BRPI0305314B1

BRPI0305314B1 - bactéria corineforme geneticamente modificada, e, método para produzir l-glutamina

Info

Publication number: BRPI0305314B1
Application number: BRPI0305314A
Authority: BR
Inventors: Jun Nakamura; Kayo Akiyama
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2002-11-26
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2016-05-24
Also published as: CN101050466B; EP1424397B1; BR0305314A; CN1316011C; US7943364B2; EP1424397A1; DE60335774D1; CN101050466A; CN1502689A; US20040152175A1

Abstract

"bactéria corineforme, método para produzir lglutamina, e, gene da glutamina sintetase derivado de uma bactéria corineforme". a l-glutamina é produzida cultivando-se uma bactéria corineforme tendo capacidade de produzir l-glutamina e modificada a fim de que a atividade de glutaminase intracelular seja reduzida e, preferivelmente, também modificada, a fim de que a atividade da glutamina sintetase intracelular seja aumentada. o método de produção inclui cultivar a bactéria em um meio, seguido por acúmulo da l-glutamina no meio, e coletar a lglutamina do meio.

Description

'BACTÉRIA COR1NEEORME GENETICAMENTE MODIFICADA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-GLUTAMINA” FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se a urna bactéria produtora de L-glutamina, pertencente às bactérias corineformes, e que é útil para a produção de L-glutamina, A presente invenção também refere-se a um método para produzir L-glutamina. A L-glutamina é um aminoácido industrialmente útil como um ingrediente de condimentos, agentes promotores da função do fígado, infusões de aminoáeidos, farmacêuticos aminoãcidos compreensivos e assim por diante.

Breve Descrição da Técnica Relacionada Várias técnicas para aumentar a produção do aminoãcido-L, empregando-se técnicas de DNA recombinante, foram descritas. Por exemplo, técnicas para aumentar as atividades das enzimas envolvidas na biossíntese do L-aminoãcido ou técnicas para reduzir as atividades das enzimas envolvidas na degradação dos L-aminoácidos e assim por diante são conhecidas. Um método para produzir L-glutamina, empregando-se uma bactéria corineforme tendo aumentada atividade de glutamina sintetase, foi descrito (Publ. de Pedido de Pat. US No. 2003/0003550). Além disso, genes codificando a glutamina sintetase (Acesso ao Genbank No. Y13221) e glutamina 2-oxoglutarato amínotransfcrase (Acesso do Genbank No. AB024708) foram informados e são sabidos estarem envolvidos na biossíntese da glutamina e na degradação das bactérias corine formes, Além dos genes supracitados, foi sugerida a existência de uma enzima envolvida na degradação da L-glutamina de bactérias corineformes (Aminoáeidos, 7:73-77 (1963)). Entretanto, esta enzima é inibida pelos íons amôniü e baixo pH e, assim, somente funciona na fermentação da glutamina na presença dos íons amônio requeridos. A glutaminase (glutamina amidoidrolase) é conhecida como uma enzima que degrada a L-glutamina por hidrólise. Os genes codificando a glutaminase foram informados para as bactérias Pseudomonas (FEMS Microbiol. Lett., 178 (2), 327-335 (1999)), Aspergíllus oryzae (Appl. Microbiol. Biotechnol., 54, 59-68 (2000), EP 1 077 256 Al), Thizobium otli (Biochim. Biophys. Acta, 1444 (3): 451-6, 1999), rato (J. Biol. Chem., 266.(28), 18792 - 18796 (1991)), entre outros. Além disso, foi informada a existência de atividade da glutaminase em Escherichia coli (J. Biol. Chem., 243 (5) 853 — 878 (1968)). Entretanto, um gene da glutaminase, derivado das bactérias corineformes, não foi identificado e qualquer efeito que a mutação de tal gene terá sobre a produção de glutamina não é conhecido. É conhecido um método para aumentar a expressão genética, modificando-se uma seqüência promotóra do desejado gene (Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 2000-818935). Além disso, um é conhecido um gene codificando a glutamina sintetase (a seguir “glnA ”) das bactérias corineformes (FEMS Microbiology Letters, 154, 81-88, 1997). Ademais, foi identificado o sítio de iniciação de transcrição do gene, incluindo a região promotora (FEMS Microbiology Letters, 205, 361-367, 2001). Entretanto, o aumento da expressão do gene da glutamina sintetase, modificando-se uma seqüência promotora, não foi anteriormente descrito. Métodos de melhorar os microorganismos por reprodução têm sido freqüentemente usados na produção da fermentação dos L-aminoácidos. Isto é, uma vez que a produção dos L-aminoácidos produzidos de microorganismos tipo selvagem é com frequência extremamente baixa, são conhecidos métodos de conceder resistência auxotrófica ou análoga por mutação ou conceder mutações projetadas para melhorar a regulação metabólica, ou uma combinação destas. Embora a L-glutamina possa ser obtida por estes métodos conhecidos, há claramente uma necessidade na arte de melhorar as produções de fermentação, a fim de que a produção de L-glutamina possa ser realizada eficientemente e a baixo custo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores da presente invenção estudaram assiduamente a fim de conseguir a presente invenção. A presente invenção descreve um novo gene presente em bactérias corineformes, bem como métodos para produção melhorada de L-glutamina, usando-se técnicas recombinantes. Inicialmente, um gene foi identificado codificando a glutaminase e ao mesmo tempo foi descoberto que a capacidade de produzir a L-glutamina era muito superior em uma cepa com reduzida atividade de glutaminase do que em uma cepa onde a atividade de glutaminase era similar àquela de uma cepa tipo selvagem. Além disso, descobriu-se que a capacidade de produzir L-glutamina podería ser mais melhorada reduzindo-se a atividade de glutaminase, enquanto simultaneamente aumentando a atividade da glutamina sintetase.

Um objetivo da presente invenção é melhorar a capacidade de produzir L-glutamina de uma bactéria corineforme, reduzindo-se a capacidade de degradação de L-glutamina da bactéria corineforme e, desse modo, prover um método para produzir a L-glutamina utilizando-se uma cepa bacteriana tendo tal característica. r E um outro objetivo da presente invenção prover uma bactéria corineforme tendo capacidade de produção de L-glutamina e modificada a fim de que a atividade de glutaminase intracelular seja reduzida. r E mais um objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, em que a atividade de glutaminase intracelular é reduzida rompendo-se um gene de glutaminase em um cromossomo. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, em que a atividade da glutaminase é 0,1 U/mg de proteína celular ou menos. É mesmo um outro objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, em que a atividade de glutaminase é similar a ou menor do que a atividade da glutamina sintetase, quando medida como atividade por unidade de peso de proteínas celulares. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, que é mais modificada a fim de que a atividade da glutamina sintetase intracelular seja aumentada. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada aumentando-se a expressão de um gene da glutamina sintetase. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover a bactéria citada acima, em que o aumento da expressão de um gene da glutamina sintetase é conseguido aumentando-se o número de cópias do gene codificando a glutamina sintetase, ou modificando-se uma seqüência reguladora de expressão do gene codificando a glutamina sintetase, a fim de que a expressão do gene na bactéria seja aumentada. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover um método para produzir L-glutamina, compreendendo as etapas de cultivar uma bactéria, como citado acima, em um meio para produzir L-glutamina no meio e coletar a L-glutamina do meio. r E mesmo mais um objetivo da presente invenção prover um gene da glutamina sintetase de uma bactéria corineforme, em que a seqüência da região -35 do gene é substituída por TTGCCA e a seqüência da região -10 do gene é substituída por TATAAT.

De acordo com a presente invenção, a capacidade de produzir L-glutamina de bactérias corineformes pode ser melhorada, resultando em maiores produções de L-glutamina e a baixo custo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra o esquema para construção do plasmídeo pHMKGLS5, contendo um gene da glutaminase. A Fig. 2 mostra o esquema para construção do plasmídeo pNEL, não contendo qualquer região autonomamente replicável em bactérias corineformes. A Fig. 3 mostra o esquema para construção do plasmídeo pNELAgls para rompimento de gls. A Fig. 4 mostra o esquema para construção do plasmídeo pNELglnA14 tendo um gene GS com aumentada expressão. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS VERSÕES PREFERIDAS Bactéria corineforme da presente invenção Na presente invenção, as bactérias corineformes incluem mas não são limitadas àquelas bactérias classificadas no gênero Brevibacterium, bem como àquelas classificadas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), que são estreitamente relacionadas.

Exemplos de tais bactérias corineformes incluem mas não são limitados a Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium album, Brevibacterium cerium e Microbacterium ammoniaphilum.

Especificamente, as seguintes cepas são abrangidas: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539), Corynebacterium herculis ATCC 13868, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205), Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872, Brevibacterium album ATCC 15111, Brevibacterium cerium ATCC 15112 e Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.

Estas cepas podem ser obtidas de, por exemplo, da American Type Culture Collection. Cada cepa recebe seu número de acesso e pode-se solicitar uma cepa desejada por seu número de acesso. O número de acesso para cada cepa é indicado no catálogo da American Type Culture Collection. A cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente uma corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japão, código postal: 305-5466)) como um depósito internacional sob as cláusulas do Budapest Treaty, recebendo um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada em 5 de janeiro de 1989 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade e Industry, como um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty, recebendo um número de acesso de FERM BP-2205.

Na presente invenção, “capacidade de produzir L-glutamina” significa uma capacidade da bactéria corineforme da presente invenção acumular L-glutamina em um meio em que a bactéria é cultivada. Esta capacidade de produzir L-glutamina pode ser uma propriedade de uma cepa tipo selvagem de bactérias corineformes ou pode ser uma propriedade dada ou aumentada pela criação. O método de conceder resistência à 6-diazo-5-oxo-norleucina (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497), o método de conceder resistência análoga e/ou resistência de sulfóxido de metionina à purina (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694), o método de conceder resistência ao ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495), o método de conceder resistência a um ácido glutâmico contendo peptídeo (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994) e assim em diante, podem ser usados para conceder ou aumentar a capacidade de produzir L-glutamina por criação. Exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-glutamina incluem mas não são limitados a: Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495);

Brevibacterium flavum AJ12210 (FERM P-8123, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694);

Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694);

Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM-BP2205, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994);

Brevibacterium flavum DH18 (FERMP-11116, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497);

Corynebacterium melassecola DH344 (FERM P-11117, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497);

Corynebacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495).

Além disso, a bactéria corineforme da presente invenção pode ser modificada a fim de que a atividade de glutaminase intracelular seja reduzida. A “atividade de glutaminase” (a seguir “atividade GLS”) significa uma atividade enzimática de converter L-glutamina em ácido L-glutâmico. A atividade GLS pode ser medida, por exemplo, pelo seguinte método, entre outros conhecidos na arte.

Uma solução enzimática bruta de bactéria corineforme é adicionada a uma solução contendo 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 75 mM L-glutamina e uma reação é permitida a 30°C por 30 minutos ou 60 minutos. Em seguida, SDS é adicionado à mistura de reação em uma concentração final de 0,5% para terminar a reação e o ácido L-glutâmico resultante é quantificado. Na presente invenção, a atividade de glutaminase, produzindo 1 pmol de ácido glutâmico por minuto no sistema de reação supracitado, é definida como 1 U. A quantidade de proteína na solução enzimática bruta pode ser medida por um método conhecido, por exemplo, usando-se Ensaio de Proteína (Bio-Rad) com uma albumina de soro bovino padrão. A seguir, a atividade GLS por 1 mg de proteína é indicada com a unidade “U/mg”. A solução enzimática bruta supracitada pode ser preparada, por exemplo, como segue. Primeiro, para preparar as células, 20 ml de um meio contendo 30 g de glicose, 1,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 100 pg de VB2. HC1, 3 pg de biotina, 200 mg de hidrolisados de soja, 1,5 g de uréia e 0,02 ml de agente anti-espuma GD-113 em 1 1 de água pura (ajustada a pH 6,8 com NaOH) são introduzidos dentro de um frasco Sakaguchi de 500 ml. Após a esterilização do meio por autoclave a 115°C por 10 minutos, as células da cepa são inoculadas dentro do meio e cultivadas a 31,5°C com agitação a 115 rpm. A cultura é terminada antes do açúcar ser completamente consumido e o caldo de cultura é instantaneamente resfriado. As células são separadas do caldo de cultura por centrifugação com refrigeração, lavadas com 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) e rompida por sonicação. As células não rompidas são removidas por centrifugação a 15000 g por 15 minutos, para preparar uma solução enzimática bruta. A solução enzimática bruta é colocada sobre gelo até uso.

De acordo com o método supracitado, as atividades GLS das bactérias produtoras de L-glutamina conhecidas foram medidas e os resultados são mostrados na Tabela 8. A expressão “modificada a fim de que a atividade de glutaminase intracelular seja reduzida” significa que a bactéria foi modificada a fim de que a atividade GLS por célula tome-se mais baixa do que aquela de uma cepa tipo selvagem ou não modificada de bactéria corineforme. Os exemplos incluem quando o número de moléculas GLS (glutaminase) por célula diminui ou quando a atividade GLS por molécula GLS diminui e assim em diante. A “redução” também inclui completo desaparecimento da atividade. Uma cepa ou cepa não modificada de bactéria corineforme pode ser comparada a, por exemplo, a Brevibacterium flavum ATCC 14067. Como resultado da redução da atividade GLS, a quantidade de acúmulo de L-glutamina em um meio aumenta e o ácido L-glutâmico subproduto de um meio diminui. f E suficiente que a bactéria corineforme da presente invenção tenha atividade GLS reduzida, em comparação com uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Preferivelmente, a atividade GLS, como medida no sistema de medição supracitado, pode ser reduzida a um nível de 0,1 U/mg ou menor, preferivelmente 0,02 U/mg ou menor, mais preferivelmente 0,01 U/mg ou menor, mais preferivelmente 0,01 U/mg ou menor. Entretanto, a presente invenção não é limitada à atividade de 0,01 U/mg ou menor.

Embora o gene codificando a GLS das bactérias corineformes não tenha sido anteriormente identificado, a presente invenção abrange um gene que foi isolado pelos inventores da Brevibacterium flavum. Eles procuravam por genes de Corynebacterium glutamicum para homólogo ao gene GLS conhecido da Rhizobium bacterium (Biochim Biophys Acta, 1444 (3): 451-6, 19 de março de 1999), usando sequência genômica publicada de Corynebacterium glutamicum, e encontraram um gene que foi estimado para GLS. Baseado na seqüência do gene GLS putativo de Corynebacterium glutamicum, eles isolaram o gene GLS da Brevibacterium flavum e que é homólogo ao gene de uma Rhizobium bacterium (Biochim Biophys Acta, 1444(3): 451-6, 19 de março de 1999). O gene gls pode ser obtido por PCR (vide White, T. J. e outros, Trends Genet., 5, 185 (1989)), empregando-se iniciadores baseados naquela seqüência de nucleotídeo, por exemplo, os iniciadores mostrados na SEQ ID NOS: 5 e 6 e o DNA cromossomal da bactéria corineforme, como um padrão. Os genes codificando GLS de outros microorganismos podem também ser similarmente obtidos. O gene gls da cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067, obtida como descrito acima, é mostrado na SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido codificada por ele é mostrada na SEQ ID NO: 2. O DNA cromossomal pode ser preparado de uma bactéria servindo como um doador de DNA, por exemplo, pelo método de Saito e Miura (vide H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, págs. 97-98, Baifukan, 1992) e similares.

Os métodos para reduzir a atividade GLS das bactérias corineformes incluem mas não são limitados a, por exemplo, tratar as bactérias por irradiação ultravioleta, ou com um agente mutagenizante, seguido por seleção da cepa mutante resultante. Os agentes mutagenizantes, que são úteis na presente invenção, incluem N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso. Métodos que não tratamentos de mutagênese, para obter uma bactéria corineforme tendo reduzida atividade GLS, incluem rompimento de gene. Isto é, uma bactéria corineforme é transformada com um DNA contendo um gene gls, por meio do que uma seqüência parcial do gene gls é deletada a fim de romper a função GLS (gene gls tipo-deleção), e a subseqüente recombinação entre o gene gls tipo-deleção e o gene gls do cromossomo rompe o gene gls do cromossomo. Tal rompimento do gene, pela substituição de gene via recombinação homóloga, é conhecido, bem como os métodos de utilizar o DNA linear, métodos de utilizar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura e assim por diante. A atenuação da atividade GLS pode também ser realizada substituindo-se uma seqüência reguladora de expressão, tal como o promotor do gene gls, por uma mais fraca (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-818935). Os métodos de mutagênese e os métodos de rompimento de gene podem ser usados em combinação.

Um gene gls de um cromossomo hospedeiro pode ser substituído pelo gene gls tipo deleção, por exemplo, da seguinte maneira. Um DNA recombinante é preparado inserindo-se uma origem de replicação sensível a temperatura, o gene gls tipo deleção e um gene marcador para resistência a uma droga, tal como cloranfenicol, e usado para transformar uma bactéria corineforme. Em seguida, o transformante resultante é cultivado no meio contendo a droga, a fim de que a origem de replicação sensível a temperatura não funcione e, como resultado, um transformante é obtido, em que o DNA recombinante foi incorporado dentro do DNA cromossomal.

Para introduzir o DNA recombinante, preparado como descrito acima, dentro de uma bactéria corineforme, qualquer método de transformação conhecido pode ser empregado. Por exemplo, tais métodos incluem tratar células recipientes com cloreto de cálcio, a fim de aumentar a permeabilidade das células para DNA, que foi informada para Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), e preparar células competentes de células que estão na fase de crescimento, seguido por introdução do DNA dentro delas, o que foi informado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Além disso, um método para produzir células recipientes-DNA, dentro de protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver o DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante dentro das células aceitadoras-DNA, que é sabido ser aplicável a Bacillus substilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Sard, J. M. e Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Sei., USA, 75, 1929 (1978)), pode também ser empregado. A transformação das bactérias corineformes pode também ser realizada pelo método de pulso elétrico (Sugimoto e outros, Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-207791).

Exemplos do plasmídeo sensível a temperatura para bactérias corineformes incluem mas não são limitados a p48K e pSFKT2 (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-262288 para estes), pHSC4 (vide Patente Francesa Aberta ao Público No. 2667875, 1992 e Patente Japonesa Aberta ao Público No. No. 5-7491) e assim por diante. Estes plasmídeos podem autonomamente replicar a 25 °C pelo menos, porém não pode replicar autonomamente a 37°C. A Escherichia coli AJ12571, abrigando pHSC4, foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Tecnology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patente Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-5466)), em 11 de outubro de 1990, recebendo o número de acesso de FERM P-11763. Em seguida, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 26 de agosto de 1991, recebendo o número de acesso de FERM BP-3524. Além disso, é também possível transformar uma bactéria corineforme com um plasmídeo que não pode replicar autonomamente em bactérias corineformes e incorporar o plasmídeo dentro do cromossomo da bactéria corineforme por recombinação homóloga, como descrito na seção de exemplos.

Em uma cepa incorporando DNA recombinante dentro do DNA cromossomal, como descrito acima, o gls tipo deleção é recombinado com a seqüência gls nativa presente no cromossomo e o gls cromossomal e o gls tipo deleção são inseridos dentro do cromossomo, a fim de que as outras porções do DNA recombinante (segmento vetor, origem de replicação sensível a temperatura e marcador de resistência a drogas) estejam presentes entre os dois genes. Portanto, a cepa transformante expressa o gls nativo, porque o gls nativo é dominante neste estado.

Em seguida, a fim de que somente o gls tipo deleção permaneça no DNA cromossomal, uma cópia do gls é eliminada do DNA cromossomal com o segmento vetor (incluindo a origem de replicação sensível a temperatura e o marcador de resistência a droga) por recombinação dos dois genes gls. Neste caso, o gls normal é deixado no DNA cromossomal e o gls tipo deleção é extirpado do DNA cromossomal, ou vice versa. Em ambos os casos, o DNA extirpado pode ser retido na célula como um plasmídeo, quando a célula é cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura pode funcionar. Subseqüentemente, se a célula é cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura não pode funcionar, o gls do plasmídeo é eliminado juntamente com o plasmídeo da célula. Em seguida, uma cepa em que gls é rompido pode ser obtida selecionando-se uma cepa em que o gls tipo deleção é deixado no cromossomo utilizando-se PCR, hibridização do Sul ou similar. r E suficiente que o gene gls tipo deleção, usado para o rompimento de gene tenha uma homologia para o gene gls alvo do DNA cromossomal da bactéria corineforme em um tal grau que resulte em recombinação homóloga. A homologia é preferivelmente de 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais e, muitíssimo preferivelmente, 95% ou mais. Além disso, os DNAs que podem hibridizar entre si sob rigorosas condições podem provocar recombinação homóloga. As “condições rigorosas” incluem condições sob as quais um híbrido chamado específico é formado e um híbrido não específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição pela utilização de qualquer valor numérico. Entretanto, por exemplo, as condições rigorosas incluem condições pelas quais os DNAs hibridizam entre si em uma concentração de sal tipicamente usada para lavagem em hibridização do Sul, isto é, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60°C. E admitido que nas células das bactérias corineformes a L-glutamina é sintetizada pela glutamina sintetase (“GS”) e degradada pela glutaminase (“GLS”). Isto é, os inventores da presente invenção deduziram que, para eficientemente produzir L-glutamina em elevadas produções, era importante manter a atividade GS em um elevado nível, enquanto mantendo-se a atividade GLS em um baixo nível. Entretanto, em cepas de bactérias corineformes, a atividade GS é marcantemente mais baixa do que a atividade r GLS. E desnecessário dizer que, embora o equilíbrio da formação e degradação da L-glutamina intracelular dentro das células, durante a produção de L-glutamina, seja mudado com atividades não somente específicas destas enzimas, mas também com valores Km das enzimas e concentrações intracelulares de substratos, as atividades específicas representam um importante fator.

Por exemplo, como descrito no Exemplo 4, em uma cepa mutante tendo reduzida atividade GLS, a produção de L-glutamina é aumentada quando a atividade GLS residual é suprimida a um nível de cerca de 60 por cento da atividade GS.

A atividade GS pode ser medida, por exemplo, como segue. A reação pela GS pode ser quantificada adicionando-se uma solução enzimática bruta de uma bactéria corineforme a uma solução contendo 100 mM imidazol-HCl (pH 7,0), 90 mM KC1, 0,1 mM NH4CI, 1 mM MnCl2, 1 mM ácido fosfoenolpirúvico, 0,3 mH NADH, 10 U de lactato deidrogenase, 25 U de piruvato cinase, 1 mM ATP e 10 mM MSG (glutamato de sódio) e medindo-se a variação de absorvência a 340 nm a 30°C. Para a medição bmta, a solução de reação supracitada, sem o MSG, é usada. A concentração de proteína da solução enzimática bruta é quantificada utilizando-se o Ensaio de Proteína (Bio-Rad) com albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Na presente invenção, a quantidade de enzima necessária para produzir 1 pmol de NAD por minuto, no sistema de reação supracitado, é definida como 1 U. Em seguida, a atividade GS por 1 mg de proteína é indicada com uma unidade de “U/mg”. A solução de enzima bruta supracitada é preparada, por exemplo, como segue. Isto é, a solução de enzima bruta é preparada separando-se as células do caldo de cultura por centrifugação, lavando-se as células com 100 mM imidazol-HCl (pH 7,0, uma solução contendo KC1 90 mM), sonicando-se as células e removendo-se a fração insolúvel por ultracentrifiigação. A fim de eficientemente produzir L-glutamina utilizando-se a bactéria corineforme da presente invenção, uma cepa em que a atividade GLS é reduzida e a atividade da glutamina sintetase é aumentada simultaneamente é preferivelmente usada. A expressão “atividade de glutamina sintetase é aumentada” significa que a atividade da GS por célula é mais elevada do que a de uma bactéria corineforme. Por exemplo, isto pode ser exemplificado por um caso em que o número de moléculas de GS por célula aumenta e um caso em que a atividade da GS por molécula de GS aumenta e assim por diante. Além disso, uma bactéria corineforme, que serve como um objeto de comparação, pode ser, por exemplo, a Brevibacterium flavum ATCC 14067. Como resultado do aumento da atividade GS, a quantidade de acúmulo de L-glutamina em um meio aumenta e o subproduto ácido L-glutâmico diminui e assim por diante. É suficiente que na bactéria corineforme da presente invenção a atividade GLS seja reduzida e a atividade GS seja aumentada, em comparação com uma cepa ou cepa não modificada. Preferivelmente, a bactéria corineforme da presente invenção é uma bactéria em que a atividade GLS deve ser similar a ou menor do que a atividade GS, mais preferivelmente a atividade GLS deve ser Vi ou menos da atividade GS, quando medida como atividade por unidade de peso de proteínas celulares. Na presente invenção, a atividade GLS e a atividade GS por unidade de peso de proteína celular significam as atividades medidas pelos métodos de medição supracitados e definidos de acordo com as definições supracitadas. O aumento da atividade GS em uma bactéria corineforme pode ser conseguido aumentando-se o número de cópias do gene codificando GS. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado ligando-se um fragmento de gene codificando GS com um vetor sabido funcionar na bactéria, preferivelmente um vetor tipo de múltiplas cópias, e transformar o vetor em um hospedeiro tendo capacidade de produção de L-glutamina. Altemativamente, o DNA recombinante supracitado pode ser introduzido dentro de uma bactéria corineforme para obter-se um transformante e a capacidade de produção de L-glutamina pode ser subseqüentemente concedida ao transformante.

Qualquer um dos genes derivados das bactérias corineformes, ou genes derivados de outros organismos, tais como bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, pode ser usado como o gene GS. Entre estes, os genes derivados de bactérias corineformes são preferidos por sua facilidade de expressão. O gene glnA é sabido codificar a GS da bactéria corineforme (FEMS Microbiology Letters, 154, 81-88, 1997). O gene da GS pode ser obtido por PCR, usando-se iniciadores baseados na seqüência de nucleotídeo conhecida, por exemplo, os iniciadores mostrados na SEQ ID NOS: 19 e 20 e usando-se DNA cromossomal de uma bactéria corineforme como um padrão. Os genes codificando a GS de outro microorganismo podem também ser similarmente obtidos. A seqüência de nucleotídeo do gene glnA da cepa da Brevibacterium flavum ATCC 14067 e da seqüência de aminoácido codificada por ele são mostradas nas SEQ ID NOS: 3 e 4. O gene codificando GS pode ser, além do gene glnA, um codificando uma seqüência de aminoácido que inclui substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos aminoácidos, contanto que a GS codificada tenha a atividade de catalisar a reação do ácido L-glutâmico e do íon amônio, para produzir L-glutamina. Número de “diversos” aminoácidos, como aqui usado, varia dependendo das posições dos resíduos aminoácidos na estrutura tridimensional da proteína e dos tipos dos aminoácidos. Entretanto, ele preferivelmente significa entre 2 a 30, mais preferivelmente entre 2 a 20 e muitíssimo preferivelmente entre 2 a 10.

Exemplos de DNA codificando substancialmente a mesma proteína que GS descrita acima incluem DNA que é hibridizável com uma sonda tendo os números de seqüência de nucleotídeo de 874 a 2307 da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 3 ou uma sonda preparada desta seqüência de nucleotídeo sob condições rigorosas e codifica uma proteína tendo uma atividade similar à GS. “Condições rigorosas” incluem condições em que um chamado híbrido específico é formado e um híbrido não-específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição utilizando-se qualquer valor numérico. Entretanto, por exemplo, as condições rigorosas incluem uma condição por meio da qual os DNAs tendo elevada homologia, por exemplo, DNAs tendo homologia de 70% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, hibridizam entre si, enquanto que os DNAs tendo homologia mais baixa do que a acima não hibridizam entre si. Altemativamente, as condições rigorosas são exemplificadas pelas condições pelas quais os DNAs hibridizam entre si em uma concentração de sal típica para lavagem em hibridização do Sul, isto é, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60°C.

Um vetor que funciona em bactérias corineformes significa, por exemplo, um plasmídeo que pode autonomamente replicar em bactérias corineformes. Exemplos específicos dele incluem mas não são limitados ao pAM330 (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 58-67699), pHM1519 (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 58-77895), pSFK6 (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-262288).

Se um fragmento de DNA, tendo capacidade de produzir um plasmídeo autonomamente replicável em bactérias corineformes, for removido destes vetores e inserido dentro dos vetores supracitados para Escherichia coli, ele pode ser usado como um chamado vetor de transporte, autonomamente replicável em bactérias tanto Escherichia coli como corineformes.

Exemplos de tal vetor de transporte incluem mas não são limitados àqueles descritos aqui. As cepas bacterianas que abrigam cada um dos vetores e seus números de acesso nos depositários internacionais entre parênteses, são como seguem: pAJ655 Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corybacterium glutamícum SR801 (ATCC 39135) pAJ1844 Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corybacterium glutamícum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148 Corybacterium glutamícum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440 Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) pHC4 Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532) Estes vetores podem ser obtidos das bactérias depositadas, como segue. Isto é, as células coletadas em sua fase de crescimento exponencial são lisadas usando-se lisozima e SDS e centrifugadas a 30000 x g. O sobrenadante obtido do lisado é adicionado com polietileno glicol, fracionado e purificado por centrifugação de gradiente de densidade de equilíbrio de cloreto de césio-brometo de etídio. O número de cópias do gene GS pode também ser aumentado, permitindo-se que múltiplas cópias do gene existam no DNA cromossomal de uma bactéria corineforme. Isto pode ser realizado alvejando-se uma seqüência presente no DNA cromossomal em múltiplos números de cópia. Um DNA repetitivo ou uma repetição invertida, presente no final de um elemento transponível, pode ser usado como a seqüência presente no DNA cromossomal em número de múltiplas cópias. Altemativamente, como descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-109985, múltiplas cópias do gene GS podem ser introduzidas dentro do DNA cromossomal incorporando-as dentro de um transposon e transferindo-o.

Além dos métodos de amplificação de gene acima, a expressão do gene GS pode ser aumentada substituindo-se uma seqüência de controle de expressão, tal como promotores do gene GS, por uma mais forte. Exemplos de promotores fortes incluem o promotor lac, promotor trp, o promotor trc e assim por diante. Além disso, é também possível introduzirem-se substituições de nucleotídeo para diversos nucleotídeos dentro de uma região promotora do gene GS, a fim de que seja modificado em uma mais forte, como descrito na Publicação de Patente Internacional WOOO/18935. Por tal substituição ou modificação da região promotora, a expressão do gene GS é aumentada e, assim, a atividade GS é aumentada. Tal modificação da seqüência reguladora da expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene GS.

Por exemplo, o sítio de iniciação de transcrição do gene glnA de bactérias corineformes, bem como sua região promotora, foram informados por Anton e outros (FEMS Microbiology Letters, 205, 361-367, 2001). Por exemplo, a atividade GS é aumentada substituindo-se a seqüência da região —10 por TATAAT, e da região —35 por TTGCCA, regiões estas sendo descritas na Fig. 3C da referência supracitada. Entretanto, na presente invenção, a região -35 do gene GS significa uma região que é localizada 3 pb a jusante, isto é, em direção ao sítio de iniciação de transcrição, a partir da região —35 descrita na referência supracitada (números de nucleotídeos 727 a 732 da SEQ ID NO: 3). Por outro lado, a região -10 do gene GS significa uma região que é a mesma que a região -10 descrita na referência supracitada (números de nucleotídeos 751 a 756 da SEQ ID NO: 3). Tais modificações destas regiões do gene GS pode ser realizada, por exemplo, por mutagênese específica de sítio. Exemplos do gene GS, onde a região -35 e a região -10 são modificadas, incluem mas não são limitados ao gene glnA das bactérias corineformes, por exemplo, um gene tendo a seqüência da SEQ ID NO: 3. A proteína codificada pode ter uma seqüência de aminoácido incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou diversos resíduos aminoácidos, contanto que a proteína codificada tenha uma atividade de catalisação da reação gerando L-glutamina de um íon amônio e ácido L-glutâmico.

Além do aumento de expressão do gene GS descrito acima, a atividade GS pode também ser aumentada eliminando-se o controle de atividade via a adenilação da GS intracelular (Publ. Pedido Pat. US No. 2003/0003550A1).

Na bactéria corineforme da presente invenção, além da redüção da atividade GLS e aumento da atividade GS, uma atividade de uma enzima catalisando uma reação envolvida no trajeto da biossíntese da L-glutamina pode ser aumentada. Exemplos de uma tal enzima incluem mas não são limitados a isocianato deidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, piruvato deidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase, piruvato cinase, fosfofluctocinase e assim em diante.

Além disso, a atividade de uma enzima que catalisa uma reação ramificando-se para fora do trajeto da biossíntese da L-glutamina e produzindo um composto que não L-glutamina, pode ser reduzida ou eliminada. Exemplos de tal enzima incluem mas não são limitados a isocitrato liase, α-cetoglutarato deidrogenase, glutamato sintase e assim em diante.

Produção de L-glutamina empregando-se microorganismo da presente invenção A L-glutamina pode ser eficientemente produzida e o subproduto ácido L-glutâmico pode ser suprimido cultivando-se uma bactéria corineforme obtida como descrito acima em um meio. A L-glutamina é produzida e acumula-se no meio e pode ser coletada do meio. A fim de produzir L-glutamina utilizando-se a bactéria corineforme da presente invenção, a cultura pode ser realizada de uma maneira convencional, empregando-se um meio típico contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais minerais, bem como nutrientes traço orgânicos, tais como aminoácidos e vitaminas, como necessário. Um meio sintético ou um meio natural pode ser usado. Qualquer espécie de fonte de carbono e fonte de nitrogênio pode ser usada, contanto que possa ser utilizada pela cepa a ser cultivada. Açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisados e melaços de amido, e ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido cítrico, e álcoois tais como etanol, podem também ser usados cada um sozinho ou em uma combinação com outras fontes de carbono como a fonte de carbono.

Amônia, sais de amônio tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico e assim por diante, podem ser usados como a fonte de carbono.

Aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, aqueles contendo aquelas substâncias tais como peptona, casaminoácidos, extrato de levedura e produto de decomposição da proteína de soja e assim por diante, podem ser usados como a fonte de carbono. É preferível suplementar o nutriente requerido quando uma cepa mutante auxotrófica, que requer um aminoácido ou similar para seu crescimento, é usada.

Os sais de ácido fosfórico, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante podem ser usados como os sais minerais. A cultura pode ser realizada com aeração. A temperatura da cultura é controlada para ser de 20 a 45 °C e o pH é controlado para ser de 5 a 9. Quando o pH cai durante a cultura, o meio pode ser neutralizado pela adição de carbonato de cálcio ou um álcali, tal como gás de amônia ou similar. Uma quantidade substancial de L-glutamina é acumulada no caldo de cultura após 10 a 120 h de cultura em uma tal maneira como descrita acima. A L-glutamina pode usualmente ser coletada do caldo de cultura após a cultura de uma maneira convencional. Por exemplo, após as células terem sido removidas do caldo de cultura, a L-glutamina pode ser coletada concentrando-se o caldo para cristalizar a L-glutamina.

Exemplos A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência às versões preferidas, dadas somente como exemplo.

Exemplo 1: Construções de cepa amplificada-gls (1) Medição da atividade de glutaminase da bactéria corineforme A existência da glutaminase, uma enzima que degrada a L-glutamina para gerar ácido L-glutâmico, não tinha sido definitivamente informada nas bactérias corineformes. Portanto, os inventores da presente invenção verificaram se a atividade de glutaminase existia em bactérias corineformes. A cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi inoculada dentro de um meio contendo 30 g de glicose, 1,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 100 pg de VB!. HC1, 3 pg de biotina, 200 mg de hidrolisados de soja, 1,5 g de uréia e 0,02 ml de agente anti-espuma GD-113 em 1 1 de água pura (ajustada a pH 7,0 com KOH) e cultivada a 31,5 °C com agitação. As células foram separadas do caldo de cultura por centrifugação, lavada com 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) e rompidas por sonicação. As células não rompidas foram removidas por centrifugação para obter-se uma solução de enzima bruta. A concentração de proteína na enzima bruta foi quantificada utilizando-se Ensaio de Proteína (Bio-Rad) com albumina de soro bovino como uma amostra padrão. A atividade de glutaminase foi medida adicionando-se a solução de enzima bruta a uma solução contendo 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) e 75 mM L-glutamina, permitindo-se uma reação a 30°C por 30 minutos ou 60 minutos, em seguida adicionando-se SDS em uma concentração final de 0,5%, para terminar a reação, e quantificando-se o ácido L-glutâmico produzido. Como resultado, foi demonstrado que uma enzima exibindo a atividade de glutaminase estava presente em Brevibacterium flavum como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1: Atividade GLS da bactéria corineforme (2) Clonagem do gene da glutaminase Sabe-se que a L-glutamina serve como um doador de NH3 na biossíntese dos ácidos nucleicos, aminoácidos etc. e que a pequena subunidade da carbamoilfosfato sintetase exibe a atividade de glutaminase. Além disso, um gene codificando a glutaminas, glsA, foi recentemente clonado para Rhizobium etli e caracterizado como provendo a atividade de glutaminase independentemente das biossínteses do ácido nucleico e aminoácido (Biochim. Biophys. Acta, 1444 (3): 451-6, 1999). Portanto, os inventores da presente invenção pesquisaram genes de Corybacterium glutamicum para um gene homólogo para glsA e, como resultado, verificaram um gene que foi estimado para codificar GLS. Então, baseado na seqüência de nucleotídeo do suposto gene GLS, o homólogo do gene foi clonado e amplificado em Brevibacterium flavum, e atividade de glutaminase melhorada foi verificada. A seqüência de nucleotídeo do gene clonado foi mostrada na SEQ ID NO: 1 (a seguir, um gene tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 é referido como “gls”). A seqüência alvo foi amplificada por PCR, usando-se os iniciadores mostrados nas SEQ ID NOS: 5 e 6 e usando-se o DNA cromossomal da cepa de Brevibacterium. flavum ATCC 14067 como um padrão. As seqüências das SEQ ID NOS: 5 e 6 correspondem aos números de nucleotídeo 1 a 20 e 2100 a 2081 da SEQ ID NO: 1, respectivamente. O DNA cromossomal da cepa de Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi preparado usando-se Kit de Purificação de DNA Genômico Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.). Foi realizado PCR por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por 3 minutos usando-se Polimerase de DNA Pyrobest (Takara Shuzo). O produto PCR resultante foi purificado em uma maneira convencional e embotada na extremidade usando-se Kit de Embotamento (Takara Shuzo). O produto PCR de extremidade embotada foi ligado usando-se ICit de ligação (Takara Shuzo) com um vetor de transporte para bactérias corineformes e Escherichia coli, pHMK2, que tinha sido digerido com Smal. A mistura de ligação foi usada para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo). As células foram disseminadas em meio L contendo 10 μg/ml de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal e 25 μg/ml de canamicina e cultivadas durante a noite. Então as colônias brancas emergidas foram selecionadas e separadas em colônias simples, para obterem-se transformantes. Os plasmídeos são preparados dos transformardes pelo método alcalino e um plasmídeo, em que o fragmento PCR objetivo foi inserido dentro do vetor, foi isolado. O plasmídeo obtido foi designado como pHMKGLS5. O supracitado pHMK2 foi obtido como segue. O plasmídeo pHK4 (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 5-7491), tendo uma origem de replicação derivada do plasmídeo pHM1519, autonomamente replicável em bactérias corineformes (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e Smal, para obter-se um fragmento contendo a origem de replicação. O fragmento obtido foi embotado na extremidade utilizando-se Kit de Embotamento de DNA (Takara Shuzo) e inserido dentro do sítio BsaAl do vetor de clonagem pKl para E. coli (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-262288), para obter-se pHMK2. O processo de construção de pHMKGLS5 é mostrado na Fig. 1.

(3) Construção da cepa superexpressando-gA pHMGLS5 obtido em (2) descrito acima foi introduzido dentro de uma bactéria corineforme para obter-se uma cepa amplificada-gA·. Especificamente, a cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi transformada com pHMGLS5 pelo método de pulso elétrico (vide Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-207791), disseminada em meio CM2G (10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de glicose, pH 7,0 (KOH)) contendo 25 pg/ml de canamicina e cultivada a 31,5 °C por dois dias. A colônia emergida foi isolada como um transformante e designada como 2247/pHMKGLS5. Uma cepa introduzída-pHMK2 foi também construída e o transformante obtido foi designado como 2247/pHMK2. Cada um destes transformantes foi cultivado pelo método descrito em (1) e a atividade GLS foi medida. Como resultado, foi confirmado que a atividade de glutaminase aumentou na cepa introduzida-pHMGLS5 (Tabela 2). A relação de abrigo- plasmídeo dos transformantes foi de 100%.

Tabela 2: atividade GLS da cepa GLS-amplificada Exemplo 2: Construção da cepa deficiente-g/s (1) Construção do plasmídeo para rompimento de gls A fim de confirmar se qualquer gene codificando a glutaminase das bactérias corineformes que não o gene gls podería existir, uma cepa deficiente-g/s foi construída. O método é especificamente descrito aqui.

Primeiro, o PCR foi realizado utilizando-se o DNA cromossomal da cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e os DNAs sintéticos da SEQ ID NOS: 5 e 7 como iniciadores, para obter-se um produto de amplificação do lado do término-N do gene gls. Em seguida, a fim de obter-se um produto de amplificação de uma seqüência do lado do término-C do gene gls, PCR foi realizada usando-se o DNA cromossomal da cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e os DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 6 e 8 como iniciadores. As seqüências das SEQ ID NOS: 7 e 8 são parcialmente complementares entre si. As seqüências das SEQ ID NOS: 7, 8, 9 e 10 correspondem aos números de nucleotídeos 1245 a 985, 983 a 1245, 414 a 438 e 1869 a 1845 da SEQ ID NO: 1, respectivamente, e as seqüências das SEQ ID NOS: 7 e 8 são deficientes dos nucleotídeos dos nucleotídeos números 1003 a 1230 da SEQ ID NO: 1. A PCR foi realizada usando-se Z-Taq (Takara Shuzo) por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos.

Em seguida, a fim de obter-se um fragmento de gene gls, tendo uma seqüência interna deletada, os fragmentos de gene supracitados, dos lados dos términos-N e C, foram misturados em quantidades substancialmente equimolares e PCR foi realizada usando-se esta mistura como um padrão e os DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 9 e 10 como iniciadores, para obter-se um produto de amplificação de gene gls, tendo uma mutação. PCR foi realizada usando-se Z-Taq (Takara Shuzo) por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por 30 segundos. Este produto de gene gls tem a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, por meio do que os aminoácidos 110- e 185- são deletados. O produto PCR resultante foi purificado em uma maneira convencional, em seguida digerido com Smal e inserido dentro do sítio Smal de pNEL. Utilizando-se este DNA, células competentes de Escherichia coli DH5a (Takara Shuzo) foram transformadas e as células foram aplicadas a um meio L contendo 40 pg/ml de X-Gal e 25 μg/ml de canamicina e cultivadas durante a noite. Em seguida, as colônias azuis emergidas foram colhidas e separadas em colônias simples para obter-se cepas transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes obtidos e o plasmídeo inserido com o produto PCR alvo foi designado como pNELAgls. pNEL é um plasmídeo obtido realizando-se PCR usando-se pNEOL (vide WOOO/18935) como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados nas SEQ ID NOS: 11 e 12 como iniciadores, digerindo-se o produto de amplificação com Smal e auto-ligando-se o produto da digestão. O plasmídeo pNEL não contém qualquer região autonomamente replicável nas células de bactérias corineformes. A PCR foi realizada utilizando-se Polimerase de DNA Pyrobest (Takara Shuzo) por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 98 °C por 20 segundos, recozimento e extensão a 68 °C por 6 minutos. O esquema de construção de pNEL é mostrado na Fig. 2 e o esquema de construção de pNELAgls é mostrado na Fig. 3. (2) Construção da cepa deficiente de gls pNELAgls, obtido em (1) não contém uma região autonomamente replicável nas células de bactérias corineformes. Portanto, se uma bactéria corineforme for transformada com este plasmídeo, uma cepa tendo este plasmídeo introduzido dentro do cromossomo por recombinação homóloga aparecerá como um transformante, embora ela ocorra em uma freqüentemente extremamente baixa. A cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi transformada com uma alta concentração de pNELAgls pelo método de pulso elétrico, disseminada em meio CM2G (10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de glicose, pH 7,0 (KOH)) contendo 25 pg/ml de canamicina e cultivada a 31,5 °C por dois dias e a colônia emergida foi isolada como um transformante. Este transformante forma uma colônia azul na placa contendo 40 pg~ml de X-Gal. Em seguida, este transformante foi subcultivado em meio CM2G não contendo canamicina, apropriadamente diluído e então aplicado a uma placa CM2G, contendo 40 pg/ml de X-Gal. De um grande número de colônias emergidas, as cepas que formavam uma colônia branca e apresentavam sensibilidade a canamicina (km) foram escolhidas. PCR foi realizada usando-se o DNA cromossomal destas cepas sensíveis a Km como um padrão e DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 5 e 6 como iniciadores, e uma cepa que fornecia um produto PCR, tendo um tamanho menor do que aquele obtido usando-se o DNA cromossomal de ATCC 14067 como um padrão, foi usada para os experimentos seguintes como uma cepa deficiente-gls (a seguir, 2247Agis). (3) Introdução do plasmídeo gls dentro de 2247 gls O plasmídeo pGLS5 descrito no Exemplo 1, seção (2) foi introduzido dentro da cepa 2247Agls, obtida em (2) descrito acima pelo método de pulso elétrico, e um transformante foi obtido utilizando-se a resistência a canamicina como um marcador. O transformante obtido foi designado como 2247Agls/pGLS5. Separadamente, pHMK2 foi também introduzido e o transformante obtido foi designado como 2247Agls/pHMK2. (4) Medição da atividade GLS da cepa defíciente-gls O resultado da medição da atividade GLS, realizada pelo método descrito no Exemplo 1,(1) para Brevibacterium flavum ATCC 14067, 2247Agls e pHMK2 e suas cepas introduzídas-pHMKGLS, são mostrados na Tabela 3. Foi confirmado que a atividade para degradar L-glutamina tinha quase desaparecido em 2247Agls. Além disso, o desaparecimento da atividade foi complementado pela introdução de pHMKGLS5. Assim, deduziu-se que o gene principalmente responsável pela atividade de glutaminase das bactérias corineformes é gls.

Tabela 3: Atividade GLS da cepa deficiente-GLS e cepa complementada com plasmídeo Exemplo 3: Produção da L-glutamina pela cepa deficiente-gls (1) Avaliação da cultura da cepa deficiente-gA L-glutamina foi produzida pela cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 e cepa 2247Agls como segue. Células da cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 e da cepa 2247Agis, obtidas por cultura em um meio de disseminação CM2B, foram inoculadas em um meio contendo 100 g de glicose, 60 g ou 40 g de (NH4)2S04, 2,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 350 pg de VBj. HC1, 4 pg de biotina, 200 mg de hidrolisados de soja e 50 g de CaC03 em 1 1 de água pura (ajustada a pH 6,8 com NaOH) e cultivadas a 31,5 °C com agitação, até o açúcar do meio ser consumido.

Após o término da cultura, a quantidade de L-glutamina acumulada no caldo de cultura foi analisada paro caldo de cultura apropriadamente diluída por cromatografia líquida. CAPCELL PAK Cl8 (Shiseido) foi usado como uma coluna e a amostra foi eluída com um eluente contendo 0,095% de ácido fosfórico, 3,3 mM de ácido heptanossulfônico e 5% de acetonitrila em 1 1 de água destilada. A quantidade de L-glutamina acumulada (Gin) foi analisada com base na variação da absorvência a 210 nm. Além disso, a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado (Glu) foi analisada paro caldo de cultura apropriadamente diluída, empregando-se Biotech Analyzer AS 210 (Asahi Chemical Industry). Os resultados da análise acima são mostrados na Tabela 4 (60 g/1 de sulfato de amônio) na Tabela 5 (40 g/1 de sulfato de amônio).

Quanto à cepa 2247Agis, cerca de 3% da melhoria na produção foram reconhecidos para todas as condições em comparação com a cepa precursora, a cepa ATCC 14067. Estes resultados demonstraram que o desaparecimento ou redução da atividade GLS foi eficaz para a produção de L-glutamina.

Tabela 4: Produção de L-glutamina por cepa reduzida de atividade GLS (1) Tabela 5: Produção de L-glutamina por cepa reduzida em atividade GLS (2) Exemplo 4: Construção de cepa deficiente de gls e atividade GS aumentada (1) Construção de plasmídeo tendo gene GS com aumentada expressão A seqüência de nucleotídeo do gene GS das bactérias corineformes já foi elucidada (No. de Acesso GenBank Y13221). Com referência a esta seqüência, um gene GS com aumentada expressão (gene GS do tipo aumentado) foi construído. O método será especificamente descrito aqui. Primeiro, PCR primário foi realizado para o lado do término-N, empregando-se o DNA cromossomal da cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e DNAs da SEQ ID NOS: 13 e 18 como iniciadores e a PCR primária para o lado do término-C foi realizada usando-se DNAs da SEQ ID NOS: 15 e 17 como iniciadores. As seqüências das SEQ ID NOS: 13, 14, 15, 16, 17 e 18 correspondem aos nucleotídeos números 487 a 507, 523 a 549, 1798 a 1775, 1770 a 1745, 1118 a 1169 e 1169 a 1118 do No. de Acesso do Genbank Y13221, respectivamente. As seqüências das SEQ ID NOS: 17 e 18 são complementares entre si. PCR foi realizada utilizando-se Polimerase de DNA Pyrobest (Takara Shuzo) por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94 °C por 30 segundos, recozimento a 55 °C por 15 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto.

Em seguida, a fim de obter-se um fragmento de gene GS tipo aumentado, os produtos de amplificação do lado a montante e do lado a jusante do gene GS foram misturados em quantidades substancialmente equimolares e PCR foi realizada usando-se esta mistura como um padrão e os DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 14 e 16 como iniciadores, para obter-se um produto de amplificação de gene GS, tendo uma mutação. A PCR foi realizada utilizando-se Polimerase de DNA Pyrobest (Takara Shuzo) por 30 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 55°C por 15 segundos e extensão a 72°C por 2 minutos.

Em seguida, o produto PCR foi purificado em uma maneira convencional, em seguida digerido com Smal e inserido dentro do sítio Smal de pNEL. Células competentes de Escherichia coli DH5oc (Takara Shuzo) foram transformadas com o DNA obtido e as células foram aplicadas a meio L contendo 40 μg/ml de X-Gal e 25 μg/ml de canamicina e cultivadas durante a noite. Em seguida, as colônias azuis emergidas foram colhidas e separadas em colônias simples, para obterem-se transformantes. Os plasmídeos foram extraídos dos transformardes obtidos e a região reguladora de expressão glnA foi seqüenciada. O plasmídeo introduzido com o objetivo de mutação foi designado como pNELglnA14. O esquema de construção de pNELglnA14 é mostrado na Fig. 4. No fragmento de gene glnA clonado em pNELglnA14, obtido como descrito acima, a seqüência (ATTATA) da região a jusante a 3 pb da região -35 do gene GS descrito em FEMS Microbiology Letters, 205 (2001) 361-367, é substituída por TTGCCA. (2) Construção da cepa aumentada em atividade pNELglnA14 obtido (1) como descrito acima não contém qualquer região autonomamente replicável nas células das bactérias corineformes. Portanto, se uma bactéria corineforme for transformada com este plasmídeo, uma cepa em que este plasmídeo é introduzido dentro do cromossomo por recombinação homóloga aparecería como um transformante, embora isto ocorra em uma freqüência extremamente baixa. A cepa Brevibacterium flavum 2247Agls foi transformada com uma alta concentração de pNELglnA14 pelo método de pulso elétrico, disseminada em meio CM2G (10 g/1 de polipeptona, 10 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de glicose, pH 7,0 (KOH)) contendo 25 pg/ml de canamicina e cultivada a 31,5°C por dois dias e as colônias emergidas foram isoladas como transformantes. Estes transformantes formam uma colônia azul na placa CM2G contendo 40 pg/ml de X-Gal. Em seguida, estes transformantes foram subcultivados em meio CM2G não contendo canamicina (Km), apropriadamente diluídos e então aplicados a uma placa CM2G contendo 40 pg/rnl de X-Gal. De um grande número de colônias emergidas, as cepas que formaram uma colônia branca e apresentaram susceptibilidade a canamicina foram escolhidas. A PCR foi realizada usando-se o DNA cromossomal destas cepas sensíveis a Km como um padrão e os DNAs sintéticos das SEQ ID NOS: 14 e 16 como iniciadores e a região reguladora de expressão foi seqüenciada. Entre as cepas sensíveis a Km, uma cepa, em que a mutação objetiva foi inserida dentro da região reguladora de expressão, foi isolada. A cepa obtida foi designada como 2247AglsglnA14 e usada para os seguintes experimentos.

(3) Medição da atividade GS A cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi inoculada dentro de um meio contendo 30 g de glicose, 1,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 100 pg de VBi. HC1, 3 pg de biotina, 350 mg de hidrolisados de soja, 3,0 g de uréia e 0,02 ml de GD-113 em 1 1 de água pura (ajustada a pH 7,0 com KOH) e cultivada a 31,5 °C com agitação. Com referência ao método descrito no Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 70, No. 3, 182-184, 1990, a atividade GS foi medida adicionando-se uma solução de enzima bruta a uma solução contendo 100 mM de imidazol-HCl (pH 7,0), 90 mM KC1, 0,1 mM NH4C1, 1 mM MnCl2, 1 mM ácido fosfoenolpirúvico, 0,3 mM NADH, 10 U de lactato deidrogenase, 25 U de piruvato cinase, 1 mM ATP e 10 mM MSG, e medindo-se a variação da absorvência a 340 nm a 30°C. Para a medição do modelo, a solução de reação supracitada, não contendo MSG, foi usada. A concentração de proteína da solução de enzima bruta foi quantificada utilizando-se Ensaio de Proteína (Bio-Rad) com albumina de soro bovino como um padrão. Foi verificado que a atividade GS foi aumentada cerca de três vezes na cepa aumentada em atividade GS.

Tabela 6: Atividades GLS e GS da cepa deficiente de GLS e cepa deficiente de GLS e aumentada em GS

(4) Avaliação da cultura de cepa reduzida em atividade GLS e aumentada em atividade GS

Utilizando-se a cepa Brevíbacterium flavum ATCC 14067, cepa 2247Agls e cepa 2247Agls glnA14, a cultura para produção de L-glutamina foi realizada como segue. Células da cepa Brevíbacterium flavum ATCC 14067, cepa 2247Agls e cepa 2247Agls glnA14, a cultura para produção de L-glutamina foi realizada como segue. Células da cepa Brevíbacterium flavum ATCC 14067, cepa 2247Agls e cepa 2247Agis glnA14, obtidas por cultura em um meio de disseminação CM2B, foram inoculadas dentro de um meio contendo 100 g de glicose, 60 g de (NH4)2S04, 2,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 350 μg de VBj. HC1, 4 pg de biotina, 200 mg de hidrolisados de soja e 50 g de CaC03 em 1 1 de água pura (ajustada a pH 6,8 com NaOH) e cultivadas a 31,5 °C com agitação, até o açúcar do meio ser consumido.

Após o término da cultura, a quantidade de L-glutamina acumulada no caldo de cultura foi analisada quanto o caldo de cultura apropriadamente diluída por cromatografia líquida. Além disso, a quantidade de ácido L-glutâmico acumulado foi analisada quanto à calda de cultura apropriadamente diluída, utilizando-se Biotech Analyzer AS210 (Asahi Chemical Industry). Os resultados da análise acima são mostrados na Tabela 7.

Quanto à cepa 2247Agis glnA14, mais melhoria na produção foi reconhecida, em comparação com a cepa 2247Agls. Estes resultados demonstraram que, além do desaparecimento ou redução da atividade GLS, o aumento da atividade GLS foi efetivo para a produção da L-glutamina.

Tabela 7: Produção de L-glutamina por cepa deficiente de GLS e cepa deficiente de GLS e aumentada em GS_________________________________ Exemplo de Referência (1) Medição da atividade de glutaminase de bactérias produtoras de L-glutamina conhecidas e 2247Agis glnA14.

As cepas AJ11576 e AJD11577 que foram obtidas como cepas tolerantes a uma substância tendo atividade de vitamina P (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-164792), AJ11573 e AJ11574 que foram obtidas como cepas tolerantes a ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495), AJ12418 e AJ12419 que foram obtidas como cepas tolerantes a um peptídeo contendo ácido glutâmico (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994) e assim por diante, são conhecidas como bactérias produtoras de L-glutamina. A atividade GLS destas bactérias produtoras de L-glutamina e cepas 2247Agls glnA14, obtidas no Exemplo 4, foi medida pelo método descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 8. Todas estas cepas produtoras de L-glutamina conhecidas tiveram significativa atividade GLS.

Tabela 8: Atividade GLS de bactérias produtoras de L-glutamina conhecidas e 2247Agls glnA14.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com referência a suas versões preferidas, será evidente para uma pessoa hábil na arte que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes empregados, sem desvio do escopo da invenção. Cada um dos documentos supracitados, incluindo a prioridade estrangeira JP2002-342287, é incorporado por referência aqui, em sua totalidade.

Claims

1. Bactéria corinefornic geneticamente modificada tendo capacidade de produzir L-glutamina, caracterizada pelo fato de que o gene da glutaminase mostrada na SEQ ID NO: I em um cromossomo está rompido, e em que a região de nucleotídeo de números 727 a 732 na SEQ ID NO: 3 que codifica a glutamina sintetase ser substituída com TTGCCA, e em que a região de nucleotídeo de números 751 a 756 na SEQ ID NO: 3 ser substituída com TATAAT.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato da atividade de glutaminase intracelular ser OJ U/rng de proteína celular ou menos.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de dita atividade de glutaminase ser igual a ou menor do que a atividade da glutamina sintetase, quando medida como atividade por unidade de peso de proteínas celulares.

4. Método para produzir L-glutamina, caracterizado pelo fato de compreender a) cultivar a bactéria como definida na reivindicação 1 em um meio para produzir e acumular L-glutamina no meio, e b) coletar a L-glutamina do meio.