KR20110034718A - 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법 - Google Patents

글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 글루탐산의 제조방법을 제공한다. 상기 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)는 당밀 내성을 가짐으로써, 원료가가 저렴한 당밀을 주된 탄소원으로 사용하여 높은 수율로 글루탐산을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라, 상기 균주를 고농도의 당밀을 탄소원으로 함유하는 배지 중에서 배양하고, 이로부터 글루탐산을 높은 수율로 회수할 수 있으므로, 글루탐산 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.
글루탐산, 당밀

Description

글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법{Microorganism having glutamic acid-producing activity and process for producing glutamic acid using the same}
본 발명은 글루탐산 글루탐산 생산능을 갖는 신규의 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글루탐산 생산능을 갖는 당밀 내성의 신규의 코리네박테리움 속 균주 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법에 관한 것이다.
글루탐산은 생물체의 단백질을 구성하는 물질로서, 고유의 정미력과 감칠맛을 가지고 있어 가정용 및 가공식품 생산을 위한 조미료로 널리 이용되고 있다. 글루탐산은 코리네박테리움속 또는 브레비박테리움속 미생물을 배양하여 얻어진 배양액으로부터 회수하여 제조되고 있다. 글루탐산의 생산성을 높이기 위하여, 통상 배지 내 비오틴을 특정 범위로 제한하거나, 계면활성제를 첨가하여 배양을 수행하거나, 페니실린계 항생제를 첨가하여 배양을 수행하거나, 혹은 배양 온도를 조절하여 배양을 수행하는 방법 등이 알려져 있다.
한편, 미생물 배양을 통한 글루탐산의 제조에 있어서, 탄소원으로서 글루코 오즈, 프락토오즈 등의 당류를 사용하거나, 당류보다 가격이 저렴한 자당을 사용하여 배양을 수행한다. 상기 자당원으로는 당밀(糖蜜)과 원당(原糖)을 혼합하여 사용하고 있으며, 통상 당밀과 원당의 혼합 비율을 40:60 내지 60:40의 중량비로 조정하여 사용하고 있다. 상기 당밀은 사탕수수 액으로부터 설탕을 정제하고 남은 블랙스트랩 당밀 (Blackstrap molasses)을 말하며, 원당은 당밀의 불순물을 제거한 뒤 농축, 결정화 과정으로 얻은 자당 결정을 말한다. 따라서, 당밀은 원당에 비해 가격이 훨씬 저렴하므로, 탄소원으로서 당밀의 사용량을 높일수록 글루탐산의 제조원가를 낮출 수 있을 것으로 기대된다. 그러나, 탄소원으로서 값싼 당밀을 과량으로 사용할 경우, 배양 과정 특히 후반기 배양 과정에서 미생물에 의한 당소모가 급격히 감소하므로, 글루탐산의 생산성이 크게 낮아지게 된다.
본 발명자들은 글루탐산의 제조비용을 낮추기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 원료가가 저렴한 당밀을 주된 탄소원으로 사용하여 높은 수율로 글루탐산을 생산할 수 있는 변이주를 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 종래에 글루탐산 생산능을 갖는 균주로부터 다양한 변이주를 얻었으며, 이 중 높은 당밀 내성을 갖는 코리네박테리움 속 변이주를 분리하였다.
따라서, 본 발명은 당밀을 주된 탄소원으로 사용하여 높은 수율로 글루탐산을 생산할 수 있는 신규의 코리네박테리움 속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 배양액으로부터 글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 글루탐산의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 글루탐산의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 배양은 탄소원으로서 당밀을 포함하는 배지 중에서 수행되거나; 혹은 탄소원으로서 당밀과 원당의 혼합물을 포함하고, 상 기 당밀의 함량이 상기 탄소원에 대하여 80 중량% 이상인 배지 중에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 배양은 상기 탄소원의 일부를 포함하는 배지(제1 배지) 중에서 배양하고, 상기 제1 배지 중의 당 함량이 1.0∼1.5 중량% 이하로 감소하는 시점에서 나머지 함량의 탄소원을 포함하는 배지(제2 배지) 중에서 배양함으로써 수행될 수 있으며, 상기 제1 배지 중의 탄소원 및 제2 배지 중의 탄소원의 중량비는 1 : 1 ∼ 3 의 범위일 수 있다.
선택적으로, 상기 제2 배지 중에서의 배양은, 배양액의 OD610 값의 증가량이 20∼25 일 때, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제를 상기 배양액에 투입하여 배양함으로써 수행될 수 있으며, 상기 계면활성제의 농도는 0.5∼5.0 g/L의 범위일 수 있다.
또한, 선택적으로 상기 제1 배지 및/또는 제2 배지는 2 내지 100 ㎍/L의 비오틴을 포함하는 배지일 수 있으며, 구체적으로는 탄소원, 우레아, KH2PO4, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·5H2O, 티아민-HCl, 비오틴, 대두 가수분해물, 및 물로 구성된 액체 배지일 수 있다.
본 발명에 의해 새롭게 분리된, 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)는 당밀 내성을 가짐으로써, 원료가가 저렴한 당밀을 주 된 탄소원으로 사용하여 높은 수율로 글루탐산을 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라, 상기 균주를 고농도의 당밀을 탄소원으로 함유하는 배지 중에서 배양하고, 이로부터 글루탐산을 높은 수율로 회수할 수 있으므로, 글루탐산 제조 원가를 크게 낮출 수 있다.
본 명세서에서, "글루탐산(glutamic acid)"라 함은 L-글루탐산, DL-글루탐산, L-글루탐산 나트륨염, DL-글루탐산 나트륨염, L-글루탐산 암모늄염, DL-글루탐산 암모늄염을 모두 포함하며, 바람직하게는 L-글루탐산이다.
본 발명은 글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)를 제공한다.
본 발명자들은 기존에 사용되어 왔던 글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주를 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG)로 DNA 변이를 유발하여 약 1∼2 X 105 여종의 균주를 얻은 다음, 단일 탄소원으로서 약 24 %의 고농도의 당밀을 함유하는 배지중에서 상기 균주를 배양하여, 성장 속도 및 생리학적 특성을 조사하였다. 그 결과, 고농도 당밀을 함유하는 배지 중에서 성장 속도가 우수한 균주 약 40 종을 선별하였으며, 이 중 고농도 당밀에 높은 내성을 지니는 균주 1종을 분리하였다.
상기 분리된 균주는 글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주로서, 높은 G+C%를 나타내는 그람 양성 세균인 악티노 박테리아(Actinobacteria)에 속하며, 글루탐산 생합성 유전자들 중에서 시트레이트 신타아제(citrate synthase), 아코니테이트 히드라타아제(aconitate hydratase), 이소시트레이트 데히드로게나아제(isocitrate dehydrogenase), 글루타메이트 데히드로게나아제(glutamate dehydrogenase)의 염기서열을 분석한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 속하는 균주로 판명되었다. 상기의 결과들을 근거로, 본 발명자들은 새롭게 분리한 균주를 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)로 명명하였으며, 이를 2009년 9월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 11558BP의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명은 또한 상기 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 글루탐산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 배양은 탄소원으로서 당밀을 포함하는 배지 중에서 수행되거나; 혹은 탄소원으로서 당밀과 원당의 혼합물을 포함하고, 상기 당밀의 함량이 상기 탄소원(즉, 당밀과 원당의 혼합물)에 대하여 80 중량% 이상인 배지 중에서 수행될 수 있다. 물론, 상기 탄소원은 종래의 제조방법과 마찬가지로, 글루코오즈, 프락토오즈, 수크로오즈 등의 당류를 사용하거나, 또는 당밀과 원당을 40 : 60 내지 60 : 40 의 중량비(예를 들어, 약 50 : 50 의 중량비)로 혼합한 것을 사용할 수도 있다. 상기 당류를 사용하는 경우, 그 함량은 배지 총 중량에 대하여 7∼10 중량%의 범위일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 탄소원으로서 당밀의 함량이 80 중량% 이상 혹은 약 100 중량%(즉, 당밀만을 함유)의 범위로 사용하는 것이 경제적인 측면에서 바람직하다.
상기 배지는 상기 탄소원 이외에, 통상의 글루탐산 제조시 사용되는 배지 성분, 예를 들어, 우레아(urea), KH2PO4, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·5H2O, 티아민-HCl, 비오틴, 대두 가수분해물, H3PO4, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 등의 성분을 함유할 수 있으며, 이들 성분들은 종래의 글루탐산 제조시 사용되는 배지에서 적용되는 함량 범위로 사용될 수 있다.
또한, 상기 배양은 상기 탄소원의 일부를 포함하는 배지(제1 배지) 중에서 배양하고, 상기 제1 배지 중의 당 함량이 1.0∼1.5 중량% 이하로 감소하는 시점에서 나머지 함량의 탄소원을 포함하는 배지(제2 배지) 중에서 배양함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 제1 배지 중의 탄소원 및 제2 배지 중의 탄소원의 중량비는 1 : 1 ∼ 3, 바람직하게는 약 1 : 1 의 범위일 수 있다.
선택적으로, 탄소원(예를 들어, 당밀)의 사용량을 증가시키기 위하여, 상기 제2 배지 중에서의 배양은 특정 시점에서 계면활성제를 추가로 가하여 배양을 수행할 수 있다. 즉, 상기 제2 배지 중에서의 배양은, 배양액의 OD610 값의 증가량이 20∼25 일 때, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제를 상기 배양액에 투입하여 배양함으로써 수행될 수 있으며, 상기 계면활성제의 농도는 0.5∼5.0 g/L의 범위일 수 있다.
또한, 선택적으로, 탄소원(예를 들어, 당밀)의 사용량을 증가시키기 위하여, 상기 제1 배지 및/또는 제2 배지는 비오틴의 함량을 제한하여 얻어진 배지일 수 있다. 즉, 상기 제1 배지 및/또는 제2 배지는 2 내지 100 ㎍/L의 비오틴을 포함하는 배지일 수 있으며, 구체적으로는 탄소원(당밀; 당밀과 원당의 혼합물; 또는 당류), 우레아, KH2PO4, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·5H2O, 티아민-HCl, 비오틴(2 내지 100 ㎍/L), 대두 가수분해물, 및 물로 구성된 액체 배지일 수 있다.
상기 배양액으로부터 글루탐산의 회수는 통상의 회수 방법, 예를 들어 등전점을 이용한 직접 결정법, 이온교환수지법, 액체 크로마토그래피법 등을 이용하여 회수할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리 및 기탁
글루타민 생산능을 갖는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주(I6)를 100ml 삼각플라스크에 10ml 영양배지(1% 펩톤, 1% 육즙, 0.5% 효모 추출물, 0.25% NaCl) 상에서 30 ℃, 180rpm 조건으로 6 시간 동안 배양한 뒤, 610nm 흡광도(OD610) 값이 약 10 정도인 대수증식기의 균체를 원심분리하여 회수하고, 10ml 식염수(0.9% NaCl)로 3회 세척하고, 최종적으로 3ml의 식염수에 현탁하였다. 상기 균체 현탁액에 화학적으로 DNA 변이를 일으키는 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine, NTG)을 150 mg/L 농도로 15분간 처리한 후, 다시 원심분리하여 균체를 회수한 다음, 10ml 식염수로 3회 세척한 후 최종적으로 3ml 영양배지에 현탁하였다. 상기 NTG 처리된 균체 현탁액을 30 ℃, 180rpm 조건으로 1 시간 동안 배양한 뒤, 적절한 농도의 희석액(10-2～10-6)을 단일 탄소원으로 당밀이 함유된 당밀선별배지
(24% 사탕수수 당밀(cane molasses), 5g/L (NH4)2SO4, 2.5g/L 우레아, 1.5g/L KH2PO4, 1.5g/L K2HPO4, 0.5g/L MgSO4·7H2O, 20mg/L FeSO4·7H2O, 20mg/L MnSO4·5H2O, 10mg/L 아스코르브산, 0.2mg/L Ca-판토테네이트(Ca-panthothenate), 0.2mg/L 티아민-HCl, 0.2mg/L 비오틴, 0.2mg/L 니코틴산, 0.2mg/L 리보플라빈, 0.1mg/L 시아노코발라민, 0.1mg/L p-아미노부티르산, 2% 한천)에 도말하여, NTG가 처리되지 않은 균체(즉, I6)에 비해 빠르게 성장하는 균주를 약 40 여종 선별하였으며, 이 중 고농도 당밀에 높은 내성을 지니는 균주(BC144)를 선별하였다. 상기 선별된 균주 BC144의 당밀 내성도를 한천이 제외된 액체 당밀선별배지 상에서 생육 정도를 측정한 결과는 다음 표 1과 같다.
당밀 농도별 상대 생육도 비교
균주명 상대 생육도
4% 당밀배지 20% 당밀배지 24% 당밀배지
I6 100% 94% 16%
BC144 100% 98% 93%
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 24% 당밀 배지 조건에서 기존 생산균주는 크게 생육 저해를 받았으나, 새롭게 분리한 균주 BC144는 생육 저해가 거의 일어나지 않았다. 상기 분리된 균주는 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)로 명명하였으며, 이를 2009년 9월 18일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 KCTC 11558BP의 수탁번호를 부여받았다.
실시예 2. 계면활성제 첨가 방법을 통한 글루탐산 생산
코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)를 2L 플라스크 상에서 300ml의 1차 종배양 배지(2.5% 글루코오즈, 4g/L 우레아, 0.5g/L KH2PO4, 0.5g/L K2HPO4, 0.5g/L NH4H2PO4, 0.5g/L (NH4)2HPO4, 0.5g/L MgSO4·7H2O, 0.5g/L (NH4)2SO4, 20mg/L FeSO4·7H2O, 50mg/L MnSO4·5H2O, 0.2mg/L 티아민-HCl, 0.2mg/L 비오틴, 0.2%(v/v) 대두 가수분해물, pH 6.4)에 1 루프(loop) 접종한 뒤, 30 ℃, 140rpm으로 16시간 동안 배양하였다. 이와 같이 배양된 균주를 5L 배양기(jar fermentor) 상에서 2.8L의 2차 종배양 배지(4.5% 당밀, 0.3g/L MgSO4·7H2O, 14mg/L FeSO4·7H2O, 1.9g/L 우레아, 1.3g/L 참치 추출물(tuna extract), 140㎍/L 티아민-HCl)에 0.03%되도록 접종하였다. 2차 종배양은 31.5 ℃, 600 rpm, pH 7.5 조건으로 OD610 값이 27.5가 되도록 14∼16 시간 동안 배양하였다.
얻어진 배양액 700ml을 취해 글루탐산 생산배지(6.6% 당밀, 4.4% 원당, 1.34g/L H3PO4, 30mg/L 소듐 올리에이트(sodium oleate), 198㎍/L 티아민-HCl, 134㎍/L 비오틴, 8L)에 접종하였으며, 30L 배양기(jar fermentor) 상에서 초기 8L의 배지에 33 ℃, 300 rpm, pH 7.5, 내압 0.7 kg/cm2 조건으로 배양하였다. 배양 중 배지에 남아있는 자당 농도를 측정하여 자당 함량이 1.0∼1.5 % 이하로 감소하였을 때, 5.9 L의 추가 배지(34.41% 당밀, 4.88% 원당)를 연속식으로 첨가하여 계속 배양하였다. 배양 중 OD610 값의 증가량이 20∼25 정도일 때, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)를 1.16g/L 농도로 첨가하여 20 시간 동안 계속 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 뒤, 얻어진 글루탐산이 함유된 모액(mother liquid)에 황산을 첨가하여 pH 3.0으로 조절하여 결정으로 석출되는 글루탐산을 회수하였다.
또한, 상기에서 원당 대신 당밀만을 사용하여 즉, 상기 6.6% 당밀, 4.4% 원당 대신 11% 당밀 및 18.15% 당밀, 21.14% 원당 대신 36.2% 당밀이 함유된 생산배지를 사용(탄소원 총 함량: 21.7%)한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 배양을 수행하여 글루탐산을 회수하였다.
비교를 위하여 기존 생산균주(I6)를 상기와 동일한 조건으로 배양하여 글루탐산을 제조하였다. 상기와 같이 배양을 수행하여 얻어진 글루탐산의 생산성은 다음 표 2와 같다.
글루탐산 생산성
균주 당밀 80% 및 원당 20% 당밀 100%
글루탐산 농도(%) 수율(%) 글루탐산 농도(%) 수율(%)
I6 12.53 54.47 11.43 52.67
BC144 12.94 56.26 12.31 55.73
상기 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 고농도 즉 배지의 당밀 비율을 80%로 증가시켜 배양을 수행하였을 때, I6 균주의 글루탐산 수율은 54.47%로서로서 당밀과 원당 각각 1:1 혼합물을 사용한 경우(수율: 55.78%)에 비하여 크게 하락한 반면, BC144 균주의 생산성은 당밀 비율 50% 조건과 유사하게(수율: 55.08%) 나타났다. 또한, 탄소원으로서 당밀 100%를 사용하여 배양을 수행하였을 때, I6 균주의 생산성은 글루탐산 11.43% 및 수율 52.67%인 반면, BC144 균주의 생산성은 글루탐산 12.31% 및 수율 55.73%로 나타났다. 따라서, 본 발명에 의해 새롭게 분리된 균주 즉, BC144 균주를 이용할 경우, 가격이 저렴한 당밀을 탄소원으로 사용할 수 있으므로, 글루탐산 제조원가를 크게 낮출 수 있다.
실시예 3. 비오틴 제한을 통한 글루탐산 생산
기존 생산균주(I6) 및 본 발명에 의해 새롭게 분리된 균주(BC144)의 글루탐산 생산성을, 비오틴 제한을 통한 배양 조건을 채용하여, 비교하였다. 탄소원으로 사용하는 당밀에는 상당량의 비오틴이 포함되어 있어 (0.3∼0.4 mg/kg) 비오틴 제한을 통한 글루탐산 생산이 불가능하여, 이 경우 탄소원으로는 포도당을 사용하여 배양하였다.
각각의 균주를 100ml 플라스크 상에서 10ml의 종배지(4% 글루코오즈, 4g/L 우레아, 1g/L KH2PO4, 0.4g/L MgSO4·7H2O, 10mg/L FeSO4·7H2O, 10mg/L MnSO4·5H2O, 200㎍/L, 티아민-HCl, 50㎍/L 비오틴, 5.5% 대두 가수분해물, pH 7.0)에 1 루프(loop) 접종하여 30 ℃, 180 rpm 조건으로 8시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 100ml 플라스크 상에서 10ml의 생산 배지 (7% 글루코오즈, 30g/L (NH4)2SO4, 1g/L KH2PO4, 0.4g/L MgSO4·7H2O, 10mg/L FeSO4·7H2O, 10mg/L MnSO4·5H2O, 0.2mg/L 티아민-HCl, 2㎍/L 비오틴, 1.5%(v/v) 대두 가수분해물, pH 7.0)에 1% 되도록 접종하여 30 ℃, 180rpm으로 23시간 동안 배양한 뒤, 생성된 글루탐산을 측정하였다. 그 결과는 다음 표 3과 같다.
비오틴 제어를 통한 글루탐산 생산성
균주 글루탐산 농도(%) 수율(%)
I6 3.43 52.5
BC144 3.70 55.9
표 3의 결과로부터, BC144 균주는 I6 균주에 비해 글루탐산 생산량이 크게 증가함을 알 수 있다. 즉, 상기 선별된 BC144 균주는 당밀을 탄소원으로 사용하는 글루탐산 생산뿐만 아니라, 포도당을 사용한 비오틴 제어 방법을 통한 글루탐산 생산 시에도 기존 균주(I6)에 대비하여 높은 생산성을 나타내었다.

Claims (9)

  1. 글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP).
  2. 코리네박테리움 sp. BC144(Corynebacterium sp. BC144)(KCTC 11558BP)를 배양하고, 얻어진 배양액으로부터 글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는 글루탐산의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양이 탄소원으로서 당밀을 포함하는 배지 중에서 수행되거나; 혹은 탄소원으로서 당밀과 원당의 혼합물을 포함하고, 상기 당밀의 함량이 상기 탄소원에 대하여 80 중량% 이상인 배지 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양이 상기 탄소원의 일부를 포함하는 배지(제1 배지) 중에서 배양하고, 상기 제1 배지 중의 당 함량이 1.0∼1.5 중량% 이하로 감소하는 시점에서 나머지 함량의 탄소원을 포함하는 배지(제2 배지) 중에서 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 배지 중의 탄소원 및 제2 배지 중의 탄소원의 중 량비가 1 : 1 ∼ 3 임을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 배지 중에서의 배양이, 배양액의 OD610 값의 증가량이 20∼25 일 때, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 계면활성제를 상기 배양액에 투입하여 배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 계면활성제의 농도가 0.5∼5.0 g/L인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 배지가 2 내지 100 ㎍/L의 비오틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 제1 배지, 제2 배지, 또는 제1 배지 및 제2 배지가 탄소원, 우레아, KH2PO4, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, MnSO4·5H2O, 티아민-HCl, 비오틴, 대두 가수분해물, 및 물로 구성된 액체 배지임을 특징으로 하는 제조방법.
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