CN110951661B - 一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌其细胞内α‑酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。本发明所述高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌能使L‑谷氨酰胺在培养基或细胞中积累，很大程度提高L‑谷氨酰胺的产量。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L‑谷氨酰胺高产菌株，产生L‑谷氨酰胺的能力与未修饰菌株相比得到增强，能有效积累L‑谷氨酰胺，提高L‑谷氨酰胺的产量，且具有较高的转化率，为L‑谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，学名为2-氨基-5-羧基戊酰胺，分子式为C5H10N2O3，分子量为146。L-谷氨酰胺是人体内氮源代谢过程中不可缺少的条件性必需氨基酸，对保持肌肉新陈代谢、细胞分化和生长、组织创伤的修复、体内毒素的中和有着重要作用。
L-谷氨酰胺广泛存在于自然界，例如，以游离状态含于南瓜、向日葵的幼苗中。虽然可自天然产物提取谷氨酰胺，但L-Gln的生产方法主要有化学合成法、酶促合成法和发酵法。化学合成法是以L-Glu为原料，经过多步化学反应合成L-Gln。其中研究时间最长、技术条件最成熟的合成法主要有：L-Gln甲酯法(“手性源”合成法)和肼法。化学合成法的特点是使用化学试剂直接合成，方法直接且反应速度较快，但转化率不高且产品中反应物及副产物残留是限制产品质量和使用范围。酶促合成法生产L-Gln是以NH4+及谷氨酸作原料，经L-Gln合成酶(GS)催化而成。与化学合成法相比，酶促合成法反应步骤相对简单，其中三磷酸腺苷(ATP)是必需的。但ATP价格昂贵，同时酶促反应底物NH4+、副产品二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制L-Gln的生成，因此该生产方法不能满足大规模工业化生产的需要。
发酵法是目前最常用的L-Gln生产方法，以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)为生产菌发酵生产L-Gln。谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物弱降解能力的特性，作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产L-氨基酸、核苷酸及其他有机酸。发酵法具有原料来源广泛、生产成本低、产品质量可控、产物单一等优点。但目前L-Gln的菌种的发酵性能仍较差、L-Gln的转化率仍较低，仍不能满足大规模工业化生产的需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一种高产缬氨酸的棒杆菌及其构建方法与应用。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。
α-酮戊二酸脱氢酶复合体(ODHC)能够催化α-酮戊二酸向琥珀酰辅酶A的转化，是谷氨酸合成代谢的主要竞争途径。本发明对ODHC的Elo亚基的编码基因odhA进行失活改造可以使棒杆菌在细胞内积累大量谷氨酸。敲除yggB基因使谷氨酸外运蛋白(YggB)蛋白失活，使谷氨酸无法分泌到胞外从而使谷氨酸在胞内大量积累。谷氨酰胺合成酶(GS)是谷氨酰胺合成的关键基因，可以被腺苷酰化修饰。腺苷化修饰就是AMP以共价键方式与肽链上的酪氨酸残基结合产生GS(AMP)的过程，腺苷酰化会使GS的活性降低或丧失。本发明通过解除对GS的腺苷酰化修饰作用可以很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失，命名为MHZ-0512-1。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内谷氨酸外运蛋白活性丧失，命名为MHZ-0512-2。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失，且所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-3。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内谷氨酸外运蛋白活性丧失，且所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-4。
在本发明另一些实施方案中，本发明所述谷氨酸棒杆菌其细胞内编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失、编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失，且编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸。即所述谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和谷氨酸外运蛋白活性均丧失，同时所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除，命名为MHZ-0512-5。
进一步的，在一些实施例中，所述odhA基因片段缺失为odhA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。
在一些实施例中，所述yggB基因片段缺失为yggB基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列被敲除。
本发明所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌均可采用同源重组的方法进行基因改造获得。
本发明还提供了所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌的构建方法，制备odhA基因片段缺失重组载体、yggB基因片段缺失重组载体和glnAY405F点突变重组载体，将odhA基因片段缺失重组载体和/或yggB基因片段缺失重组载体以及glnAY405F点突变重组载体转化谷氨酸棒杆菌获得高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌。
本发明中，所述载体为pK18mobsacB载体。
本发明中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株。该菌株没有生产L-谷氨酰胺的能力，且没有对L-谷氨酰胺代谢流路相关基因进行定向修饰。
本发明中，所述制备odhA基因片段缺失重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增odhA碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组A1/A4进行overlap PCR扩增得到odhA基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒。
本发明中，所述制备yggB基因片段缺失重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增yggB碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组B1/B4进行overlap PCR扩增得到yggB基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔyggB重组质粒。
本发明中，所述制备glnAY405F点突变重组载体的方法具体为以C1/C2、C3/C4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增glnA基因点突变的上、下游片段，利用引物组C1/C4进行overlap PCR扩增得到glnA基因点突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-glnAY405F重组质粒。
其中，所述A1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述A2的序列如SEQ ID No.2所示；
所述A3的序列如SEQ ID No.3所示；
所述A4的序列如SEQ ID No.4所示；
所述B1的序列如SEQ ID No.5所示；
所述B2的序列如SEQ ID No.6所示；
所述B3的序列如SEQ ID No.7所示；
所述B4的序列如SEQ ID No.8所示；
所述C1的序列如SEQ ID No.9所示；
所述C2的序列如SEQ ID No.10所示；
所述C3的序列如SEQ ID No.11所示；
所述C4的序列如SEQ ID No.12所示。
本发明还提供了所述构建方法获得的谷氨酸棒杆菌。
利用本发明获得的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产，能够实现发酵过程中L-谷氨酰胺的有效积累，且具有较高的转化率。因此本发明还提供了所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-谷氨酰胺中的应用。
在一些实施方案中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌MHZ-0512-3、MHZ-0512-4和MHZ-0512-5。
进一步的，本发明还提供了一种L-谷氨酰胺的生产方法，将上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
在本发明中，所述种子培养基为葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O1.0 g/L，玉米浆30g/L，NaOH调pH7.0。
在本发明中，所述发酵培养基为葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440 g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO3 50g/L，NaOH调pH7.0。
进一步的，在本发明中，所述发酵培养接种量10％，培养温度33℃，培养时间48h。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本发明所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和/或谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除。本发明所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌能使L-谷氨酰胺在培养基或细胞中积累，很大程度提高L-谷氨酰胺的产量。另外本发明一些谷氨酸棒杆菌中同时具有GS蛋白质解除腺苷酰化修饰和α-KGDH蛋白、YggB蛋白质活性丧失，三者功能同时存在具有协同作用，能大幅度提高L-谷氨酰胺产量和转化率。实验表明本发明所述谷氨酸棒杆菌为L-谷氨酰胺高产菌株，产生L-谷氨酰胺的能力与未修饰菌株相比得到增强，能有效积累L-谷氨酰胺，提高L-谷氨酰胺的产量，且具有较高的转化率，为L-谷氨酰胺的工业化生产奠定了基础，具有广泛的工业应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组质粒pK18mobsacB-ΔodhA图谱；
图2示重组质粒pK18mobsacB-ΔyggB图谱；
图3示重组质粒pK18mobsacB-glnAY405F图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，本实验出发菌株为谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032。所述所述BHI液体培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液，所述BHI固体培养基配方为3.7％脑心浸粉溶液和1.8％琼脂粉。
实施例1：重组质粒pK18mobsacB-ΔodhA，pK18mobsacB-ΔyggB，pK18mobsacB-glnAY405F的构建
在NCBI GenBank数据库中获得谷氨酸棒杆菌ATCC13032 odhA基因的核苷酸序列，设计在特定位置(敲除该基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列)引入碱基缺失以使odhA基因失活，基于碱基序列及所选缺失位置合成了四条引物(如表1所示)。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以A1/A2，A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板制备odhA碱基缺失位点的上下游同源臂片段，其中odhA上游同源臂序列如SEQ ID NO.16所示，odhA下游同源臂序列如SEQ ID NO.17所示)。PCR程序为，98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸20s，循环30次后。所得两个片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后，利用引物组A1/A4进行overlap PCR扩增得到产物，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后利用BamHI/HindIII进行消化，同时将pK18mobsacB利用BamHI/HindIII进行消化，并用T4DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGenBiotech)，挑取卡那抗性克隆，BamHI/HindIII酶切鉴定得到overlap PCR片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，提取质粒，用T1/T2扩增片段，通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段确实为ΔodhA基因待缺失位点的上下游同源臂片段，即为pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒。
pK18mobsacB-ΔyggB质粒构建与上述类似，同样敲除yggB基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列，所用引物为B1/B2，B3/B4扩增yggB缺失基因的上下游同源臂片段，其中yggB上游同源臂序列如SEQ ID NO.18所示，yggB下游同源臂序列如SEQ ID NO.19所示。
pK18mobsacB-glnAY405F质粒构建与上述类似，突变将glnA基因ORF区1214位碱基A突变成T，所用引物为C1/C2，C3/C4扩增glnAY405F基因的上下游同源臂片段，酶切位点为SalI/HindIII。其中特异性的点突变鉴定引物序列如SEQ ID NO.13所示，glnAY405F上游同源臂序列如SEQ ID NO.20所示，glnAY405F下游同源臂序列如SEQ ID NO.21所示。
表1引物序列
引物 核苷酸序列 SEQ ID NO.
A1 gaggatccccatcgccgccatccctgat 1
A2 ggcaggtactcgcctcttttccttgcttct 2
A3 agaagcaaggaaaagaggcgagtacctgccggtgaaggcagtcatggctc 3
A4 cacaagcttacacagcaccctggatcacg 4
B1 gaggatccggcggatcgaccacggcttg 5
B2 gagccaagattagcgctgaaaagtagcggg 6
B3 cccgctacttttcagcgctaatcttggctcgatcatccccaactccacgg 7
B4 cacaagctttcgccgcagcctccggcttcggttc 8
C1 tctgtcgacatcatcaagaacaccgctcgcctcc 9
C2 gcagcttcctctggtggtagttcgaagaggtccttgtccactggagcgt 10
C3 tcgaactaccaccagaggaagctgc 11
C4 cacaagcttggtctgggagacattcaccctggaa 12
C5 cagtggacaaggacctcttg 13
pK18T1 ctcgtatgttgtgtggaattgtg 14
PK18T2 aggctgcgcaactgttgggaagg 15
实施例2：从谷氨酸棒杆菌种ATCC 13032菌株构建odhA基因破坏的菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种ATCC13032至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5ml BHI液体培养基试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100ml BHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TGBuffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-ΔodhA重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养液，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L卡那霉素的BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有15mg/L的卡那霉素的BHI固体选择培养基上选择单交换转化体，其中带有odhA碱基缺失的序列通过与内源odhA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以A1/T2，T1/A4引物对进行菌落PCR鉴定具体卡那霉素抗性克隆，PCR参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI液体培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选对卡那霉素敏感的重组子利用A1/A4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到odhA碱基缺失的菌株，命名为MHZ-0512-1。
实施例3：从ATCC 13032菌株构建yggB基因破坏的菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种ATCC13032至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5ml BHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100ml BHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TG Buffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-ΔyggB重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养基，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L的卡那霉素抗性BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择单交换转化体，其中带有yggB碱基缺失的序列通过与内源odhA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast TaqDNA聚合酶(TransGen Biotech)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定具有卡那霉素抗性的克隆，PCR参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选对卡那霉素敏感的重组子利用B1/B4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到yggB碱基缺失的菌株，命名为MHZ-0512-2。
实施例4：从MHZ-0512-1菌株构建glnAY405F突变型菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种MHZ-0512-1至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5mlBHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100mlBHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TG Buffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml 10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-glnAY405F重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养基，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L的卡那霉素BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有15mg/L的卡那霉素的BHI固体选择培养基上选择单交换转化体，其中带有glnAY405F突变型序列通过与内源glnA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以C1/T2，T1/C4引物对进行菌落PCR鉴定有卡那霉素抗性的单克隆，PCR参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选卡那霉素敏感的重组子利用C5/C4引物对扩增目的片段，PCR参数为：94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，能够扩增出的为阳性克隆的目的菌株，将阳性克隆进行测序验证，得到glnAY405F突变型菌株，命名为MHZ-0512-3。
实施例5：从MHZ-0512-2菌株构建glnAY405F突变型菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种MHZ-0512-2至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5ml BHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100ml BHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TG Buffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml 10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-glnAY405F重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养基，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L的卡那霉素BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有15mg/L的卡那霉素的BHI固体选择培养基上选择单交换转化体，其中带有glnAY405F突变型序列通过与内源glnA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以C1/T2，T1/C4引物对进行菌落PCR鉴定有卡那霉素抗性的单克隆，PCR参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选卡那霉素敏感的重组子利用C5/C4引物对扩增目的片段，PCR参数为：94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，能够扩增出的为阳性克隆的目的菌株，将阳性克隆进行测序验证，得到glnAY405F突变型菌株，命名为MHZ-0512-4。
实施例6：从MHZ-0512-3菌株构建ΔyggB突变型菌株
谷氨酸棒杆菌感受态的制备：从-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种MHZ-0512-3至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5mlBHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100mlBHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD 600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TG Buffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml 10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。
电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-ΔyggB重组质粒DNA入溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI液体培养基，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6min，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L的卡那霉素抗性BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养24h。
在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择单交换转化体，其中带有yggB碱基缺失的序列通过与内源odhA基因同源重组连同重组载体整合到基因组中。利用Fast TaqDNA聚合酶(TransGen Biotech)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定具有卡那霉素抗性的克隆，PCR参数为：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 40s，共26个循环，两个引物对均扩增出目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养24h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选对卡那霉素敏感的重组子利用B1/B4引物对扩增目的片段，阳性克隆的目的片段较野生型所扩增的片段小，将阳性克隆进行测序验证，得到yggB碱基缺失的菌株，命名为MHZ-0512-5。
实施例7：L-谷氨酰胺基因工程菌发酵生产L-谷氨酰胺
将实施例2、实施例3和实施例4和实施例5和实施例6所构建基因工程菌株MHZ-0512-1、MHZ-0512-2和MHZ-0512-3和MHZ-0512-4和MHZ-0512-5以及对照菌株接种于200ml三角瓶进行种子培养，装液量50ml/瓶。于500ml三角摇瓶中进行发酵培养，装液量20ml/瓶。接种量10％，培养温度33℃，培养时间48h。每组实验设置三个平行，最终结果取三组实验的平均值。
所述种子培养基成分如下：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0 g/L，玉米浆30g/L，NaOH调pH7.0。
所述发酵培养基组分如下：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440 g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆10g/L，CaCO350g/L，NaOH调pH7.0。各基因工程菌株发酵产L-谷氨酰胺结果见表2。
表2：各基因工程菌株发酵产L-谷氨酰胺结果
菌株 OD562(×100) L-Gln(g/L) L-Gln转化率(％) L-Glu(g/L)
ATCC 13032 0.65 0.1 0.11 3.6
MHZ-0512-1 0.35 0.2 0.22 8.4
MHZ-0512-2 0.63 0.2 0.22 0.1
MHZ-0512-3 0.52 25.6 28.44 2.5
MHZ-0512-4 0.49 20.1 22.33 0.2
MHZ-0512-5 0.45 30.3 33.67 0.1
由表2可知，敲除odhA基因(菌株MHZ-0512-1)L-谷氨酸的产量和对照组(菌株ATCC13032)相比有所提高，显著差异(P＜0.05)，说明敲除odhA基因破坏ODHC蛋白对L-谷氨酸的合成有促进作用，ATCC 13032菌株敲除yggB基因(菌株MHZ-0512-2)使谷氨酸不能通过YggB蛋白运输，从而L-谷氨酸产量减少。
菌株MHZ-0512-1解除glnA基因的腺苷酰化修饰后菌株(菌株MHZ-0512-3)使L-谷氨酸合成L-谷氨酰胺的产量增加，为25.6g/L，差异显著(P＜0.05)，并且谷氨酸产量大幅度减少，减少量为5.9g/L，差异显著(P＜0.05)。同时敲除odhA基因和解除glnA基因的腺苷酰化修饰的组合具有协同作用，相比对照菌株能够提高L-谷氨酰胺的产量。
菌株MHZ-0512-2解除glnA基因的腺苷酰化修饰后菌株(菌株MHZ-0512-4)使L-谷氨酸合成L-谷氨酰胺的产量增加，为20.1g/L，差异显著(P＜0.05)，由于敲除了YggB蛋白使减少了谷氨酸产量，为0.2g/L，差异显著(P＜0.05)。同时敲除yggB基因和解除glnA基因的腺苷酰化修饰的组合具有协同作用，相比对照菌株能够提高L-谷氨酰胺的产量。
最后同时敲除odhA基因，敲除yggB基因和解除glnA基因的腺苷酰化修饰菌株MHZ-0512-5，谷氨酰胺含量大幅上升，为30.3g/L，并且副产物谷氨酸的含量大幅降低，这样的组合具有协同作用，相比对照菌株能够提高L-谷氨酰胺的产量。
综上所述，本发明所构建的L-谷氨酰胺基因工程菌能够实现发酵过程中L-谷氨酰胺的有效积累，且具有较高的转化率，该菌株具有广泛的工业应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 新疆梅花氨基酸有限责任公司
<120> 一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
<130> MP1721860
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
gaggatcccc atcgccgcca tccctgat 28
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
ggcaggtact cgcctctttt ccttgcttct 30
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
agaagcaagg aaaagaggcg agtacctgcc ggtgaaggca gtcatggctc 50
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
cacaagctta cacagcaccc tggatcacg 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 5
gaggatccgg cggatcgacc acggcttg 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 6
gagccaagat tagcgctgaa aagtagcggg 30
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 7
cccgctactt ttcagcgcta atcttggctc gatcatcccc aactccacgg 50
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 8
cacaagcttt cgccgcagcc tccggcttcg gttc 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 9
tctgtcgaca tcatcaagaa caccgctcgc ctcc 34
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 10
gcagcttcct ctggtggtag ttcgaagagg tccttgtcca ctggagcgt 49
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 11
tcgaactacc accagaggaa gctgc 25
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 12
cacaagcttg gtctgggaga cattcaccct ggaa 34
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 13
cagtggacaa ggacctcttg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 14
ctcgtatgtt gtgtggaatt gtg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 15
aggctgcgca actgttggga agg 23
<210> 16
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 16
cttaaacgcc atcgccgcca tccctgatgg tttcaaccat caagtcggtg aacgcgggcg 60
caacctgtca tccggacagc gccaactgat cgcgctggcg cgcgccgaac ttatcgagcc 120
ttccatcatg cttctcgacg aagccacctc caccctcgac cccgccaccg aagccgttat 180
cctcaacgcc tccgatcgag tcactaaggg acgcaccagc atcatcgtcg cgcaccgctt 240
ggcaaccgct aaaagggccg accgtattct tgttgttgaa caaggacgta tcattgagga 300
cggatctcac gacgcgttgt tgtctgctaa cggcacctac gcccgcatgt ggcatttaat 360
ggcctgacac gttattttta ggagaactgt caacaaatta atgctacaac tggggcttag 420
gcataatcag ccaacgacca acgttacagt ggataaaaca aagctcaata aaccctcaag 480
aagcaaggaa aagaggcgag tacctgcc 508
<210> 17
<211> 509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 17
agaagcaagg aaaagaggcg agtacctgcc ggtgaaggca gtcatggctc acccggacat 60
gaacaactcc tacgacgtca tcgacggcaa gccaaccctg atcgtgcctg agcacatcaa 120
cctgggcctt gctatcgacc ttcctcagaa ggacggctcc cgcgcacttg tcgtagcagc 180
catcaaggaa accgagaaga tgaacttctc cgagttcctc gcagcctacg aagacatcgt 240
ggcacgctcc cgcaagggca agctcaccat ggatgactac cagggcgtta ccgtttcctt 300
gaccaaccca ggtggcatcg gtacccgcca ctctgttcca cgtctaacca agggccaggg 360
caccatcatc ggtgtcggtt ccatggatta cccagcagag ttccagggcg cttcagaaga 420
ccgccttgca gagctcggcg ttggcaaact tgtcaccatc acctccacct acgatcaccg 480
cgtgatccag ggtgctgtgt ccggtgaat 509
<210> 18
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 18
ggcggatcga ccacggcttg caaccgtggc gggagtgggc tgttgagaag ctgccacatt 60
cacgactttc tggctccttt actaaataag gattttcaca ggacccgtcc aagccaagcc 120
gatttcaact cagcctaaag acaaagccct catttaaaat tgttccgacg cggatgcgtg 180
tgcacgcagt gcgacagatg tctgttgcaa agttggctac ttgggtcata accaacaaga 240
aagccctcgt tccaacactg tggtgagtgt tgtcgagggc gcttgacgag acgacttgga 300
aggccgttac ggcaggcgcc gcgcggttac tactacaagt cgaataatgg tcatggtgtg 360
tcatgctaca cacatcgagt ttccaattcc acaacgcacg aaaattccca cccccaaaac 420
tcccccactt cggttaagga atcaggattc tcacaaagtt caggcaggct cccgctactt 480
ttcagcgcta atcttggctc 500
<210> 19
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 19
cccgctactt ttcagcgcta atcttggctc gatcatcccc aactccacgg cgaaagtgtg 60
catcaacaat tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg 120
ttctgaaaac atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg 180
ccaggagaaa atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt 240
cacgccgcca acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt 300
caccgccggc aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcagcgaatt 360
ctgggaagaa tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt 420
tgagcatgaa gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc 480
gaagccggag gctgcggcga 500
<210> 20
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 20
atcatcaaga acaccgctcg cctccacggc aaggctgcaa ccttcatgcc taagccactg 60
gctggcgaca acggttccgg catgcacgct caccagtccc tctggaagga cggcaagcca 120
ctcttccacg atgagtccgg ctacgcaggc ctgtccgaca tcgcccgcta ctacatcggc 180
ggcatcctgc accacgcagg cgctgttctg gcgttcacca acgcaaccct gaactcctac 240
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cgcgctccag acccatcagg caacccatac ctgggctttg cagcgatgat gatggccggc 420
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<211> 499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 21
tcgaactacc accagaggaa gctgcatcca ttccacaggc accaacctcc ctggaagcat 60
ccctgaaggc actgcaggaa gacaccgact tcctcaccga gtctgacgtc ttcaccgagg 120
atctcatcga ggcgtacatc cagtacaagt acgacaacga gatctcccca gttcgcctgc 180
gcccaacccc gcaggaattc gaattgtact tcgactgcta attcacttag ctagccgata 240
gcggaaaccc cctgaaattc ttcattgaat ttcagggggt ttctttttta cattccacct 300
aaaaggaaag cgccggatcc tccatcatgg tggatccggc gcttttattt attagttttt 360
gggctagatg ccgatcagtt cagatgcaac tacatcggac agtgagacgg ttccgtgtgg 420
ttcgccacgg aacaggagaa ggtgatcagc gttgataatt acttccaact ggcgttccag 480
ggtgaatgtc tcccagacc 499

Claims (7)

1.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌，其特征在于，其细胞内α-酮戊二酸脱氢酶和谷氨酸外运蛋白活性丧失，并且谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除;
所述α-酮戊二酸脱氢酶活性丧失为编码突变α-KGDH蛋白质的Elo亚基的odhA基因片段缺失；所述谷氨酸外运蛋白活性丧失为编码突变YggB蛋白的yggB基因片段缺失；所述谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化修饰解除为编码GS蛋白质的glnA基因ORF区405位酪氨酸突变为苯丙氨酸；
所述odhA基因片段缺失为odhA基因ORF序列1位-500位500 bp核苷酸序列被敲除；所述yggB基因片段缺失为yggB基因ORF序列1位-500位500 bp核苷酸序列被敲除；
所述谷氨酸棒杆菌为ATCC 13032菌株。
2.权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，制备odhA基因片段缺失重组载体、yggB基因片段缺失重组载体和glnA Y405F点突变重组载体，将odhA基因片段缺失重组载体和yggB基因片段缺失重组载体以及glnA Y405F点突变重组载体转化谷氨酸棒杆菌获得高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌；
所述谷氨酸棒杆菌为ATCC 13032菌株；所述载体为pK18mobsacB。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述制备odhA基因片段缺失重组载体的方法具体为以A1/A2、A3/A4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增odhA碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组A1/A4进行overlap PCR扩增得到odhA基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔodhA重组质粒；
所述制备yggB基因片段缺失重组载体的方法具体为以B1/B2、B3/B4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增yggB碱基缺失位点的上、下游片段，利用引物组B1/B4进行overlap PCR扩增得到yggB基因片段缺失产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-ΔyggB重组质粒；
所述制备glnA Y405F点突变重组载体的方法具体为以C1/C2、C3/C4作为引物，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组DNA作为模板扩增glnA基因点突变的上、下游片段，利用引物组C1/C4进行overlap PCR扩增得到glnA基因点突变产物，与pK18mobsacB载体连接得到pK18mobsacB-glnAY405F重组质粒；
所述A1的序列如SEQ ID No.1所示；
所述A2的序列如SEQ ID No.2所示；
所述A3的序列如SEQ ID No.3所示；
所述A4的序列如SEQ ID No.4所示；
所述B1的序列如SEQ ID No.5所示；
所述B2的序列如SEQ ID No.6所示；
所述B3的序列如SEQ ID No.7所示；
所述B4的序列如SEQ ID No.8所示；
所述C1的序列如SEQ ID No.9所示；
所述C2的序列如SEQ ID No.10所示；
所述C3的序列如SEQ ID No.11所示；
所述C4的序列如SEQ ID No.12所示。
4.权利要求2或3所述构建方法获得的谷氨酸棒杆菌。
5.权利要求1或4所述谷氨酸棒杆菌在发酵生产L-谷氨酰胺中的应用。
6.一种L-谷氨酰胺的生产方法，其特征在于，权利要求1或4任一项所述谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基进行种子培养，然后将种子培养物转入发酵培养基发酵培养。
7.根据权利要求6所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基为葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O1.0 g/L，玉米浆 30g/L，NaOH 调pH7.0；所述发酵培养基为葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440 g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米浆 10g/L，CaCO350g/L，NaOH 调pH7.0；所述发酵培养接种量10%，培养温度33℃，培养时间48 h。
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