén előtt és/vagy után egy vagy több DNS-szekvencia állhat; az ilyen struktúrákat génkonstrukciónak nevezzük.
A piruvát-karboxiláz-gén előtt előnyösen tac-promoter (laclQ-Gen) helyezkedik elő, amelyhez specifikus szabályozószekvenciák kapcsolódnak.
A piruvát-karboxiláz-gén klónozásával a gént tartalmazó plazmidokat kapunk, amelyek segítségével a gén aminosavtermelő törzsbe transzformálható. A transz3
HU 224 055 Β1 formációval kapott sejtek előnyösen transzformált Corynebacterium-sejtnek felelnek meg, amelyek a gént replikációra alkalmas alakban (vagyis a kromoszómán több kópiában) tartalmazzák, miáltal a gén kópiái rekombinációval a genom és/vagy egy plazmid vagy vektor tetszőleges helyeibe épülnek be.
1. példa
Corynebacterium glutamicum piruvát-karboxiláz-génjének klónozása
Ismert piruvát-karboxiláz-gének (pyc-gének), név szerint a Saccharomyces cerevisiae pyc-génje [I. J. Bioi. Chem. 263, 11 493 (1988); Mól. Gén. Génét. 229, 307 (1991)], Mensch [Biochem. Biophys Acta 1227, 46 (1994)], Maus [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1766 (1993)], az Aedes aegypti pyc-génje [EMBL-GeneBank No. L36530] és a Mycobacterium tuberculosis pyc-génje [EMBL-GeneBank No. U00024] alapján PCR-láncindítót szintetizáltunk (MWG Biotech). Ez a láncindító az M. tuberculosis pyc-génjének 810-831. és 1015-1037. nukleotidjainak felel meg. E láncindítóval - az Innis és munkatársai által [„PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press (1990)] által, nem generált homológ láncindító esetére leírt standard eljárás alkalmazásával - végzett amplifikációt követően a C. glutamicum ATCC 13 032 törzs [Microbiology 140, 1817 (1994)] kromoszomális DNS-éből egy kb. 200 bp-os fragmenst izoláltunk. A 200 bp-os méret megfelel a pyc-génnel kapcsolatos várakozásnak. A PCR-terméket Sanger és munkatársai leírása szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)], fluoreszcens jelölésű ddNTP-k és automata DNS-szekvenáló készülék (Applied Biosystems) alkalmazásával szekvenáltuk.
A C. glutamicum e DNS-fragmenséből kiindulva a következő homológ oligonukleotidokat állítottuk elő:
pyc-1:5-CGTCTTCATCGAAATGAAC-3’ pyc-2: 5’-ACGGTGGTGATCCGGCACT-3’
Az oligonukleotidot a C. glutamicum piruvát-karboxiláz-génje próbájának izolálására alkalmaztuk. A láncindítót C. glutamicum kromoszomális DNS-ével és - digoxigeninnel jelzett - nukleotidokkal együtt polimeráz-láncreakciónak vetettük alá. A reakciót a Boehringer-Mannheim által forgalmazott „PCR DIG Labeling Kits” reagenskészlet mellékelt használati útmutatója szerint végeztük, miáltal olyan, digoxigeninnel jelzett DNS-fragmenst amplifikáltunk, amely megfelel a kb. 200 bp-os várt méretnek. Az így kapott pyc-próbákat Southern-blot-hibridizációval - a C. glutamicum kromoszomális DNS-ében pyc-gént hordozó DNS-fragmens azonosítására alkalmaztuk. Ennek során C. glutamicum WT-törzs kromoszomális DNS-ének 2-5 pg-ját Hindlll-mal, Sphl-gyel, Sall-gyel, Ddral-gyel, EcoRl-gyel és BamHI-gyel emésztettük, és a kapott DNS-fragmenseket - 0,8%-os agarózgélen, 20 V feszültséggel 16 óra hosszat végzett elektroforézissel méret szerint elválasztottuk. Az agarózgélen talált DNS-fragmenseket Southern-blot-eljárással denaturáltuk [J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)], majd vákuumos „VacuGene Biot Apparátus” készülék alkalmazásával (Pharmacia LKB) nejlonmembránra (Nytran N13;
Schleicher és Schüll, Dassel, Svájc) másoltuk, immobilizáltuk, és a digoxigeninmarkert - alkalikus foszfatázokkal végzett NBT/X-foszfát konverzióval - detektáltuk. A következő - pyc-DNS-próbával hibridizálódott kromoszomális fragmenseket detektáltuk: 17 kb-os Hindlll-fragmens; 6,5 kb-os Sall-fragmens; 1,35 kb-os EcoRI-fragmens.
A 17 kb-os Hindlll-fragmenst izoláltuk és szubklónoztuk. Erre a célra a C. glutamicum kromoszomális DNS-ének pHC79-kozmidban készített kozmidgénbankját alkalmaztuk, amely a C. glutamicum genomját 99%-ban reprezentálja [Mól. Microbiol. 6, 317 (1992)]. E génbankkal - a Sambrook és munkatársai által leírt kalcium-kloridos eljárással [„Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] - E. coli DH5a-törzset transzformáltunk. A sejteket kb. 300 telep mennyiségben - 50 pg/ml kanamicint tartalmazó - LB-agarlemezekre szélesztettük (összesen 5000 telep). Ezt követően a kapott, transzformáit terméket Nytran-N13-membránra vittük át, majd a sejtek lúgos lízise céljából 5 percig inkubáltuk, és a DNS-t - 0,5 M NaOH és 1,5 M NaCl oldatában áztatott - Whatman-szűrőpapíron denaturáltuk, majd 1 M Tris/HCI (pH=7,5) és 1,5 M NaCl elegyében semlegesítettük.
A szűrőpapírt 2xSSC-ben inkubáltuk, majd a felszabadult DNS-t 366 nm hullámhosszúságú UV sugárzással fixáltuk a szűrőpapíron. A maradék sejttörmeléket 0,1% SDS-t tartalmazó 3xSSC-oldatban 50 °C-on végzett rázatással távolítottuk el. A szűrőpapírt ebben az alakjában alkalmaztuk a specifikus pyc-próbával történő hibridizációra [I. Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)].
A pyc-próbával végzett hibridizációval három transzformánst azonosítottunk, melyekből Bimbóim lúgos lízises eljárásával [Meth. Enzymol. 100, 243 (1983)] izoláltuk a kozmid-DNS-t, és azt restrikciós enzimes és Southern-blot-analízissel a Hindlll-fragmensek jelenlétére teszteltük. A pHC79-10-kozmidot, amely a 40 kb-os Hindlll-fragmenst teljes egészében tartalmazza, tovább vizsgáltuk. A Sall-gyel és EcoRI-gyel végzett hasítás után is ugyanazokat a hibridizálódott fragmenseket kaptuk, mint a kromoszomális DNS-ben, azaz egy
6.5 kb-os Sall-fragmenst és egy 1,35 kb-os EcoRI-fragmenst. A 17 kb-os Hindlll-fragmenst a kozmid restrikciós enzimes emésztésével izoláltuk, és Hindlll-mal emésztett pUC18 E. coli vektorba ligáitok. A kapott pUC-pyc-vektorban lévő fragmenseket restrikciós analízisnek vetettük alá. A fragmensek fizikai térképét az 1. ábrán mutatjuk be.
2. példa
A piruvát-karboxiláz-gén szekvenálása
A további szubklónozási lépések során a pUC-pycplazmidból - megfelelő endonukleázok alkalmazásával - 0,85 kb-os Sall/EcoRI fragmenst, 1,35 kb-os EcoRl-fragmenst, 1,6 kb-os EcoRI/EcoRI/Stul fragmenst, továbbá a 0,85 kb-os Sall/EcoRI fragmenssel átfedő
1.6 kb-os Clal-fragmenst izoláltunk. Ligálással a fragmenseket a - megfelelő endonukleázokkal emésztett 4
HU 224 055 Β1 pUC18-klónozóvektorba ligáltuk, majd a fentebb leírtak szerint szekvenáltuk [I. Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)], a kapott nukleotidszekvenciákat analizáltuk. A nukleotidszekvenciák vizsgálatára a HUSAR-programcsomagot (Release 3.0; Germán Zone fór Cancer Research, Heidelberg) alkalmaztuk. A fragmensek szekvenciaanalízisével 3576 bp-os, folytonos nyitott leolvasási fázist azonosítottunk, amely 1140 aminosavas proteint kódol. Az aminosavszekvencia EMBL-GeneBank (Heidelberg) adataival végzett összehasonlításával valamennyi ismert piruvát-karboxilázzal sikerült hasonlóságokat kimutatni. A legnagyobb mértékű (62%-os) azonosságot a Mycobacterium tuberculosis feltételezett piruvát-karboxilázával (EMBL-GeneBank No. U00024) mutattuk ki. A hasonlóság mértéke konzervált aminosavszubsztitúciók beiktatásával 76%-ra növekedett. Más organizmusokból származó piruvát-karboxilázokkal történő összehasonlítással 46-47%-os és 64-65%-os aminosavszekvencia-hasonlóságot mutattunk ki [Gene 191, 47 (1997); J. Bacteriol. 178, 5960 (1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 990, 1766 (1993); Biochem. J. 316, 631 (1996); EMBL-GeneBank: No. L36530; J. Bioi. Chem.
263,11 493 (1988); Mól. Gén. Génét. 229, 307 (1991)]. Ezen eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a klónozott fragmens tartalmazta a C. glutamicumböl származó piruvát-karboxiláz-gént. A gén nukleotidszekvenciáját 1, azonosító számú szekvenciaként, míg az általa kódolt aminosavszekvenciát a 2. azonosító számú szekvenciaként mutatjuk be.
3. példa
A piruvát-karboxiláz nagy mennyiségben történő termeltetése
A C. glutamicum piruvát-karboxiláz-génjének túlzott mértékben történő expresszáltatása céljából a gént pUCpyx-plazmidból 6,2 kb-os Sspl/Scal fragmensként E. coli glutamicum „swing pEKO-vektorba [Gene 102, 93 (1991)] klónoztuk, amelyet EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasítottunk. Klenow-polimerázzal végzett kezeléssel a túlnyúló végeket tompa végekhez ligáltuk az EcoRl-hely feltöltésével vagy Pstl kapcsolásával, és a linearizált vektort a 6,2 kb-os Sspl/Scal fragmenshez ligáltuk. Az így kapott pEKOpyc-vektort E. coli DH5atörzsbe transzformáltuk, a transzformánsokból plazmid-DNS-t izoláltunk, és az inszerteket restrikciós enzimekkel végzett hasítással ellenőriztük. A DNS-t elektroporációval SP733-törzsbe juttattuk [FEMS Microbiol. Lett. 65, 299 (1989)],
Ez a törzs a restrikciónegatív C. glutamicum R127-törzs [Dechema Biotechnology Conference 4, 323 (1990] kémiai mutagenezissel létrehozott mutánsa, amelyre jellemző, hogy - egyedüli szénforrásként piruvátot és laktátot tartalmazó - minimáltápközegen nem szaporodik [Microbiology 143, 195 (1997)]. Ez a fenotípus a piruvát-karboxiláz defektusaként értelmezhető, és C. glutamicumból (azaz a pEKOpyc-plazmidot hordozó törzs) származó piruvát-karboxiláz-gén bejuttatásával komplementálható (és ellentétes az egyedüli szénforrásként laktátot tartalmazó minimáltápközegen szaporodni képes kiindulási törzs fenotípusával). Ez azt bizonyítja, hogy a gén funkcionális piruvát-karboxilázt kódolt.
A pEKOpyc-plazmidot elektroporációval vad típusú C. glutamicum törzsbe (ATCC 13 032) transzformáltuk. Az így kapott WT (pEKOpyc) törzset - piruvát-karboxiláz-aktivitásukat illetően - vad típusú ATCC 13 032 törzzsel hasonlítottuk össze. Ezt a törzset komplex tápközegben [Luria-Bertani, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 0,5% laktát jelenlétében, illetve 2% laktátot és 4% glükózt tartalmazó minimáltápközegen tenyésztettük, majd Peters-Wendisch és munkatársai által leírt eljárással [Microbiology 143, 1095 (1997)] piruvát-karboxiláz-tesztet végeztünk. A teszt eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. A táblázatban felsorolt adatok azt mutatják, hogy a pEKOpyc-plazmidot hordozó törzsben a piruvát-karboxiláz-aktivitás kb. négyszer nagyobb volt, mint a kiindulási törzs aktivitása.
1. táblázat
Törzs IPTG (μρ/ΓηΙ) Piruvát- karboxiláz (nmolperc-1· ’m9száraztömeg
13 032 (pEKOpyc) 0 75±13
ATCC 13 032 0 19±4
DG52-5 200 88±13
(pVWEXI pyc) 0 11±2
DG52-5 200 5±2
(pVWEXI) 0 6±1
DM368-3 200 76±10
(pVWEXI pyc) 0 12±3
DM368-3 200 10+1
(pVWEXI) 0 11±2 |
4. példa
A lizinfelhalmozódás növelése C. glutamicum DG52-5-törzsben a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben végzett expresszáltatásával A piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatása hatásának a lizintermelő DG52-5-törzsben [J. Gén. Microbiol. 134, 3221 (1988)] történő vizsgálata céljából a pVWEXI expressziós vektort alkalmaztuk, amely IPTG-vel indukálható génexpressziót tesz lehetővé. E vektorba a pyc-gént promoter nélkül klónoztuk. Ebből a célból először láncindító oligonukleotidokat (1. láncindító: az 1. azonosító számú szekvencia 112-133. nukleotidjai; 2. láncindító: az 1. azonosító számú szekvencia 373-355. nukleotidjai) szintetizáltunk, és a piruvát-karboxiláz-gén 261 bp-os promoter nélküli - kezdeti régióját polimeráz-láncreakcióval amplifikáltuk. A láncindítókat úgy választottuk ki, hogy az 1. láncindító Pstl-hasítási helyet, a 2. láncindító pedig BamHI-hasítási helyet építsen be a PCR-termékbe. A polimeráz-láncreakció után 274 bp-os PCR-terméket izoláltunk, majd azt konkatemerekhez ligáltuk, és Pstl-gyel és BamHI-gyel hasítottuk. A restrik5
HU 224 055 Β1 ciós terméket etanolos precipitációval betöményítettük, majd - előzetesen Pstl-gyel és BamHI-gyel hasított pVWEXI-vektorral ligáltuk. Az így kapott konstrukciót (pVWEXi-PCR) restrikciós enzimes emésztéssel teszteltük. A pyc-gén végrégióját a pEKOpyc-vektorból Rcal/Klenow/Sall kezeléssel izoláltuk, majd a BamHl/Klenow/Sall pVWEXI-PCR vektorba ligáltuk. Az így kapott konstrukciót (pVWEXI pyc) restrikciós térképezéssel vizsgáltuk. A plazmid fizikai térképét a 2. ábrán mutatjuk be.
Ezt a plazmidot elektroporációval C. glutamicum DG52-5-törzsbe juttattuk be. Kontrollként a DG52-5törzset inszert nélküli pVWEXI-vektorral transzformáltuk, és összehasonlítottuk a három különböző transzformáns L-lizin precipitációját. Erre a célra [DG52-5 (pVWEXI pyc) 3,4 és (2*TY; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 50 pg/liter kanamicinnel] az egyes előtenyészetekből a megfelelő fermentációs tápközeget külön-külön beoltottuk. A tápközegbe a plazmid stabilitásának fenntartása érdekében további kanamicint adtunk. Mindegyik esetben két párhuzamos tesztet végeztünk; az egyik lombikba 200 pg/ml kanamicint adtunk, míg a másik lombik IPTG-t nem tartalmazott. A tenyészeteket 30 °C-on, 48 óra hosszat, 120-as percenkénti fordulatszámmal síkkeverőn inkubáltuk, majd a tápközegben meghatároztuk a felhalmozódott lizin mennyiségét. Az aminosavkoncentrációt nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg [J. Chromat. 266, 471 (1983)].
A fermentáció eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be, ahol az adatok a különböző kiónokkal végzett kísérletek eredményeinek középértékei.
2. táblázat
Törzs IPTG (pg/ml) Lizin (mM)
DG52-5 (pVWEXI pyc) 200 0 35,4+2,6 23,6±2,9
DG52-5 (pVWEXI) 200 0 23,3±2,9 22,1 ±4,0
A táblázatban bemutatott eredmények azt jelzik, hogy a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatása a tápközegben a lizin 50%-kal nagyobb mértékű felhalmozódását eredményezi. Ilyenformán, az anaplerotikus piruvát-karboxiláz génjének alkalmazása a lizintermelés jelentős mértékű növelését teszi lehetővé.
5. példa
A treonin és homoszerin felhalmozódásának növelése C. glutamicum DM368-3-törzsben a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatásával
A treonin tenyészeti felülúszóban - a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben végzett expresszáltatásának következtében - történő felhalmozódását az L-lizin 4. példában leírt termeltetéséhez hasonlóan teszteltük.
A treonintermelő C. glutamicum DM368-3-törzset (Degussa AG) pVWEXI pyc-plazmiddal (kontrollként pVWEXI-plazmiddal) transzformáltuk, és a három különböző transzformánsnál külön-külön meghatároztuk a treonin felhalmozódásának mértékét. Ebből a célból komplex tápközegben (2*TY; 50 pg/liter kanamicin) DM368-3 (pVWEXI) 2-es és 3-as törzset, valamint DM368-3 (pVWEXI pyc) 1-es, 2-es és 3-as törzset tenyésztettünk, és az előnyészetekkel külön-külön fermentációs tápközeget [CGXII; J. Bacteriol. 175, 5595 (1993)] oltottunk be. A tápközegbe a plazmid stabilitásának fenntartása érdekében további kanamicint adtunk. Mindegyik esetben két párhuzamos tesztet végeztünk; az egyik lombikba 200 pg/ml kanamicint adtunk, míg a másik lombik IPTG-t nem tartalmazott. A tenyészeteket 30 °C-on, 48 óra hosszat, 120-as percenkénti fordulatszámmal síkkeverőn inkubáltuk, majd a tápközegben meghatároztuk a felhalmozódott treonin mennyiségét. Az aminosavkoncentrációt nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg [J. Chromat. 266, 471 (1983)]. A fermentáció eredményeit a 3. táblázatban mutatjuk be, ahol az adatok a különböző klónokkal végzett három kísérlet eredményeinek középértékei.
3. táblázat
Törzs IPTG (Pg/ml) Treonin (mM) Homoszerin (mM)
DM368-3 200 10,2±0,5 14,4±1,2
(pVWEXI pyc) 0 7,9±1,0 5,6±0,2
DM368-3 200 8,0+0,5 5,8+0,7
(pVWEXI) 0 7,5±0,8 6,1+1,0
Az eredmények azt mutatják, hogy a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatása a tápközegben a treonin kb. 40%-kal nagyobb mértékű felhalmozódását eredményezi. Ilyenformán, az anaplerotikus piruvát-karboxiláz génjének alkalmazása az L-treonin-termelés jelentős mértékű növelését teszi lehetővé.
Ezenfelül, az aminosavkoncentráció meghatározása azt a váratlan eredményt mutatta, hogy a piruvátkarboxiláz-gént nagy mennyiségben expresszáló törzs tápközegében a homoszerin mennyisége 150%-kal több volt, mint a gént nem túlzott mennyiségben expresszáló törzs esetében (I. 3. táblázat). Ezen eredmények alapján látható, hogy a találmány szerinti eljárással a treonin és a homoszerin mennyisége egyaránt jelentős mértékben növelhető.
6. példa
A glutaminsav felhalmozódásának növelése vad típusú C. glutamicum törzsben a piruvát-karboxiláz-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatásával
Az L-lizin, L-treonin és L-homoszerin termeléséhez hasonló módon (I. 4. és 5. példa) a tenyészeti felülúszóban vizsgáltuk a glutaminsav - piruvát-karboxiláz-gén túlzott mennyiségben végzett expresszáltatásának köszönhető - felhalmozódását is. Erre a célra, a már el6
HU 224 055 Β1 nyeit a 4. táblázatban mutatjuk be, ahol az adatok a különböző klónokkal végzett két-két kísérlet eredményeinek középértékei.
mondottaknak megfelelően, a C. glutamicum 4. példa szerinti ATCC 13 032 vad típusú törzsét pVWEXI pyc-plazmiddal (kontrollként pVWEXI-plazmiddal) transzformáltuk, és a két transzformáns tenyészeti felülúszójában meghatároztuk a glutaminsav mennyisé- 5 gét. C. glutamicum ATCC 13 032 (pVWEXIpyc) D1- és D2-törzset, illetve C. glutamicum ATCC 13 032 (pVWEXIpyc) 1-es és 2-es törzset komplex tápközegben (50 pg/liter kanamicint tartalmazó 2*TY-tápközeg) tenyésztettük, és az egyes előtenyészetekkel külön-kü- 10 lön CGXII fermentációs tápközeget [J. Bacteriol. 175,
5595 (1993)] oltottunk be. A tápközegbe a plazmid stabilitásának fenntartása érdekében további kanamicint adtunk. Mindegyik esetben két párhuzamos tesztet végeztünk; az egyik lombikba 200 pg/ml kanamicint ad- 15 tünk, míg a másik lombik IPTG-t nem tartalmazott. A tenyészeteket 30 °C-on, 48 óra hosszat, 120-as percenkénti fordulatszámmal síkkeverőn inkubáltuk, majd a tápközegben meghatároztuk a felhalmozódott glutaminsav mennyiségét. Az aminosavkoncentrációt nagy 20 teljesítményű folyadékkromatográfiával határoztuk meg [J. Chromat. 266, 471 (1983)]. A fermentáció eredmé4. táblázat
Törzs IPTG (pg/ml) Glutaminsav (mM)
ATCC 13 032 200 11±2
ATCC 13 032 0 13±2
ATCC 13 032 (pVWEXIpyc) 200 67+4
ATCC 13 032 (pVWEXIpyc) 0 32±4
Az eredmények azt mutatják, hogy a piruvát-karboxiláz-gén túlzott mennyiségben történő expresszáltatása a tápközegben a glutaminsav kb. 500%-kal nagyobb mértékű felhalmozódását eredményezi. Ilyenformán, az anaplerotikus piruvát-karboxiláz génjének alkalmazása a glutaminsavtermelés jelentős mértékű növelését teszi lehetővé.
Szekvencialista
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI;
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 3728 bázispár
TÍPUSA: nukleotid
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCAACCGTG CTTGAAGTCG TGCAGGTCAG GGGAGTGTTG CCCGAAAACA TTGAGAGGAA 60 AACAAAAACC GATGTTTGAT TGGGGGAATC GGGGGTTACG ATACTAGGAC GCAGTGACTG 120 CTATCACCCT TGGCGGTCTC TTGTTGAAAG GAATAATTAC TCTAGTGTCG ACTCACACAT 180 CTTCAACGCT TCCAGCATTC AAAAAGATCT TGGTAGCAAA CCGCGGCGAA ATCGCGGTCC 240 GTGCTTTCCG TGCAGCACTC GAAACCGGTG CAGCCACGGT AGCTATTTAC CCCCGTGAAG 300 ATCGGGGATC ATTCCACCGC TCTTTTGCTT CTGAAGCTGT CCGCATTGGT ACCGAAGGCT 360 CACCAGTCAA GGCGTACCTG GACATCGATG AAATTATCGG TGCAGCTAAA AAAGTTAAAG 420 CAGATGCCAT TTACCCGGGA TACGGCTTCC TGTCTGAAAA TGCCCAGCTT GCCCGCGAGT 480 GTGCGGAAAA CGGCATTACT TTTATTGGCC CAACCCCAGA GGTTCTTGAT CTCACCGGTG 540 ATAAGTCTCG CGCGGTAACC GCCGCGAAGA AGGCTGGTCT GCCAGTTTTG GCGGAATCCA 600 CCCCGAGCAA AAACATCGAT GAGATCGTTA AAAGCGCTGA AGGCCAGACT TACCCCATCT 660 TTGTGAAGGC AGTTGCCGGT GGTGGCGGAC GCGGTATGCG TTTTGTTGCT TCACCTGATG 720 AGCTTCGCAA ATTAGCAACA GAAGCATCTC GTGAAGCTGA AGCGGCTTTC GGCGATGGCG 780 CGGTATATGT CGAACGTGCT GTGATTAACC CTCAGCATAT TGAAGTGCAG ATCCTTGGCG 840 ATCACACTGG AGAAGTTGTA CACCTTTATG AACGTGACTG CTCACTGCAG CGTCGTCACC 900 AAAAAGTTGT CGAAATTGCG CCAGCACAGC ATTTGGATCC AGAACTGCGT GATCGCATTT 960 GTGCGGATGC AGTAAAGTTC TGCCGCTCCA TTGGTTACCA GGGCGCGGGA ACCGTGGAAT 1020 TCTTGGTCGA TGAAAAGGGC AACCACGTCT TCATCGAAAT GAACCCACGT ATCCAGGTTG 1080 AGCACACCGT GACTGAAGAA GTCACCGAGG TGGACCTGGT GAAGGCGCAG ATGCGCTTGG 1140 CTGCTGGTGC AACCTTGAAG GAATTGGGTC TGACCCAAGA TAAGATCAAG ACCCACGGTG 1200 CAGCACTGCA GTGCCGCATC ACCACGGAAG ATCCAAACAA CGGCTTCCGC CCAGATACCG 1260 GAACTATCAC CGCGTACCGC TCACCAGGCG GAGCTGGCGT TCGTCTTGAC GGTGCAGCTC 1320 AGCTCGGTGG CGAAATCACC GCACACTTTG ACTCCATGCT GGTGAAAATG ACCTGCCGTG 1380 GTTCCGACTT TGAAACTGCT GTTGCTCGTG CACAGCGCGC GTTGGCTGAG TTCACCGTGT 1440 CTGGTGTTGC AACCAACATT GGTTTCTTGC GTGCGTTGCT GCGGGAAGAG GACTTCACTT 1500 CCAAGCGCAT CGCCACCGGA TTCATTGCCG ATCACCCGCA CCTCCTTCAG GCTCCACCTG 1560 CTGATGATGA GCAGGGACGC ATCCTGGATT ACTTGGCAGA TGTCACCGTG AACAAGCCTC 1620
HU 224 055 Β1
ATGGTGTGCG TCCAAAGGAT GTTGCAGCTC CTATCGATAA GCTGCCTAAC ATCAAGGATC 1680
TGCCACTGCC ACGCGGTTCC CGTGACCGCC TGAAGCAGCT TGGCCCAGCC GCGTTTGCTC 1740
GTGATCTCCG TGAGCAGGAC GCACTGGCAG TTACTGATAC CACCTTCCGC GATGCACACC 1800
AGTCTTTGCT TGCGACCCGA GTCCGCTCAT TCGCACTGAA GCCTGCGGCA GAGGCCGTCG 1860
CAAAGCTGAC TCCTGAGCTT TTGTCCGTGG AGGCCTGGGG CGGCGCGACC TACGATGTGG 1920
CGATGCGTTT CCTCTTTGAG GATCCGTGGG ACAGGCTCGA CGAGCTGCGC GAGGCGATGC 1980
CGAATGTAAA CATTCAGATG CTGCTTCGCG GCCGCAACAC CGTGGGATAC ACCCCGTACC 2040
CAGACTCCGT CTGCCGCGCG TTTGTTAAGG AAGCTGCCAG CTCCGGCGTG GACATCTTCC 2100
GCATCTTCGA CGCGCTTAAC GACGTCTCCC AGATGCGTCC AGCAATCGAC GCAGTCCTGG 2160
AGACCAACAC CGCGGTAGCC GAGGTGGCTA TGGCTTATTC TGGTGATCTC TCTGATCCAA 2220
ATGAAAAGCT CTACACCCTG GATTACTACC TAAAGATGGC AGAGGAGATC GTCAAGTCTG 2280
GCGCTCACAT CTTGGCCATT AAGGATATGG CTGGTCTGCT TCGCCCAGCT GCGGTAACCA 2340
AGCTGGTCAC CGCACTGCGC CGTGAATTCG ATCTGCCAGT GCACGTGCAC ACCCACGACA 2400
CTGCGGGTGG CCAGCTGGCA ACCTACTTTG CTGCAGCTCA AGCTGGTGCA GATGCTGTTG 2460
ACGGTGCTTC CGCACCACTG TCTGGCACCA CCTCCCAGCC ATCCCTGTCT GCCATTGTTG 2520
CTGCATTCGC GCACACCCGT CGCGATACCG GTTTGAGCCT CGAGGCTGTT TCTGACCTCG 2580
AGCCGTACTG GGAAGCAGTG CGCGGACTGT ACCTGCCATT TGAGTCTGGA ACCCCAGGCC 2640
CAACCGGTCG CGTCTACCGC CACGAAATCC CAGGCGGACA GTTGTCCAAC CTGCGTGCAC 2700
AGGCCACCGC ACTGGGCCTT GCGGATCGTT TCGAACTCAT CGAAGACAAC TACGCAGCCG 2760
TTAATGAGAT GCTGGGACGC CCAACCAAGG TCACCCCATC CTCCAAGGTT GTTGGCGACC 2620
TCGCACTCCA CCTCGTTGGT GCGGGTGTGG ATCCAGCAGA CTTTGCTGCC GATCCACAAA 2680
AGTACGACAT CCCAGACTCT GTCATCGCGT TCCTGCGCGG CGAGCTTGGT AACCCTCCAG 2940
GTGGCTGGCC AGAGCCACTG CGCACCCGCG CACTGGAAGG CCGCTCCGAA GGCAAGGCAC 3000
CTCTGACGGA AGTTCCTGAG GAAGAGCAGG CGCACCTCGA CGCTGATGAT TCCAAGGAAC 3060
GTCGCAATAG CCTCAACCGC CTGCTGTTCC CGAAGCCAAC CGAAGAGTTC CTCGAGCACC 3120
GTCGCCGCTT CGGCAACACC TCTGCGCTGG ATGATCGTGA ATTCTTCTAC GGCCTGGTCG 3180
AAGGCCGCGA GACTTTGATC CGCCTGCCAG ATGTGCGCAC CCCACTGCTT GTTCGCCTGG 3240
ATGCGATCTC TGAGCCAGAC GATAAGGGTA TGCGCAATGT TGTGGCCAAC GTCAACGGCC 3300
AGATCCGCCC AATGCGTGTG CGTGACCGCT CCGTTGAGTC TGTCACCGCA ACCGCAGAAA 3360
AGGCAGATTC CTCCAACAAG GGCCATGTTG CTGCACCATT CGCTGGTGTT GTCACCGTGA 3420
CTGTTGCTGA AGGTGATGAG GTCAAGGCTG GAGATGCAGT CGCAATCATC GAGGCTATGA 3480
AGATGGAAGC AACAATCACT GCTTCTGTTG ACGGCAAAAT CGATCGCGTT GTGGTTCCTG 3540
CTGCAACGAA GGTGGAAGGT GGCGACTTGA TCGTCGTCGT TTCCTAAACC TTTCTGTAAA 3600
AAGCCCCGCG TCTTCCTCAT GGAGGAGGCG GGGCTTTTTG GGCCAAGATG GGAGATGGGT 3660
GAGTTGGATT TGGTCTGATT CGACACTTTT AAGGGCAGAG ATTTGAAGAT GGAGACCAAG 3720
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1140 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: protein
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Ser Thr His Thr 5 Ser Ser Thr Leu Pro 10 Alá Phe Lys Lys Ile 15 Leu
Val Alá Asn Arg 20 Gly Glu Ile Alá Val 25 Arg Alá Phe Arg Alá 30 Alá Leu
Glu Thr Gly 35 Alá Alá Thr Val Alá 40 Ile Tyr Pro Arg Glu 45 Asp Arg Gly
Ser Phe 50 His Arg Ser Phe Alá 55 Ser Glu Alá Val Arg 60 Ile Gly Thr Glu
Gly Ser Pro Val Lys Alá Tyr Leu Asp Ile Asp Glu Ile Ile Gly Alá
70 75 80
HU 224 055 Β1
Alá Lys Lys Val Lys Alá Asp Alá Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95
Ser Glu Asn Alá Gin Leu Alá Arg Glu Cys Alá Glu Asn Gly Ile Thr 100 105 110
Phe Ile Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125
Arg Alá Val Thr Alá Alá Lys Lys Alá Gly Leu Pre Val Leu Alá Glu 130 135 140
Ser Thr Pro Ser Lys Asn Ile Asp Glu Ile Val Lys Ser Alá Glu Gly
145 150 155 160
Gin Thr Tyr Pro Ile Phe Val Lys Alá Val Alá Gly Gly Gly Gly Arg
165 170 175
Gly Met Arg Phe Val Ma Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Alá Thr 180 185 190
Glu Alá Ser Arg Glu Alá Glu Alá Alá Phe Gly Asp Gly Alá Val Tyr 195 200 205
Val Glu Acg Alá Val Ile Asn Pro Gin His Ile Glu Val Gin Ile Leu 210 215 220
Gly Asp His Thr Gly Glu Val Val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser
225 230 235 240
Leu Gin Arg Arg His Gin Lys Val Val Glu Ile Alá Pro Alá Gin His
245 250 255
Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Ile Cys Alá Asp Alá Val Lys Phe 260 265 270
Cys Arg Ser Ile Gly Tyr Gin Gly Alá Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285
Asp Glu Lys Gly Asn His Val Phe Ile Glu Met Asn Pro Arg Ile Gin 290 295 300
Val Glu His Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys
305 310 315 320
Alá Gin Met Arg Leu Alá Alá Gly Alá Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu
325 330 335
Thr Gin Asp Lys Ile Lys Thr His Gly Alá Alá Leu Gin Cys Arg Ile 340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr Ile 355 360 365
Thr Alá Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Alá Gly Val Arg Leu Asp Gly Alá 370 375 380
Alá Gin Leu Gly Gly Glu Ile Thr Alá His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400
HU 224 055 Β1
Lys Met Thr Cys Arg 405
Gin Arg Alá Leu Alá 420
Gly Phe Leu Arg Alá 435
Ile Alá Thr Gly Phe 450
Pro Alá Asp Asp Glu 465
Thr Val Asn Lys Pro 485
Ile Asp Lys Leu Pro 500
Arg Asp Arg Leu Lys 515
Arg Glu Gin Asp Alá 530
His Gin Ser Leu Leu 545
Alá Alá Glu Alá Val 565
Alá Trp Gly Gly Alá 580
Asp Pro Trp Asp Arg 595
Asn Ile Gin Met Leu 610
Tyr Pro Asp Ser Val 625
Gly Val Asp Ile Phe 645
Met Arg Pro Alá Ile 660
Glu Val Alá Met Alá 675
Leu Tyr Thr Leu Asp 690
Ser Gly Alá His Ile 705
Gly Ser
Glu Phe
Leu Leu
Ile Alá 455
Gin Gly 470
His Gly
Asn Ile
Gin Leu
Leu Alá 535
Alá Thr 550
Alá Lys
Thr Tyr
Leu Asp
Leu Arg 615
Cys Arg 630
Arg Ile
Asp Alá
Tyr Ser
Tyr Tyr 695
Leu Alá 710
Asp Phe Glu Thr Alá 410
Thr Val Ser Gly Val 425
Arg Glu Glu Asp Phe 440
Asp His Pro His Leu 460
Arg Ile Leu Asp Tyr 475
Val Arg Pro Lys Asp 490
Lys Asp Leu Pro Leu 505
Gly Pro Alá Alá Phe 520
Val Thr Asp Thr Thr 540
Arg Val Arg Ser Phe 555
Lys Thr Pro Glu Leu 570
Asp Val Alá Met Arg 585
Glu Leu Arg Glu Alá 600
Gly Arg Asn Thr Val 620
Alá Phe Val Lys Glu 635
Phe Asp Alá Leu Asn 650
Val Leu Glu Thr Asn 665
Gly Asp Leu Ser Asp 680
Leu Lys Met Alá Glu 700
Ile Lys Asp Met Alá 715
Val Alá Arg Alá 415
Alá Thr Asn Ile 430
Thr Ser Lys Arg 445
Leu Gin Alá Pro
Leu Alá Asp Val 480
Val Alá Alá Pro 495
Pro Arg Gly Ser 510
Alá Arg Asp Leu 525
Phe Arg Asp Alá
Alá Leu Lys Pro 560
Leu Ser Val Glu 575
Phe Leu Phe Glu 590
Met Pro Asn Val 605
Gly Tyr Thr Pro
Alá Alá Ser Ser 640
Asp Val Ser Gin 655
Thr Alá Val Alá 670
Pro Asn Glu Lys 685
Glu Ile Val Lys
Gly Leu Leu Arg 720
HU 224 055 Β1
Pro Alá Alá Val Thr 725 Lys Leu Val Thr Alá 730 Leu Arg Arg Glu Phe 735 Asp
Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Alá Gly Gly Gin Leu Alá
740 745 750
Thr Tyr Phe Alá Alá Alá Gin Alá Gly Alá Asp Alá Val Asp Gly Alá
755 760 765
Ser Alá Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gin Pre Ser Leu Ser Alá Ile
770 775 780
Val Alá Alá Phe Alá His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu
785 790 795 800
Alá Val Ser Asp leu Glu Pro Tyr Trp Glu Alá Val Arg Gly Leu Tyr
805 810 815
Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg
820 825 830
His Glu Ile Pro Gly Gly Gin Leu Ser Asn Leu Arg Alá Gin Alá Thr
835 840 845
Alá Leu Gly Leu Alá Asp Arg Phe Glu Leu Ile Glu Asp Asn Tyr Alá
850 855 860
Alá Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser
865 870 875 880
Lys Val Val Gly Asp Leu Alá Leu His Leu Val Gly Alá Gly Val Asp
885 890 895
Pro Alá Asp Phe Alá Alá Asp Pro Gin Lys Tyr Asp Ile Pro Asp Ser
900 905 910
Val Ile Alá Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp
915 920 925
Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Alá Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys
930 935 940
Alá Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gin Alá His Leu Asp Alá
945 950 955 960
Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro
965 970 975
Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr
980 985 990
Ser Alá Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg
995 1000 1005
Glu Thr Leu Ile Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg
1010 1015 1020
Leu Asp Alá Ile Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val
1025 1030 1035 1040
HU 224 055 Β1
Alá Asn Val Asn Gly 1045 Gin 1 Ile Arg Pro Met 1050 Arg Val Arg Asp Arg 1055 Ser
Val Glu Ser Val 1060 Thr 1 Alá Thr Alá Glu 1065 Lys 1 Alá Asp Ser Ser 1070 Asn 1 Lys
Gly His Val 1075 Alá Alá Pro Phe Alá 1080 Gly 1 Val Val Thr Val 1085 Thr Val Alá
Glu Gly 109C Asp 1 Glu Val Lys Alá 1095 Gly Asp Alá Val Alá 1100 Ile 1 Ile Glu Alá
Met 1105 Lys Met Glu Alá Thr 1110 Ile 1 Thr Alá Ser Val 1115 Asp Gly Lys Ile Asp 1120
Arg Val Val Val Pro 1125 Alá Alá Thr Lys Val 1130 Glu 1 Gly Gly Asp Leu 1135 Ile
Val Val Val Ser
1140

Claims (37)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás aszparaginsav- és/vagy glutaminsavcsaládba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, azzal jellemezve, hogy megfelelő aminosavtermelő mikroorganizmusban az enzim genetikai módosításával és/vagy a piruvát-karboxiláz-gén expresszáltatásával fokozzuk a piruvát-karboxiláz-aktivitást.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy endogén piruvát-karboxiláz-gén mutagenezisével nagyobb piruvát-karboxiláz-aktivitású enzimet hozunk létre.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piruvát-karboxiláz-gén expresszióját a gén kópiaszámának növelésével fokozzuk.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piruvát-karboxiláz-gén kópiaszámának növelése céljából a gént génkonstrukcióba foglaljuk.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gént olyan génkonstrukcióba foglaljuk, amely a piruvát-karboxiláz-génnel kapcsolódó szabályozószekvenciákat tartalmaz.
  6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavtermelő mikroorganizmust a gént tartalmazó génkonstrukcióval transzformáljuk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gént tartalmazó génkonstrukcióval Corynebacfer/um-nemzetségbe tartozó mikroorganizmust transzformálunk.
  8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan mikroorganizmust transzformálunk, amelyben a megfelelő aminosav szintézisében szerepet játszó enzim a szabályozás alól fel van szabadítva, és/vagy amely a megfelelő aminosavat illetően fokozott exportszállításí aktivitást mutat.
  9. 9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan mikroorganizmust transzformálunk, amelyben a megfelelő aminosav szintézisében szerepet játszó anyagcseretermékek nagyobb mennyiségben vannak jelen.
  10. 10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan mikroorganizmust transzformálunk, amelyben a megfelelő aminosav bioszintézises reakcióútjával kompetícióban lévő bioszintézises reakcióutak csökkent aktivitással játszódnak le.
  11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piruvát-karboxiláz-gént Corynebacterium-nemzetségbe tartozó mikroorganizmustörzsből izoláljuk.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génexpressziót a transzkripciós szignál erősítésével fokozzuk.
  13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy piruvát-karboxiláz-génként a piruvát-karboxiláz-gén előtt tac-promotert tartalmazó génkonstrukciót alkalmazunk.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan génkonstrukciót alkalmazunk, amelyben a tac-promoter szabályozószekvenciákhoz van kapcsolva.
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy piruvát-karboxiláz-génként olyan gént alkalmazunk, amely a 2. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy piruvát-karboxiláz-génként olyan gént alkalmazunk, amely az 1. azonosító számú szekvencia 165-3587. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát vagy azzal azonos aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
  17. 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lizint, treonint, homoszerint, glutaminsavat és/vagy arginint állítunk elő.
  18. 18. Izolált piruvát-karboxiláz-gén, amely a 2. azonosító számú szekvenciaként bemutatott aminosavszekvenciát kódolja.
    HU 224 055 Β1
  19. 19. A 18. igénypont szerinti piruvát-karboxiláz-gén, amely az 1. azonosító számú szekvencia 165-3587. nukleotidjaiból álló nukleotidszekvenciát vagy azzal azonos aminosavszekvenciát kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
  20. 20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti piruvát-karboxiláz-gén, amelyhez az 1. azonosító számú szekvencia 20-109. nukleotídjait tartalmazó nukleotidszekvencia van kapcsolva.
  21. 21. A 18. vagy 19. igénypont szerinti piruvát-karboxiláz-gén, amelyhez tac-promoter van kapcsolva.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti piruvát-karboxiláz-gén a promoterhez kapcsolódó szabályozószekvenciával együtt.
  23. 23. A 18-20. igénypont szerinti piruvát-karboxiláz-gén, a hozzákapcsolódó szabályozószekvenciákkal együtt.
  24. 24. Génkonstrukció, amely 18-23. igénypontok bármelyike szerinti piruvát-karboxiláz-gént tartalmaz.
  25. 25. Vektor, amely 18-23. igénypontok bármelyike szerinti piruvát-karboxiláz-gént vagy 24. igénypont szerinti gén konstrukciót tartalmaz.
  26. 26. Transzformált sejt, amely replikációra alkalmas alakban 18-23. igénypontok bármelyike szerinti piruvát-karboxiláz-gént vagy 24. igénypont szerinti génkonstrukciót tartalmaz.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti transzformált sejt, amely 25. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  28. 28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti transzformált sejt, amely a Corynebacterium-nemzetségbe tartozik.
  29. 29. A 26-28. igénypontok bármelyike szerinti transzformáit sejt, amelyben a megfelelő aminosav szintézisében szerepet játszó enzimek és/vagy a megfelelő aminosav szállításában szerepet játszó enzimek a szabályozás alól fel vannak szabadítva.
  30. 30. A 26-29. igénypontok bármelyike szerinti transzformált sejt, amely a központi anyagcsere - megfelelő aminosav szintézisében szerepet játszó - anyagcseretermékeiből fokozott mennyiséget tartalmaz.
  31. 31. A 26-30. igénypontok bármelyike szerinti transzformált sejt, amely a központi anyagcsere - megfelelő aminosav szintézisében szerepet nem játszó anyagcseretermékeiből csökkentett mennyiséget tartalmaz.
  32. 32. Piruvát-karboxiláz-gén alkalmazása aszparaginsav- és/vagy glutaminsavesaládba tartozó aminosavak mikroorganizmusokban történő termelődésének fokozására.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy fokozott piruvát-karboxiláz-aktivitású enzimet kódoló, mutagenizált piruvát-karboxiláz-gént alkalmazunk.
  34. 34. A 32. vagy 33. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavat termelő mikroorganizmust piruvát-karboxiláz-gént tartalmazó génkonstrukcióval transzformáljuk.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavat termelő mikroorganizmust olyan génkonstrukcióval transzformáljuk, amely szabályozószekvenciákat is tartalmaz.
  36. 36. A 32-35. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy Corynebacteriumból származó piruvát-karboxiláz-gént alkalmazunk.
  37. 37. A 32-36. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy aminosavtermelő mikroorganizmusként Corynebacteriumot alkalmazunk.
HU0004381A 1997-10-04 1998-09-30 Eljárás aszparaginsav és/vagy glutaminsav családba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, és hatóanyagok az eljárásban történő alkalmazásra HU224055B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19743894 1997-10-04
DE19831609A DE19831609B4 (de) 1997-10-04 1998-07-14 Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
PCT/EP1998/006210 WO1999018228A2 (de) 1997-10-04 1998-09-30 Verfahren zur mikrobiellen herstellung von aminosäuren der aspartat- und/oder glutamatfamilie und im verfahren einsetzbare mittel

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0004381A1 HUP0004381A1 (en) 2001-03-28
HUP0004381A3 HUP0004381A3 (en) 2003-08-28
HU224055B1 true HU224055B1 (hu) 2005-05-30

Family

ID=26040582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0004381A HU224055B1 (hu) 1997-10-04 1998-09-30 Eljárás aszparaginsav és/vagy glutaminsav családba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, és hatóanyagok az eljárásban történő alkalmazásra

Country Status (15)

Country Link
US (2) US7267967B1 (hu)
EP (1) EP1015621B1 (hu)
JP (1) JP2002508921A (hu)
CN (1) CN1323171C (hu)
AT (1) ATE290602T1 (hu)
AU (1) AU741038B2 (hu)
BR (1) BRPI9813021B1 (hu)
CA (1) CA2305577A1 (hu)
DE (1) DE59812638D1 (hu)
ES (1) ES2238773T3 (hu)
HU (1) HU224055B1 (hu)
ID (1) ID26644A (hu)
RU (1) RU2231552C2 (hu)
SK (1) SK284235B6 (hu)
WO (1) WO1999018228A2 (hu)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2194122B1 (en) 1998-04-13 2015-12-02 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
AU2203399A (en) * 1998-12-23 2000-07-31 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from (corynebacterium glutamicum)
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
JP2000201692A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ―グルタミン酸の製造法
TW200734459A (en) 1999-10-04 2007-09-16 Ajinomoto Kk Genes for heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic coryneform bacteria
DE19947792A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das Irp Gen codierende Nukleotidsequenzen
US7132272B2 (en) 1999-10-05 2006-11-07 Degussa Ag Nucleotide sequence encoding corynebacterium glutamicum leucine response regulatory protein
RU2207376C2 (ru) * 1999-10-14 2003-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислоты методом ферментации, штамм бактерии escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
US6949374B2 (en) 2000-05-04 2005-09-27 Degussa Ag FadD15 gene of Corynebacterium glutamicum, encoding an acyl-CoA synthase polypeptide
DE10021831A1 (de) * 2000-05-04 2001-11-08 Degussa Neue für das fadD15-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10032350A1 (de) 2000-07-04 2002-01-24 Degussa Neue für das mdhA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
EP1307562B1 (en) * 2000-08-10 2004-12-15 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the lysr3 gene
DE10039049A1 (de) 2000-08-10 2002-02-21 Degussa Neue für das IysR3-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10042051A1 (de) * 2000-08-26 2002-03-07 Degussa Neue für das cstA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
PL364087A1 (en) * 2001-02-21 2004-12-13 Basf Aktiengesellschaft Method for the production of d-pantothenic acid and/or salts thereof as adjunct for animal feedstuffs
JP2004523237A (ja) * 2001-02-21 2004-08-05 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト 動物飼料添加剤としてのｄ−パントテン酸および／またはその塩の製造方法
DE10108223A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
DE10108225A1 (de) * 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
EP1407035B1 (en) 2001-07-18 2006-04-12 Degussa AG Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an attenuated aspa gene
ATE434663T1 (de) 2001-07-18 2009-07-15 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur herstellung von l-threonin durch enterobakteriaceae-stämmen mit verstärkter exprimierung der succ und sucd gene
CA2456416A1 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds ii
US8278076B2 (en) 2002-02-20 2012-10-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Microbial production of pyruvate and pyruvate derivatives
DE10303571A1 (de) 2003-01-30 2004-08-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE10316109A1 (de) 2003-04-09 2004-10-21 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004005836A1 (de) 2004-02-06 2005-09-15 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102004037572A1 (de) * 2004-08-03 2006-02-23 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102005018835A1 (de) 2005-04-22 2006-11-02 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
DE102005043979A1 (de) 2005-09-15 2007-03-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Produktion von Aminosäuren in aminosäureproduzierenden Mikroorganismen
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
DE102006032634A1 (de) 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
EP2066782A4 (en) * 2006-09-15 2010-02-03 Cj Cheiljedang Corp CORYNEBACTERIA WITH IMPROVED L-LYSINE PRODUCTIVITY AND METHOD FOR THE PREPARATION OF L-LYSINE THEREWITH
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR100830826B1 (ko) 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
CN102348806A (zh) 2008-01-23 2012-02-08 味之素株式会社 L-氨基酸的生产方法
EP2098597A1 (de) 2008-03-04 2009-09-09 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
CN102177246B (zh) 2008-09-08 2015-02-11 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2267145A1 (de) 2009-06-24 2010-12-29 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
MX2012009816A (es) 2010-02-25 2012-12-10 Council Scient Ind Res Procesos para la produccion de arginina utilizando corynebacterium glutamicum atcc 21831 o corynebacterium glutamicum atcc 21493 en un medio de fermentacion que comprende bagazo de mandioca o semilla del fruto de panapen como una fuente de carbono.
KR101145943B1 (ko) 2010-03-11 2012-05-15 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
JP5796282B2 (ja) * 2010-08-31 2015-10-21 東レ株式会社 コリネ型細菌による化学品の製造方法
RU2496867C2 (ru) * 2011-04-25 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты семейства глутамата с использованием коринеформной бактерии
EP2540834A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Metabolic Explorer Method for the preparation of 1,3-propanediol
CN105483145B (zh) * 2011-12-21 2021-04-06 Cj第一制糖株式会社 利用具有产生l-赖氨酸能力的微生物产生l-赖氨酸的方法
JP5831669B2 (ja) 2013-05-13 2015-12-09 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
EA201591846A1 (ru) * 2013-05-17 2016-08-31 Ксилеко, Инк. Обработка биомассы
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
ES2761596T3 (es) 2013-10-02 2020-05-20 Ajinomoto Kk Aparato de control de amoniaco y método de control de amoniaco
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP6519476B2 (ja) 2013-10-23 2019-05-29 味の素株式会社 目的物質の製造法
CN105505969A (zh) * 2014-09-26 2016-04-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用
JP6623690B2 (ja) 2015-10-30 2019-12-25 味の素株式会社 グルタミン酸系ｌ−アミノ酸の製造法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
DE102017004751A1 (de) 2017-05-18 2018-11-22 Forschungszentrum Jülich GmbH Pyruvatcarboxylase und für die Pyruvatcarboxylase kodierende DNA, Plasmid enthaltend die DNA, sowie Mikroorganismus zur Produktion und verfahren zur Herstellung von Produkten, deren Bioynthese Oxalacetat als Vorstufe beeinhaltet und Chromosom
EP3467099A1 (en) 2017-10-05 2019-04-10 Evonik Degussa GmbH Method for the fermentative production of l-amino acids
EP3608409A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 Evonik Operations GmbH Process for preparing l amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
EP3847270A1 (en) 2018-09-07 2021-07-14 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
RU2019128538A (ru) 2018-09-26 2021-03-11 Эвоник Оперейшенс ГмбХ Способ ферментативного получения l-лизина
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
CN113755492B (zh) * 2020-07-20 2023-05-30 中国科学院天津工业生物技术研究所 丙酮酸羧化酶基因启动子的突变体及其应用
JPWO2022092018A1 (hu) 2020-10-28 2022-05-05
WO2023222510A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222515A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
WO2023222505A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Evonik Operations Gmbh Biotechnological production of monomers of bisucaberins, desferrioxamines and analogs thereof
US20240117393A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2223754B (en) 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE4201085A1 (de) 1992-01-17 1993-07-22 Degussa Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit l-lysin ausscheidender coryneformer bakterien
HU219600B (hu) * 1993-08-24 2001-05-28 Ajinomoto Co., Inc. Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, ennek génje, valamint eljárás aminosav előállítására
US5939307A (en) * 1996-07-30 1999-08-17 The Archer-Daniels-Midland Company Strains of Escherichia coli, methods of preparing the same and use thereof in fermentation processes for l-threonine production
DE60030400T2 (de) * 1999-07-09 2007-09-13 Degussa Gmbh Für den opac-gen kodierende nukleotidsequenzen
DE19941478A1 (de) * 1999-09-01 2001-03-08 Degussa Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien
DE19959329A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE10154102A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-15 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae

Also Published As

Publication number Publication date
SK284235B6 (en) 2004-11-03
ES2238773T3 (es) 2005-09-01
CN1275167A (zh) 2000-11-29
CN1323171C (zh) 2007-06-27
DE59812638D1 (de) 2005-04-14
ID26644A (id) 2001-01-25
EP1015621A2 (de) 2000-07-05
US20070202571A1 (en) 2007-08-30
AU1148299A (en) 1999-04-27
EP1015621B1 (de) 2005-03-09
HUP0004381A1 (en) 2001-03-28
RU2231552C2 (ru) 2004-06-27
BRPI9813021B1 (pt) 2016-04-05
CA2305577A1 (en) 1999-04-15
HUP0004381A3 (en) 2003-08-28
AU741038B2 (en) 2001-11-22
WO1999018228A2 (de) 1999-04-15
ATE290602T1 (de) 2005-03-15
BR9813021A (pt) 2000-08-15
SK4812000A3 (en) 2000-09-12
WO1999018228A3 (de) 1999-05-20
JP2002508921A (ja) 2002-03-26
US7267967B1 (en) 2007-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU224055B1 (hu) Eljárás aszparaginsav és/vagy glutaminsav családba tartozó aminosavak mikrobiális termeltetésére, és hatóanyagok az eljárásban történő alkalmazásra
KR100526316B1 (ko) 아스파테이트 및 글루타메이트계열 아미노산의 미생물적제조방법과 이 방법에 사용되는 작용제
KR100337959B1 (ko) 돌연변이체포스포에놀피루베이트카복실라제,이의유전자및아미노산의제조방법
KR100976072B1 (ko) 에스세리키아속 세균을 사용하는 ｌ-트레오닌의 제조방법
US10526586B2 (en) Pyruvate dehydrogenase variants, a microorganism comprising the same and a method for producing L-amino acid using the same
RU2761871C1 (ru) Новый экспортер L-триптофана и способ продуцирования L-триптофана с его использованием
GB2223754A (en) Dna coding for phosphoenolpyruvate carboxylase
US8535915B2 (en) Promoter, and a production method for L-lysine using the same
JP2001136991A (ja) 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
US10253339B2 (en) Gluconate repressor variant, microorganism containing the same producing L-lysine, and method for producing L-lysine
WO1995023224A1 (fr) Nouveau gene tire de corynebacterium et son utilisation
KR20020073153A (ko) Ｌ-아미노산의 제조법 및 신규 유전자
JP2001190290A (ja) 遺伝子ｓｕｃＣおよびｓｕｃＤをコードする新規のヌクレオチド配列
JP2009507505A (ja) 微生物を使用するアミノ酸産生法
US10597686B2 (en) Polypeptide having the activity of exporting O-acetyl-homoserine
KR102126951B1 (ko) 디하이드로디피콜린산 리덕타제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산방법
KR100830860B1 (ko) 메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소및 이를 암호화하는 유전자
CN114630903B (zh) 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶的修饰多肽及使用其生产l-苏氨酸的方法
KR20220101509A (ko) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
EP2397545B1 (en) Method for producing amino acid
MXPA00003224A (en) Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050311

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees