CN111411093B

CN111411093B - 活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用

Info

Publication number: CN111411093B
Application number: CN202010186134.2A
Authority: CN
Inventors: 孙际宾; 李庆刚; 郑平; 周文娟; 张晓立; 德莱奥西班乔·泰沃; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2039-04-30
Also published as: CN110218710B; CN111411093A; CN111334486B; CN111334486A; WO2020220432A1; CN110218710A

Abstract

本发明公开了活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用。本发明提供的突变体蛋白：将磷酸转酮酶进行如下突变得到的蛋白质：对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y，第2位氨基酸残基由T突变为A；对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y，第6位氨基酸残基由I突变为T；对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y，第2位氨基酸残基由T突变为A，第6位氨基酸残基由I突变为T。本发明还保护突变体蛋白在制备代谢物中的应用。与现有磷酸转酮酶相比，本发明提供的突变体蛋白的磷酸转酮酶酶活显著增加，进而显著提高目标代谢物的产量。

Description

活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用

本申请为申请号为“201910359888.0”、申请日为2019年04月30日，发明名称为“活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及活性提高的磷酸转酮酶，以及该磷酸转酮酶在生产代谢物中的应用，涉及的代谢物包括但不限于氨基酸(特别是源自乙酰辅酶A的氨基酸)、琥珀酸、柠檬酸等。

背景技术

氨基酸、有机酸，是人类和动物营养中最重要的成分，在医药、健康、食品、化工、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。当前，氨基酸、有机酸主要采用微生物发酵法来生产，已知的可生产氨基酸的微生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，棒杆菌属(Corynebavterium)、短杆菌属(Brevibacterium)等。近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因工程手段对菌株进行遗传改造，已经获得了大量的高效的氨基酸、有机酸生产工程菌株。

磷酸转酮酶(phosphoketolase，F/XPK)，包括6-磷酸果糖转酮酶(FPK)和5-磷酸木酮糖转酮酶(XPK)。6-磷酸果糖转酮酶催化的反应为：果糖-6-磷酸(F6p)+Pi→乙酰磷酸(AcP)+赤藓糖-4-磷酸(E4P)。5-磷酸木酮糖转酮酶催化的反应为：木酮糖-5-磷酸(X5p)+pi→乙酰磷酸(AcP)+甘油醛-3-磷酸(G3P)。磷酸转酮酶催化的反应能够减少葡萄糖的氧化，但是通常使用的多种基因工程出发菌株(包括大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等)，都不存在F/XPK，在这些菌株中引入F/XPK，能够增加源自乙酰辅酶A的代谢物的理论转化率。天然的F/XPK酶活性较低，需要大量过表达才能体现出效果，限制了其应用潜力。因此，本领域急需开发酶活性高的磷酸转酮酶。

发明内容

本发明的目的是提供活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用。

本发明提供的蛋白质，为突变体蛋白，为将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变得到的蛋白质：

(a1)对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；

(a2)对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；

(a3)对应于序列3的第14位氨基酸残基由N突变为D；

(a4)对应于序列3的第20位氨基酸残基由E突变为D；

(a5)对应于序列3的第120位氨基酸残基由T突变为A；

(a6)对应于序列3的第231位氨基酸残基由E突变为K；

(a7)对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；

(a8)对应于序列3的第342位氨基酸残基由E突变为K；

(a9)对应于序列3的第397位氨基酸残基由K突变为R；

(a10)对应于序列3的第676位氨基酸残基由D突变为G；

(a11)对应于序列3的第785位氨基酸残基由F突变为L；

(a12)对应于序列3的第801位氨基酸残基由W突变为R。

所述多种突变具体可为以上突变中的任意两种、以上突变中的任意三种、以上突变中的任意四种、以上突变中的任意五种突变、以上突变中的任意六种、以上突变中的任意七种、以上突变中的任意八种、以上突变中的任意九种、以上突变中的任意十种、以上突变中的任意十一种或者以上突变的所有。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行(a1)和(a2)两种突变得到的蛋白质。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行特定突变和非特定突变得到的蛋白质。所述特定突变为(a1)和(a2)两种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行(a1)和(a2)和(a7)三种突变得到的蛋白质。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶进行特定突变和非特定突变得到的蛋白质。所述特定突变为(a1)和(a2)和(a7)三种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。

所述(a1)具体可为(b1)。所述(a2)具体可为(b2)。所述(a3)具体可为(b3)。所述(a4)具体可为(b4)。所述(a5)具体可为(b5)。所述(a6)具体可为(b6)。所述(a7)具体可为(b7)。所述(a8)具体可为(b8)。所述(a9)具体可为(b9)。所述(a10)具体可为(b10)。所述(a11)具体可为(b11)。所述(a12)具体可为(b12)。

(b1)第2位氨基酸残基由T突变为A。

(b2)第6位氨基酸残基由I突变为T。

(b3)第14位氨基酸残基由N突变为D。

(b4)第20位氨基酸残基由E突变为D。

(b5)第120位氨基酸残基由T突变为A。

(b6)第231位氨基酸残基由E突变为K。

(b7)第260位氨基酸残基由H突变为Y。

(b8)第342位氨基酸残基由E突变为K。

(b9)第397位氨基酸残基由K突变为R。

(b10)第676位氨基酸残基由D突变为G。

(b11)第785位氨基酸残基由F突变为L。

(b12)第801位氨基酸残基由W突变为R。

所述磷酸转酮酶具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

所述磷酸转酮酶还可为与序列表的序列3所示的蛋白质具有90％，优选95％，更优选98％，最优选99％同源性的蛋白或多肽。

示例性的，所述突变体蛋白可为实施例中的M21蛋白、M41蛋白、M71蛋白、M81蛋白、M82蛋白、T2A蛋白、I6T蛋白、N14D蛋白、E20D蛋白、T120A蛋白、E231K蛋白、H260Y蛋白、E342K蛋白、K397R蛋白、D676G蛋白、F785L蛋白、W801R蛋白、T2A/I6T蛋白、T2A/H260Y蛋白、I6T/H260Y蛋白或T2A/I6T/H260Y蛋白。

编码以上任一所述突变体蛋白的多核苷酸(例如基因，该基因命名为突变体基因)也属于本发明的保护范围。

示例性的，所述突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行如下(c1)至(c12)中任意一种或多种突变得到的DNA分子：

(c1)第4位核苷酸由A突变为G；

(c2)第17位核苷酸由T突变为C；

(c3)第40位核苷酸由A突变为G；

(c4)第60位核苷酸由A突变为T；

(c5)第358位核苷酸由A突变为G；

(c6)第691位核苷酸由G突变为A；

(c7)第778位核苷酸由C突变T为；

(c8)第1024位核苷酸由G突变为A；

(c9)第1190位核苷酸由A突变为G；

(c10)第2027位核苷酸由A突变为G；

(c11)第2353位核苷酸由T突变为C；

(c12)第2401位核苷酸由T突变为C。

本发明提供的突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行(c1)和(c2)两种突变得到的DNA分子。

本发明提供的突变体基因具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行特定突变和非特定突变得到的DNA分子。所述特定突变为(c1)和(c2)两种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c7)、(c8)、(c9)、(c10)、(c11)、(c12)。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行(c1)和(c2)和(c7)三种突变得到的DNA分子。

本发明提供的突变体蛋白具体可为将磷酸转酮酶基因的编码框进行特定突变和非特定突变得到的DNA分子。所述特定突变为(c1)和(c2)和(c7)三种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c8)、(c9)、(c10)、(c11)、(c12)。

磷酸转酮酶基因的编码框具体可如序列表的序列4所示。

具有以上任一所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组离体细胞或重组微生物均属于本发明的保护范围。

具有以上任一所述突变体蛋白的融合蛋白也属于本发明的保护范围。

所述融合蛋白可为将所述突变体蛋白与蛋白标签融合得到的蛋白质。蛋白标签可位于突变体蛋白的N端，也可位于突变体蛋白的C端。突变体蛋白和蛋白标签之间还可以具有间隔氨基酸残基，具体可具有10个以下间隔氨基酸残基。

示例性的标签具体如表1所示。

表1标签的序列

所述融合蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：突变体蛋白、间隔序列、蛋白标签。蛋白标签具体可为His₆标签。间隔序列具体可由10个以下氨基酸残基组成。间隔序列具体可为“LE”。

示例性的，所述融合蛋白可为实施例中的FXPK-His₆蛋白、M21-His₆蛋白、M41-His₆蛋白、M71-His₆蛋白、M81-His₆蛋白、M82-His₆蛋白、T2A-His₆蛋白、I6T-His₆蛋白、N14D-His₆蛋白、E20D-His₆蛋白、T120A-His₆蛋白、E231K-His₆蛋白、H260Y-His₆蛋白、E342K-His₆蛋白、K397R-His₆蛋白、D676G-His₆蛋白、F785L-His₆蛋白、W801R-His₆蛋白、T2A/I6T-His₆蛋白、T2A/H260Y-His₆蛋白、I6T/H260Y-His₆蛋白或T2A/I6T/H260Y-His₆蛋白。

编码所述融合蛋白的多核苷酸(例如基因)也属于本发明的保护范围。

具有编码所述融合蛋白的多核苷酸的表达盒、重组载体、重组离体细胞或重组微生物均属于本发明的保护范围。

示例性的，以上任一所述重组载体具体可为实施例中的重组质粒pTR-fxpk、重组质粒pTR1-fxpk、重组质粒pTR-M21、重组质粒pTR-M41、重组质粒pTR-M71、重组质粒pTR-M81、重组质粒pTR-M82、重组质粒pTR-T2A、重组质粒pTR-I6T、重组质粒pTR-H260Y、重组质粒pTR-T2A/I6T、重组质粒pTR-T2A/I6T/H260Y、重组质粒pET-fxpk、重组质粒pET-M21、重组质粒pET-M41、重组质粒pET-M71、重组质粒pET-M81、重组质粒pET-M82、重组质粒pET-T2A、重组质粒pET-I6T、重组质粒pET-N14D、重组质粒pET-E20D、重组质粒pET-T120A、重组质粒pET-E231K、重组质粒pET-H260Y、重组质粒pET-E342K、重组质粒pET-K397R、重组质粒pET-D676G、重组质粒pET-F785L、重组质粒pET-W801R、重组质粒pET-T2A/I6T、重组质粒pET-T2A/H260Y、重组质粒pET-I6T/H260Y、重组质粒pET-T2A/I6T/H260Y或质粒pSil-fxpk。

所述重组微生物可为将以上任一所述重组载体导入宿主微生物得到的重组微生物。

示例性的，以上任一所述重组微生物具体可为实施例中的菌株Z188△pfk(pTR-fxpk)或菌株Z188△pfk(pTR1-fxpk)，以及实施例5至实施例11中得到的各个重组菌。

所述宿主微生物可为氨基酸生产菌株或有机酸生产菌株。

所述宿主微生物包括但不限于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黑曲霉，等等。

示例性的，所述宿主微生物可为谷氨酸棒杆菌Z188、菌株Z188△pfk、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌琥珀酸生产菌株(例如CGMCC No.5107、CGMCC No.5108或CGMCCNo.5109等)、谷氨酰胺生产菌株(例如实施例8中的谷氨酰胺生产菌株)、大肠杆菌脯氨酸生产菌株(例如DH5α(pSW2))、大肠杆菌反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株(例如DH5α(pSW3))、黑曲霉(例如Co827(CICC 40347))。

本发明还保护特定物质在制备代谢物中的应用；所述特定物质为：以上任一所述突变体蛋白、以上任一所述融合蛋白、以上任一所述突变体基因、以上任一所述编码所述融合蛋白的基因、以上任一所述表达盒、以上任一所述重组载体、以上任一所述重组离体细胞或以上任一所述重组微生物。所述代谢物具体可为氨基酸。示例性的，所述氨基酸具体可为源自乙酰辅酶A的氨基酸。示例性的，所述氨基酸包括但不限于谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸等。所述代谢物具体可为有机酸。示例性的，所述有机酸包括但不限于琥珀酸、柠檬酸等。

本发明还保护一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：将磷酸转酮酶进行如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变：(a1)至(a12)同上。

所述方法中，具体可进行(a1)和(a2)两种突变。

所述方法中，具体可进行特定突变和非特定突变。所述特定突变为(a1)和(a2)两种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a7)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。

所述方法中，具体可进行(a1)和(a2)和(a7)三种突变。

所述方法中，具体可进行特定突变和非特定突变。所述特定突变为(a1)和(a2)和(a7)三种突变。所述非特定突变为如下突变中的任意一种或任意组合：(a3)、(a4)、(a5)、(a6)、(a8)、(a9)、(a10)、(a11)、(a12)。

所述磷酸转酮酶具体可为序列表的序列3所示的蛋白质。

本发明还保护一种制备代谢物的方法，包括如下步骤：通过培养以上任一所述的重组微生物制备代谢物。所述方法还包括将代谢物从培养体系中分离纯化出来的步骤。所述代谢物具体可为氨基酸。示例性的，所述氨基酸具体可为源自乙酰辅酶A的氨基酸。示例性的，所述氨基酸包括但不限于谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸等。所述代谢物具体可为有机酸。示例性的，所述有机酸包括但不限于琥珀酸、柠檬酸等。

本发明还保护一种获得磷酸转酮酶酶活增高的蛋白质的方法，包括如下步骤：

(1)将现有蛋白质与参照蛋白质进行序列比对；所述现有蛋白质为现有的具有磷酸转酮酶酶活的蛋白质；所述参照蛋白质为序列表的序列3所示的蛋白质；

(2)根据比对结果，将参照蛋白质中的特定突变对应于现有蛋白质，然后将现有蛋白质进行突变，得到磷酸转酮酶酶活高于所述现有蛋白质的新蛋白质；所述特定突变为如下(a1)至(a12)中任意一种或多种突变：(a1)至(a12)同上。

所述获得磷酸转酮酶酶活增高的蛋白质的方法还包括检测新蛋白质和现有蛋白质的磷酸转酮酶酶活，从而将酶活增高的蛋白质选择出来的步骤。

以上任一所述磷酸转酮酶包括但不限于6-磷酸果糖转酮酶。

以上任一所述磷酸转酮酶酶活包括但不限于6-磷酸果糖转酮酶酶活。

所述重组离体细胞是将所述基因导入离体宿主细胞得到的。所述宿主细胞具体可为可以生产氨基酸、有机酸的宿主细胞。本文所用的术语“宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，含有本发明的磷酸转酮酶且能够生产氨基酸、有机酸特别是源自乙酰辅酶A的氨基酸、有机酸的细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中的含有本发明所述的磷酸转酮酶且能够生产氨基酸、有机酸等化合物。

所述重组微生物是将所述基因导入宿主微生物得到的。所述宿主微生物具体可为可以生产氨基酸、有机酸的宿主微生物。本文所用的术语“宿主微生物”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，含有本发明的磷酸转酮酶且能够生产氨基酸、有机酸特别是源自乙酰辅酶A的氨基酸、有机酸的微生物。换言之，本发明可以利用任何宿主微生物，只要所述宿主微生物中的含有本发明所述的磷酸转酮酶且能够生产氨基酸、有机酸等化合物。所述宿主微生物包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、泛菌属(Pantoea)、短杆菌属(Brevibacterium sp)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)的微生物。所述宿主微生物优选为或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，最优选为谷氨酸棒状杆菌。所述宿主微生物具体可为谷氨酸棒杆菌Z188。

本发明中，发明人敲除氨基酸生产菌株的6-磷酸果糖激酶(PFK)基因，将外源磷酸转酮酶的活性与菌株的生长速度偶联，从而在野生型FXPK蛋白的基础上通过生长富集发现了酶活提高的突变体蛋白以及可以增加现有磷酸转酮酶酶活的多个突变位点。与现有磷酸转酮酶相比，本发明提供的突变体蛋白的磷酸转酮酶酶活显著增加。采用本发明提供的突变位点对现有磷酸转酮酶进行单点或多点突变，可以显著提高其磷酸转酮酶酶活。本发明提供方案，可以实现更高的磷酸转酮酶活性，进而显著提高目标代谢物的产量。

附图说明

图1为实施例2中的结果。

图2为实施例3中的结果。

图3为实施例5中的结果。

图4为实施例6中的结果。

具体实施方式

本发明的“磷酸转酮酶”包括6-磷酸果糖转酮酶(FPK)和/或5-磷酸木酮糖转酮酶(XPK)，是指能够催化果糖-6-磷酸生成乙酰磷酸和赤藓糖-4-磷酸的酶和/或能够催化木酮糖-5-磷酸生成乙酰磷酸和甘油醛-3-磷酸的酶。

“5-磷酸木酮糖转酮酶”可以是一种酶，其来自具有5-磷酸木酮糖转酮酶活性的细菌，包括但不限于乳酸菌属、甲醇同化细菌属、甲烷同化细菌属、链球菌属(Streptococcus)等，可优选醋杆菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、链球菌属(Streptoccus)、甲基球菌属(Methylococcus)、丁酸杆菌属(Buryrivibrio)、丝状菌属(Fibrobacter)的细菌，也可优选属于假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、温酵母属(Wingea)等的酵母。

“6-磷酸果糖转酮酶”可以是一种酶，其来自于具有6-磷酸果糖转酮酶活性的细菌，包括但不限于醋杆菌属(Acetobacter)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、绿菌属(Chlorobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、甲基球菌属(Methylococcus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)的细菌，包括但不限于属于红酵母属(Rhodotorula)、假丝酵母属(Trichosporon)、酵母属(Saccharomyces)等的酵母。

磷酸转酮酶也可能是一个酶，呈现出6-磷酸果糖转酮酶(FPK)和5-磷酸木酮糖转酮酶(XPK)两种活性。关于本发明，磷酸转酮酶可以来源于青春双歧杆菌。本发明中通过对序列表的序列3所示蛋白质进行突变获得了酶活提高的突变体蛋白，本领域技术人员可以任意进行突变，只要其相对于其自然状态酶活有所提高，也在本发明的保护范围内。磷酸转酮酶可以来源于各种物种，包括但不限于青春双歧杆菌、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)等。

本文所用的术语“自然状态”是指微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。

本文所用的术语“含有本发明的磷酸转酮酶”具有本领域技术人员常规理解的含义，并且可以通过本领域已知的方法实施，包括但不限于，如：将包含编码蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸插入到染色体上，和/或将多核苷酸克隆到载体上引入微生物，和/或在染色体上行直接增加该多核苷酸的拷贝等方法来实现，也可以非限制性地包括任何已知的可以引入蛋白活性的方法。

本发明所述“氨基酸、有机酸特别是源自乙酰辅酶A的氨基酸、有机酸”是指如L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸(反式-4-羟基-L-脯氨酸)、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-半胱氨酸、柠檬酸、琥珀酸等以乙酰辅酶A为底物的氨基酸、有机酸。

本发明所述“氨基酸、有机酸生产菌株”是指，当细菌在培养中被培养时能够产生氨基酸、有机酸并且能够积累氨基酸、有机酸，或者能够将氨基酸、有机酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离氨基酸、有机酸，特别是指与野生型菌株或者亲本菌株相比，能够积累更多氨基酸、有机酸的能力。为了赋予菌株产氨基酸、有机酸的能力，可以采用传统的育种方法，比如培育营养缺陷型的突变株、抗类似物的菌株，或者能够产氨基酸、有机酸的代谢控制突变株，以及培育氨基酸、有机酸生物合成相关酶活性提高的重组菌株的方法，或者以上方法的组合。

本领域技术人员知晓，为提升活性而对野生型多肽进行突变，找到能实现所需目的的位点更为重要。因此，基于本发明的教导，本领域技术人员会对序列3所示蛋白质的第2位、第6位、第14位、第20位、第120位、第231位、第260位、第342位、第397位、第676位、第785位、第801位的氨基酸残基进行突变，并检测突变体的相关活性。在具体的实施方式中，本发明的磷酸转酮酶突变体蛋白在对应于序列3所示蛋白质的第2位氨基酸残基为A，和/或第6位氨基酸残基为T，和/或第14位氨基酸残基为D，和/或第20位氨基酸残基为D，和/或第120位氨基酸残基为A，和/或第231位氨基酸残基为K，和/或第260位氨基酸残基为Y，和/或第342位氨基酸残基为K，和/或第397位氨基酸残基为R，和/或第676位氨基酸残基为G，和/或第785位氨基酸残基为L，和/或第801位氨基酸残基为R。

此外，本领域普通技术人员也不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

因此，对本发明的磷酸转酮酶突变体作进一步突变而得到仍具备磷酸转酮酶的功能和活性的进一步突变体是显而易见的。例如，本领域技术人员公知在多肽的任一端增加或减少数个氨基酸残基，例如优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基不会影响得到的突变体的功能。例如，为便于纯化，技术人员往往在得到的蛋白的任一端带上6×His标签，而这种蛋白与不具备6×His标签的蛋白具有相同的功能。因此，本发明应包括本发明的磷酸转酮酶的保守性突变体。这些保守性突变体可以根据，例如表2所示进行氨基酸替换而产生。

表2

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于序列3所示蛋白质的第40位的氨基酸残基”而言，如果在序列3所示蛋白质的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于序列3所示氨基酸序列的第40位就可能是第46位。

在具体的实施方式中，只要所述同源性或序列相同性在90％以上，优选95％以上，更优选96％、97％、98％、99％以上，且具有磷酸转酮酶活性(即6-磷酸果糖转酮酶活性和/或5-磷酸木酮糖转酮酶活性)，也在本发明的保护范围内。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

记载有质粒pK18mobsacB的文献(plasmid pK18mobsacB)，记载于如下文献：Schafer A,Tauch A,Jager W,Kalinowski J,Thierbach G,Puhler A(1994)Smallmobilizable multipurpose cloning vectors derived from the Escherichia coliplasmids pK18 and pK19-selection of defined deletions in the chromosome ofCorynebacterium glutamicum.Gene 145(1):69-73.https://doi.org/10.1016/0378-1119(94)90324-7。

质粒pTRCmob(Plasmid pTRCmob)，记载于如下文献：Liu,Q.,et al.(2007).Journal of Biotechnology 132(2007)273–279。

液体CGXII无机盐培养基的配方见表3(调节pH为7.0)。

表3

实施例1、构建敲除pfk基因的菌株，即菌株Z188△pfk

谷氨酸棒杆菌Z188，即谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Z188。谷氨酸棒杆菌Z188的全基因组见GenBank accession number：NZ_AKXP00000000.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_AKXP00000000)。pfk基因即6-磷酸果糖激酶基因。谷氨酸棒杆菌Z188的基因组DNA中，pfk基因的编码框及其上下游各1000bp部分的核苷酸序列见序列表的序列2(序列表的序列2中，第1001-2041位核苷酸为编码框，编码序列表的序列1所示的蛋白质)。

Δpfk-F1：CCTCGAATTC GGATGCTGCCAATGGAATGGTGCCCAGTG；

Δpfk-R1：CTTCAAGGTT AAATTCATTGCTGGCTGTGC；

Δpfk-F2：CAATGAATTT AACCTTGAAGGAAGTTCCATTC；

Δpfk-R2：TCTACTGCAG GGAATGATGACACCGATGGTGTCTGTCCTCGAC。

1、以谷氨酸棒杆菌Z188的基因组DNA为模板，采用Δpfk-F1和Δpfk-R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、以谷氨酸棒杆菌Z188的基因组DNA为模板，采用Δpfk-F2/Δpfk-R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤1的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物同时作为模板，采用Δpfk-F1/Δpfk-R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、取步骤3得到的PCR扩增产物，采用限制性内切酶EcoRI和PstI进行双酶切，回收酶切产物。

5、取质粒pK18mobsacB，采用限制性内切酶EcoRI和PstI进行双酶切，回收载体骨架。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒。

7、利用步骤6得到的重组质粒，根据文献(Niebisch and Bott,(2001).ArchMicrobiol175(4):282-294.Schafer et al.,(1994).Gene 145(1):69-73)中记载的两步Rec重组的方法敲除谷氨酸棒杆菌Z188的pfk基因，得到敲除pfk基因的菌株，将其命名为菌株Z188△pfk。

菌株Z188△pfk进行测序。与谷氨酸棒杆菌Z188的基因组DNA相比，菌株Z188△pfk的基因组的差异仅在于，缺失了序列表的序列2所示DNA分子的第1100-1983位核苷酸所示的区段。

实施例2、重组菌的制备以及生长性能

来源于青春双歧杆菌的磷酸转酮酶如序列表的序列3所示。对序列表的序列3所示的蛋白质的编码基因进行全密码子优化，优化后基因如序列表的序列4所示。将序列表的序列3所示的磷酸转酮酶又称为FXPK蛋白或F/XPK蛋白。将编码FXPK蛋白的基因又称为fxpk基因。

一、制备重组质粒

1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子；将合成的双链DNA分子作为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

F1：CTACGAATTCGAAGGAGATATACATATG；

R1：TCAGGGATCCTCATTCGTTGTCACCCGCGGTC。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，采用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收酶切产物。

3、取质粒pTRCmob，采用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pTR-fxpk。经测序验证，重组质粒pTR-fxpk中具有特异DNA分子甲。所述特异DNA分子甲自上游至下游依次由如下五个元件组成：序列表的序列5所示的DNA分子(序列5中第1-246位核苷酸组成启动子)、EcoRI酶切识别序列“gaattc”、核糖体结合位点“GAAGGAGATATACAT”、序列表的序列4所示的DNA分子、BamHI酶切识别序列“GGATCC”。

5、以重组质粒pTR-fxpk为模板，采用Ptrc-1和Ptrc-2组成的引物对进行单点突变，得到重组质粒pTR1-fxpk。本步骤的目的是在启动子区引入单点突变，从而增加启动子的启动活性，促进基因的表达。

Ptrc-1：GAGCGGATAACAATCTCACACAGGAAACAG；

Ptrc-2：CTGTTTCCTGTGTGAGATTGTTATCCGCTC。

重组质粒pTR1-fxpk进行测序验证。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR1-fxpk的差异仅在于用序列表的序列6所示的DNA分子取代了序列表的序列5所示的DNA分子。

二、制备重组菌

将重组质粒pTR-fxpk导入菌株Z188△pfk，得到重组菌，命名为菌株Z188△pfk(pTR-fxpk)。

将重组质粒pTR1-fxpk导入菌株Z188△pfk，得到重组菌，命名为菌株Z188△pfk(pTR1-fxpk)。

三、比较菌株的生长性能

供试菌株分别为：谷氨酸棒杆菌Z188、菌株Z188△pfk、菌株Z188△pfk(pTR-fxpk)、菌株Z188△pfk(pTR1-fxpk)。

将供试菌株接种至液体CGXII无机盐培养基(初始体系的OD_600nm值＝0.1)，30℃、850rpm振荡培养，不同时间取样(各200μL)，利用酶标仪检测600nm下的吸光度(OD_600nm值)。

结果见图1。菌株Z188△pfk在液体CGXII无机盐培养基中几乎不生长。菌株Z188△pfk(pTR-fxpk)和菌株Z188△pfk(pTR1-fxpk)都可以正常生长，fxpk基因表达水平越高，菌株生长速度越快。结果表明，FXPK酶活/含量的增加能够促进菌株的生长，从而可以通过生长富集的方式从突变体库中筛选酶活提高的突变蛋白。

实施例3、获得酶活性提高的突变蛋白

一、构建fxpk基因突变体库

1、以重组质粒pTR-fxpk为模板，采用F1和R1组成的引物对，进行易错PCR扩增。易错PCR扩增，采用

DNA聚合酶(北京全式金生物)。分别设置三个反应体系，分别含有0.2mM、0.5mM或0.8mM的氯化锰。完成易错PCR扩增后，将三个反应体系合并。

2、取步骤1的产物，采用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收酶切产物。

3、取重组质粒pTR-fxpk，采用限制性内切酶EcoRI和BamHI进行双酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒。

5、将步骤4得到的重组质粒导入菌株Z188△pfk，得到重组菌。

由于易错PCR扩增产生了多种fxpk基因的突变基因，在步骤4中得到了多种重组质粒(约1万种)，形成fxpk基因突变重组质粒库，相应的，在步骤5中得到了多种重组菌，形成fxpk基因突变重组菌库。

采用相同的方法构建了9个fxpk基因突变重组菌库，依次命名为M1重组菌库至M9重组菌库。

二、通过生长富集获得FXPK酶活性提高的突变体

利用液体CGXII无机盐培养基在24深孔板中培养9个fxpk基因突变重组菌库(每孔1ml培养基)，30℃、850rpm振荡培养，每隔48小时转接一次(接种量为1％)。每次培养后，取200μL到微孔板中，利用酶标仪检测600nm下的吸光度(OD_600nm值)。将菌株Z188△pfk(pTR-fxpk)作为对照菌株。结果见图2。随着连续传代培养，M2重组菌库、M4重组菌库、M7重组菌库和M8重组菌库中均富集到能够生长加快的菌株。

对M2重组菌库、M4重组菌库、M7重组菌库和M8重组菌库分别进行测序分析，从M2重组菌库、M4重组菌库、M7重组菌库中各筛选到一个fxpk基因的突变基因，从M8重组菌库中筛选到2个fxpk基因的突变基因。从而，得到5个FXPK蛋白的突变蛋白。将各个突变蛋白分别命名为M21蛋白、M41蛋白、M71蛋白、M81蛋白和M82蛋白。与FXPK蛋白相比各个突变蛋白的突变氨基酸，以及与fxpk基因(序列表的序列4中第26-2503位核苷酸所示)相比各个突变基因的突变核苷酸，见表4。

表4

^(1-14)表示核苷酸突变导致对应的氨基酸发生突变，^(-)表示核苷酸突变没有导致氨基酸突变发生。

实施例4、用于表达各个蛋白质的各个重组质粒的构建

FXPK蛋白如序列表的序列3所示。fxpk基因如序列表的序列4所示。

一、分别制备各个重组质粒，并测序验证。

重组质粒pTR-M21。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-M21的差异仅在于用M21D基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，M21D基因发生了如下5个核苷酸的突变：第17位核苷酸由T突变为C，第358位核苷酸由A突变为G，第691位核苷酸由G突变为A，第1190位核苷酸由A突变为G，第2027位核苷酸由A突变为G。M21D基因编码M21蛋白。与FXPK蛋白相比，M21蛋白发生了如下5个氨基酸残基的突变：第6位氨基酸残基由I突变为T，第120位氨基酸残基由突变T为A，第231位氨基酸残基由E突变为K，第397位氨基酸残基由K突变为R，第676位氨基酸残基由D突变为G。

重组质粒pTR-M41。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-M41的差异仅在于用M41D基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，M41D基因发生了如下2个核苷酸的突变：第4位核苷酸由A突变为G，第2353位核苷酸由T突变为C。M41D基因编码M41蛋白。与FXPK蛋白相比，M41蛋白发生了如下2个氨基酸残基的突变：第2位氨基酸残基由T突变为A，第785位氨基酸残基由F突变为L。

重组质粒pTR-M71。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-M71的差异仅在于用M71D基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，M71D基因发生了如下3个核苷酸的突变：第40位核苷酸由A突变为G，第1481位核苷酸由G突变为A，第2401位核苷酸由T突变为C。M71D基因编码M71蛋白。与FXPK蛋白相比，M71蛋白发生了如下3个氨基酸残基的突变：第14位氨基酸残基N由突变为D，第494位氨基酸残基由R突变为H，第801位氨基酸残基由W突变为R。

重组质粒pTR-M81。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-M81的差异仅在于用M81D基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，M81D基因发生了如下4个核苷酸的突变：第60位核苷酸由A突变为T，第778位核苷酸由C突变为T，第1024位核苷酸由G突变为A，第1401位核苷酸由G突变为A。M81D基因编码M81蛋白。与FXPK蛋白相比，M81蛋白发生了如下4个氨基酸残基的突变：第20位氨基酸残基由E突变为D，第260位氨基酸残基由H突变为Y，第342位氨基酸残基由E突变为K，第467位氨基酸残基M由突变为I。

重组质粒pTR-M82。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-M82的差异仅在于用M82D基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，M82D基因发生了如下3个核苷酸的突变：第60位核苷酸由A突变为T，第778位核苷酸由C突变为T，第1024位核苷酸由G突变为A。M82D基因编码M82蛋白。与FXPK蛋白相比，M82蛋白发生了如下3个氨基酸残基的突变：第20位氨基酸残基由E突变为D，第260位氨基酸残基由H突变为Y，第342位氨基酸残基由E突变为K。

重组质粒pTR-T2A。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-T2A的差异仅在于用T2A基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，T2A基因发生了如下1个核苷酸的突变：第4位核苷酸由A突变为G。T2A基因编码T2A蛋白。与FXPK蛋白相比，T2A蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第2位氨基酸残基由T突变为A。

重组质粒pTR-I6T。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-I6T的差异仅在于用I6T基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，I6T基因发生了如下1个核苷酸的突变：第17位核苷酸由T突变为C。I6T基因编码I6T蛋白。与FXPK蛋白相比，I6T蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第6位氨基酸残基由I突变为T。

重组质粒pTR-H260Y。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-H260Y的差异仅在于用H260Y基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，H260Y基因发生了如下1个核苷酸的突变：第778位核苷酸由C突变为T。H260Y基因编码H260Y蛋白。与FXPK蛋白相比，H260Y蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第260位氨基酸残基由H突变为Y。

重组质粒pTR-T2A/I6T。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-T2A/I6T的差异仅在于用T2A/I6T基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，T2A/I6T基因发生了如下2个核苷酸的突变：第4位核苷酸由A突变为G，第17位核苷酸由T突变为C。T2A/I6T基因编码T2A/I6T蛋白。与FXPK蛋白相比，T2A/I6T蛋白发生了如下2个氨基酸残基的突变：第2位氨基酸残基由T突变为A，第6位氨基酸残基由I突变为T。

重组质粒pTR-T2A/I6T/H260Y。与重组质粒pTR-fxpk相比，重组质粒pTR-T2A/I6T/H260Y的差异仅在于用T2A/I6T/H260Y基因取代了fxpk基因。与fxpk基因相比，T2A/I6T/H260Y基因发生了如下3个核苷酸的突变：第4位核苷酸由A突变为G，第17位核苷酸由T突变为C，第778位核苷酸由C突变为T。T2A/I6T/H260Y基因编码T2A/I6T/H260Y蛋白。与FXPK蛋白相比，T2A/I6T/H260Y蛋白发生了如下3个氨基酸残基的突变：第2位氨基酸残基由T突变为A，第6位氨基酸残基由I突变为T，第260位氨基酸残基由H突变为Y。

二、制备重组质粒pET-fxpk。

在质粒pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切识别序列之间插入序列表的序列4中第4-2475位核苷酸所示的DNA分子，得到重组质粒pET-fxpk。经测序验证，重组质粒pET-fxpk中具有特异DNA分子乙。所述特异DNA分子乙自上游至下游依次由如下五个元件组成：NdeI酶切识别序列“CATATG”(其中ATG作为融合基因的起始密码子)、序列表的序列4中第4-2475位核苷酸所示的DNA分子(即去除起始密码子和终止密码子的fxpk基因)、XhoI酶切识别序列“CTCGAG”、His₆标签编码序列“CACCACCACCACCACCAC”、终止密码子“TGA”。重组质粒中的融合基因表达FXPK-His₆蛋白。FXPK-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：FXPK蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

三、分别制备各个重组质粒，并测序验证。

重组质粒pET-M21。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-M21的差异仅在于用去除终止密码子的M21D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达M21-His₆蛋白。M21-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：M21蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-M41。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-M41的差异仅在于用去除终止密码子的M41D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达M41-His₆蛋白。M41-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：M41蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-M71。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-M71的差异仅在于用去除终止密码子的M71D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达M71-His₆蛋白。M71-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：M71蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-M81。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-M81的差异仅在于用去除终止密码子的M81D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达M81-His₆蛋白。M81-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：M81蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-M82。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-M82的差异仅在于用去除终止密码子的M82D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达M82-His₆蛋白。M82-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：M82蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-T2A。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-T2A的差异仅在于用去除终止密码子的T2A基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达T2A-His₆蛋白。T2A-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：T2A蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-I6T。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-I6T的差异仅在于用去除终止密码子的I6T基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达I6T-His₆蛋白。I6T-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：I6T蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-N14D。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-N14D的差异仅在于用去除终止密码子的N14D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，N14D基因发生了如下1个核苷酸的突变：第40位核苷酸由A突变为G。N14D基因编码N14D蛋白。与FXPK蛋白相比，N14D蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第14位氨基酸残基N由突变为D。重组质粒中的融合基因表达N14D-His₆蛋白。N14D-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：N14D蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-E20D。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-E20D的差异仅在于用去除终止密码子的E20D基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，E20D基因发生了如下1个核苷酸的突变：第60位核苷酸由A突变为T。E20D基因编码E20D蛋白。与FXPK蛋白相比，E20D蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第20位氨基酸残基由E突变为D。重组质粒中的融合基因表达E20D-His₆蛋白。E20D-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：E20D蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-T120A。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-T120A的差异仅在于用去除终止密码子的T120A基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，T120A基因发生了如下1个核苷酸的突变：第358位核苷酸由A突变为G。T120A基因编码T120A蛋白。与FXPK蛋白相比，T120A蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第120位氨基酸残基由突变T为A。重组质粒中的融合基因表达T120A-His₆蛋白。T120A-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：T120A蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-E231K。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-E231K的差异仅在于用去除终止密码子的E231K基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，E231K基因发生了如下1个核苷酸的突变：第691位核苷酸由G突变为A。E231K基因编码E231K蛋白。与FXPK蛋白相比，E231K蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第231位氨基酸残基由E突变为K。重组质粒中的融合基因表达E231K-His₆蛋白。E231K-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：E231K蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-H260Y。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-H260Y的差异仅在于用去除终止密码子的H260Y基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达H260Y-His₆蛋白。H260Y-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：H260Y蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-E342K。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-E342K的差异仅在于用去除终止密码子的E342K基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，E342K基因发生了如下1个核苷酸的突变：第1024位核苷酸由G突变为A。E342K基因编码E342K蛋白。与FXPK蛋白相比，E342K蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第342位氨基酸残基由E突变为K。重组质粒中的融合基因表达E342K-His₆蛋白。E342K-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：E342K蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-K397R。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-K397R的差异仅在于用去除终止密码子的K397R基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，K397R基因发生了如下1个核苷酸的突变：第1190位核苷酸由A突变为G。K397R基因编码K397R蛋白。与FXPK蛋白相比，K397R蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第397位氨基酸残基由K突变为R。重组质粒中的融合基因表达K397R-His₆蛋白。K397R-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：K397R蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-D676G。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-D676G的差异仅在于用去除终止密码子的D676G基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，D676G基因发生了如下1个核苷酸的突变：第2027位核苷酸由A突变为G。D676G基因编码D676G蛋白。与FXPK蛋白相比，D676G蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第676位氨基酸残基由D突变为G。重组质粒中的融合基因表达D676G-His₆蛋白。D676G-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：D676G蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-F785L。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-F785L的差异仅在于用去除终止密码子的F785L基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，F785L基因发生了如下1个核苷酸的突变：第2353位核苷酸由T突变为C。F785L基因编码F785L蛋白。与FXPK蛋白相比，F785L蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第785位氨基酸残基由F突变为L。重组质粒中的融合基因表达F785L-His₆蛋白。F785L-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：F785L蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-W801R。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-W801R的差异仅在于用去除终止密码子的W801R基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，W801R基因发生了如下1个核苷酸的突变：第2401位核苷酸由T突变为C。W801R基因编码W801R蛋白。与FXPK蛋白相比，W801R蛋白发生了如下1个氨基酸残基的突变：第801位氨基酸残基由W突变为R。重组质粒中的融合基因表达W801R-His₆蛋白。W801R-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：W801R蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-T2A/I6T。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-T2A/I6T的差异仅在于用T2A/I6T基因取代了fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达T2A/I6T-His₆蛋白。T2A/I6T-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：T2A/I6T蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-T2A/H260Y。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-T2A/H260Y的差异仅在于用去除终止密码子的T2A/H260Y基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，T2A/H260Y基因发生了如下2个核苷酸的突变：第4位核苷酸由A突变为G，第778位核苷酸由C突变为T。T2A/H260Y基因编码T2A/H260Y蛋白。与FXPK蛋白相比，T2A/H260Y蛋白发生了如下2个氨基酸残基的突变：第2位氨基酸残基由T突变为A，第260位氨基酸残基由H突变为Y。重组质粒中的融合基因表达T2A/H260Y-His₆蛋白。T2A/H260Y-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：T2A/H260Y蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-I6T/H260Y。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-I6T/H260Y的差异仅在于用去除终止密码子的I6T/H260Y基因取代了去除终止密码子的fxpk基因。与fxpk基因相比，I6T/H260Y基因发生了如下2个核苷酸的突变：第17位核苷酸由T突变为C，第778位核苷酸由C突变为T。I6T/H260Y基因编码I6T/H260Y蛋白。与FXPK蛋白相比，I6T/H260Y蛋白发生了如下2个氨基酸残基的突变：第6位氨基酸残基由I突变为T，第260位氨基酸残基由H突变为Y。重组质粒中的融合基因表达I6T/H260Y-His₆蛋白。I6T/H260Y-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：I6T/H260Y蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

重组质粒pET-T2A/I6T/H260Y。与重组质粒pET-fxpk相比，重组质粒pET-T2A/I6T/H260Y的差异仅在于用T2A/I6T/H260Y基因取代了fxpk基因。重组质粒中的融合基因表达T2A/I6T/H260Y-His₆蛋白。T2A/I6T/H260Y-His₆蛋白自N端至C端依次由如下元件组成：T2A/I6T/H260Y蛋白、LE(XhoI酶切识别序列编码)、His₆标签。

实施例5、各个蛋白质的制备及其作为磷酸转酮酶的酶活测定

将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。采用液体LB培养基培养重组菌，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm＝0.6-0.8，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.4mM，然后20℃、200rpm振荡培养18小时，然后4℃、7000g离心5min收集菌体。洗涤菌体，然后进行超声破碎，然后收集上清液，利用His SpinTrap columns(购自GE公司，产品货号28-4013-53)纯化具有His₆标签的蛋白质，然后将蛋白质的缓冲体系置换为pH7.2的PBS缓冲液。

重组质粒pET-fxpk进行上述步骤制备得到FXPK-His₆蛋白。重组质粒pET-M21进行上述步骤制备得到M21-His₆蛋白。重组质粒pET-M41进行上述步骤制备得到M41-His₆蛋白。重组质粒pET-M71进行上述步骤制备得到M71-His₆蛋白。重组质粒pET-M81进行上述步骤制备得到M81-His₆蛋白。重组质粒pET-M82进行上述步骤制备得到M82-His₆蛋白。重组质粒pET-T2A进行上述步骤制备得到T2A-His₆蛋白。重组质粒pET-I6T进行上述步骤制备得到I6T-His₆蛋白。重组质粒pET-N14D进行上述步骤制备得到N14D-His₆蛋白。重组质粒pET-E20D进行上述步骤制备得到E20D-His₆蛋白。重组质粒pET-T120A进行上述步骤制备得到与T120A-His₆蛋白。重组质粒pET-E231K进行上述步骤制备得到E231K-His₆蛋白。重组质粒pET-H260Y进行上述步骤制备得到H260Y-His₆蛋白。重组质粒pET-E342K进行上述步骤制备得到E342K-His₆蛋白。重组质粒pET-K397R进行上述步骤制备得到K397R-His₆蛋白。重组质粒pET-D676G进行上述步骤制备得到D676G-His₆蛋白。重组质粒pET-F785L进行上述步骤制备得到F785L-His₆蛋白。重组质粒pET-W801R进行上述步骤制备得到W801R-His₆蛋白。重组质粒pET-T2A/I6T/I6T进行上述步骤制备得到T2A/I6T-His₆蛋白。重组质粒pET-T2A/H260Y进行上述步骤制备得到T2A/H260Y-His₆蛋白。重组质粒pET-I6T/H260Y进行上述步骤制备得到I6T/H260Y-His₆蛋白。重组质粒pET-T2A/I6T/H260Y/I6T/H260Y进行上述步骤制备得到T2A/I6T/H260Y-His₆蛋白。

利用ThermoFisher公司的BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

分别测定上述制备的各个具有His₆标签的蛋白质对6-磷酸果糖的反应活性。反应原理：底物6-磷酸果糖被供试蛋白催化生成的乙酰磷酸，乙酰磷酸与羟胺生成羟肟酸，羟肟酸与氯化铁反应生成红色化合物，能够在505nm下被检测到。反应体系：49μl磷酸盐缓冲液(pH6.5、100mM)，1μl 10mM焦磷酸硫胺素水溶液，0.1μl 100mM MgCl₂水溶液，0.1μl 0.7M半胱氨酸盐酸盐水溶液，30μl 100mM果糖-6-磷酸水溶液，20μl供试蛋白溶液。先将反应体系置于30℃水浴中反应10分钟；然后加入80μl 2mol/L羟胺水溶液，混匀后室温静置10分钟；然后加入55μl 15g/100ml三氯乙酸水溶液、55μl 4mol/L盐酸水溶液，55μl 5g/100mlFeCl₃·6H₂O水溶液，然后室温静置反应1分钟；然后取样200μl，检测505nm下的吸光值(OD_505nm值)。一个酶活单位(U)定义为：在1分钟的反应时间内，每生成1μmol的乙酰磷酸所需要的酶。

酶活(U)除以蛋白量(mg)，得到比酶活(U/mg)。

上述制备的各个具有His₆标签的蛋白质作为磷酸转酮酶的比酶活见图3。图3中，FXPK代表FXPK-His₆蛋白，M21代表M21-His₆蛋白，M41代表M41-His₆蛋白，以此类推。各个突变体蛋白作为磷酸转酮酶的酶活均高于野生型的FXPK蛋白，T2A/I6T蛋白和T2A/I6T/H260Y蛋白的酶活最高。

实施例6、表达各个蛋白质的重组菌产谷氨酸的能力比较

分别将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌Z188，得到各个重组菌。重组质粒分别为如下：重组质粒pTR-fxpk、重组质粒pTR-M21、重组质粒pTR-M41、重组质粒pTR-M71、重组质粒pTR-M81、重组质粒pTR-M82、重组质粒pTR-T2A、重组质粒pTR-I6T、重组质粒pTR-H260Y、重组质粒pTR-T2A/I6T、重组质粒pTR-T2A/I6T/H260Y。

检测供试菌株发酵生产谷氨酸的能力。供试菌株分别为如下：谷氨酸棒杆菌Z188以及上述制备的各个重组菌。

种子培养基：葡萄糖50g/L，磷酸0.7g/L，七水硫酸镁0.8g/L，硫酸铵10g/L，3-(N-玛琳代)丙磺酸84g/L，玉米粉3g/L，尿素10g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉0.5g/L，余量为水，用氢氧化钠调pH为7.0。发酵培养基与种子培养基的区别仅在于不加入蛋白胨和酵母粉。

取供试菌株的单克隆，接种至5ml种子培养基中，30℃、850rpm振荡培养12小时，得到种子液。取96孔板，每孔加入150μl发酵培养基，然后以10％的接种量接种种子液，然后30℃、850rpm振荡培养33小时，然后利用SBA-40D生物传感分析仪检测谷氨酸产量(每升体系中的谷氨酸含量)和葡萄糖消耗，计算从葡萄糖到谷氨酸的转化率。

结果见图4。可以看出，相比野生型的FXPK蛋白，所测试的FXPK突变体蛋白都能够增加谷氨酸的产量和转化率。

实施例7、各个蛋白质对大肠杆菌发酵生产琥珀酸的影响

利用实施例4的步骤一中构建的各个重组质粒以及重组质粒pTR-fxpk，转化大肠杆菌琥珀酸生产菌株(CGMCC No.5107、CGMCC No.5108或CGMCC No.5109，中国专利ZL201110264353.9)，以获得携带野生型fxpk基因及不同fxpk突变体基因的琥珀酸生产菌株。利用中国专利ZL201110264353.9中所述的琥珀酸生产的发酵条件对菌株生产琥珀酸的能力进行测试。与野生型的FXPK相比，各个FXPK突变体蛋白酶活显著提高。与携带野生型fxpk基因的平行菌株相比，携带各个fxpk突变体基因的菌株生产琥珀酸的能力显著提高，糖酸转化率显著提高。

实施例8、各个蛋白质对谷氨酸棒杆菌发酵生产谷氨酰胺的影响

在谷氨酸生产菌株Z188的基础上，根据文献报告，将其谷氨酰胺合成酶进行Y405F突变，能够生产谷氨酰胺(Liu,Q.,et al.2008.Appl Microbiol Biotechnol 77(6):1297-1304.)。利用实施例4的步骤一中构建的各个重组质粒以及重组质粒pTR-fxpk，转化到构建的谷氨酰胺生产菌株中，利用文献(Liu,Q.,et al.2008.Appl Microbiol Biotechnol 77(6):1297-1304.)所述的谷氨酰胺发酵条件对菌株生产谷氨酰胺的能力进行测试。与野生型的FXPK相比，各个FXPK突变体蛋白酶活显著提高。与携带野生型fxpk基因的平行菌株相比，携带各个fxpk突变体基因的菌株生产谷氨酰胺的能力显著提高，糖酸转化率显著提高。

实施例9、各个蛋白质对大肠杆菌发酵生产脯氨酸的影响

大肠杆菌脯氨酸生产菌株DH5α(pSW2)是携带有质粒pSW2的大肠杆菌DH5α，其中质粒pSW2通过将谷氨酸激酶proB74【proB(NCBI-GI:16128228)第107位Asp突变为Asn】的基因以及谷氨酸半醛脱氢酶proA(NCBI-GI:16128229)的基因连接到质粒puc19上构建而成(中国专利2014107400221中的实施例5)。

利用实施例4的步骤一中构建的各个重组质粒以及重组质粒pTR-fxpk，转化大肠杆菌脯氨酸生产菌株DH5α(pSW2)。利用中国专利2014107400221实施例5中所述的发酵条件对菌株生产脯氨酸的能力进行测试。与野生型的FXPK相比，各个FXPK突变体蛋白酶活显著提高。与携带野生型fxpk基因的平行菌株相比，携带各个fxpk突变体基因的菌株生产脯氨酸的能力显著提高，糖酸转化率显著提高。

实施例10、各个蛋白质对大肠杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的影响

大肠杆菌反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株DH5α(pSW3)是携带有质粒pSW3的大肠杆菌DH5α，其中质粒pSW3是在专利中质粒pSW2的基础上进一步连接L-脯氨酸-4-羟基化酶构建而成的(中国专利2014107400221)。

利用实施例4的步骤一中构建的各个重组质粒以及重组质粒pTR-fxpk，转化大肠杆菌反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株DH5α(pSW3)。利用中国专利2014107400221实施例5中所述的发酵条件对菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力进行测试。与野生型的FXPK相比，各个FXPK突变体蛋白酶活显著提高。与携带野生型fxpk基因的平行菌株相比，携带各个fxpk突变体基因的菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力显著提高，糖酸转化率显著提高。

实施例11、各个蛋白质对黑曲霉发酵生产柠檬酸的影响

以重组质粒pTR-fxpk为模板，采用Fxpk-Fm(Fxpk-Fm:attctcgagATGACCTCTCCGGTTATCG)和Fxpk-Rm(Fxpk-Rm：aatgcatgcTCATTCGTTGTCACCCG)组成的引物对，扩增野生型的fxpk基因，同时分别在5′端与3′端添加XhoI与SphI的酶切位点。然后通过XhoI与SphI双酶切将基因插入与黑曲霉表达质粒pSilent-1(Genbank ID:AB303070)，获得以PtrpC为启动子、以TtrpC为终止子的fxpk基因的黑曲霉表达质粒pSil-fxpk。

实施例4的步骤一中构建的各个重组质粒，参照上述方法，制备突变体基因的黑曲霉表达质粒。

将质粒分别转化至黑曲霉Co827(CICC 40347)的原生质体中。利用中国专利201710022533.3实施例中所述的发酵条件对重组黑曲霉生产柠檬酸的能力进行测试。与野生型的FXPK相比，各个FXPK突变体蛋白酶活显著提高。与携带野生型fxpk基因的平行菌株相比，携带各个fxpk突变体基因的菌株生产柠檬酸的能力显著提高，糖酸转化率显著提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 活性提高的磷酸转酮酶及在生产代谢物中的应用

<130> GNCYX200754

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 346

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

Met Glu Asp Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro

1 5 10 15

Gly Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu

20 25 30

Phe Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu

35 40 45

Ala Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile

50 55 60

Leu Leu Arg Gly Gly Thr Ile Leu Gly Thr Gly Arg Leu His Pro Asp

65 70 75 80

Lys Phe Lys Ala Gly Ile Asp Gln Ile Lys Ala Asn Leu Glu Asp Ala

85 90 95

Gly Ile Asp Ala Leu Ile Pro Ile Gly Gly Glu Gly Thr Leu Lys Gly

100 105 110

Ala Lys Trp Leu Ser Asp Asn Gly Ile Pro Val Val Gly Val Pro Lys

115 120 125

Thr Ile Asp Asn Asp Val Asn Gly Thr Asp Phe Thr Phe Gly Phe Asp

130 135 140

Thr Ala Val Ala Val Ala Thr Asp Ala Val Asp Arg Leu His Thr Thr

145 150 155 160

Ala Glu Ser His Asn Arg Val Met Ile Val Glu Val Met Gly Arg His

165 170 175

Val Gly Trp Ile Ala Leu His Ala Gly Met Ala Gly Gly Ala His Tyr

180 185 190

Thr Val Ile Pro Glu Val Pro Phe Asp Ile Ala Glu Ile Cys Lys Ala

195 200 205

Met Glu Arg Arg Phe Gln Met Gly Glu Lys Tyr Gly Ile Ile Val Val

210 215 220

Ala Glu Gly Ala Leu Pro Arg Glu Gly Thr Met Glu Leu Arg Glu Gly

225 230 235 240

His Ile Asp Gln Phe Gly His Lys Thr Phe Thr Gly Ile Gly Gln Gln

245 250 255

Ile Ala Asp Glu Ile His Ala Arg Leu Gly His Asp Val Arg Thr Thr

260 265 270

Val Leu Gly His Ile Gln Arg Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Asp Arg

275 280 285

Val Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Arg Ala Ala Arg Ala Cys His Glu

290 295 300

Gly Ser Phe Asp Lys Val Val Ala Leu Lys Gly Glu Arg Ile Glu Met

305 310 315 320

Ile Thr Phe Glu Asp Ala Val Gly Thr Leu Lys Glu Val Pro Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Val Thr Ala Gln Ala Met Phe Gly

340 345

<210> 2

<211> 3041

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

accgaggacc agtggcaggc ctccaagcgg gagttcaatg agcaaaatga ggcagaagaa 60

ctcgtgctca gcaaggcata agggcaaggg gttctagaaa gaccaacgga cgtgttttcc 120

cagctcccat tggtttaaaa agctcatttc gaggcctgaa cgtgcgaatc aggacaaaac 180

tcgagtagcc cggaatgatt ttggtttcct tctgcgagtt cgccatgtgg ctgcggtaaa 240

actgccccgg aaccggaata tctcgacgcc acagaacgcc atttgcgggc cttaacaccc 300

cgtgggcata ccttttaccg attccagata ttcggtcgct tatattgcct agtgtgattc 360

caaacagaaa actggggcga cctctaataa gagtcgcccc gataagtttt ttaccgtaat 420

tattactggg agtcagatac tgcgtaagca atcgcagcag cgccagcggt cacagtaaga 480

actgcaggcc acgcgccaat cttcttggca agtgggtggg acaggccaaa tgcaccaacg 540

taggttgtca gcaggccagt agctactgca ggacccttct tttcattcca gcttcgtgca 600

gcaagcgctc cggatgctgc caatggaatg gtgcccagtg ggcgaatgcc ggattcacgg 660

gcagtcaacc aaccgccgat caaacctgct gcgacgacgg tggcagtgct gacctgggat 720

gcctttttca atttcatttc catggtgagc cagtctagag acaaaatttt tccgcggggt 780

tttcttgatc tgatccgaca agccaatggg ggaaaaaatg tgtccgacca aaaattgtgc 840

agcacaccac atgcccgctc ggacaatgtc gatttgttaa tgaaactgca gctctggcga 900

ttaaataagg tggtcagaga caatttttcg gccggtcaac ccctgtgatt ttcttatttt 960

tgggtgattg ttccggcgcg ggtgttgtga tgggtttaat atggaagaca tgcgaattgc 1020

tactctcacg tcaggcggcg actgccccgg actaaacgcc gtcatccgag gaatcgtccg 1080

cacagccagc aatgaatttg gctccaccgt cgttggttat caagacggtt gggaaggact 1140

gttagccgat cgtcgcgtac agctgtatga cgatgaagat attgaccgaa tcctccttcg 1200

aggcggcacc attttgggca ctggtcgcct ccatccggac aagtttaagg ccggaattga 1260

tcagattaag gccaacttag aagacgccgg catcgatgcc cttattccaa tcggtggcga 1320

aggaaccctg aagggtgcca agtggctgtc tgataacggt atccctgttg tcggtgtccc 1380

aaagaccatt gacaatgacg tgaatggcac tgacttcacc ttcggtttcg atactgctgt 1440

tgcagtggct accgacgctg ttgaccgcct gcacaccacc gctgaatctc acaaccgtgt 1500

gatgattgtg gaggtcatgg gccgccacgt gggttggatt gctctgcacg caggtatggc 1560

cggcggtgct cactacaccg ttatcccaga agttcctttc gatattgcag agatctgcaa 1620

ggcgatggaa cgtcgcttcc agatgggcga gaagtacggc attatcgtcg ttgcggaagg 1680

tgcattgcca cgcgaaggca ccatggaact tcgtgaaggc cacattgacc agttcggcca 1740

caagaccttc accggaatcg gccagcagat tgctgatgaa atccatgcgc gcctcggtca 1800

cgatgttcgt accaccgttc ttggccacat tcagcgtggt ggaaccccga ctgctttcga 1860

ccgtgttctg gccactcgtt atggtgttcg ggcagctcgt gcatgccatg agggaagctt 1920

tgacaaggtt gttgccttga agggtgagcg catcgagatg atcacctttg aagatgccgt 1980

cggaaccttg aaggaagttc cattcgagcg ctgggttact gcccaggcaa tgtttggata 2040

gtttttcggg cttttatcaa cagccaataa cagctctttc gcccattgag gtggaggggc 2100

tgttttttca tgccgtaagg aaggtgcaag taagtgaaat caagtggcat agatccattg 2160

atgcttagac tgtgacctag gcttgacttt cgtgggggag tggggataag ttcatcttaa 2220

acacaatgca atcgattgca tttacattcc ttatcccaca ataggggtac cttccagaaa 2280

gttggtgagg agatggcttc cgaaacctcc agcccgaaga agcgggccac cacactcaaa 2340

gacatcgcgc aaacaacaca gctttcagtc agcacggtgt cccgggcatt ggccaacaac 2400

gcgagcattc cggaatccac acgcatccga gtggttgaag ccgctcaaaa gctgaactac 2460

cgtcccaatg cccaagctcg tgcattgcgg aagtcgagga cagacaccat cggtgtcatc 2520

attccaaaca ttgagaaccc atatttctcc tcactagcag catcgattca aaaagctgct 2580

cgtgaagctg gggtgtccac cattttgtcc aactctgaag aaaacccaga gctgcttggt 2640

cagactttgg cgatcatgga tgaccaacgc ctcgatggaa tcatcgtggt gccacacatt 2700

cagtcagagg aacaagtcac tgacttggtt accaggggag tgccagtagt gctggcagac 2760

cgtagttttg ttaactcgtc tattccttcg gttacctcag atccagttcc gggcatgact 2820

gaagctgtgg acttactcct ggcagctgac gtgcaattgg gctaccttgc cggcccgcag 2880

gatacttcca ctggtcagct gcgtcttaac acttttgaaa gactatgcgt ggaccgcggc 2940

atcgtcggag catctgtcta ttacggtggc taccgccaag aatctggata tgacggcatc 3000

aaggtgctga tcaaacaggg agccaatgcg attatcgctg g 3041

<210> 3

<211> 825

<212> PRT

<213> Bifidobacterium

<400> 3

Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro

1 5 10 15

Val Ser Glu Glu Ala Ile Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Ala Ala

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

35 40 45

Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His

50 55 60

Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

65 70 75 80

Leu Ile Ala Asp His Gln Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly

85 90 95

His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ala Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr

100 105 110

Thr Glu Tyr Phe Pro Asn Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys

115 120 125

Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Tyr Ala

130 135 140

Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Val Met Asn Asn Pro Ser Leu Phe Val

165 170 175

Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr

180 185 190

Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Ile Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val

195 200 205

Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile

210 215 220

Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

225 230 235 240

Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asn Glu Asp His

245 250 255

Leu Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Phe Glu Thr Val Phe Asp

260 265 270

Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Ala Ala Gln Thr Asp Asp Met Thr Arg

275 280 285

Pro Phe Tyr Pro Met Ile Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys

290 295 300

Pro Lys Phe Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His

305 310 315 320

Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

325 330 335

Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Glu

340 345 350

Asn Gly Ala Val Lys Pro Glu Val Thr Ala Phe Met Pro Thr Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Ile Gly Glu Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Arg Ile Arg Glu

370 375 380

Glu Leu Lys Leu Pro Lys Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Arg Leu Gly

405 410 415

Val Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Lys Asn Asn Pro Asp Ser Phe Arg Ile

420 425 430

Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ala Tyr Asp

435 440 445

Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Leu Ser Ala Gln Val Asp

450 455 460

Glu His Met Ala Val Thr Gly Gln Val Thr Glu Gln Leu Ser Glu His

465 470 475 480

Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Gly Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly

485 490 495

Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu

500 505 510

Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp

515 520 525

Arg Lys Pro Ile Ser Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe Asn Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Pro Val Asp Ser Asn Met Leu Leu Ala Val Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly

610 615 620

Ala Ala Glu Trp Lys Trp Ala Ser Asn Val Lys Ser Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Gln Ile Val Leu Ala Ala Thr Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ala Asp Lys Leu Asp Ala Met Gly Ile Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Val Asp Leu Val Lys Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asn Glu

675 680 685

Ala Leu Ser Asp Glu Glu Phe Ala Glu Leu Phe Thr Glu Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala Arg Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Gln Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Asn Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Gln Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asn Glu Leu Glu Ala Phe Arg Gln Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asn Lys Gln Gly Ala Ile Ser Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 4

<211> 2478

<212> DNA

<213> Bifidobacterium

<400> 4

atgacctctc cggttatcgg taccccgtgg aaaaaactga acgcgccggt ttctgaagaa 60

gcgatcgaag gtgttgacaa atactggcgt gcggcgaact acctgtctat cggtcagatc 120

tacctgcgtt ctaacccgct gatgaaagaa ccgttcaccc gtgaagacgt taaacaccgt 180

ctggttggtc actggggtac caccccgggt ctgaacttcc tgatcggtca catcaaccgt 240

ctgatcgcgg accaccagca gaacaccgtt atcatcatgg gtccgggtca cggtggtccg 300

gcgggtaccg cgcagtctta cctggacggt acctacaccg aatacttccc gaacatcacc 360

aaagacgaag cgggtctgca gaaattcttc cgtcagttct cttacccggg tggtatcccg 420

tctcactacg cgccggaaac cccgggttct atccacgaag gtggtgaact gggttacgcg 480

ctgtctcacg cgtacggtgc ggttatgaac aacccgtctc tgttcgttcc ggcgatcgtt 540

ggtgacggtg aagcggaaac cggtccgctg gcgaccggtt ggcagtctaa caaactgatc 600

aacccgcgta ccgacggtat cgttctgccg atcctgcacc tgaacggtta caaaatcgcg 660

aacccgacca tcctgtctcg tatctctgac gaagaactgc acgagttctt ccacggtatg 720

ggttacgaac cgtacgagtt cgttgcgggt ttcgacaacg aagaccacct gtctatccac 780

cgtcgtttcg cggaactgtt cgaaaccgtt ttcgacgaaa tctgcgacat caaagcggcg 840

gcgcagaccg acgacatgac ccgtccgttc tacccgatga tcatcttccg taccccgaaa 900

ggttggacct gcccgaaatt catcgacggt aaaaaaaccg aaggttcttg gcgttctcac 960

caggttccgc tggcgtctgc gcgtgacacc gaagcgcact tcgaagttct gaaaaactgg 1020

ctggaatctt acaaaccgga agaactgttc gacgaaaacg gtgcggttaa accggaagtt 1080

accgcgttca tgccgaccgg tgaactgcgt atcggtgaaa acccgaacgc gaacggtggt 1140

cgtatccgtg aagaactgaa actgccgaaa ctggaagact acgaagttaa agaagttgcg 1200

gaatacggtc acggttgggg tcagctggaa gcgacccgtc gtctgggtgt ttacacccgt 1260

gacatcatca aaaacaaccc ggactctttc cgtatcttcg gtccggacga aaccgcgtct 1320

aaccgtctgc aggcggcgta cgacgttacc aacaaacagt gggacgcggg ttacctgtct 1380

gcgcaggttg acgaacacat ggcggttacc ggtcaggtta ccgaacagct gtctgaacac 1440

cagatggaag gtttcctgga aggttacctg ctgaccggtc gtcacggtat ctggtcttct 1500

tacgaatctt tcgttcacgt tatcgactct atgctgaacc agcacgcgaa atggctggaa 1560

gcgaccgttc gtgaaatccc gtggcgtaaa ccgatctctt ctatgaacct gctggtttct 1620

tctcacgttt ggcgtcagga ccacaacggt ttctctcacc aggacccggg tgttacctct 1680

gttctgctga acaaatgctt caacaacgac cacgttatcg gtatctactt cccggttgac 1740

tctaacatgc tgctggcggt tgcggaaaaa tgctacaaat ctaccaacaa aatcaacgcg 1800

atcatcgcgg gtaaacagcc ggcggcgacc tggctgaccc tggacgaagc gcgtgcggaa 1860

ctggaaaaag gtgcggcgga atggaaatgg gcgtctaacg ttaaatctaa cgacgaagcg 1920

cagatcgttc tggcggcgac cggtgacgtt ccgacccagg aaatcatggc ggcggcggac 1980

aaactggacg cgatgggtat caaattcaaa gttgttaacg ttgttgacct ggttaaactg 2040

cagtctgcga aagaaaacaa cgaagcgctg tctgacgaag agttcgcgga actgttcacc 2100

gaagacaaac cggttctgtt cgcgtaccac tcttacgcgc gtgacgttcg tggtctgatc 2160

tacgaccgtc cgaaccacga caacttcaac gttcacggtt acgaagaaca gggttctacc 2220

accaccccgt acgacatggt tcgtgttaac aacatcgacc gttacgaact gcaggcggaa 2280

gcgctgcgta tgatcgacgc ggacaaatac gcggacaaaa tcaacgaact ggaagcgttc 2340

cgtcaggaag cgttccagtt cgcggttgac aacggttacg accacccgga ctacaccgac 2400

tgggtttact ctggtgttaa caccaacaaa cagggtgcga tctctgcgac cgcggcgacc 2460

gcgggtgaca acgaatga 2478

<210> 5

<211> 252

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 60

tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 120

aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac 180

aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 240

aaacagacca tg 252

<210> 6

<211> 252

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc 60

tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat 120

aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac 180

aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ctcacacagg 240

aaacagacca tg 252

Claims

1.突变体蛋白，为如下(d1)、(d2)、(d3)或(d4)：

(d1)将磷酸转酮酶进行如下突变得到的蛋白质：对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；

(d2)将磷酸转酮酶进行如下两个突变得到的蛋白质：对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；

(d3)将磷酸转酮酶进行如下两个突变得到的蛋白质：对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T；

(d4)将磷酸转酮酶进行如下三个突变得到的蛋白质：对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T。

2.一种融合蛋白，为将权利要求1所述突变体蛋白与蛋白标签融合得到的蛋白质。

3.编码权利要求1中所述突变体蛋白的多核苷酸或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。

4.具有权利要求3所述多核苷酸的表达盒、重组载体、重组微生物或离体的重组细胞。

5.特定物质在制备代谢物中的应用；

所述特定物质为：权利要求1中所述的突变体蛋白，或，权利要求2中所述融合蛋白，或，权利要求3所述的多核苷酸，或，权利要求4所述表达盒，或，权利要求4所述重组载体，或，权利要求4所述重组微生物，或，权利要求4所述离体的重组细胞；

所述代谢物为源自乙酰辅酶A的代谢物。

6.一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：

将磷酸转酮酶进行如下突变：

对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y。

7.一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：

将磷酸转酮酶进行两个如下突变：

对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；

对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A。

8.一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：

将磷酸转酮酶进行如下两个突变：

对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；

对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T。

9.一种提高磷酸转酮酶酶活的方法，包括如下步骤：

将磷酸转酮酶进行如下三个突变：

对应于序列3的第260位氨基酸残基由H突变为Y；

对应于序列3的第2位氨基酸残基由T突变为A；

对应于序列3的第6位氨基酸残基由I突变为T。

10.一种制备代谢物的方法，包括如下步骤：通过培养权利要求4所述的重组微生物制备代谢物；所述代谢物为源自乙酰辅酶A的代谢物。