MXPA00003224A - Proceso para la obtencion microbiana, de aminoacidos de la familia del aspartato y/o glutamato y agentes que se pueden usar en ese proceso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para la obtención microbiana de aminoácidos de la familia del aspartato y/o glutamo en el cual se incrementa la actividad de piruvato-carboxilasa cambiando genéticamente la enzima y/o la expresión del gen de piruvato- carboxilasa de un mecanismo que produce el aminoácido correspondiente. Además, la invención se refiere a un gen de piruvato-carboxilasa y agentes adicionales que se pueden usar en el método inventivo.

Description

PROCESO PARA LA OBTENCIÓN MICROBIANA, DE AMINOÁCIDOS DE LA FAMILIA DEL ASPARTATO Y/O GLUTAMATO Y AGENTES QUE SE PUEDEN USAR EN ESE PROCESO Descripción de la invención La invención se refiere a un proceso para la obtención microbiana de aminoácidos de la familia del aspartato y/o glutamato según las reivindicaciones 1 a 17, genes de piruvato-carboxilasa según las reivindicaciones 18 a 23, estructuras de genes según la reivindicación 24, vectores según la reivindicación 25, células transformadas según la reivindicación 26 a 31, así como usos según la reivindicación 32 a 37. Los aminoácidos son de gran interés económico, siendo que el uso de los aminoácidos es variado: Así, por ejemplo, se requieren como aditivo de alimento para animales L-lisina así como L-treonina, L-metionina y L-triptofano, como aditivo para condimentos L-glutamato, en la industria farmacéutica L-isoleucina y L-tirosina, como medicamento L-arginina y L-isoleucina, o L-glutamato, L-aspartato y L-fenilalanina como sustancia de partida para productos químicos finos. Un método preferido para la obtención de éstos muy diversos aminoácidos es la obtención biotecnológica mediante microorganismos; puesto que de ésta manera se obtiene directamente la forma biológicamente activa y ópticamente activa del respectivo aminoácido, y se pueden emplear materias primas sencillas y económicas. Como microorganismos se emplean, por ejemplo, corinebacterium glutamicum y sus subespecies relacionadas ssp. flavum y ssp. lactofermentum (Liebl et al., Int J System Bacteriol 1991, 41: 255 a 260) así como también escherichia coli y bacterias relacionadas. Sin embargo, estas bacterias normalmente producen los aminoácidos solamente en las cantidades requeridas para el crecimiento, de manera que por consiguiente no se forman ni se secretan los aminoácidos excedentes. Ésto tiene su fundamento en que la biosíntesis de los aminoácidos se controla de muchas maneras en la célula. Consecuentemente ya se conocen los más diversos métodos para incrementar la formación de producto mediante la anulación de los mecanismos de control. En éstos procesos se aplican, por ejemplo, análogos de los aminoácidos con el fin de anular la regulación efectiva de la biosíntesis. Así, por ejemplo, se describe un proceso en el que se usan cepas de corinebacterium que son resistentes contra análogos de la L-tirosina y la L-fenilalanina (JP 19037/1976 y 39517/1978) . Asimismo se describen procesos en los que se emplean bacterias resistentes contra análogos de L-lisina y también L-teonina con el fin de sobreponerse a los mecanismos de control (EP 0 205 849, GB 2 152 509) .

Además se conocen también microorganismos construidos mediante técnicas recombinantes en los que también se anula la regulación de la biosíntesis al clonar y exprimir los genes que codifican para las enzimas clave ya no retroinhibibles. Así, por ejemplo, se conoce una bacteria recombinante que produce L-lisina con aspartatoquinasa retrorresistente codificada de plásmido (EP 0 381 527) . Asimismo se conoce una bacteria recombinante que produce L-fenilalanina con prefenatodehidroquinasa retrorresistente (JP 123475/1986, EP 0 488 424) . Adicionalmente se lograron rendimientos incrementados de aminoácidos mediante la sobreexpresión de genes que no codifican para enzimas retrosensibles de la síntesis de los aminoácidos. Así, por ejemplo, se mejora la formación de L-lisina mediante la síntesis incrementada de la síntesis de dihidrodipicolinato (EP 0 197 335) . Asimismo se logra una formación mejorada de isoleucina emdiante el incremento de la síntesis de la treonindehidratasa (EP 0 436 886) . Otros intentos de aumentar la producción de aminoácido apuntan hacía un mejor proporcionamiento de los metabolitos celulares primarios del metabolismo central. Así se sabe que la sobreexpresión de la transcetolasa lograda mediante técnicas recombinantes permite una formación mejorada de producto de L-Triptofano, L-Tirosina o L-Fenilalanina (EP 0 600 463) . Además, la reducción de la actividad fosfoenolpiruvato-carboxilasa en Corinebacterium conduce a una mejor formación de aminoácidos aromáticos (EP 0 3331 145) , siendo que en cambio el incremento de la actividad fosfoenolpiruvato-carboxilasa en Corinebacterium condujo a un aumento de la secreción de aminoácidos de la familia del aspartato (EP 0 358 940) . Durante el crecimiento y en particular bajo condiciones de producción de aminoácidos resulta necesario rellenar el ciclo del ácido tricarboxílico continuamente y efectivamente con compuestos C4, por ejemplo oxalacetato, para reponer los productos intermedios sustraídos para la biosíntesis del aminoácido. Hasta hace poco se creia que la fosfoenolpiruvato-carboxilasa es responsable de estas funciones conocidas como anapleróticas en el Corinebacterium (Kinoshita, Biology of industrial microorganisms 1985: 115 a 142, Benjamin/Cummings Publishing Company, London; Liebl, The prokaryotes II, 1991: 1157 a 1171, Ediciones Springer, N.Y.; Vallino y Stephanopoulus, Biotechnol Bioeng 1993, 41: 633 a 646). Sin embargo se descubrió que los mutantes negativos de fosfoenolpiruvato-carboxilasa crecían de la misma manera sobre todos los agentes ensayados en comparación con las respectivas cepas de partida (Peters-Wendisch et al., FEMS Microbiology Letters 1993, 112: 269 a 274; Gubler et al., Appl Microbiol Biotechnol 1994, 40: 857 a 863). Este resultado demostró que la fosfoenolpiruvato-carboxilasa no es esencial para el crecimiento y que no desempeña ningún papel o solamente uno subordinado para las reacciones anapleróticas. Además, el resultado precedentemente mencionado advirtió que en Corynebacterium debe existir cuando menos otra enzima responsable de la síntesis del oxalacetato que se requiere para el crecimiento. Hace poco se descubrió de hecho una actividad piruvato-carboxilasa en células permeabilizadas de Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch et al., Microbiology 1997, 143: 1095 a 1103) . Esta enzima es inhibida efectivamente mediante AMP, ADP y acetil coenzima A y es formada en cantidad incrementada en la presencia de lactato como fuente de carbohidratos . La ocurrencia de una piruvato-carboxilasa en Corynebacterium glutamicum fué comprobada también por otro grupo de trabajo mediante espectroscopia RMN 13C y GS-MS, y confirmada (Park el al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 47: 430-440). Puesto que era necesario partir del supuesto de que esta enzima en primer lugar es responsbale de rellenar el ciclo del ácido tricarboxílico durante el crecimiento era de esperar que un incremento de la expresión del gen o bien de la actividad de la enzima no conduce a incremento alguno, o en todo caso muy pequeño, de los aminoácidos pertenecientes a la familia del aspartato. Además se esperaba que un incremento de la expresión del gen o bien de la actividad de la enzima de la piruvato-carboxilasa asimismo tampoco ejercería influencia alguna en la producción de aminoácidos de otras familias. Sin embargo, ahora se descubrió sorprendentemente que después del incremento de la actividad de piruvato-carboxilasa mediante modificación genética de la enzima y/o después del incremento de la expresión del gen de piruvato-carboxilasa se aumenta la producción microbiana de los aminoácidos de la familia del aspartato y/o del glutamato. Se demostró que en particular las cepas con una cantidad incrementada de copias del gen de la piruvato-carboxilasa secretan aproximadamente 50% más de lisina, 40% más de treonina y 150% más de homoserina al medio de cultivo. Se demostró además que sorprendentemente también se aumenta de manera impotante la producción de glutamato (compárese en particular el ejemplo de realización bajo 6. y la tabla 4). La modificación genética de la piruvato-carboxilasa para incrementar la actividad enzimática de preferencia se lleva a cabo mediante la mutación del gen endógeno. Tales mutaciones o bien se pueden producir en forma no específica de acuerdo a los métodos clásicos, como por ejemplo mediante radiación UV, o bien en forma específica mediante métodos gentecnológicos como delecion(es) , inserció (es) y/o sustitución (es) de nucleótidos. La expresión del gen de la piruvato-carboxilasa se incrementa mediante el incremento de la cantidad de copias del gen y/o mediante el reforzamiento de los factores reguladores que influyen positivamente en la expresión del gen. Así, por ejemplo, un reforzamiento de los elementos reguladores se puede llevar a cabo de preferencia en el plano de la transcripción al incrementar en particular las señales de transcripción. Esto puede efectuarse, por ejemplo, al incrementar la actividad del promotor mediante modificación de la secuencia del promotor antepuesto al gen estructural o intercambiando al promotor completo por promotores más activos. También se puede llevar a cabo un reforzamiento de la transcripción mediante influencia adecuada sobre un gen regulador asociado al gen de la piruvato-carboxilasa. Además, eventualmente mediante la mutación de una secuencia génica reguladora, la efectividad del enlace de una proteina reguladora al DNA del gen de la piruvato-carboxilasa a ser regulado puede estar de tal manera influenciada que debido a ello se refuerza la transcripción y por consiguiente la expresión del gen. Pero también se le pueden asociar al gen de la piruvato-carboxilasa los así denominados "intensificadores" como secuencias reguladoras, los cuales asimismo determinan un incremento de la expresión del gen de la piruvato-carboxilasa a través de un mejoramiento de la interacción entre la RNA polimerasa y el DNA. Pero paralelamente también es posible un reforzamiento de la translación al mejorar, por ejemplo, la estabilidad del mRNA. Para aumentar la cantidad de copias del gen, el gen de la piruvato-carboxilasa se inserta en una construcción génica o vector. La construcción génica contiene en particular secuencias reguladoras asociadas al gen de la piruvato-carboxilasa, de preferencia aquellas que incrementan la expresión del gen. Para insertar el gen de la piruvato-carboxilasa en una construcción génica de preferencia el gen se aisla a partir de una cepa de microorganismos de la especie Corynebacterium y se transforma en una cepa de microorganismos productora aminoácido, en particular Corynebacterium o en Escherichia coli o Serratia marcescens. Para el método de conformidad con la invención son adecuados particularmente los genes de C. glutamicum o ssp flavum de C. glutamicum o ssp lactofermentum de C. glutamicum. Después de aislar el gen y la recombinación in vitro con vectores conocidos (compárese, por ejemplo, Simón et al., Bio/Technology 1983, I: 784 a 791; Eik anns et al., Gene 1991, 102: 93 a 98) se lleva a cabo la transformación a las cepas que producen aminoácido mediante electroporación (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1991, 65: 299 a 304) o conjugación (Schafer et al., J Bacteriol 1990, 172: 1663 a 1666). Como cepas huésped se emplean de preferencia aquellos productores de aminoácido que se encuentran desregulados en la síntesis del aminoácido correspondiente y/o que tienen una actividad incrementada de soporte exportador para el aminoácido sorrespondiente. Se prefieren además aquellas cepas que contienen una proporción más alta de aquellos metabolitos del metabolismo central que participan en la síntesis del aminoácido correspondiente, y/o cepas que contienen una proporción reducida de aquellos metabolitos del metabolismo central que no participan en la síntesis del aminoácido correspondiente, en particular metabolitos cuya competencia son las reacciones concurrentes; es decir que se prefieren aquellas cepas con las cuales se desrrolla con actividad reducida una ruta de biosíntesis concurrente con la ruta correspondiente de la biosíntesis del aminoácido. Así es particularmente adecuado una cepa de microorganismos corineforme con actividad reducida de síntesis de citrato, resistente contra ß-metiléster del ácido aspártico (AME) (EP 0 551 614). Después del aislamiento se pueden obtener genes de la pyruvato-carboxilasa con secuencias de nucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácido indicada bajo SEQ ID No. 2 o sus variaciones de alelos, o bien que tienen la secuencia de nucleótidos del nucleótido 165 al 3587 según a SEQ ID No. l o una secuencia de DNA de actividad sustancialmente igual. Además se pueden obtener genes con un promotor antepuesto de la secuencia de nucleótidos del nucleótido 20 al 109 según a SEQ ID No. l o una secuencia de DNA de actividad sustancialmente igual. Las variaciones de alelos o bién las secuencias de DNA de actividad igual comprenden en particular los derivados funcionales que se pueden obtener de las secuencias correspondientes mediante delecion (es) , inserción (es) y/o sustitución (es) de nucleótidos, siendo que se conserva o incluso se incrementa la actividad o bién función de la enzima. Estos genes de la pyruvato-carboxilasa se emplean de preferencia en el método según la invención. Al gen de la pyruvato-carboxilasa con o sin promotor antepuesto o bién sin el gen reguador asociado se le pueden añadir delante y/o detrás una o varias secuencias de DNA, de manera que el gen quede contenido en una estructura génica. Al gen de la pyruvato-carboxilasa se le antepone de preferencia el promotor tac (gen lacl2, siendo que a éste se asocian en particular secuencias reguladoras. Mediante la clonación del gen de la pyruvato-carboxilasa se pueden obtener plasmidos que contienen el gen y son adecuados para la transformación de un productor de aminoácido. Las células obtenibles mediante transformación, que de preferencia son células transformadas de Corynebacterium, contienen al gen en forma replicable, es decir, en copias adicionales sobre el cromosoma, siendo que mnediante recombinación, las copias se integran en sitios a discreción del genoma, y/o sobre un plasmido o vector. Ejemplo de realización 1. Clonación del gen de la pyruvato-carboxilasa a partir de orynebacterium glutamicum A partir de las regiones conservadas de todos los genes (pyc) de la piruvato-carboxilasa conocidos hasta ahora, de Saccharomices cerevisiae (J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315), humano (Biochim Biophys Acta 1994, 1227: 46-52), ratón (Proc Nati Acad Sci, USA 1993, 90: 1766-1770), Aedes aegypti (Banco de genes EMBL: No. de acceso L36530) así como MYcobacterium tuberculosis (Banco de genes EMBL: No. de acceso U00024) se sintetizaron cebadores PCR (MWG Biotech) . Los cebadores correspondían a las bases 810 a 831 y 1015 a 1037 del gen pyc de M. tuberculosis. Mediante PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) de acuerdo al método estándar de Innis et al.

(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press), con éstos cebadores se pudo amplificar para cebadores homólogos no degenerados un fragmento de aproximadamente 200 bp de DNA cromosomal de C. glutamicum ATCC 13032, el cual se había aislado según descrito en Eikmanns et al. (Microbiology 1994, 140: 1817-1828). El tamaño de 200 bp correspondió a la esperanza para los genes pyc. El producto de la PCR se secuenció según descrito en Sanger et al. (Proc Nati Acad Sci, USA 1977, 74: 5463-5467) . La secuenciación se llevó a cabo con ddNTPs marcados de fluorescencia en un aparato automático para secuenciación de DNA (Applied Biosystems) . A partir de éste fragmento de DNA de C. glutamicum se obtuvieron los siguientes oligonucleotidos homólogos : pyc 1 5'- CGTCTTCATCGAAATGAAC-3' PYC 2 5'- ACGGTGGTGATCCGGCACT-3' Los oligonucleótidos se emplearon como cebadores de la PCR para aislar una sonda para el gen de la piruvato-carboxilasa (pyc) de C. glutamicum. Los cebadores se aplicaron una reacción ' PCR con DNA cromosomal de C. glutamicum y nucleótidos marcados ' de digoxigenina. La reacción se llevo a cabo de acuerdo a la instrucción del "PCR DIG Labeling. Kit" de la Compañía Boehringer Mannheim. Con ésta preparación se pudo amplificar un fragmento de DNA marcado de digoxigenina que correspondió al tamaño esperado de aproximadamente 200 bp. La sonda pyc preparada de ésta manera se empleo entonces para identificar a través de hibridización Southern Biot un fragmento de DNA en el DNA cromosomal de C. glutamicum sobre el cual se localiza el gen pyc. Para éste propósito se cortaron en cada caso 2 a 5 µg de DNA cromosomal de C. glutamicum WT con las enzimas de restricción HindIII, Sphl, Salí, Dral, EcoRI . y BamHI, los fragmentos de DNA obtenidos se separaron de acuerdo a su tamaño gelelectroforéticamente durante 16 horas a 20 V en un gel de agarosa al 0.8%. Los fragmentos de DNA que se encontraban en el gel de agarosa se desnaturalizaron de aucerdo a un método de Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517) y se transfirieron de la matriz de gel a una membrana de nilón (Nytran N13 de la Cia. Schleicher und Schüll, Dassel, Suiza) mediante apoyo de vacío del aparato VacuGeneBlot de la Cia. Pharmacia LKB (Uppsala, Suecia), se inmovilizaron y la marcación de digoxigenina se comprobó mediante fosfatasa alcalina por medio de reacción NBT/X-fosfato. De ésta manera fué posible comprobar los siguientes fragmentos cromosomales que hibridizan con la sonda DNA pyc: un fragmento HindIII de 17 kb, un fragmento Salí de 6.5 kb y un fragmento EcoRI de 1.35 kb. El fragmento HindIII de 17 kb se aisló y subclonó. Para éste propósito se empleó un banco de genes cósmido de DNA cromosomal de C. glutamicum en el cósmido pHC79 que representaba el genoma de C. glutamicum en un 99% (Mol Microbiol 1992, 6: 317-326). La cepa E. coli DH5a se transformó con éste banco de genes mediante el método CaCl2 de Sa brook et al. (Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) y se colocó en placas de aproximadamente 300 colonias por placa placa de agar LB con 50 µg/1 de canamicina (5000 colonias en total) . A continuación los transformandos se transfirieron a filtros N13 Nytran, y éstos se incubaron durante 5 minutos sobre papel de Whatmann impregnado con 0.5 M de NaOH y 1.5 M de NaCl para la lísis alcalina de las células y la desnaturalización del DNA. La subsecuente neutralización se llevó a cabo con 1 M de Tris/HCl pH 7.5 y 1.5 M de NaCl. Después de la incubación de los filtros en 2 x SSC se fijó el DNA liberado se fijó sobre el filtro mediante radiación UV a 366 nm. Seguidamente se eliminaron los fragmentos celulares restantes mediante agitación a 50°C en 3 x SSC, 0.1% de SDS. Los filtros se emplearon en ésta forma para la hibridización con una sonda pyc específica, según se describe en Southern (J Mol Biol 1975, 98: 503-517). Se identificaron 3 transfor andos que hibridizaron contra la sonda pyc. A partir de éstos transformandos se aisló el DNA cósmido mediante preparación de plasmido según el método de lisis alcalina de Birnboim (Meth Enzymol 1983, 100: 243-255) y a continuación se ensayaron a través de análisis de restricción y Southern Biot con respecto a la existencia del fragmento HindIII. El cósmido pHC79-10 que contenía una inserción de 40 kb llevaba el fragmento HindIII de 17 kb completo y se siguió analizando. Resultó que también después de la restricción con las endonucleasas Salí y EcoRI se obtenian los mismos fragmentos hibridizantes como en el DNA cromosomal, es decir, un fragmento Salí de 6.5 kb y un fragmento EcoRI de 1.35 kb. El fragmento HindIII de 17 kb se aisló del cósmido mediante restricción con HindIII y se ligó al vector pUC18 de E. coli, el cual igualmente se corto con HindIII. Se preparó un análisis de restricción del fragmento en el vector pUCpyc resultante. El mapa físico del fragmento se representa en la figura 1. 2. Secuenciación del gen de la piruvato-carboxilasa En etapas adicionales de subclonación se aislaron del plásmido pUCpyc mediante restricción con las enzimas de restricción correspondientes un fragmento SalI-EcoRI de 0.85 kb, el fragmento EcoRI de 1.35 kb, un fragmento EcoRI-EcoRI-StuI de 1.6 kb, así como un fragmento Clal de 1.6 kb que se solapaba parcialmente con el fragmento SalI-EcoRI de 0.85 kb. Mediante ligamiento los fragmentos se clonaron en el vector pUCld en cada caso correspondientemente restringido, y seguidamente se secuenciaron como se describió en lo que precede según Sanger et al. (Proc Nati Acad Sci, USA 1977, 74: 5463-5467). Las secuencias de nucleotidos obtenidas se analizaron con el paquete de programa HÚSAR (versión 3.0) del Centro Alemán de Investigación del Cáncer (Heidelberg) . El análisis de la secuencia de los fragmentos dio por resultado una trama de lectura abierta ininterrumpida de 3576 bp que codifica para una secuencia de proteinas de 1140 aminoácidos. Una comparación de la secuencia de proteinas derivada con el banco de datos de genes EMBL (Heidelberg) arrojó similitudes con con todas las pyruvato-carboxilasas conocidas. La identidad más elevada (62%) se encontró con respecto a la pyruvato-carboxilasa putativa de Mycobacterium tuberculosis (Banco de genes EMBL: No. de acceso U00024) . Tomando en cuenta las sustituciones de aminoácido conservadas, la similitud fué del 76%. Una comparación con las piruvato-carboxilasas de otros organismos dio por resultado 46 a 47% de aminoácidos idénticos y 64 a 65% de aminoácidos similares (Gene 1997, 191: 47-50; J Bacteriol 1996, 178: 5960-5970; Proc Nati Acad Sci USA 1993, 90: 1766-1770; Biochem J 1996, 316: 631-637; Banco de genes EMBL: No. de acceso L36530; J Biol Chem 1988, 263: 11493-11497; Mol Gen Genet 1991, 229: 307-315). Por es 'tos resultados se dedujo que el fragmento clonado porta el gen para la pyruvato-carboxilasa de C. glutamicum. La secuencia de nucleótidos del gen se indica bajo SEQ ID No. 1 y la correspondiente secuencia de aminoácido bajo SEQ ID No. 2. 3. Sobreexpresión del gen de la pyruvato-carboxilasa Para la sobreexpresión del gen para la pyruvato-carboxilasa de C. glutamicum se clonó el gen del plásmido pUCpyc como fragmento Sspl-Scal de 6.2 kb en el vector pendulante pEKO de E. coli-C- glutamicum (Gene 1991, 102: 93-98) que fué cortado con las endonucleasas de restricción EcoRI y PstI. Mediante el tratamiento de polimerasa Klenow los extremos sobresalientes (libres) se llenaron para formar extremos lisos (cohesivos) (EcoRI) o bién se suprimieron (PstI), y el vector linearizado se ligó con el fragmento Sspl-Scal de 6.2 kb. El constructo pEKOpyc obtenidose transformó primero a la cepa E. coli DH5a, el DNA plásmido se aislo sobre el transformando obtenido se controló mediante restricción que la inserción fuera correcta. A continuación se introdujo el DNA a la cepa SP733 mediante electroporación (FEMS Microbiol Lett 1989, 65: 299-304) . En el caso de ésta cepa se trata de un mutante de la cepa c. glutamicum R127 de restricción negativa (Dechema Biotechnology Conference 1990, 4: 323-327, Editorial Chemie), que se obtuvo mediante mutagenesis química y que se distingue porque no puede crecer sobre un medio mínimo con pyruvato y lactato como única furnte de carbono (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). Este fenotipo es provocado por un defecto en la pyruvato-carboxilasa y se pudo complementar mediante la introducción del gen de la pyruvao-carboxilasa de C. glutamicum, es decir que contrariamente a la cepa de partida, la cepa que porta al plásmido pEKOpyc estuvo nuevamente en condiciones de crecer sobre medio mínimo con lactato como única fuente de carbono. Con ésto también se aportó la prueba de que el gen codifica para una pyruvato-carboxilasa funcional. Adicionalmente se transformó al plásmido pEKOpyc mediante electroporación al tipo salvaje ATCC 13032 de C. glutamicum. La cepa WT (pEKOpyc) resultante se investigó con respecto a si actividad pyruvato-carboxilasa en comparación con el tipo salvaje ATCC 13032. Las cepas se cultivaron en medio complejo (Luria-Bertani, Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) con 0.5% de lactato y en medio mínimo con 2% de lactato o bién 4% de glucosa, y el ensayo de la pyruvato-carboxilasa se llevó a cabo de acuerdo al método según se describe en Peters-Wendisch et al. (Microbiology 1997, 143: 1095-1103). El resultado del análisis (Tabla 1) muestra que la actividad pyruvato-carboxilasa en la cepa portadora de pEKOpyc fué aproximadamente 4 veces mas alta que en la cepa de partida. 4. Incremento de la acumulación de lisina mediante la sobreexpresión del gen de la pyruvato-carboxilasa en la cepa C. glutamicum DG52-5 Para investigar el efecto de la sobreexpresión del gen para la pyruvato-carboxilasa en la cepa DG52-5 de producción de lisina (J Gen Microbiol 1988, 134: 3221-3229) se empleo el vector de expresión pVWEXl que permite una expresión inducida de IPTG. Dentro de éste vector se clono el gen pyc sin promotor. Para éste propósito primero se sintetizaron cebadores de PCR (cebador 1 = posición 112-133; cebador 2 = posición 373-355 en la secuencia de nucleótidos de acuerdo a SEQ ID No. 1) y se emplificaron mediante PCR 261 bp de la región inicial sin promotor del gen de la pyruvato-carboxilasa. Los cebadores se seleccionaron de manera que el cebador 1 proporciona un punto de corte PstI y el cebador 2 un punto de corte BamHI. Después de la PCR se aisló el producto de 274 bp de la PCR, se ligó a concatémeros y a continuación se cortó con las enzimas de restricción PstI y BamHI. La preparación de la restricción se concentró mediante precipitación por etanol y a continuación se ligó con el vector pVWEXl cortado con el PstI-BamHI. El constructo pVWEXl-PCR obtenido se probó medíate restricción. La región final del gen pyc se aisló mediante tratamiento Rcal-Klenow-Sall del vector pEKOpyc y se ligó al vector pVWEXl-PCR tratado de BamHI-Klenow-SalI. El constructo pVWEXlpyc obtenido se analizó mediante mapeo de restricción. En la figura 2 se muestra un mapa físico del plásmido. El plásmido se introduce a la cepa DG52-5 de C. glutamicum mediante electroporación. Como control se transformó la cepa DG52-5 con el vector pVWEXl sin inserción y se comparó la secreción de L-lisina de en cada caso tres transformandos diferentes. Para éste propósito se cultivaron DG52-5 (pVWEXl) 1, 2 y 3 así como DG52-5 (pVWEXlpyc) 3, 4 y 6 en medio complejo (2 x TY; Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press; con 50 µg/1 de canamicina) , y se vacunó el medio de la fermentación CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) en cada caso separado de los cultivos previos El medio contenía adicionalmente canamicina para mantener estables a los plásmidos. Se llevaron a cabo en cada caso dos preparaciones paralelas, siendo que a un matraz se le adicionaron 200 µg de IPTG/ml en tanto que el segundo matraz no contenía IPTG. Después de cultivar durante 48 horas a 30°C sobre el agitador rotatorio a 120 rpm se determinó la cantidad de lisina acumulada en el medio. La determinación de la concentración de aminoácido se llevó a cabo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (J Chromat 1983, 266: 471-482). El resultado de la fermentación esta representado en la tabla 2, siendo que los valores indicados representan en cada caso valores promedio de tres experimentos con clones diferentes. Se demostró que una sobreexpresión del gen de la pyruvato-carboxilasa conduce a una acumulación de la lisina en el medio incrementada por 50%. Por consiguiente el uso del gen descubierto y descrito para la enzima anaplerótica de pyruvato-carboxilasa representa un método para mejorar en forma decisiva la formación de la L-lisina. 5. Acumulación incrementada de treonina y homoserina mediante la sobreexpresión del gen de la pyruvato- carboxilasa en la cepa DM368-3 de C. glutamicum En forma análoga a los experimentos para la formación de la L-lisina se investigó también la acumulación de tronina en el sobrenadante del cultivo debido a la sobreexpresión del gen para la pyruvato-carboxilasa. Para éste propósito, tal como se describió bajo el punto 4, la cepa DM368-3 de C. glutamicum (Degussa AG) productora de la treonina se transformó con el plásmido pVWEXlpyc así como con el plásmido pVWEXl para control, y se investigó la secreción de treonina de en cada caso tres transformandos diferentes. Para éste propósito se cultivaron DM368-3 (pVWEXl) 1, 2 y 3 así como DM368-3 (pVWEXlpyc) 1, 2 y 3 en medio complejo (2 x TY; 50 µg/1 de canamicina) , y se vacunó el medio de la fermentación CGXII (J Bacteriol 1993, 175: 5595-5603) en cada caso separado de los cultivos previos. El medio contenía adicionalmente canamicina para mantener estables a los plásmidos. Se llevaron a cabo dos preparaciones paralelas, siendo que a un matraz se le adicionaron 200 µg de IPTG/ml en tanto que el segundo matraz no contenía IPTG. Después de sultivar durante 48 horas a 30°C sobre el agitador rotatorio a 120 rpm se determinó la cantidad de treonina acumulada en el medio. La determinación de la concentración de aminoácido se llevó a cabo asimismo mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (J Chromat 1983, 266: 471-482). El resultado de la fermentación esta representado en la tabla 3, siendo que los valores indicados representan en cada caso valores promedio de en cada caso tres experimentos con clones diferentes. Se demostró que la sobreexpresión del gen de la pyruvato-carboxilasa conduce a un incremento de la consentrasión de la treonina en el medio de aproximadamente 40%. Por sonsiguiente el uso del gen dessubierto y dessrito para la enzima anaplerótisa de pyruvato-sarboxilasa representa un método para mejorar en forma desisiva la formasión de la L-treonina. Adisionalmente, la determinasión de la sonsentrasión de aminoásido demostró que la sepa son el gen de la pyruvato-sarboxilasa sobreexpresado además sesretó al medio alrededor de 150% más de homoserina que la sepa sin gen sobreexpresado. Los resultados sorrespondientes están asimismo representados en la figura 3. Ponen en slaro que mediante el método de conformidad con la invención se puede mejorar en forma decisiva tanto la formación de la treonina como también la de la homoserina. 6. Asumulasión insrementada de glutamato mediante la sobreexpresión del gen de la pyruvato-sarboxilasa en el tipo salvaje de C. glutamisum En forma análoga a los experimentos para la formasión de la L-lisina, la L-treonina y la L-homoserina (ver lo presedente bajo 4. y 5.) se investigó también la asumulasión de glutamato en el sobrenadante del sultivo debido a la sobreexpresión del gen para la pyruvato-sarboxilasa. Para éste propósito, tal somo se dessribió bajo el punto 4, el tipo salvaje ATCC 13032 de C. glutamisum se transformó son el plásmido pVWEXlpys así somo son el plásmido pVWEXl para sontrol, y se investigó la sesresión de glutamato de en sada saso dos transformandos diferentes. Para éste propósito se sultivaron C. glutamisum ATCC 13032 (pVWEXlpys)Dl y D2 así somo C. glutamisum ATCC 13032 (pVWEXlpys)l y 2 en medio somplejo (2 x TY; 50 µg/1 de sanamisina) , y se vasunó el medio de la fermentasión CGXII (J Basteriol 1993, 175: 5595-5603) en sada saso separado de los sultivos previos. El medio sontenía adisionalmente canamicina para mantener estables a los plásmidos. Para inducir la secreción del glutamato se le adicionaron al medio 25 mg de Tween 60 por ml aproximadamente 6 horas después de la inoculación. Se llevaron a cabo dos preparaciones paralelas, siendo que a un matraz se le adicionaron 200 µg de IPTG/ml en tanto que el segundo matraz no contenía IPTG. Después de cultivar durante 48 horas a 30°C sobre el agitador rotatorio a 120 rpm se determinó la cantidad de glutamato acumulada en el medio. La determinación de la consentración de aminoácido se llevó a sabo asimismo mediante sromatografía líquida de alto rendimiento (J Chromat 1983, 266: 471-482) . El resultado de la fermentasión esta representado en la tabla 4, siendo que los valores indisados representan en sada caso valores promedio de en cada caso dos experimentos con clones diferentes. Se demostró que la sobreexpresión del gen de la pyruvato-carboxilasa conduse a un insremento de la sonsentrasión del glutamato en el medio de aproximadamente 500%. Por sonsiguiente el uso del gen dessubierto y dessrito para la enzima anaplerótisa de pyruvato-sarboxilasa representa un método para mejorar en forma desisiva la formasión de glutamato.

Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 PERFIL DE SECUENCIA (1) DATOS GENERALES (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: Forschungszentrum Juelish GmbH (B) CALLE: Apartado Postal 1913 (C) LUGAR: Juelich (E) PAÍS: Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 52425 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Pyruvato-carboxilasa (iii) CANTIDAD DE SECUENCIAS: 2 (iv) VERSIÓN LEGIBLE EN COMPUTADORA (A) SOPORTE DE DATOS: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOPORTE LÓGICO: Patent In Reléase # 1.0, Versión # 1.30 (EPA) (2) INDICACIONES RESPECTO A SEQ ID NO:l: (i) CARACERISTICAS DISTINTIVAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 3728 pares de bases (B) TIPO: Nucleótido (C) FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE LA MOLÉCULA: Genoma DNA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: CGCAACCGTG CTTGAAGTCG TGCAGGTCAG GGGAGTGTTG CCCGAAAACA TTGAGAGGAA 60 AACAAAAACC GATGTTTGAT TGGGGGAATC GGGGGTTACG ATACTAGGAC GCAGTGACTG 120 CTATCACCCT TGGCGGTCTC TTGTTGAAAG GAATAATTAC TCTAGTGTCG ACTCACACAT 180 CTTCAACGCT TCCAGCATTC AAAAAGATCT TGGTAGCAAA CCGCGGCGAA ATCGCGGTCC 240 GTGCTTTCCG TGCAGCACTC GAAACCGGTG CAGCCACGGT AGCTATTTAC CCCCGTGAAG 300 ATCGGGGATC ATTCCACCGC TCTTTTGCTT CTGAAGCTGT CCGCATTGGT ACCGAAGGCT 360 CACCAGTCAA GGCGTACCTG GACATCGATG AAATTATCGG TGCAGCTAAA AAAGTTAAAG 420 CAGATGCCAT TTACCCGGGA TACGGCTTCC TGTCTGAAAA TGCCCAGCTT GCCCGCGAGT 480 GTGCGGAAAA CGGCATTACT TTTATTGGCC CAACCCCAGA GGTTCTTGAT CTCACCGGTG 540 ATAAGTCTCG CGCGGTAACC GCCGCGAAGA AGGCTGGTCT GCCAGTTTTG GCGGAATCCA 600 CCCCGAGCAA AAACATCGAT GAGATCGTTA AAAGCGCTGA AGGCCAGACT TACCCCATCT 660 TTGTGAAGGC AGTTGCCGGT GGTGGCGGAC GCGGTATGCG TTTTGTTGCT TCACCTGATG 720 AGCTTCGCAA ATTAGCAACA GAAGCATCTC GTGAAGCTGA AGCGGCTTTC GGCGATGGCG 780 CGGTATATGT CGAACGTGCT GTGATTAACC CTCAGCATAT TGAAGTGCAG ATCCTTGGCG 840 ATCACACTGG AGAAGTTGTA CACCTTTATG AACGTGACTG CTCACTGCAG CGTCGTCACC 900 AZ-AAAGTTGT CGAAATTGCG CCAGCACAGC ATTTGGATCC AGAACTGCGT GATCGCATTT 960 GTGCGGATGC AGTAAAGTTC TGCCGCTCCA TTGGTTACCA GGGCGCGGGA ACCGTGGAAT 1020 TCTTGGTCGA TGAAAAGGGC AACCACGTCT TCATCGAAAT GAACCCACGT ATCCAGGTTG 1080 AGCACACCGT GACTGAAGAA GTCACCGAGG TGGACCTGGT GAAGGCGCAG ATGCGCTTGG 1140 CTGCTGGTGC AACCTTGAAG GAATTGGGTC TGACCCAAGA TAAGATCAAG ACCC CGGTG 1200 CAGCACTGCA GTGCCGCATC ACCACGGAAG ATCCAAACAA CGGCTTCCGC CCAGATACCG 1260 GAACTATCAC CGCGTACCGC TCACCAGGCG GAGCTGGCGT TCGTCTTGAC GGTGCAGCTC 1320 AGCTCGGTGG CGAAATCACC GCACACTTTG ACTCCATGCT GGTGAAAATG ACCTGCCGTG 1380 GTTCCGACTT TGAAACTGCT GTTGCTCGTG CACAGCGCGC GTTGGCTGAG TTCACCGTGT 1440 CTGGTGTTGC AACCAACATT GGTTTCTTGC GTGCGTTGCT GCGGGAAGAG GACTTCACTT 1500 CCAAGCGCAT CGCCACCGGA TTCATTGCCG ATCACCCGCA CCTCCLTCAG GCTCCACCTG 1560 CTCKTGATGA GCAGGGACGC ATCCTGGATT ACTTGGCAGA TGTCACCGTG AACAAGCCTC 1620 ATGGTGTGCG TCCAAAGGAT GTTGCAGCTC CTATCGATAA GCTGCCTAAC ATCAAGGATC 1680 TGCCACTGCC ACGCGGTTCC CGTGACCGCC TGAAGCAGCT TGGCCCAGCC GCGTTTGCTC 1740 GTGATCTCCG TGAGCAGGAC GCACTGGCAG TTACTGATAC CACCTTCCGC GATGCACACC 1800 AGTCTTTGCT TGCGACCCGA GTCCGCTCAT TCGCACTGAA GCCTGCGGCA GAGGCCGTCG 1860 CAAAGCTGAC TCCTGAGRTT TTGTCCGTGG AGGCCTGGGG CGGCGCGACC TACGATGTGG 1920 CGATGCGTTT CCTCTTTGAG GATCCGTGGG ACAGGCTCGA CGAGCTGCGC GAGGCGATGC 1980 CGAATGTAAA CATTCAGATG CTGCTTCGCG GCCGCAACAC CGTGGGATAC ACCCCGTACC 2040 CAGACTCCGT CTGCCGCGCG TTTGTTAAGG AAGCTGCCAG CTCCGGCGTG GACATCTTCC 2100 GCATCTTCGA CGCGCTTAAC GACGTCTCCC AGATGCGTCC AGCAATCGAC GCAGTCCTGG 2160 AGACCAACAC CGCGGTAGCC GAGGTGGCTA TGGCTTATTC TGGTGATCTC TCTGATCCAA 2220 ATGAAAAGCT CTACACCCTG GATTACTACC TAAAGATGGC AGAGGAGATC GTCAAGTCTG 2280 GCGCTCACAT CTTGGCCATT AAGGATATGG CTGGTCTGCT TCGCCCAGCT GCGGTAACCA 2340 AGCTGGTCAC CGCACTGCGC CGTGAATTCG ATCTGCCAGT GCACGTGCAC ACCCACGACA 2400 CTGCGGGTGG CCAGCTGGCA ACCTACTTTG CTGCAGCTCA AGCTGGTGCA GATGCTGTTG 2460 ACGGTGCTTC CGCACCACTG TCTGGCACCA CCTCCCAGCC ATCCCTGTCT GCCATTGTTG 2520 CTGCATTCGC GCACACCCGT CGCGATACCG GTTTGAGCCT CGAGGCTGTT TCTGACCTCG 2580 AGCCGTACTG GGAAGCAGTG CGCGGACTGT ACCTGCCATT TGAGTCTGGA ACCCCAGGCC 2640 CAACCGGTCG CGTCTACCGC CACGAAATCC CAGGCGGACA GTTGTCCAAC CTGCGTGCAC 2700 AGGCCACCGC ACTGGGCCTT GCGGATCGTT TCGAACTCAT CGAAGACAAC TACGCAGCCG 2760 TTAATGAGAT GCTGGGACGC CCAACCAAGG TCACCCCATC CTCCAAGGTT GTTGGCGACC 2820 TCGCACTCCA CCTCGTTGGT GCGGGTGTGG ATCCAGCAGA CTTTGCTGCC GATCCACAAA 2880 AGTACGACAT CCCAGACTCT GTCATCGCGT TCCTGCGCGG CGAGCTTGGT AACCCTCCAG 2940 GTGGCTGGCC AGAGCCACTG CGCACCCGCG CACTGGAAGG CCGCTCCGAA GGCAAGGCAC 3000 CTCTGACGGA AGTTCCTGAG GAAGAGCAGG CGCACCTCGA CGCTGATGAT TCCAAGGAAC 3060 GTCGCAATAG CCTCAACCGC CTGCTGTTCC CGAAGCCAAC CGAAGAGTTC CTCGAGCACC 3120 GTCGCCGCTT CGGCAACACC TCTGCGCTGG ATGATCGTGA ATTCTTCTAC GGCCTGGTCG 3180 AAGGCCGCGA GACTTTGATC CGCCTGCCAG ATGTGCGCAC CCCACTGCTT GTTCGCCTGG 3240 ATGCGATCTC TGAGCCAGAC GATAAGGGTA TGCGCAATGT TGTGGCCAAC GTCAACGGCC 3300 AGATCCGCCC AATGCGTGTG CGTGACCGCT CCGTTGAGTC TGTCACCGCA ACCGCAGAAA 3360 AGGCAGATTC CTCCAACAAG GGCCATGTTG CTGCACCATT CGCTGGTGTT GTCACCGTGA 3420 CTGTTGCTGA AGGTGATGAG GTCAAGGCTG GAGATGCAGT CGCAATCATC GAGGCTATGA 3480 AGATGGAAGC AACAATCACT GCTTCTGTTG ACGGCAAAAT CGATCGCGTT GTGGTTCCTG 3540 CTGCAACGAA GGTGGAAGGT GGCGACTTGA TCGTCGTCGT TTCCTAAACC TTTCTGTAAA 3600 AAGCCCCGCG TCTTCCTCAT GGAGGAGGCG GGGCTTTTTG GGCCAAGATG GGAGATGGGT 3660 GAGTTGGATT TGGTCTGATT CGACACTTTT AAGGGCAGAG ATTTGAAGAT GGAGACCAAG 3720 GCTCAAAG 3728 (2) INDICACIONES RESPECTO A SEQ ID NO: 2: (i) CARACERISTICAS DISTINTIVAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 1140 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) FORMA DE LA CADENA: Cadena sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal ( ii ) TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteina (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : Met Ser Thr His Thr Ser Ser Thr Leu Pro Ala Phe Lys Lys lie Leu 1 5 10 15 Val Ala Asn Arg Gly Glu lie Ala Val Arg Ala Phe Arg Ala Ala Leu Glu Thr Gly Ala Ala Thr Val Ala lie Tyr Pro Arg Glu Asp Arg Gly 40 45 Ser Phe His Arg Ser Phe Ala Ser Glu Ala Val Arg lie Gly Thr Glu 50 55 60 Gly Ser Pro Val Lys Ala Tyr Leu Asp lie Asp Glu lie lie Gly Ala 65 70 75 80 Ala Lys Lys Val Lys Ala Asp Ala lie Tyr Pro Gly Tyr Gly Phe Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Ala Gln Leu Ala Arg Glu Cys Ala Glu Asn Gly lie Thr 100 105 110 Phe lie Gly Pro Thr Pro Glu Val Leu Asp Leu Thr Gly Asp Lys Ser 115 120 125 Arg Ala Val Thr Ala Ala Lys Lys Ala Gly Leu Pro Val Leu Ala Glu 130 135 140 Ser Thr Pro Ser Lys Asn lie Asp Glu lie Val Lys Ser Ala Glu Gly 145 150 155 160 Gln Thr Tyr Pro lie Phe Val Lys Ala Val Ala Gly Gly Gly Gly Arg 165 170 175 Gly Met Arg Phe Val Ala Ser Pro Asp Glu Leu Arg Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Glu Ala Ser Arg Glu Ala Glu Ala Ala Phe Gly Asp Gly Ala Val Tyr 195 200 205 Val Glu Arg Ala Val lie Asn Pro Gln Mis He Glu Val Gln He Leu 210 215 220 Gly Asp Mis Thr Gly Glu Val Val Mis Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser 225 230 235 240 Leu Gln Arg Arg His Gln Lys Val Val Glu He Ala Pro Ala Gln Mis 245 250 255 Leu Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg He Cys Ala Asp Ala Val Lys Phe 260 265 270 Cys Arg Ser He Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Gly Asn Mis Val Phe He Glu Met Asn Pro Axg He Gln 290 295 300 Val Glu Mis Thr Val Thr Glu Glu Val Thr Glu Val Asp Leu Val Lys 305 310 315 320 Ala Gln Met Arg Leu Ala Ala Gly Ala Thr Leu Lys Glu Leu Gly Leu 325 330 335 Thr Gln Asp Lys He Lys Thr His Gly Ala Ala Leu Gln Cys Arg He 340 345 350 Thr Thr Glu Asp Pro Asn Asn Gly Phe Arg Pro Asp Thr Gly Thr He 355 360 365 Thr Ala Tyr Arg Ser Pro Gly Gly Ala Gly Val Arg Leu Asp Gly Ala 370 375 380 Ala Gln Leu Gly Gly Glu He Thr Ala His Phe Asp Ser Met Leu Val 385 390 395 400 Lys Met Thr Cys Arg Gly Ser Asp Phe Glu Thr Ala Val Ala Arg Ala 405 410 415 Gln Arg Ala Leu Ala Glu Phe Thr Val Ser Gly Val Ala Thr Asn He 420 425 430 Gly Phe Leu Arg Ala Leu Leu Arg Glu Glu Asp Phe Thr Ser Lys Arg 435 440 445 He Ala Thr Gly Phe He Ala Asp His Pro His Leu Leu Gln Ala Prb 450 455 460 Pro Ala Asp Asp Glu Gln Gly Arg He Leu Asp Tyr Leu Ala Asp Val 465 470 475 480 Thr Val Asn Lys Pro His Gly Val Arg Pro Lys Asp Val Ala Ala Pro 485 490 495 He Asp Lys Leu Pro Asn He Lys Asp Leu Pro Leu Pro Arg Gly Ser 500 505 510 Arg Asp Arg Leu Lys Gln Leu Gly Pro Ala Ala Phe Ala Arg Asp Leu 515 520 525 Arg Glu Gln Asp Ala Leu Ala Val Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala 530 535 540 His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg Val Arg Ser Phe Ala Leu Lys Pro 545 550 555 560 Ala Ala Glu Ala Val Ala Lys Lys Thr Pro Glu Leu Leu Ser Val Glu 565 570 575 Ala Trp Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Val Ala Met Arg Phe Leu Phe Glu 580 585 590 Asp Pro Trp Asp Arg Leu Asp Glu Leu Arg Glu Ala Met Pro Asn Val 595 600 605 Asn He Gln Met Leu Leu Arg Gly Arg Asn Thr Val Gly Tyr Thr Pro . 610 615 620 Tyr Pro Asp Ser Val Cys Arg Ala Phe Val Lys Glu Ala Ala Ser Ser 625 630 635 640 Gly Val Asp He Phe Arg He Phe Asp Ala Leu Asn Asp Val Ser Gln 645 650 655 Met Arg Pro Ala He Asp Ala Val Leu Glu Thr Asn Thr Ala Val Ala 660 665 670 Glu Val Ala Met Ala Tyr Ser Gly Asp Leu Ser Asp Pro Asn Glu Lys 675 680 685 Leu Tyr Thr Leu Asp Tyr Tyr Leu Lys Met Ala Glu Glu He Val Lys 690 695 700 Ser Gly Ala His He Leu Ala He Lys Asp Met Ala Gly Leu Leu Arg 705 710 715 720 Pro Ala Ala Val Thr Lys Leu Val Thr Ala Leu Arg Arg Glu Phe Asp 725 730 735 Leu Pro Val His Val His Thr His Asp Thr Ala Gly Gly Gln Leu Ala 740 745 750 Thr Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Ala Val Asp Gly Ala 755 760 765 Ser Ala Pro Leu Ser Gly Thr Thr Ser Gln Pro Ser Leu Ser Ala He 770 775 780 Val Ala Ala Phe Ala His Thr Arg Arg Asp Thr Gly Leu Ser Leu Glu 785 790 795 ' 800 Ala Val Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Trp Glu Ala Val Arg Gly Leu Tyr 805 810 815 Leu Pro Phe Glu Ser Gly Thr Pro Gly Pro Thr Gly Arg Val Tyr Arg 820 825 830 His Glu He Pro Gly Gly Gln Leu Ser Asn Leu Arg Ala Gln Ala Thr 835 840 845 Ala Leu Gly Leu Ala Asp Arg Phe Glu Leu He Glu Asp Asn Tyr Ala 850 855 860 Ala Val Asn Glu Met Leu Gly Arg Pro Thr Lys Val Thr Pro Ser Ser 865 870 875 880 Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Leu His Leu Val Gly Ala Gly Val Asp 885 890 895 Pro Ala Asp Phe Ala Ala Asp Pro Gln Lys Tyr Asp He Pro Asp Ser 900 905 910 Val He Ala Phe Leu Arg Gly Glu Leu Gly Asn Pro Pro Gly Gly Trp 915 920 925 Pro Glu Pro Leu Arg Thr Arg Ala Leu Glu Gly Arg Ser Glu Gly Lys 930 935 940 Ala Pro Leu Thr Glu Val Pro Glu Glu Glu Gln Ala His Leu Asp Ala 945 950 955 960 Asp Asp Ser Lys Glu Arg Arg Asn Ser Leu Asn Arg Leu Leu Phe Pro 965 970 975 Lys Pro Thr Glu Glu Phe Leu Glu His Arg Arg Arg Phe Gly Asn Thr 980 985 990 Ser Ala Leu Asp Asp Arg Glu Phe Phe Tyr Gly Leu Val Glu Gly Arg 995 1000 1005 Glu Thr Leu He Arg Leu Pro Asp Val Arg Thr Pro Leu Leu Val Arg 1010 1015 1020 Leu Asp Ala He Ser Glu Pro Asp Asp Lys Gly Met Arg Asn Val Val 1025 1030 1035 1040 Ala Asn Val Asn Gly Gln He Arg Pro Met Arg Val Arg Asp Arg Ser 1045 1050 1055 Val Glu Ser Val Thr Ala Thr Ala Glu Lys Ala Asp Ser Ser Asn Lys 1060 1065 1070 Gly His Val Ala Ala Pro Phe Ala Gly Val Val Thr Val Thr Val Ala 1075 1080 1085 Glu Gly Asp Glu Val Lys Ala Gly Asp Ala Val Ala He He Glu Ala 1090 1095 1100 Met Lys Met Glu Ala Thr He Thr Ala Ser Val Asp Gly Lys He Asp 1105 1110 1115 1120 Arg Val Val Val Pro Ala Ala Thr Lys Val Glu Gly Gly Asp Leu He 1125 1130 1135 Val Val Val Ser 1140

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES Proceso para la obtención microbiana de aminoácidos de la familia del aspartato y/o glutamato en el cual se incrementa la actividad de pyruvato-carboxilasa cambiando genéticamente la enzima y/o la expresión del gen de pyruvato-carboxilasa de un mecanismo que produce el aminoácido correspondiente.
2. Proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque mediante la mutación del gen endógeno de pyruvato-carboxilasa se produce una enzima con una actividad pyruvato-carboxilasa más elevada.
3. Proceso según la reivindicasión 1 o 2, caracterizado porque la expresión génica de pyruvato-carboxilasa se incrementa mediante el aumento de la cantidad de copias del gen.
4. Proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque para aumentar la cantidad de copias del gen, el gen de pyruvato-carboxilasa se incorpora en un construsto géniso.
5. Proseso según la reivindicación 4, carasterizado porque el gen se incorpora en un constructo génico que contiene secuensias génisas reguladoras asosiadas al gen de pyruvato-sarboxilasa.
6. Proseso según la reivindisasión 4 o 5, sarasterizado porque se transforma un misroorganismo que produce el aminoácido corespondiente con el constructo génico que contiene el gen.
7. Proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque se transforma un microorganismo de la especie Corynebacterium con el constructo génico que contiene el gen.
8. Proceso según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque para la transformación se emplea un microorganismo en el cual las enzimas que participan en la síntesis del aminoácido correspondiente están desreguladas y/o tienen una mayor actividad de soporte exportador para el aminoácido correspondiente.
9. Proceso según una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque para la transformación se emplea un microorganismo que contiene una proporción más elevada de los metabolitos del metabolismo central que participan en la síntesis del aminoácido correspondiente .
10. 10, Proceso según una de las reivindicasiones 6 a 9, sarasterizado porque para la transformasión se emplea un misroorganismo en el sual se desarrolla son menor astividad un modo de biosíntesis sonsurrente al modo de la biosíntesis del aminoásido sorrespondiente.
11. 11. Proseso según una de las reivindicaciones precedentes, carasterizado porque el gen de pyruvato- sarboxilasa se aisla de una sepa de misroorganismo de la espesie Corynebasterium.
12. 12. Proseso según una de las reivindisasiones precedentes, carasterizado porque la expresión del gen se insrementa mediante el reforzamiento de las señales de transsrípsión.
13. 13. Proceso según una de las reivindicasiones presedentes, sarasterizado porque al gen de pyruvato- sarboxilasa se le antepone el promotor tas.
14. 14. Proseso según la reivindisación 13, carasterizado por sesuencias reguladoras asociadas al promotor tac.
15. 15. Proceso según una de las reivindicaciones precedentes, carasterizado porque somo gen de pyruvato-sarboxilasa se emplea un gen son la sesuensia de nucleótidos que codifica para la secuencia aminoácida indicada bajo SEQ ID No. 2 y sus variaciones de alelos.
16. 16. Proceso según la reivindicación 15, carasterizado porque como gen de pyruvato-carboxilasa se emplea un gen con la secuencia de nucleótidos del nucleótido 165 al 3587 según SEQ ID No. 1, o con una secuensia de DNA que sustancialmente tiene la misma actividad.
17. Proseso según una de las reivindisasiones presedentes para la elaborasión de lisina, treonina, homoserina, glutamato y/o arginina.
18. Gen de pyruvato-sarboxilasa son una sesuensia de nusleótidos que sodifica para la secuensia aminoásida indisada bajo SEQ ID No. 2 y sus variasiones de alelos.
19. Gen de pyruvato-sarboxilasa según la reivindicación 18, con la secuencia de nucleótidos del nucleótido 165 al 3587 según SEQ ID No. 1, o con una secuensia de DNA que sustansialmente tiene la misma astividad.
20. Gen de pyruvato-sarboxilasa según la reivindisasión 18 o 19, que tiene antepuesto un promotor de la sesuensia nusleótida del nucleótido 20 al 109 según SEQ ID No. l o una sesuensia de DNA de actividad sustancialmente igual.
21. Gen de pyruvato-carboxilasa según la reivindicasión 18 o 19, que tiene antepuesto un promotor tac.
22. Gen de pyruvato-carboxilasa según la reivindicación 21 con secuencias reguladoras asociadas al promotor.
23. 23. Gen de pyruvato-carboxilasa según una de las reivindicasiones 18 a 20 con secuensias génisas asosiadas a él.
24. 24. Estructura génica que contiene un gen de pyruvato-carboxilasa según una de las reivindicasiones 18 a 23.
25. 25. Vector que contiene un gen de pyruvato- carboxilasa según una de las reivindicaciones 18 a 23 o una estructura génica según la reivindicación 24.
26. 26. Célula transformada que contiene en forma replicable un gen de pyruvato-carboxilasa según una de las reivindicasiones 18 a 23 o una estrustura génisa según la reivindicación 24.
27. 27. Célula transformada según la reivindicación 26, que contiene un vestor según la reivindisasión 25.
28. 28. Célula transformada según la reivindisasión 26 o 27, caracterizada porque pertenece a la especie de Corynebacterium.
29. 29. Célula transformada según una de las reivindicasiones 26 a 28, saracterizada porque en ella se encuentran desreguladas las enzimas que participan en la síntesis del aminoácido correspondiente y/o las enzimas que partisipan en la exportasión del aminoásido sorrespondiente.
30. 30. Célula transformada según una de las reivindisasiones 26 a 29, caracterizada porque contiene una proporción más elevada de los metabolitos del metabolismo central que participan en la síntesis del aminoácido correspondiente.
31. 31. Célula transformada según una de las reivindicaciones 26 a 30, caracterizada porque contiene una proporción más reducida de los metabolitos del metabolismo central que no participan en la síntesis del aminoácido correspondiente.
32. 32. Uso del gen de pyruvato-carboxilasa para incrementar la producción de los aminoácidos de microorganismos que provienen de la familia del aspartato y/o del glutamato.
33. 33. Uso según la reivindicasión 32, caracterizado porque se emplea un gen de pyruvato-carboxilasa mutado que codifica para una enzima con mayor actividad pyruvato-carboxilasa.
34. 34. Uso según la reivindicasión 32 o 33, sarasterizado porque se transforma un misroorganismo que produce el aminoácido corespondiente con un construsto géniso que sontiene un gen de pyruvato- sarboxilasa. Uso según la reivindicasión 34, carasterizado porque el sonstructo génico contiene adicionalmente secuensias reguladoras. Uso según una de las reivindisasiones 32 a 35, caracterizado porque se emplea un gen de pyruvato-carboxilasa de Corynebacterium. Uso según una de las reivindicaciones 32 a 36, caracterizado porque se emplea Corynebacterium como microorganismo productor de aminoácido.