WO2020122505A1 - L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법 - Google Patents

L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2020122505A1
WO2020122505A1 PCT/KR2019/017124 KR2019017124W WO2020122505A1 WO 2020122505 A1 WO2020122505 A1 WO 2020122505A1 KR 2019017124 W KR2019017124 W KR 2019017124W WO 2020122505 A1 WO2020122505 A1 WO 2020122505A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glutamic acid
strain
corynebacterium
gene
mutant strain
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/017124
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김현영
이선희
김현호
조영일
윤형섭
김석수
Original Assignee
대상 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대상 주식회사 filed Critical 대상 주식회사
Priority to US17/413,156 priority Critical patent/US20220049212A1/en
Priority to CN201980082944.9A priority patent/CN113227381B/zh
Priority to EP19895465.3A priority patent/EP3896165A4/en
Priority to JP2021533622A priority patent/JP2022513813A/ja
Priority to CN202311504949.0A priority patent/CN117568249A/zh
Publication of WO2020122505A1 publication Critical patent/WO2020122505A1/ko
Priority to JP2023032941A priority patent/JP2023071883A/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01182—(R)-Citramalate synthase (2.3.1.182)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)

Definitions

  • the present invention relates to a mutant strain having improved L-glutamic acid production capacity and a method for producing L-glutamic acid using the same, more specifically, the activity of citramalate synthase is attenuated or inactivated, resulting in by-product citramalate Corynebacterium sp. with reduced production of L-glutamic acid and increased production capacity of L-glutamic acid and a method for producing L-glutamic acid using the same.
  • L-glutamic acid is a representative amino acid produced by microbial fermentation, and sodium L-glutamate (MSG) balances and balances the overall taste of food, such as meat, fish, chicken, vegetables, sauces, soups, It is widely used as a seasoning for the production of processed foods for home use because it can enhance the preference of foods such as seasoning and improve the taste of low-salt foods with salt reduced to 30%.
  • MSG sodium L-glutamate
  • L-glutamic acid In order to produce L-glutamic acid, it is usually produced through fermentation using strains of the genus Brevibacterium or Corynebacterium and its mutants. In order to increase the production of L-glutamic acid by microbial culture, to increase the expression of the gene in the L-glutamic acid biosynthetic pathway, increase the number of copies of the gene or modify the promoter of the gene to regulate the enzyme activity on the biosynthetic pathway Methods have been used. Specifically, amplification of a specific gene such as the pyc gene or fasR (US Pat. No. 6,852,516) or the promoter site of the gdh, gltA, icd , pdh and argG genes (US Pat. No. 6,962,805) is performed by L- Glutamic acid production has been increased.
  • amplification of a specific gene such as the pyc gene or fasR (US Pat. No. 6,852,516) or the promote
  • Citramalate synthase ( cimA ) is an enzyme that synthesizes citramalate using acetyl-CoA and pyruvate as substrates.
  • Corynebacterium glutamicum does not have a cimA gene, and Corynebacterium In glutamicum, it is known that the leuA gene, which is highly homologous to the cimA gene, plays the role of citramalate synthase.
  • acetyl-CoA is used as a substrate in the fermentation path of L-glutamic acid
  • the inventors of the present application thus attenuate or inactivate the activity of citramalate synthase to save the substrate acetyl-CoA, thereby further increasing L-glutamic acid productivity and I was sleeping.
  • the yggB gene of Coryneform bacteria is a homolog of the yggB gene of Escherichia coli (FEMS Microbiol Lett. 2003, 218(2), p305-309, Mol Microbiol. 2004, 54(2), p420-438) It has been reported to be a type of mechanosensitive channel (EMBO J. 1999, 18(7):1730-7).
  • EMBO J. 1999, 18(7):1730-7 As a method for conferring L-glutamic acid production capacity to coryneform bacteria, specifically, the effects of the same mutations as in the present invention on L-glutamic acid production have not been reported.
  • the inventors of the present application produced a mutant strain by weakening or inactivating the activity of citramalate synthase and a mutation in YggB protein that is additionally involved in the release of glutamic acid, and the mutant strain has the ability to produce L-glutamic acid.
  • the present invention was completed by confirming the superiority.
  • An object of the present invention is to provide a mutant strain of the genus Corynebacterium ( Corynebacterium sp. ) that has weakened or inactivated citramalate synthase activity and has improved production capacity of L-glutamic acid.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • One aspect of the present invention provides a mutant strain of Corynebacterium sp. , wherein the activity of citramalate synthase is attenuated or inactivated and the production capacity of L-glutamic acid is improved.
  • citramalate synthase means an enzyme that catalyzes the process of converting acetyl-CoA and pyruvate to citramalate and coenzyme A.
  • the "productivity improved" strain means that the productivity of L-glutamic acid is increased compared to the parent strain.
  • mother strain refers to a wild type or mutant strain that is a target of mutation, and includes a target that is directly transformed or transformed with a recombinant vector.
  • the parent strain may be a wild type Corynebacterium glutamicum strain or a strain mutated from a wild type.
  • it can be Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain.
  • the strain of Corynebacterium sp. with improved production capacity of L-glutamic acid has a weakened or inactivated activity of citramalate synthase compared to a parent strain. May be
  • weakened activity means a case where the degree of citramalate synthase enzyme activity in a cell is reduced compared to a parent strain such as a wild type strain or a strain before modification.
  • the weakening is due to a variation in the gene encoding the enzyme and the activity of the enzyme itself decreases compared to the activity of the enzyme possessed by the original microorganism, and the transcription inhibition or translation inhibition of the gene encoding the enzyme is reduced.
  • the expression level of the enzyme is lowered, so that the overall level of enzyme activity in the cell is lower than that of the wild-type strain or the strain before modification, a concept is also included.
  • activation means that the expression of the gene encoding citramalate synthase is not expressed at all or is not expressed as compared to the wild-type strain or the strain before modification.
  • Attenuation or inactivation of citramalate synthase enzyme activity can be achieved by application of various methods well known in the art.
  • a method of replacing the gene encoding the enzyme on the chromosome with a mutated gene so that the activity of the enzyme is reduced, including when the activity of the enzyme is completely removed A method of introducing a mutation into an expression control sequence (eg, a promoter) of a gene on a chromosome encoding the enzyme;
  • a method of deleting all or part of a gene on a chromosome encoding the enzyme A method of introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to a transcript of a gene on the chromosome and inhibits translation from the mRNA to an enzyme;
  • citrate malate synthase may be one encoded by the leuA (2-isopropylmalate synthase) gene.
  • the leuA (2-isopropylmalate synthase) gene has a high homology to the cimA (citramalate synthase) gene, and is known to play a role of citramalate synthase in a strain of the genus Corynebacterium.
  • the leuA gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the activity of citramalate synthase is weakened or inactivated is that the expression of the leuA gene encoding citramalate synthase is reduced, thereby weakening or inactivating the activity of citramalate synthase. It may be done.
  • “reduction of expression” means that the expression level of the gene is reduced than the original expression level, and includes the case where expression is completely inhibited and expression is not achieved.
  • the initial codon of gene translation may be substituted to reduce its expression, or genetically engineered to reduce the expression level of an existing gene.
  • the method of modifying the sequence for expression control is performed by inducing a variation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof in the nucleic acid sequence of the expression control sequence, or the promoter is a weaker promoter. It can be performed by a method such as replacement.
  • the expression control sequence includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence that controls termination of transcription and translation.
  • a gene reducing expression exists in a microorganism to be mutated, for example, by replacing a native promoter that activates the expression of the gene with a weak promoter or introducing mutation, Gene expression can be reduced. Furthermore, the expression of the gene can be reduced by deleting all or part of the existing gene.
  • the decrease in expression of the leuA gene is performed by inducing a sequence variation by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, or replacing with a weaker promoter. And the like.
  • the mutant strain of the genus Corynebacterium in which the leuA gene is deleted according to an embodiment of the present invention is a by-product, the production of citramalate is reduced than that of the parent strain, and acetyl-CoA is saved to increase L-glutamic acid production. Can be .
  • the mutant strain of the genus Corynebacterium comprises at least one leucine selected from the group consisting of leucine, the 93th amino acid, and leucine, the 109th amino acid, among the amino acid sequences of the YggB protein represented by SEQ ID NO: 15. Variations substituted with alanine or valine may be additionally induced.
  • the yggB gene refers to a gene encoding a mechanosensitive channel.
  • yggB gene is Genbank Accession No. in NCBI database. It corresponds to the complementary sequence of the sequence of 1,336,092 to 1,337,693 among the genomic sequences registered as NC_003450, and is also called NCgl1221.
  • the YggB protein encoded by the yggB gene contains GenBank accession No. It is registered as NP_600492.
  • the protein YggB yggB gene encrypted consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • L- The strain having the above mutation may improve the production capacity of L-glutamic acid by increasing the diameter of the pore by removing the methyl group involved in the pores of the YggB protein from which glutamic acid can be released.
  • the mutant strain may be transformed by a vector containing a mutant of the YggB protein by mutation or a polynucleotide encoding a mutant of the YggB protein.
  • vector refers to any medium for cloning and/or transfer of a base into a host cell.
  • the vector may be a replication unit (replicon) capable of binding to other DNA fragments to obtain replication of the combined fragments.
  • replication unit refers to any genetic unit (eg, plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as an autologous unit of DNA replication in vivo, ie, is capable of replication by self-regulation.
  • the vector is not particularly limited as long as it is replicable in the host, and any vector known in the art can be used.
  • the vector used in the construction of the recombinant vector may be a plasmid, cosmid, virus and bacteriophage in a natural state or a recombinant state.
  • pWE15, M13, ⁇ EMBL3, ⁇ EMBL4, ⁇ FIXII, ⁇ DASHII, ⁇ ZAPII, ⁇ gt10, ⁇ gt11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • Usable vectors are not particularly limited, and known expression vectors can be used, but are not limited thereto.
  • transformation is to introduce the gene into the host cell so that it can be expressed in the host cell, and the transformed gene is located in the host cell's chromosome or in addition to the chromosome if expressed in the host cell. Whatever is there can be included without limitation.
  • the mutant strain of Corynebacterium in which the leuA gene according to an embodiment of the present invention is deleted and the YggB protein has undergone mutation has an increased L-glutamic acid production than the parent strain, and an incubation time for producing L-glutamic acid is shortened and efficient. Can produce L-glutamic acid.
  • the strain of genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum .
  • the strain of the genus Corynebacterium is Corynebacterium ammoniagenes , Corynebacterium acetoacidophilum , Corynebacterium acetoacidophilum , Corynebacterium acetoglutamicum ( Corynebacterium acetoglutamicum ), Corynebacterium alkanolyticum , Corynebacterium callunae , Corynebacterium lilium , Corynebacterium melaceae, Corynebacterium melassecola ), Corynebacterium thermo amino to Ness (Corynebacterium thermoaminogenes), Corynebacterium epi when Enschede (Corynebacterium efficiens), or Corynebacterium Herr cool-less (but Corynebacterium herculis the like), but is not limited to such.
  • the strain of the genus Corynebacterium is most preferably Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP.
  • (b) provides a method for producing L-glutamic acid comprising the step of recovering L-glutamic acid from a cultured mutant strain or culture medium.
  • the cultivation may be performed according to appropriate media and culture conditions known in the art, and a person skilled in the art can easily adjust and use the media and culture conditions.
  • the medium may be a liquid medium, but is not limited thereto.
  • the culture method may include, for example, batch culture, continuous culture, fed-batch culture, or a combination culture thereof, but is not limited thereto.
  • the medium must meet the requirements of a particular strain in an appropriate manner, and can be appropriately modified by those skilled in the art.
  • the culture medium for the strain of Corynebacterium can refer to the known literature (Manual of Methods for General Bacteriology.American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), but is not limited thereto.
  • the medium may include various carbon sources, nitrogen sources, and trace element components.
  • Carbon sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid, Fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen source may also be used individually or as a mixture, but is not limited thereto.
  • Sources of phosphorus that can be used include, but are not limited to, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth, but is not limited thereto.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be included.
  • precursors suitable for the culture medium may be used. The medium or individual components may be added batchwise or continuously by an appropriate method to the culture medium during the culture process, but is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid may be added to the microbial culture medium in an appropriate manner to adjust the pH of the culture medium.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester can be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • the temperature of the culture medium may be usually 20°C to 45°C, for example, 25°C to 40°C.
  • the culture period may be continued until useful substances are obtained in a desired production amount, for example, it may be 10 to 160 hours.
  • the step of recovering L-glutamic acid from the cultured mutant strain and the culture medium collects L-glutamic acid produced from the medium using a suitable method known in the art according to the culture method or Can be recovered.
  • a suitable method known in the art according to the culture method or Can be recovered.
  • the step of recovering glutamic acid may remove the biomass by centrifuging the culture at low speed and separate the obtained supernatant through ion exchange chromatography.
  • the step of recovering the L-glutamic acid may include a process for purifying L-glutamic acid.
  • the mutant strain according to an embodiment of the present invention has a reduced or inactivated activity of citramalate synthase, thereby reducing the production amount of by-product citramalate, having excellent L-glutamic acid production capacity, and further mutating the YggB protein.
  • the strain enhances the release of glutamic acid, the production yield of L-glutamic acid is improved, so that L-glutamic acid can be more effectively produced using the mutant strain.
  • Figure 2 shows a pKLA vector prepared to crush the leuA gene in the Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain.
  • Figure 4a shows the structure of the YggB protein.
  • Figure 4b shows the pore structure of the YggB protein in which the amino acid sequence of YggB protein is substituted with alanine for the 93th leucine.
  • 4C shows the pore structure of the YggB protein in which the 109th leucine is substituted with alanine in the amino acid sequence of the YggB protein.
  • Figure 5 shows the pKY93 vector prepared to replace the 93th amino acid in the amino acid sequence of the YggB protein in the I10 strain with another amino acid.
  • Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain is a mutant strain obtained by treating nitrosoguanidine (NTG), which causes DNA mutation in the I6 strain, and has molasses resistance, making molasses with low raw material cost as the main carbon source. It can be used to produce L-glutamic acid with high yield (Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0034718).
  • NVG nitrosoguanidine
  • Corynebacterium glutamicum I6 (hereinafter, I6) and corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP (hereinafter, KCTC 11558BP) having glutamic acid production capacity were analyzed for the amount of metabolite and L-glutamic acid in cells.
  • KCTC 11558BP and I6 25 ml of KCTC 11558BP and I6 in CM liquid medium (glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 l, pH 6.8, 1L) And incubated at 30°C at 200 rpm.
  • Cells were separated from the culture via rapid vacuum filtration (Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA) when cell growth reached an exponential phase during cultivation.
  • citramalate is produced by the cimA (citramalate synthase) gene in E. coli, but the cimA gene is not present in Corynebacterium glutamicum.
  • the leuA gene which is highly homologous to the cimA gene, is known to act as a citramalate synthase, so leuA (2-isopropylmalate synthase) is crushed to break down the byproduct citramalate. It was intended to further increase the productivity of L-glutamic acid by reducing and saving acetyl-CoA, a substrate used to prepare L-glutamic acid.
  • SEQ ID NO: 14 shows the nucleotide sequence of the leuA gene.
  • Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP having L-glutamic acid production capacity was used for leuA gene (NCgl0245) crushing in Corynebacterium glutamicum.
  • the chromosomal DNA of the Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain was isolated and used as a template as primers 1 and 2 and primers 3 and 4, respectively, at 95°C for 30 seconds and 57°C.
  • PCR was performed by repeating 30 cycles under conditions of 30 seconds at 72°C and 60 seconds at, and the obtained PCR products (H1 and H2 in FIG. 2) were purified.
  • the purified PCR product was used again as a template for crossover polymerase chain reaction (PCR) and amplified once again with 1 and 4 primer sets.
  • PCR crossover polymerase chain reaction
  • the 1600bp crossover PCR product for deletion of the leuA gene was digested with Xba I and Sal I restriction enzymes (Takara, Japan) and then pK19mobSacB vector digested with the same restriction enzyme (Gene, 145: 69-73, 1994).
  • a vector for leuA gene crushing was prepared by cloning with pKLA .
  • Figure 2 shows a pKLA vector prepared to crush the leuA gene in the Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain.
  • Primer name Sequence 5'-3' Sequence number primer 1 5'-TCTAGACCCTTCCCGGAAACCCCCAC-3' SEQ ID NO: 1 primer 2 5'-GGGGTTTCGATCTTGGCAGG-3' SEQ ID NO: 2 primer 3 5'-ACCGCGCGCTGGACGTCAAC-3' SEQ ID NO: 3 primer 4 5'-GTCGACTGGCCGAAACGCTTAGCGCT-3' SEQ ID NO: 4
  • Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain (hereinafter referred to as ⁇ transformation'') using the method of van der Rest (Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) to enable transformation through an electrocompetent cell preparation method KCTC 11558BP) was introduced with the vector pKLA prepared in Example 2-1 through electroshock.
  • KCTC 11558BP strain was first cultured in 100ml of 2YT medium with 2% glucose added (Tripton 16g/l, yeast extract 10g/l, sodium chloride 5g/l), and 1mg/ml in the same medium except glucose Concentrations of isonicotinic acid hydrazine and 2.5% glycine were added. Then, after inoculating the seed culture solution so that the OD 610 value was 0.3, and then incubating at 18°C and 180 rpm for 12 to 16 hours, the OD 610 value was 1.2 to 1.4. After standing on ice for 30 minutes, centrifugation was performed at 4°C and 4000 rpm for 15 minutes.
  • Dilution to 10 -5 to 10 -7 was applied to antibiotic-free plates (containing 10% sucrose) and kanamycin resistance. Without this, strains growing in a medium containing 10% sucrose were selected. The selected strain was identified by the Corynebacterium glutamicum strain in which the leuA gene was deleted using the primers 1 and 4 set in Table 2, and the defective strain in which the leuA gene was deleted was designated as “I10”. 3 shows the positions of primers 1 and 4 in the portion where the leuA gene is deleted.
  • Example 2-3 leuA Determining the nutritional needs of a defective strain (I10)
  • the leuA- deficient strain (hereinafter referred to as I10) prepared in Example 2-2 is a leucine auxotrophic strain because the leuA gene is defective, and to confirm this, the minimum medium and leucine-added medium prepared with the composition shown in Table 3 below Smeared, and cultured at 30° C. for 24 hours, the degree of growth was measured and the results are shown in Table 4.
  • the growth of the I10 strain was drastically lowered and the growth was restored by adding leucine compared to the parent strain Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP strain in the minimal medium without leucine added. Therefore, the leuA gene defect was confirmed in the I10 strain.
  • LeuA- deficient strain (hereinafter, I10) and Corynebacterium glutamicum KCTC 11558BP (hereinafter, KCTC 11558BP) were cultured at 30° C. for 24 hours using an active plate medium prepared at the contents shown in Table 5 below. Thereafter, 10 ml of the L-glutamic acid flask medium prepared at the content shown in Table 6 was put in a 100 ml flask, and the bacteria cultured above were inoculated with a loop, followed by incubation at 30°C, 200 rpm, for 48 hours. The culture end liquid was used to perform L-glutamic acid production and intracellular metabolite analysis. L-glutamic acid production and relative amount of citramalate were carried out in the same manner as described in Example 1.
  • Table 7 shows the L-glutamic acid production and relative citramalate amounts in I10 and KCTC 11558BP. As shown in Table 7, it was confirmed that the production of L-glutamic acid in the I10 strain increased and citramalate decreased significantly.
  • Active plate medium composition table glucose 5g/L Yeast extract 10g/L urea 3g/L KH 2 PO 4 1g/L Biotin 2 ⁇ g/L Soybean hydrolyzate 0.1% v/v Leucine 50mg/L Agar 20g/L pH 7.5
  • L-glutamic acid flask medium composition table glucose 70g/L MgSO 4 . 7H 2 O 0.4g/L urea 2g/L KH 2 PO 4 1g/L Soybean hydrolyzate 1.5% v/v (NH 4 ) 2 SO 4 5g/L FeSO 4 . 7H 2 O 10mg/L MnSO 4 . 5H 2 O 10mg/L Thiamine-HCl 200 ⁇ g/L Biotin 2 ⁇ g/L Calcium carbonate 50g/L pH 7.6
  • YggB is a mechanosensitive channel homolog that is known to play an important role in the release of L-glutamic acid from Corynebacterium glutamicum.
  • SEQ ID NO: 15 shows the amino acid sequence of the YggB protein.
  • Figure 4a shows the structure of the YggB protein. The protein structure of YggB was analyzed to find mutations that could enhance excretion.
  • Figure 4b shows the pore structure of the YggB protein in which the amino acid sequence of the YggB protein is substituted with alanine for the 93th leucine
  • Figure 4c shows the pore of the YggB protein in which the amino acid sequence of the YggB protein is substituted for the 109th leucine by alanine ( pore) structure.
  • Example 4-1 Construction of strain that substituted amino acid 93 in amino acid sequence of YggB protein
  • the chromosomal DNA of the I10 strain prepared in Example 2-2 was separated and used as a template, using 5,6 sets of primers and 7,8 sets of primers at 95°C for 30 seconds and at 57°C, respectively.
  • PCR was performed by repeating 30 cycles at 30 seconds and at 72° C. for 60 seconds, and the obtained PCR product was purified.
  • the purified PCR product was used as a template and amplified by crossover PCR using primers 5 and 8.
  • the amplified product was cleaved using Xba I and Sal I restriction enzymes (Takara, Japan) after confirming the variation through sequencing.
  • the pK19mobSacB vector was cut with the same restriction enzyme and ligated with the amplified crossover PCR product to produce a vector, which was named pKY93.
  • the primer sequences used are listed in Table 8. 5 shows a pKY93 vector for substituting the 93rd amino acid in the amino acid sequence of the YggB protein in the I10 strain.
  • primer Sequence 5'-3' Sequence number primer 5 5'-TCTAGATTGAGAAGCTGCCACATTCAC-3' SEQ ID NO: 5 primer 6 5'-GCAGCGCCCGCGGCAGAGAAACCAAAAGCC-3' SEQ ID NO: 6 primer 7 5'-CTCTGCCGCGGGCTGCGATTCCGGCAAC-3' SEQ ID NO: 7 primer 8 5'-GTCGACGATCTGGTTTTGCTGTTTCTTCCGG-3' SEQ ID NO: 8 primer 9 5'-GACTGCGCACCAGCACCAATGGCAGCTGAC-3' SEQ ID NO: 9 primer 10 5'-GGTGCTGGTGCGCAGTCGATTGTTGCGGAC-3' SEQ ID NO: 10 primer 11 5'-TCTAGAGGAATCAGGATTCTCACAAAGTTCAGGC-3' SEQ ID NO: 11 primer 12 5'-CGGAATCGCAGTGCCCGCGAGAGAAACC-3' SEQ ID NO: 12 primer 13 5'-CGCGGGCACTGCGATTCCGGCAACCATTGC
  • the transformed strain was selected by introducing the pKY93 vector into the I10 strain and named it I10-93.
  • leucine the 93rd amino acid of the YggB protein, is substituted with alanine.
  • Example 4- Construction of strain that substituted the 109th amino acid in the amino acid sequence of YggB protein
  • PCR Isolate the chromosomal DNA of the I10 strain prepared in Example 2-2 and use it as a template, using 5, 9 sets of primers and 10 and 8 sets of primers, respectively, at 95°C for 30 seconds and at 57°C.
  • PCR was performed by repeating 30 cycles at 30 seconds and at 72° C. for 60 seconds, and the obtained PCR product was purified.
  • the purified PCR product was used as a template and amplified by crossover PCR using primers 5 and 8.
  • the amplified product was cleaved using Xba I and Sal I restriction enzymes (Takara, Japan) after confirming the variation through sequencing.
  • the pK19mobSacB vector was digested with the same restriction enzyme and ligated with the amplified crossover PCR product to produce a vector, which was named pKY109.
  • the primer sequences used are listed in Table 8.
  • the transformed strain was selected by introducing the pKY109 vector into the I10 strain in the same manner as in Example 2-2, and this was named I10-109.
  • I10-109 leucine, the 109th amino acid of the YggB protein, is substituted with alanine.
  • L-glutamic acid production was increased in the I10-93 and I10-109 mutant strains that induced pore expansion of the YggB protein than the I10 strain.
  • the production amount of L-glutamic acid was significantly increased than that of I10, and the fermentation time was also shortened from 48 hours to 44 hours, thereby efficiently producing L-glutamic acid.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 L-글루탐산의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 변이 균주는 시트라말레이트 신타아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어 부산물인 시트라말레이트의 생산량이 감소되고, L-글루탐산의 생산능이 우수하며, 추가적으로 YggB 단백질을 변이시킨 균주는 글루탐산의 배출을 강화시켜 L-글루탐산의 생산 수율이 향상되므로, 상기 변이 균주를 이용하면 보다 효과적으로 L-글루탐산을 제조할 수 있다.

Description

L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 L-글루탐산의 제조 방법
본 발명은 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 L-글루탐산의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되어 부산물인 시트라말레이트의 생산량이 감소되고, L-글루탐산의 생산능이 증가된 코리네박테리움 속( Corynebacterium sp.) 변이 균주 및 이를 이용하는 L-글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.
L-글루탐산은 미생물 발효에 의해 생산되는 대표적인 아미노산으로, L-글루탐산 나트륨(monosodium L-glutamate, MSG)은 음식의 전체적인 맛에 균형과 조화를 이루도록 하여 고기, 생선, 닭, 야채, 소스, 수프, 양념 등 식품의 선호도를 높여주고 소금을 30%까지 줄인 저염 식품의 맛을 증진시켜줄 수 있어 가정용 및 가공식품 생산을 위한 조미료로 널리 이용되고 있다.
L-글루탐산을 생산하기 위해 통상적으로, 주로 브레비박테리움( Brevibacterium) 이나 코리네박테리움( Corynebacterium) 속 균주 및 그 변이주를 이용해 발효를 통해 생산한다. 미생물 배양에 의한 L-글루탐산의 생산량을 증가시키기 위해, L-글루탐산 생합성 경로에서 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 해당 유전자의 복사수를 증가시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜 생합성 경로 상의 효소 활성을 조절하는 방법이 이용되어 왔다. 구체적으로, pyc 유전자나 fasR과 같은 특정 유전자의 증폭이나(미국 특허 제 6,852,516호), gdh, gltA, icd, pdh 및 argG 유전자의 프로모터(promoter) 부위를 조작하여(미국특허 제6,962,805호) L-글루탐산 생산량을 증가시킨 바 있다.
시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase, cimA)는 아세틸-CoA와 피루베이트를 기질로 하여 시트라말레이트를 합성하는 효소로서, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 cimA 유전자는 존재하지 않고, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 cimA 유전자와 상동성이 높은 leuA 유전자가 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 역할을 한다고 알려져 있다.
L-글루탐산의 발효경로에서 기질로서 아세틸-CoA가 사용되므로, 이에 본 출원의 발명자들은 시트라말레이트 신타아제의 활성을 약화 또는 불활성화시켜 기질인 아세틸-CoA를 절약하여 L-글루탐산 생산성을 더욱 높이고자 하였다.
한편, 코리네형 세균의 yggB 유전자는 대장균( Escherichia coli)의 yggB 유전자의 동족체이고(FEMS Microbiol Lett. 2003, 218(2), p305-309, Mol Microbiol. 2004, 54(2), p420-438), 기계적감각 통로(mechanosensitive channel)의 일종인 것으로 보고되어 있다(EMBO J. 1999, 18(7):1730-7). 코리네형 세균에게 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법으로서, 구체적으로 본 발명과 같은 변이가 L-글루탐산 생산에 미치는 영향은 보고되어 있지 않다.
이에 본 출원의 발명자들은 시트라말레이트 신타아제의 활성을 약화 또는 불활성화시킨 변이 균주 및 추가적으로 글루탐산 배출에 관여하는 YggB 단백질에 변이를 유발하여 변이 균주를 제작하고, 상기 변이 균주가 L-글루탐산 생산능이 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-1138289호
본 발명의 목적은 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되고 L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속( Corynebacterium sp.) 변이 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은
(a) 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 변이 균주 또는 배양 배지에서 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루탐산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되고 L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속( Corynebacterium sp.) 변이 균주를 제공한다.
본 발명에서, "시트라말레이트 신타아제"란 아세틸-CoA와 파이루베이트를 시트라말레이트 및 코엔자임 A(coenzyme A)로 변환하는 과정을 촉매하는 효소를 의미한다.
본 발명에서, "생산능이 향상된" 균주는 모균주에 비해 L-글루탐산의 생산성이 증가된 것을 의미한다.
본 발명에서, "모균주"는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이 균주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 야생형으로부터 변이된 균주일 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속( Corynebacterium sp.) 변이 균주는 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 활성이 모균주에 비해 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서, "활성이 약화"되었다는 것은 세포 내에서 시트라말레이트 신타아제 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주 등 모균주에 비하여 감소된 경우를 의미한다. 상기 약화는 효소를 암호화하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 전사(transcription) 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 상기 효소의 발현 수준이 저하되어 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다. 또한, 본 발명에서, "불활성화"란, 시트라말레이트 신타아제를 암호화하는 유전자의 발현이 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나, 발현이 되더라도 그 활성이 없는 상태를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 시트라말레이트 신타아제 효소 활성의 약화 또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 활성이 완전히 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로 염색체상의 상기 효소를 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터)에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나, 활성이 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 시트라말레이트 신타아제는 leuA(2-isopropylmalate synthase) 유전자에 의하여 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명에서, leuA(2-isopropylmalate synthase) 유전자는 cimA(citramalate synthase) 유전자와 상동성이 높고, 코리네박테리움 속 균주에서 시트라말레이트 신타아제의 역할을 한다고 알려져 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 leuA 유전자는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 이루어져 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 시트라말레이트 신타아제의 활성이 약화 또는 불활성화된 것은 시트라말레이트 신타아제를 암호화하는 leuA 유전자의 발현이 감소되어 시트라말레이트 신타아제의 활성이 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서, "발현의 감소"는 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소된 것을 의미하며, 발현이 완전히 저해되어 발현이 이루어지지 않은 경우를 포함한다. 미생물에서 발현을 감소시키고자 하는 경우에는 유전자 번역의 개시 코돈을 치환시켜 그 발현을 감소시키거나, 기존에 존재하는 유전자의 발현량이 감소하도록 유전공학적으로 조작할 수 있다. 발현 조절을 위하여 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 프로모터를 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 발현을 감소시키는 유전자가 변이시키고자 하는 미생물 내에 존재하는 경우, 예를 들어, 상기 유전자의 발현을 작동시키는 고유의 프로모터(native promoter)를 약한 프로모터(weak promoter)로 치환하거나 혹은 변이를 도입함으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 나아가, 기존 유전자의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 상기 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, leuA 유전자의 발현이 감소되는 것은 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 leuA 유전자가 결실된 코리네박테리움 속 변이 균주는 부산물로서 시트라말레이트(citramalate) 생산량이 모균주보다 감소하고, 아세틸-CoA를 절약하여 L-글루탐산 생산량이 증가할 수 있다 .
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 서열번호 15로 표시되는 YggB 단백질의 아미노산 서열 중에서 93번째 아미노산인 류신 및 109번째 아미노산인 류신으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 류신을 알라닌 또는 발린으로 치환시킨 변이가 추가적으로 유발된 것일 수 있다.
본 발명에서 yggB 유전자는, 기계적 감각통로(mechanosensitive channel)를 암호화하는 유전자를 의미한다. yggB 유전자는, NCBI 데이터베이스에 Genbank Accession No. NC_003450으로 등록되어 있는 게놈 서열 중 1,336,092 내지 1,337,693의 서열의 상보 서열에 상당하고, NCgl1221이라고도 칭한다. yggB 유전자로 암호화되는 YggB 단백질은, GenBank accession No. NP_600492호로서 등록되어 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, yggB 유전자가 암호화된 YggB 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
일 구체예에 따르면, 서열번호 15로 표시되는 YggB 단백질의 아미노산 서열 중에서 93번째 아미노산인 류신 및 109번째 아미노산인 류신으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 류신을 알라닌 또는 발린으로 치환시킨 변이에 의하여, L-글루탐산이 배출될 수 있는 YggB 단백질의 포어 내부에 관여하는 메틸 그룹이 제거되어 포어의 직경이 증가되는 것에 의하여 상기 변이를 갖는 균주는 L-글루탐산의 생산능이 향상될 수 있다.
구체적으로 상기 변이 균주는 돌연변이에 의해 상기 YggB 단백질의　변이체를 포함하거나, 상기 YggB 단백질의　변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명에서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptⅡ계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 leuA 유전자가 결실되고 YggB 단백질에 변이가 일어난 코리네박테리움 속 변이 균주는 모균주보다 L-글루탐산 생산량이 증가되고, L-글루탐산 생산을 위한 배양시간이 단축되어 효율적으로 L-글루탐산을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 암모니아 게네스( Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 아세토액시도필럼( Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰( Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰( Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내( Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 릴리움( Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라( Corynebacterium melassecola), 코리네 박테리움 써모아미노게네스( Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스( Corynebacterium efficiens), 또는 코리네박테리움 헤르쿨리스( Corynebacterium herculis) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 양상은
(a) 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 배양된 변이 균주 또는 배양 배지에서 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루탐산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있고 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 코리네박테리아 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌(Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이 균주 및 배양 배지에서 L-글루탐산을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-글루탐산을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 글루탐산을 회수하는 단계는 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-글루탐산을 회수하는 단계는 L-글루탐산을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 변이 균주는 시트라말레이트 신타아제의 활성이 약화 또는 불활성화되어 부산물인 시트라말레이트의 생산량이 감소되고, L-글루탐산의 생산능이 우수하고, 추가적으로 YggB 단백질을 변이시킨 균주는 글루탐산의 배출을 강화시켜 L-글루탐산의 생산 수율이 향상되므로, 상기 변이 균주를 이용하면 보다 효과적으로 L-글루탐산을 제조할 수 있다.
도 1은 시트라말레이트의 합성 경로를 나타낸다.
도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에서 leuA 유전자를 파쇄하기 위해 제조한 pKLA 벡터를 나타낸다.
도 3은 leuA 유전자가 결실된 부분에서 프라이머(primer) 1, 4의 위치를 나타낸다.
도 4a는 YggB 단백질의 구조를 나타낸다.
도 4b는 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 류신을 알라닌으로 치환한 YggB 단백질의 포어(pore) 구조를 나타낸다.
도 4c는 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 109번째 류신을 알라닌으로 치환한 YggB 단백질의 포어(pore) 구조를 나타낸다.
도 5는 I10 균주에서 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키기 위해 제조한 pKY93 벡터를 나타낸다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 발효 종료액의 세포 내 대사체 분석
코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주는 I6 균주에 화학적으로 DNA 변이를 일으키는 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG)을 처리하여 얻어진 변이 균주로서, 당밀 내성을 가짐으로써 원료가가 저렴한 당밀을 주된 탄소원으로 사용하여 높은 수율로 L-글루탐산을 생산할 수 있다(대한민국 공개특허 제10-2011-0034718호).
글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 I6(이하, I6) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP(이하, KCTC 11558BP)의 세포 내부의 대사체 물질 및 L-글루탐산 양을 분석하였다.
KCTC 11558BP 및 I6를 각각 CM 액상 배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 l, pH 6.8, 1L 기준) 25㎖에 접종한 후 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 도중 세포 성장이 지수증식기(exponential phase)에 도달하면 급속 진공 여과(rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA)를 통해 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포가 흡착된 필터를 10㎖의 냉각수로 2회 세척한 후, 5M 모르폴린 에탄설폰산(morpholine ethanesulfonic acid) 및 5M 메티오닌 설폰(methionine sulfone)을 함유한 메탄올에 10분간 담가두어 반응을 정지시켰다. 이로부터 얻은 추출액에 동량의 클로로포름과 0.4배 부피의 물을 혼합한 후, 수층(aqueous phase)만을 스핀 칼럼(spin column)에 적용하여 단백질 오염물을 제거하였다. 여과된 추출액을 모세관 전기영동 질량분석기(capillary electrophoresis mass spectrometry)를 사용하여 상대적인 시트라말레이트 양을 분석하고, 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
또한, C18 컬럼(Apollo C18, 5㎛, 150mm Х 4.6mm)을 이용한 고성능액체크로마토그래피(HPLC; Agilent, 미국)를 수행하여, L-글루탐산 생산량을 분석하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재하였다. KH 2PO 4 8.85g/L, 수산화 테트라부틸 암모늄 용액(Tetrabutyl ammonium hydroxide solution) 1.652g/L, 아세토나이트릴 10㎖/L, 아지드화 나트륨(sodium azide) 12.5mg/L의 조성을 갖고 pH 3.15(인산으로 조정)인 분석버퍼를 0.45㎛ membrane-filter(HA)로 필터레이션하여 사용하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, KCTC 11558BP가 생산하는 시트라말레이트(citramalate)가 대조군인 I6에 비해 약 3배 증가한 것을 확인하였다.
I6 (대조군) KCTC 11558BP
L-글루탐산 생산량(g/L) 34 37.5
시트라말레이트(상대량) 130.2 330.1
실시예 2. leuA 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주의 제조
도 1은 시트라말레이트의 합성 경로를 나타낸다. 시트라말레이트는 대장균에서 cimA(citramalate synthase) 유전자에 의해서 생성되나 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 cimA 유전자는 존재하지 않는다. 하지만 코리네박테리움 글루타미쿰에서 cimA 유전자와 상동성이 높은 leuA 유전자가 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 역할을 한다고 알려져 있으므로 leuA(2-isopropylmalate synthase)를 파쇄하여 부산물인 시트라말레이트를 감소시키고 L-글루탐산을 제조하는데 사용되는 기질인 아세틸-CoA를 절약하여 L-글루탐산의 생산성을 더욱 높이고자 하였다. 서열번호 14는 leuA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
실시예 2-1. leuA 유전자 파쇄 벡터의 제조
코리네박테리움 글루타미쿰에서 leuA 유전자(NCgl0245) 파쇄를 위해 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP를 이용하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주의 염색체 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하기 프라이머(primer) 1, 2 세트와 프라이머(primer) 3, 4 세트를 각각 이용하여, 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 60초의 조건으로 30 사이클을 반복하여 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물(도 2에서 H1 및 H2)을 정제하였다.
정제한 PCR 산물은 다시 크로스오버 PCR(crossover polymerase chain reaction)을 위한 주형으로 사용되어 프라이머 1, 4 세트로 다시 한번 증폭하였다.
leuA 유전자를 결손시키기 위한 1600bp의 크로스오버 PCR 산물은 정제 후 XbaI 및 SalI 제한효소(Takara, 일본)로 절단한 뒤 동일한 제한효소로 절단한 pK19mobSacB 벡터(Gene, 145: 69-73, 1994)로 클로닝하여 leuA 유전자 파쇄용 벡터를 제조하였고, 이를 pKLA로 명명하였다. 도 2는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에서 leuA 유전자를 파쇄하기 위해 제조한 pKLA 벡터를 나타낸다.
프라이머 이름 서열(5'-3') 서열번호
primer 1 5'-TCTAGACCCTTCCCGGAAACCCCCAC-3' 서열번호 1
primer 2 5'-GGGGTTTCGATCTTGGCAGG-3' 서열번호 2
primer 3 5'-ACCGCGCGCTGGACGTCAAC-3' 서열번호 3
primer 4 5'-GTCGACTGGCCGAAACGCTTAGCGCT-3' 서열번호 4
실시예 2-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 형질전환 및 leuA 결손 변이 균주 제조
van der Rest의 방법(Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999)을 사용하여 일렉트로컴피턴트 셀 제조법을 통하여 형질전환이 가능하게 만든 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주(이하, KCTC 11558BP)에 실시예 2-1에서 제조된 벡터 pKLA를 전기충격을 통하여 도입시켰다.
구체적으로, 2% 포도당이 첨가된 2YT 배지(트립톤 16g/ℓ, 효모추출물 10g/ℓ, 염화나트륨 5g/ℓ) 100㎖에서 KCTC 11558BP 균주를 1차 배양하고, 포도당을 제외한 동일 배지에 1mg/㎖ 농도의 이소니코틴산 히드라진(isonicotinic acid hydrazine) 및 2.5% 글라이신(glycine)을 첨가하였다. 그 다음, OD 610값이 0.3이 되게 종배양액을 접종한 후, 18℃, 180rpm으로 12 내지 16시간 배양하여 OD 610값이 1.2 내지 1.4가 되도록 하였다. 얼음에서 30분간 방치 한 후, 4℃, 4000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 그 후 상등액을 버리고 침전된 KCTC 11558BP 균주를 10% 글리세롤 용액으로 4회 세척하고, 최종적으로 10% 글리세롤 용액 0.5㎖에 재현탁하였다. 전기천공법(Electroporation)은 바이오-라드(Bio-Rad) 일렉트로포레이터(electroporator)를 사용하여 수행하였다. 일렉트로포레이션 큐벳(0.2 mm)에 상기 방법으로 제조한 컴피턴트 셀(competent cell)을 넣고 실시예 2-1에서 제조한 pKLA 벡터를 첨가한 후, 2.5kV, 200Ω 및 12.5㎌의 조건으로 전기충격을 가하였다. 전기충격이 끝난 즉시 재생(Regeneration) 배지(Brain Heart infusion 18.5 g/ℓ, 소비톨 0.5 M) 1㎖을 첨가하고 46℃에서 6분간 열처리하였다. 그 후 실온에서 식힌 뒤 15㎖ 캡 튜브로 옮겨 30℃에서 2시간 배양하고 선별 배지(트립톤 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 효모추출물 2.5g/ℓ, Brain Heart infusion powder 18.5g/ℓ, 아가 15g/ℓ, 소비톨 91g/ℓ, 카나마이신(kanamycine) 20㎍/ℓ)에 도말 하였다. 30℃에서 72시간 배양하여 생성된 콜로니는 BHI 배지에서 정지기까지 배양하여 2차 재조합을 유도했으며 10 -5 내지 10 -7까지 희석하여 항생제가 없는 평판(10% sucrose 함유)에 도말하여 카나마이신 내성이 없고 10% 수크로오스가 포함된 배지에서 성장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 상기 표 2에 기재된 프라이머 1, 4 세트를 사용하여 leuA 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 확인하였으며, leuA 유전자가 결실된 결손주를 "I10"으로 명명하였다. 도 3은 leuA 유전자가 결실된 부분에서 프라이머 1, 4의 위치를 나타낸다.
실시예 2-3. leuA 결손주(I10)의 영양 요구성 확인
상기 실시예 2-2에서 제조된 leuA 결손주(이하, I10)는 leuA 유전자가 결손되어 있으므로 류신 영양요구성 균주가 되며 이를 확인하기 위하여 하기 표 3의 조성으로 제조한 최소배지 및 류신 첨가배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 생육 정도를 측정하여 그 결과를 표 4에 기재하였다.
최소배지 조성표
포도당 20g/L
MgSO 4. 7H 2O 0.5g/L
FeSO 4. 7H 2O 20mg/L
MnSO 4. 5H 2O 20mg/L
urea 2.5g/L
(NH 4) 2SO 4 5g/L
KH 2PO 4 1.5g/L
K 2HPO 4 1.5g/L
티아민-HCl 200㎍/L
바이오틴 200㎍/L
니코틴산 200㎍/L
비타민B2 200㎍/L
시아노코발아민(cyanocobalamine) 100㎍/L
표 4에 나타난 바와 같이 류신을 첨가하지 않은 최소배지에서 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP 균주에 비해 I10 균주의 생육이 급격히 저하되었고 류신을 첨가함으로써 생육이 회복되었다. 따라서 I10 균주에서 leuA 유전자 결손을 확인 하였다.
KCTC 11558BP I10
최소배지 ++++ +
최소배지 + 50ppm 류신 ++++ ++++
실시예 3. leuA 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(I10)의 L-글루탐산 및 시트라말레이트 생산량 확인
하기 표 5에 기재된 함량으로 제조된 활성 평판 배지를 이용하여 leuA 결손주(이하, I10) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 11558BP(이하, KCTC 11558BP)를 30℃에서 24시간 배양하였다. 그 후 하기 표 6에 기재된 함량으로 제조된 L-글루탐산 플라스크 배지 10㎖을 100㎖ 플라스크에 넣어 상기에서 배양한 균을 루프로 접종하여 30℃, 200rpm, 48시간 배양하였다. 배양 종료액은 L-글루탐산 생산량과 세포 내 대사체 분석을 수행하는데 사용되었다. L-글루탐산 생산량과 상대적인 시트라말레이트 양은 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 수행되었다.
표 7은 I10 및 KCTC 11558BP에서의 L-글루탐산 생산량 및 상대적인 시트라말레이트 양을 나타낸다. 표 7에 나타난 바와 같이, I10 균주에서 L-글루탐산의 생산량은 증가하고 시트라말레이트는 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
활성 평판배지 조성표
포도당 5g/L
효모추출물 10g/L
urea 3g/L
KH 2PO 4 1g/L
바이오틴 2㎍/L
대두가수분해물 0.1% v/v
류신 50㎎/L
아가(agar) 20g/L
pH 7.5
L-글루탐산 플라스크 배지 조성표
포도당 70g/L
MgSO 4. 7H 2O 0.4g/L
urea 2g/L
KH 2PO 4 1g/L
대두가수분해물 1.5% v/v
(NH 4) 2SO 4 5g/L
FeSO 4. 7H 2O 10㎎/L
MnSO 4. 5H 2O 10㎎/L
티아민-HCl 200㎍/L
바이오틴 2㎍/L
탄산칼슘 50g/L
pH 7.6
KCTC 11558BP I10
L-글루탐산 생산량 (g/L) 37.5 39.7
시트라말레이트(상대량) 320.4 8.5
실시예 4. YggB 변이 균주의 제조
leuA 결손주(I10)의 대사체 분석 결과 세포내부에 많은 L-글루탐산이 쌓여있는 것으로 확인되어 L-글루탐산의 배출을 강화시키고자 하였다.
YggB는 기계적 감각통로의 동족체(mechanosensitive channel homolog)로써 코리네박테리움 글루타미쿰에서 L-글루탐산 배출에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 서열번호 15는 YggB 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4a는 YggB 단백질의 구조를 나타낸다. YggB의 단백질 구조를 분석하여 배출을 강화할 수 있는 변이를 탐색하였다.
도 4b는 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 류신을 알라닌으로 치환한 YggB 단백질의 포어(pore) 구조를 나타내고, 도 4c는 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 109번째 류신을 알라닌으로 치환한 YggB 단백질의 포어(pore) 구조를 나타낸다.
실시예 4-1. YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 아미노산을 치환시킨 균주의 제작
도 4b에 나타난 바와 같이, L-글루탐산 이동통로를 확장하기 위하여 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 류신을 알라닌으로 치환시 포어 내부의 좁은 부분에 관여하는 메틸그룹이 제거되어 포어의 직경이 증가 할 것으로 추정하여 변이 균주를 제작하였다.
실시예 2-2에서 제작한 I10 균주의 염색체 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하여 프라이머(primer) 5,6 세트 및 프라이머(primer) 7,8 세트를 각각 이용하여 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 60초의 조건으로 30 사이클을 반복하여 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 주형으로 사용하고 프라이머 5,8을 이용하여 크로스오버 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물은 염기서열 분석을 통해 변이를 확인한 후 XbaI, SalI 제한효소(Takara, 일본)를 이용하여 절단하였다. pK19mobSacB 벡터를 동일한 제한효소로 절단하고 상기 증폭된 크로스오버 PCR 산물과 라이게이션하여 벡터를 제작하였고, 이를 pKY93로 명명하였다. 사용한 프라이머 서열은 표 8에 기재하였다. 도 5는 I10 균주에서 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 93번째 아미노산을 치환시키기 위한 pKY93 벡터를 나타낸다.
프라이머 서열(5'-3') 서열번호
primer 5 5'-TCTAGATTGAGAAGCTGCCACATTCAC-3' 서열번호 5
primer 6 5'-GCAGCGCCCGCGGCAGAGAAACCAAAAGCC-3' 서열번호 6
primer 7 5'-CTCTGCCGCGGGCGCTGCGATTCCGGCAAC-3' 서열번호 7
primer 8 5'-GTCGACGATCTGGTTTTGCTGTTTCTTCCGG-3' 서열번호 8
primer 9 5'-GACTGCGCACCAGCACCAATGGCAGCTGAC-3' 서열번호 9
primer 10 5'-GGTGCTGGTGCGCAGTCGATTGTTGCGGAC-3' 서열번호 10
primer 11 5'-TCTAGAGGAATCAGGATTCTCACAAAGTTCAGGC-3' 서열번호 11
primer 12 5'-CGGAATCGCAGTGCCCGCGAGAGAGAAACC-3' 서열번호 12
primer 13 5'-CGCGGGCACTGCGATTCCGGCAACCATTGC-3' 서열번호 13
상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 I10 균주에 상기 pKY93 벡터를 도입하여 형질전환된 균주를 선별하여 이를 I10-93으로 명명하였다. I10-93 변이 균주는 YggB 단백질의 93번째 아미노산인 류신이 알라닌으로 치환되어 있다.
실시예 4-2. YggB 단백질의 아미노산 서열에서 109번째 아미노산을 치환시킨 균주의 제작
도 4c에 나타난 바와 같이, L-글루탐산 이동통로를 확장하기 위하여 YggB 단백질의 아미노산 서열에서 109번째 류신을 알라닌으로 치환시 포어 내부의 좁은 부분에 관여하는 메틸그룹이 제거되어 포어의 직경이 증가 할 것으로 추정하여 변이 균주를 제작하였다.
실시예 2-2에서 제작한 I10 균주의 염색체 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하여 프라이머(primer) 5, 9 세트 및 프라이머(primer) 10, 8 세트를 각각 이용하여 95℃에서 30초, 57℃에서 30초, 72℃에서 60초의 조건으로 30 사이클을 반복하여 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 주형으로 사용하고 프라이머 5, 8을 이용하여 크로스오버 PCR로 증폭하였다. 증폭된 산물은 염기서열 분석을 통해 변이를 확인한 후 XbaI, SalI 제한효소(Takara, 일본)를 이용하여 절단하였다. pK19mobSacB 벡터를 동일한 제한효소로 절단하고, 상기 증폭된 크로스오버 PCR 산물과 라이게이션하여 벡터를 제작하였고, 이를 pKY109로 명명하였다. 사용한 프라이머 서열은 표 8에 기재하였다.
상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 I10 균주에 상기 pKY109 벡터를 도입하여 형질전환된 균주를 선별하여 이를 I10-109으로 명명하였다. I10-109 변이 균주는 YggB 단백질의 109번째 아미노산인 류신이 알라닌으로 치환되어 있다.
실시예 5. 변이 균주의 L-글루탐산 생산성 확인
실시예 1 및 실시예 3과 동일한 방법으로 플라스크 규모에서 I10, I10-93 및 I10-109 균주가 L-글루탐산을 생산한 양 및 소요되는 시간을 측정하여 그 결과를 표 9에 기재하였다.
I10 I10-93 I10-109
L-글루탐산 생산량(g/L) 39 42.5 45.2
시간(hr) 48 48 44
표 9에 기재된 바와 같이, YggB 단백질의 포어(pore) 확장을 유도한 I10-93 및 I10-109 변이 균주에서 I10 균주보다 L-글루탐산 생산량이 증가하였다. 특히, I10-109 균주의 경우 I10 보다 L-글루탐산 생산량이 현저히 증가하였고 발효시간도 48시간에서 44시간으로 단축되어, 효율적으로 L-글루탐산을 생산할 수 있다.

Claims (5)

  1. 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase)의 활성이 약화 또는 불활성화되고 L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속( Corynebacterium sp.) 변이 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제는 leuA(2-isopropylmalate synthase) 유전자에 의하여 암호화되는 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 변이 균주는 서열번호 15로 표시되는 YggB 단백질의 아미노산 서열 중에서 93번째 아미노산인 류신 및 109번째 아미노산인 류신으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 류신을 알라닌 또는 발린으로 치환시킨 변이가 추가적으로 유발된 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum)인 것인 코리네박테리움 속 변이 균주.
  5. (a) 청구항 1 에 따른 코리네박테리움 속 변이 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 변이 균주 또는 배양 배지에서 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 L-글루탐산의 제조 방법.
PCT/KR2019/017124 2018-12-13 2019-12-05 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법 WO2020122505A1 (ko)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/413,156 US20220049212A1 (en) 2018-12-13 2019-12-05 Mutant strain having enhanced l-glutamic acid producing ability, and l-glutamic acid preparation method using same
CN201980082944.9A CN113227381B (zh) 2018-12-13 2019-12-05 L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
EP19895465.3A EP3896165A4 (en) 2018-12-13 2019-12-05 MUTANT STRAIN WITH IMPROVED L-GLUTAMIC ACID PRODUCTION CAPACITY AND METHOD OF L-GLUTAMIC ACID PRODUCTION USING THE SAME
JP2021533622A JP2022513813A (ja) 2018-12-13 2019-12-05 Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株、およびそれを用いたｌ－グルタミン酸の製造方法
CN202311504949.0A CN117568249A (zh) 2018-12-13 2019-12-05 L-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法
JP2023032941A JP2023071883A (ja) 2018-12-13 2023-03-03 Ｌ－グルタミン酸生産能が向上した変異菌株、およびそれを用いたｌ－グルタミン酸の製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180161190A KR102075160B1 (ko) 2018-12-13 2018-12-13 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
KR10-2018-0161190 2018-12-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020122505A1 true WO2020122505A1 (ko) 2020-06-18

Family

ID=69627443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/017124 WO2020122505A1 (ko) 2018-12-13 2019-12-05 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220049212A1 (ko)
EP (1) EP3896165A4 (ko)
JP (2) JP2022513813A (ko)
KR (1) KR102075160B1 (ko)
CN (2) CN113227381B (ko)
WO (1) WO2020122505A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646767A (zh) * 2020-12-30 2021-04-13 宁夏伊品生物科技股份有限公司 具有增强的l-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用
CN114806987A (zh) * 2022-04-19 2022-07-29 中国科学院上海高等研究院 一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102075160B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-10 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
KR102269639B1 (ko) * 2020-02-12 2021-06-25 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
KR102277406B1 (ko) * 2021-01-27 2021-07-14 씨제이제일제당 주식회사 신규한 엑시뉴클레아제 abc 서브유닛 a 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102266233B1 (ko) * 2021-01-27 2021-06-17 씨제이제일제당 주식회사 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102266230B1 (ko) * 2021-01-27 2021-06-17 씨제이제일제당 주식회사 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102277405B1 (ko) * 2021-01-27 2021-07-14 씨제이제일제당 주식회사 신규한 스퍼미딘 신타아제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022231036A1 (ko) * 2021-04-29 2022-11-03 씨제이제일제당 (주) 신규한 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
CN113512540B (zh) * 2021-05-31 2022-07-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种喹啉酸合酶突变体及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6852516B2 (en) 1999-01-13 2005-02-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamic acid by fermentation
US6962805B2 (en) 1998-09-25 2005-11-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains
WO2006070944A2 (en) * 2004-12-28 2006-07-06 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing l-glutamic acid
EP1491625B1 (en) * 2002-03-19 2010-07-21 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Mutated isopropylmalate isomerase
KR20110034718A (ko) 2009-09-29 2011-04-06 대상 주식회사 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법
KR20150003752A (ko) * 2012-04-27 2015-01-09 에보닉 인두스트리에스 아게 피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제
JP2018057376A (ja) * 2016-10-03 2018-04-12 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2590625A1 (en) * 1999-07-01 2001-01-11 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phospho-transferase system proteins
JP5343303B2 (ja) * 2004-12-28 2013-11-13 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
JP2016165225A (ja) * 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
JP2015029474A (ja) * 2013-08-02 2015-02-16 学校法人東京電機大学 プリン系物質の製造法
CN104480058B (zh) * 2014-12-30 2017-07-21 福建师范大学 一株高产l‑亮氨酸工程菌及其应用
CN105695383B (zh) * 2016-03-02 2020-06-19 廊坊梅花生物技术开发有限公司 重组菌株及其应用
KR101959063B1 (ko) * 2017-06-09 2019-03-18 대상 주식회사 L-로이신 생산능이 개선된 변이 균주 및 이를 이용한 l-로이신의 제조 방법
KR102075160B1 (ko) * 2018-12-13 2020-02-10 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
CN113135985B (zh) * 2020-01-19 2022-11-01 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产l-谷氨酸的方法
KR102269639B1 (ko) * 2020-02-12 2021-06-25 대상 주식회사 L-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 생산 방법
WO2022191357A1 (ko) * 2021-03-09 2022-09-15 대상 주식회사 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6962805B2 (en) 1998-09-25 2005-11-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of constructing amino acid producing bacterial strains, and method of preparing amino acids by fermentation with the constructed amino acid producing bacterial strains
US6852516B2 (en) 1999-01-13 2005-02-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-glutamic acid by fermentation
EP1491625B1 (en) * 2002-03-19 2010-07-21 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Mutated isopropylmalate isomerase
WO2006070944A2 (en) * 2004-12-28 2006-07-06 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing l-glutamic acid
KR20110034718A (ko) 2009-09-29 2011-04-06 대상 주식회사 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법
KR101138289B1 (ko) 2009-09-29 2012-04-24 대상 주식회사 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법
KR20150003752A (ko) * 2012-04-27 2015-01-09 에보닉 인두스트리에스 아게 피드백-내성 알파-이소프로필말레이트 신타제
JP2018057376A (ja) * 2016-10-03 2018-04-12 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genbank", Database accession no. NP_600492
"Manual of Methods for General Bacteriology", 1981, AMERICAN SOCIETY FOR BACTERIOLOGY
APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 52, 1999, pages 541 - 545
EMBO J., vol. 18, no. 7, 1999, pages 1730 - 7
FEMS MICROBIOL LETT., vol. 218, no. 2, 2003, pages 305 - 309
GENE, vol. 145, 1994, pages 69 - 73
MOL MICROBIOL., vol. 54, no. 2, 2004, pages 420 - 438
NAKAMURA, J. ET AL.: "Mutations of the Corynebacterium glutamicum NCgl 1221 gene , encoding a mechanosensitive channel homolog, induce L-glutamic acid production", APPLIED ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 73, no. 14, July 2007 (2007-07-01), pages 4491 - 4498, XP002691368, DOI: 10.1128/AEM.02446-06 *
VOGT, M. ET AL.: "Pushing product formation to its limit: metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-leucine overproduction", METABOLIC ENGINEERING, vol. 22, 11 December 2013 (2013-12-11), pages 40 - 52, XP055111480, DOI: 10.1016/j.ymben.2013.12.001 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646767A (zh) * 2020-12-30 2021-04-13 宁夏伊品生物科技股份有限公司 具有增强的l-谷氨酸生产力的菌株及其构建方法与应用
CN114806987A (zh) * 2022-04-19 2022-07-29 中国科学院上海高等研究院 一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法
CN114806987B (zh) * 2022-04-19 2023-06-06 中国科学院上海高等研究院 一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113227381B (zh) 2024-05-24
KR102075160B1 (ko) 2020-02-10
CN113227381A (zh) 2021-08-06
JP2022513813A (ja) 2022-02-09
EP3896165A1 (en) 2021-10-20
US20220049212A1 (en) 2022-02-17
EP3896165A4 (en) 2022-04-27
JP2023071883A (ja) 2023-05-23
CN117568249A (zh) 2024-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020122505A1 (ko) L-글루탐산 생산능이 향상된 변이 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산의 제조 방법
WO2021187781A1 (ko) 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법
WO2013105827A2 (ko) 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
WO2022231369A1 (ko) 신규한 포르메이트 의존성 포스포리보실글리신아미드 포밀 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022231368A1 (ko) 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022225322A1 (ko) 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 알파 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022225319A1 (ko) 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022225320A1 (ko) 신규한 포스포글리세린산 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022225321A1 (ko) 신규한 f0f1 atp 합성효소 서브유닛 감마 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154190A1 (ko) 신규한 포스포노아세테이트 하이드롤라제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154191A1 (ko) 신규한 2,5-다이케토-d-글루콘산 리덕타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
CN111655859A (zh) 生产腐胺的微生物及利用其生产腐胺的方法
WO2022163935A1 (ko) 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2022154177A1 (ko) 신규한 3d-(3,5/4)-트리하이드록시사이클로헥세인-1,2-다이온 아실하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022231370A1 (ko) 신규한 2중기능성 포스포리보실아미노이미다졸카르복사미드 포밀트랜스퍼라아제/imp 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022231371A1 (ko) 신규한 5-(카르복시아미노)이미다졸리보뉴클레오티드합성효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022225100A1 (ko) 신규한 이중기능성 메틸렌테트라히드로폴레이트 탈수소효소/메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022231067A1 (ko) 신규한 이중기능성 pyr 오페론 전사조절자/우라실 포스포리보실 전달 효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
WO2022215800A1 (ko) 신규한 분지쇄아미노산 투과효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2022163930A1 (ko) 신규한 2-숙시닐-5-엔도피루빌-6-하이드록시-3-사이클로헥센-1-카복실레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154188A1 (ko) 신규한 폴리케타이드 신타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154192A1 (ko) 신규한 알데하이드 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022163932A1 (ko) 신규한 알데하이드 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022163929A1 (ko) 신규한 펩티딜-디펩티다제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154182A1 (ko) 신규한 포름이미도일글루타마아제 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19895465

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021533622

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019895465

Country of ref document: EP

Effective date: 20210713