ES2210504T3

ES2210504T3 - Procedimiento de preparacion del acido 2-hidroxi-4-metiltio-butirico, mediante la utilizacion de una nitrilasa.

Info

Publication number: ES2210504T3
Application number: ES97912254T
Authority: ES
Inventors: Olivier Favre-Bulle; Jerome Pierrard; Christophe David; Philippe Morel; Dominique Horbez
Original assignee: Adisseo Ireland Ltd
Current assignee: Adisseo Ireland Ltd
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2017-10-24
Also published as: CZ145499A3; WO1998018941A1; FR2755143A1; NZ335332A; PL190773B1; KR100557404B1; CN1181204C; HK1022170A1; AU4951397A; HUP9904513A3; HU226148B1; US6180359B1; IL173394A0; PL332958A1; DE69736961D1; KR20000052732A; AU738160B2; EP0934419A1; PT1411126E; HUP9904513A2

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE ACIDO 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRICO Y/O DE SAL AMONICA DEL ACIDO 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRICO POR HIDROLISIS ENZIMATICA DE 2 - HIDROXI 4 METILTIO BUTIRONITRILO CARACTERIZADO PORQUE A) EN UNA PRIMERA ETAPA SE PREPARA UN MATERIAL BIOLOGICO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE NITRILASA, B) EN UNA SEGUNDA ETAPA, SE LE INMOVILIZA, C) EN UNA TERCERA ETAPA, SE PONE EN PRESENCIA DEL 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRONITRILO CON EL MATERIAL BIOLOGICO ASI INMOVILIZADO, PARA OBTENER LA SAL AMONICA DEL ACIDO 2 - HIDROXI - 4 - METILTIO BUTIRICO, D) EN UNA CUARTA ETAPA, OPCIONALMENTE, SE CONVIERTE LA SAL OBTENIDA EN LA ETAPA C) EN EL ACIDO CORRESPONDIENTE Y E) EN UNA QUINTA ETAPA, SE CONCENTRA EL PRODUCTO OBTENIDO EN LA ETAPA C) O D).

Description

Procedimiento de preparación del ácido 2-hidroxi-4-metiltio-butírico, mediante la utilización de una nitrilasa.

La presente invención, se refiere a un nuevo procedimiento de preparación del ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico (HMTBS) y / o de su sal de amonio (HMBTS).

El ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y sus sales, se utilizan desde hace mucho tiempo, en la alimentación animal, reemplazando a la metiotina. Éste, o éstas, presentan la ventaja, sobre ésta última, de presentarse en forma líquida, lo cual facilita su utilización por parte de las empresas productoras de alimentos.

Se conoce, desde hace mucho tiempo, el hecho de preparar el ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, por vía química. Se pueden citar, de esta forma, las patentes europeas EP-142 488, EP-143 000, las cuales describen la hidrólisis del 2-hidroxi-4-metiltiohidroxibutironilo (HMTBN), mediante un procedimiento en dos etapas. La primera etapa, consiste en poner en contacto el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, con un ácido mineral fuerte, tal como el ácido clorhídrico o sulfúrico. En una etapa ulterior, después de dilución en agua, la hidrólisis, se completa a una temperatura más elevada. El ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, se extrae, a continuación, con un disolvente orgánico poco miscible con el agua, tal como una cetona, de una forma preferible, la metilisobutilcetona y, a continuación, el disolvente, se elimina mediante evaporación. Este tipo de procedimiento, utilizado a escala industrial, comporta no obstante algunos inconvenientes. Éste produce una cantidad molar de sulfato de amonio, por lo menos igual a la cantidad molar de nitrilo introducida, que debe eliminarse, generando, de esta forma, un residuo industrial que va en contra de una política de protección del medio ambiente. Este procedimiento, necesita, también, la utilización de algunas cantidades importantes de disolvente, las cuales es absolutamente necesario reciclar.

Otros procedimientos, tales como por ejemplos los que se describen en las patentes estadounidenses US 3 773 927 y US 4 353 924, consisten en hidrolizar el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, con ácido clorhídrico y, a continuación, concentrar el medio con separación del cloruro de amonio formado. La sal obtenida, es tan difícil de eliminar como la sal precedente y, además, el ácido obtenido, presenta una fuerte coloración.

Se describe también, todavía, en la patente europea EP 330 521, un procedimiento de hidrólisis del metiltiohidroxipropionitrilo, el cual consiste, tal y como precedentemente, en realizar una hidrólisis en medio sulfúrico. La mezcla, se neutraliza parcialmente, con amoníaco. Aparece una separación bifásica. La fase orgánica, contiene la mayoría del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y, la fase acuosa, contiene la mayoría del sulfato de amonio producido. La solución orgánica, después de la evaporación del agua contenida, se filtra, de tal forma que se recupere el sulfato amónico disuelto. El ácido 2-hidroxi-4-metiltiltiobutírico, se diluye, a continuación, con un poco de agua, y solubiliza con un poco de ácido sulfúrico. La solución acuosa, después de la eliminación del agua, permite el obtener sulfato de amonio, directamente comercializable. Este procedimiento, resuelve, en parte, los inconvenientes de los procedimientos del arte anterior de esta técnica especializada, en cuanto a lo concerniente al uso de disolventes orgánicos, pero, no resuelve, en absoluto, los problemas ligados con los rechazos de las sales minerales.

Entre las patentes relativas a las sales del ácido el ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, se pueden citar las patentes estadounidenses US 2 745 745, US 2 938 053 y US 3 175 000, las cuales conciernen a las sales de calcio y / o de amonio. La mezcla obtenida mediante la hidrólisis del 2-hidroximetiltiobutironitrilo, se trata con una hidróxido o con carbonato de calcio. El sulfato de calcio, se precipita, entonces, liberando amoníaco, el cual forma la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico. Aquí, también, todavía, subsiste el problema de eliminar el sulfato de calcio.

Se describe, también, todavía, en la solicitud internacional de patente WO 96 / 01808, un procedimiento, el cual consiste en practicar una hidrólisis y una extracción mediante un disolvente orgánico, como en el primer documento, citado, correspondiente al arte anterior de esta técnica especializada y, a continuación, una neutralización de la solución orgánica, mediante amoníaco. Este procedimiento, como la mayoría de procedimientos anteriormente descritos, tiene como resultado la formación de por lo menos un mol de sulfato o de cloruro de amonio, por mol de nitrilo introducido, y exige el reciclado de cantidades importantes de disolvente orgánico. Éste no permite el obtener una solución de sal de amonio del ácido el ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, a un coste que sea industrialmente interesante.

Se describe, además, en el documento internacional de solicitud de patente WO 96 / 09403, la utilización de una nitrilasa, como catalizador de la hidrólisis de un grupo nitrilo en grupo carboxílico. El procedimiento descrito en este documento, no obstante, no es utilizable a escala industrial, teniendo en cuenta la insuficiencia de microorganismos que sintetizan estas nitrilasas.

Se ha descubierto ahora, gracias al procedimiento de la invención, el hecho de que, aplicando varios etapas específicas, es posible el obtener el ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutanóico y / o su sal de amonio, por vía enzimática, a escala industrial, con un rendimiento elevado, sin la utilización de disolventes y sin producción concomitante de sales minerales.

La invención, tiene por objeto un procedimiento de preparación del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y / o de la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, mediante la hidrólisis enzimática del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, caracterizado por el hecho de que:

a) en una primera etapa, se prepara un material biológico, que tiene una actividad nitrilasa,

b) en una segunda etapa, se procede a inmovilizarlo,

c) en una tercera etapa, se pone en presencia, el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, con el material biológico de esta forma inmovilizado, para obtener la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico.

d) en una cuarta etapa, eventualmente, se convierte la sal obtenida en la etapa c), en el ácido correspondiente, y

e) en una quinta etapa, se concentra el producto obtenido en la etapa c) o d).

La invención, se explicará de una forma detallada, en la descripción que se facilita a continuación, para la cual, se hará referencia a las figuras anexadas, en las cuales:

- la figura 1, representa un esquema de una célula de electrodiálisis, empleada en la etapa facultativa d); la figura 1 A, representa una célula de electrodiálisis, de membrana bipolar, de tres compartimentos; la figura 1 B, representa una célula de electrodiálisis de membrana bipolar, de dos compartimientos.

- la figura 2, representa un esquema de una instalación, para la aplicación del procedimiento según la invención;

- la figura 3, representa la carta de restricción de los plásmidos pRPA-BCTAT 1 a 5.

- la figura 4, representa la estrategia de secuenciación del fragmento de 1130 pb, que contiene la secuencia de ADN (denominada, sobre la figura, como nitB), que codifica al polipéptido que tiene la actividad nitrilasa según la invención. Los números, se refieren a la identidad de los cebadores utilizados para la secuenciación, así como las anotaciones M13FWD y M13REV.

- la figura 5, representa la tarjeta de restricción de los plásmidos pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT13.

- la figura 6, representa la electroforesis sobre gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas E. coli BL21(DE3)pRPA-BCAT12, BL21(DE3)pRPA-BCAT13, BL21(DE3)pRPA-BCAT12 + pXL2331, BL21(DE3)pRPA-BCAT13 + pXL2231. Cada pista, corresponde a una cantidad de proteínas solubles de 10 \mug y un volumen equivalente de fracción bruta insoluble.

- la figura 7, representa la electroforesis sobre gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas E. coli DH5\alpha/pRPA-BCAT3, DH5\alpha/pRPA-BCAT6, DH5\alpha/pRPA-BCAT6 + pXL2035, pRPA-BIOCAT76. Cada pista, corresponde a una cantidad de proteínas solubles de 10 \mug y un volumen equivalente de fracción bruta insoluble.

- la figura 8, representa la tarjeta de restricción del plásmido pRPA-BCAT14.

- la figura 9, representa la electroforesis sobre gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas P. putida G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT214), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT23), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT24). Cada pista, corresponde a una cantidad de proteínas solubles de 10 \mug y un volumen equivalente de fracción bruta insoluble.

Cada pista, corresponde a una cantidad de proteínas solubles de 10 \mug, y un volumen equivalente de una fracción bruta eventualmente soluble.

- la figura 10, representa una tarjeta de restricción del plásmido pCGL1087.

- la figura 11, representa una tarjeta de restricción del plásmido pOS48.7.

La primera etapa, consiste en preparar el material biológico que tiene una actividad nitrilasa.

El material biológico, puede consistir en una solución enzimática tal cual, o de células enteras o trituradas, que tienen una actividad nitrilasa.

De una forma ventajosa, se utiliza un microorganismo que expresa una nitrilasa.

La nitrilasa, puede principalmente proceder de un microorganismo, de una forma particular, el microorganismo del género Alcaligenes, Rhodococcus o Gordona, principalmente, Alcaligenes faecalis, Rodhococcus sp. HT 29-7, Gordona térrea, de una forma preferente, las cepas descritas en el documento de patente internacional WO 96 / 09403.

Se utiliza, de una forma preferente, un microorganismo que exprese una actividad nitrilasa obtenida por transferencia de la información genética que codifica a la nitrilasa de un microorganismo parental en un microorganismo huésped. De una forma particular, en el E. coli, se puede utilizar la co-expresión de las proteínas de cobertura (de caperuza) Gro ESL, para mejorar el rendimiento o prestaciones de la cepa recombinante.

A dicho efecto, se utiliza cualquier vector de expresión apropiado, especialmente, un vector plasmídico.

La secuencia nucleótida utilizada en este caso, se emplazará, entonces, bajo el control de señales que permitan su expresión en un huésped celular. El huésped celular utilizado, puede elegirse entre los sistemas procariótas, como las bacterias gram positivas o gram negativas, o eucariótas, como las por ejemplo las levaduras, los hongos, o cualquier otro sistema. Las señales que controlan la expresión de los polipéptidos, se eligen en función del huésped utilizado. A dicho efecto, el ADN codificante para la nitrilasa, puede insertarse en vectores de replicación autónoma, en el seno del huésped elegido, o en vectores integrantes del huésped elegido. Tales tipos de vectores, se prepararán según los procedimientos corrientemente utilizados por parte de la persona experta en este arte especializado de la técnica y, las construcciones resultantes, pueden introducirse en un huésped apropiado, mediante procedimientos standard, tales como la electroporación.

A título de microorganismo huésped, se pueden citar, de una forma particular, los Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Escherichia coli, o los microorganismos del género Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium y Aspergillus.

Un vector preferido para la expresión, en los E. coli, es el plásmido pRTA-BCAT6.

La segunda etapa del procedimiento, consiste en inmovilizar el material biológico. Esta inmovilización, se hace, de una forma ventajosa, en presencia de un soporte sólido, y permite obtener partículas sólidas cuyo tamaño, forma, y resistencia mecánica, pueden controlarse. Ésta permite también el empleo simultáneo del polímero de poliazetidina y de otros agentes reticulantes.

Este procedimiento de inmovilización, puede hacer intervenir células enteras o permeabilizadas. Éste puede también aplicarse a una solución enzimática exenta de células.

Las enzimas utilizadas para la inmovilización, son las nitrilasas.

El procedimiento de inmovilización, consiste en inmovilizar el material biológico activo sobre un soporte sólido, de una granulometría principalmente comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 \mum y 3 mm, de una forma preferente, comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 \mum y 2 mm, gracias a agentes químicos que reaccionan con las funciones aminas (NH_{2}, NH), carboxilo (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) o amida (CONH_{2}), del agente biológico y del soporte. Estos agentes químicos, permiten también isolubilizar en agua, el material biológico y el soporte. La masa obtenida, es muy maleable y puede ponerse en forma, con el fin de obtener partículas de forma y de tamaño deseado. La cohesión y la duración de estas partículas, se obtienen, a continuación, mediante
secado.

El material biológico a inmovilizar, puede eventualmente contener igualmente un material biológico inactivo, presente a razón de un porcentaje del 0 al 200%, en peso. Este material biológico inactivo, puede corresponder a proteínas (albúmina, gelatina), o pueden ser polisacáridos (Citasan, k-carragenano, alginato).

El soporte inerte sobre el cual se deposita el material biológico y polímero, puede estar compuesto a base de partículas orgánicas o inorgánicas, porosas o no porosas, hidrófilas o hidrófobas. Entre estas partículas, se pueden señalar, de una forma no limitativa:

-: las resinas intercambiadoras de iones,

-: la alúmina,

-: los sílices de síntesis o diatomeas y los geles de sílice,

-: las zeolitas,

-: los carbones,

-: las proteínas insolubles en agua, como el gluten,

-: los polisacáridos, como el almidón.

El soporte inerte, puede ajustarse a razón de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,01 a un 500%, en peso, del material biológico y, de una forma preferente, dentro de unos márgenes que van de un 10 a un 200%.

Los agentes químicos utilizados para insolubilizar el material biológico, pueden ser polímeros o moléculas bifuncionales que reaccionan con las funciones amina (NH_{2}, NH), carboxílica (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) amida (CONH_{2}). Se pueden citar:

-: los polímeros de poliazetidina,

-: los polímeros de polietilenimina,

-: los polímeros de poliamida,

-: los polímeros de isocianatos,

-: los geles de alginato,

-: los geles de k-carragenano,

-: las aminas como la hexametilendiamina,

-: los aldehídos como el glutaraldehido,

-: los ácidos carboxílicos como el ácido adípico, y

-: los isocianatos.

El procedimiento de inmovilización, puede hacer intervenir uno o varios de estos agentes químicos. El agente químico, se añade según una concentración comprendida dentro de unos márgenes correspondientes a un porcentaje situado entre el 1 y el 50%, en peso, con relación al material biológico y al soporte. Se preferirá una cantidad comprendida dentro de unos márgenes correspondientes a un porcentaje situado entre el 5 y el 30%, con el fin de obtener partículas suficientemente sólidas y que conserven una actividad importante y que no presenten demasiados problemas de difusión interna.

La duración del tratamiento de reticulación, se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,5 y 24 horas.

La temperatura del procedimiento, se encuentra generalmente comprendida dentro de unos márgenes situados entre unos valores de 4 y 65ºC. Se preferirá una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre unos valores de 20 y 40ºC. La temperatura empleada, durante el procedimiento de inmovilización, puede también ser muy dependiente de la estabilidad del material biológico empleado.

El valor pH, durante la fase de inmovilización, se mantiene a un nivel comprendido dentro de unos márgenes situados entre 5 y 11. Se preferirá un valor pH comprendido dentro de uno márgenes situados entre 6 y 10, con una preferencia hacia los valores pH alcalinos. El valor pH, se elige también en función de la resistencia del material biológico, y se determinará fácilmente y con soltura, por parte de las persona especializada en este arte de la
técnica.

La aplicación del biocatalizador, debe permitir su empleo en un sistema cualquiera, especialmente, en un lecho fijo.

Un procedimiento de formulación, puede ser el de la extrusión. Para realizar este cometido, el material biológico y los soportes, se reticulan mediante la ayuda de uno o varios agentes químicos. Después del tratamiento, la masa insoluble, se recupera mediante centrifugación o después de la floculación y filtración. Una tasa de materia seca, de por lo menos un porcentaje del 10%, es el que se prefiere. La masa, a continuación, se extrusiona. Mediante este procedimiento, se obtienen, de una forma preferente, unos "macarrones" de un diámetro comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,3 y 0,5 mm, y de una longitud comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 y 10 mm. Estos "macarrones", pueden esferizarse en forma de granza. Se procede, a continuación, a secar las partículas de esta forma obtenidas.

Otro procedimiento de formulación, puede ser el de la aplicación de una película (recubrimiento mediante proyección pulverizada - "spray coating"- ). Para realizar este cometido, el material biológico, se mezcla con uno o varios agentes químicos. Después de la reacción, al mezcla, se pulveriza sobre el soporte, bajo forma de una capa fina. Mediante este procedimiento, se obtienen gránulos de granza, de un diámetro medio comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,1 y 2 mm.

Las partículas obtenidas, pueden eventualmente sumergirse, a continuación, en una solución de un agente reductor, como el borohidruro de sodio, con el fin de reducir las funciones iminas formadas durante al reticulación.

Las partículas obtenidas, son lo suficientemente sólidas y resistentes al desgaste por fricción, como para poder emplearse en un lecho fijo, y lecho fluidificado o un reactor agitado.

La tercera etapa del procedimiento según la presente invención, consiste en aplicar el material biológico inmovilizado, en una o varias columnas o reactores. La finalidad de esta etapa, es la de poder producir, en continuo, las sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, a partir del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

La columna o columnas, o reactor o reactores, se alimentan mediante una solución pura o diluida de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo o una mezcla que contenga 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo y sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico.

La columna o columnas, o reactor o reactores, se ponen en marcha, de una forma preferente, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 y 60ºC, y a un pH comprendido dentro de unos valores situados entre 5 y 9.

El sistema aplicado, puede estar constituido a base de varias columnas conectadas la una con la otra, en serie, según una primera forma de puesta en ejecución de la presente invención, mediante la alimentación de la solución acuosa del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, en la cabeza de la primera columna, con una alimentación simultánea de las otras columnas, con la solución del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, en una cantidad limitada a la solubilidad de este compuesto, en la mezcla reactiva; este sistema, se denomina sistema por etapas. Según una segunda forma de puesta en ejecución de la invención, se utilizan una o varias columnas conectadas la una con la otra, en paralelo, en un bucle de circulación. Según esta instalación, el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo en solución acuosa, se alimenta en continuo, en el bucle y, el medio de reacción, se bombea en continuo, de tal forma que se conserve un volumen constante en el bucle; este sistema, se denomina sistema de bucle.

El tipo de reactor utilizado en esta invención, puede ser del tipo de lecho fijo, de lecho fluidificado, o del tipo agitado en continuo. Se prefiere utilizar los reactores del tipo de lecho fijo, debido al hecho de que, éstos, reducen los problemas de desgaste por fricción, que puedan encontrarse con partículas de células inmovilizadas. Si el microorganismo se utiliza tal cual, se preferirá utilizar un reactor agitado, acoplado a un módulo de ultrafiltración, para separar, de una forma continua, al microorganismo del producto de interés.

La cuarta etapa, la cual es una etapa facultativa, consiste en convertir la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, en el ácido correspondiente. Esta etapa, puede realizarse según dos procedimientos:

- o bien ya sea mediante electrodiálisis por mediación de un electrodializador de dos o de tres compartimientos,

- o bien ya sea mediante calentamiento de la solución acuosa, que puede seguirse de una extracción líquido / líquido.

Según el procedimiento por electrodiálisis, se empleará un electrodializador de dos o de tres compartimientos. Por "compartimento", se entiende el espacio comprendido, bien ya sea entre dos membranas, bien ya sea entre una membrana bipolar y homopolar, o bien ya sea entre dos membranas homopolares contiguas. Por "célula", se entenderá un conjunto de dos o de tres compartimientos. Un apilamiento, comprende entre 5 y 300 células. El electrodializador, se encuentra compuesto por un apilamiento, y comporta, por supuesto, un ánodo y un cátodo.

Las membranas homopolares que pueden utilizarse en el ámbito de la presente invención, se dividen en dos grandes familias, según su forma de fabricación.

Así, de este modo, se pueden emplear membranas heterogéneas, preparadas a partir de resinas intercambiadoras de iones, mezcladas a un ligante tal como el poli(cloruro de vinilo), el polietileno, u otros. El conjunto de este modo formado, puede inducir una trama, como por ejemplo un tejido de poliéster, o de poliacrilonitrilo.

Se pueden igualmente utilizar membranas homogéneas, obtenidas mediante la introducción de un grupo funcional sobre un soporte inerte, mediante injerto químico o radioquímico. El procedimiento químico más utilizado, consiste generalmente en funcionalizar un látex de un polímero que comporta núcleos aromáticos, tales como los correspondientes a estireno / divinilbenceno o estireno / butadieno. El látex de esta forma funcionalizado, puede servir, a continuación, a inducir una trama como para las mezclas heterogéneas. El procedimiento radioquímico, comporta generalmente el injerto, bajo la influencia de una radiación, de un compuesto aromático, tal como el estireno, sobre un soporte inerte, como una hoja de polietileno o de politetrafluoroetileno. El núcleo aromático, se funcionaliza, a continuación, como en el procedimiento químico.

Las membranas intercambiadoras de cationes, comportan grupos ácidos fuertes, lo mas a menudo, grupos sulfonatos, o grupos ácidos débiles, a menudo, grupos carboxilatos. Más raramente, los grupos ácidos, pueden ser grupos PO_{3}^{2-}, HPO_{2}^{-}, AsO_{3}^{2-}, SeO_{3}^{-}.

Las membranas intercambiadoras de aniónes, comportan grupos básicos fuertes, lo más a menudo, grupos de amonio cuaternario, o grupos básicos débiles, lo más a menudo, grupos aminas, Más raramente, los grupos básicos, pueden ser grupos de fosfónio cuaternario o a grupos de sulfónio.

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En el presente procedimiento, las membranas catiónicas, comportan, de una forma preferente, grupos ácidos fuertes y, entre éstos, de una forma preferente, grupos sulfonatos, y las membranas aniónicas, comportan, de una forma preferente, grupos básicos fuertes y, entre éstos, grupos de amonio cuaternario.

Las membranas bipolares, son un conjunto de dos membranas, la una catiónica, y la otra aniónica. Cuando la membrana se somete a un campo eléctrico suficiente, el agua de solvatación en la interfase de la membrana, se disocia en iones H^{+} y OH^{-}, que migran, respectivamente, hacia el cátodo, atravesando la cara o fase catiónica, y hacia el ánodo, atravesando la cara o fase aniónica. Como membranas bipolares, se pueden citar, a título de ejemplo, las membranas comercializadas por parte de las sociedades Aqualytics, Tokuyama Soda o FuMaTech.

El ánodo del electrodializador, puede estar constituido por dos materiales clásicamente utilizados en electrodiálisis, por ejemplo, grafito, níquel, o titanio, revestido mediante metales preciosos u óxidos de metales preciosos, principalmente, de titanio platinado. El cátodo, puede igualmente estar constituido por materiales clásicamente utilizados en electrodiálisis, por ejemplo, grafito, acero inoxidable, o níquel.

El electrodializador, se alimenta con la solución acuosa a tratar. Es igualmente necesario el hacer circular, en el ánodo, una solución de un anolíto y, en el cátodo, una solución de un catolíto. Se puede igualmente emplear una solución única de un electrolito. En el presente procedimiento, es ventoso el utilizar un circuito único de electrolito. El rol interpretativo de la solución de electrolito, es la de asegurar una conductividad suficiente. De una forma preferente, esta conductividad, será igual o superior a un valor de 20 milisiemens por centímetro (mS/cm), sin que, éste límite inferior, deba considerase como crítico para la aplicación del procedimiento.

El electrolito puesto en ejecución, es un compuesto iónizable tal como una sal, un ácido o una base. El electrolito, se elige, de una forma preferente, entre los compuestos no electroactivos. Así, por ejemplo, es preferible el utilizar sales neutras, como los sulfatos, ácidos como el ácido sulfúrico, bases como la sosa.

Las densidades de la corriente aplicada, son, de una forma general, de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,2 y 1,5 kA/m^{2} y, de una forma preferible, de un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,5 y 1 kA/m^{2}.

La temperatura a la cual se pone en ejecución el procedimiento de la invención, se sitúa dentro de unos márgenes correspondientes a unos valores compatibles con la estabilidad de las membranas. Se opera, de una forma preferente, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre 30 y 60ºC.

El electrodializador, puede funcionar de diferentes formas. Éste puede funcionar, en primer lugar, en continuo, atravesando la solución a tratar, al apilamiento, en continuo; se disponen, entonces, varios niveles o zonas en serie, si el tratamiento a obtener lo exige. Éste puede también funcionar en discontinuo, recirculando, la solución a tratar, sobre un depósito, hasta que se haya obtenido el tratamiento obtenido. Finalmente, éste puede funcionar en paso directo, con recirculación parcial.

Según la primera variable de la invención, la disociación de la sal de amonio en ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, y en amoníaco, puede hacerse en una célula de electrodiálisis, de membranas bipolares, de tres compartimientos, tal como la que se representa esquemáticamente en la figura 1 A.

Un aparato de electrodiálisis apropiado para la puesta en ejecución del procedimiento, está constituido por diferentes compartimientos, delimitados, respectivamente, por membranas catiónicas (MC), membranas bipolares (MB) y membranas aniónicas (MA). Estos compartimientos, se dividen en compartimientos sal (S), los cuales se empobrecen en compuestos a separar, en compartimientos base (B) y ácido (A), en donde se concentran, respectivamente, el ácido y la base regeneradas a partir de la sal.

La sal de amonio, se introduce en el compartimiento sal. Bajo la acción del campo eléctrico, el ión amonio, migra hacia el cátodo, saliendo del compartimiento (S), en donde éste se encuentra, a través de una membrana intercambiadora de cationes (marbrana catiónica), y se combina con los iones OH^{-}, procedente de la cara o fase aniónica de la membrana bipolar, en el seno de la cual, se efectúa la disociación del agua, bajo el efecto de la carga eléctrica.

Simultáneamente, los iones carboxilato (2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato, migran hacia el ánodo, saliendo del compartimiento (S), en donde éstos se encuentran, a través de una membrana intercambiadora de aniones (membrana aniónica). Después del paso al interior del compartimiento (A) siguiente, éstos se protonizan mediante el aporte de iones H^{+}, procedentes del cara o fase catiónica de la membrana bipolar. Los tres compartimientos (B), (A), (S), contiguos, forman una célula de electrodiálisis.

En una segunda variante de la invención, la regeneración del ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, puede hacerse en una célula de electrodiálisis de membranas bipolares, de dos compartimientos, tal como la que se representa en la figura 1B. Estos dos compartimientos, se encuentran delimitados, respectivamente, mediante membranas catiónicas y membranas bipolares. Estos compartimientos, se dividen en compartimento (S/A) y base (B).

La sal de amonio, se introduce en el compartimiento sal / ácido. Bajo la acción del campo eléctrico, el ión amonio, migra hacia el cátodo, saliendo del compartimiento (S/A), en donde éste se encuentra, a través de una membrana intercambiadora de iones OH^{-}, procedente de la cara o fase aniónica de la membrana bipolar, en el seno de la cual se efectúa la disociación del agua, bajo el efecto del campo eléctrico.

Simultáneamente, el compartimiento S/A, se acidifica mediante el aporte de los iones H^{+}, procedentes de la cara o fase catiónica de la membrana bipolar. Los dos compartimientos (B) y (S/A), contiguos, forman una célula de electrodiálisis.

Esta configuración, presenta la ventaja de un mínimo consumo energético, y permite el hacer variar la relación sal / ácido deseada.

Para obtener un buen funcionamiento del electrodializador, la conductividad eléctrica del compartimiento de base (el mismo que el del compartimiento ácido en el caso de la configuración de tres compartimientos), debe ser suficiente y puede ajustarse mediante la ayuda de un soporte de electrodiálisis. Así, de esta forma, la conducitividad de la solución de amoníaco, puede aumentarse mediante la ayuda de una sal de amonio, como el sulfato de amonio.

En una variante preferida de la invención, se utiliza el 2-hidroxi-4-metiltiobutanoato de amonio.

En una forma de realización particular previsible en el ámbito de la presente invención, se introduce, en el compartimiento de sal de una célula de electrodiálisis de tres compartimentos, una mezcla de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y el 2-hidroxi-4-metilbutironitrilo. La sal, se disociará tal y como precedentemente, en 2-hidroxi-4-mtiltiobutirato, y migrará o se transformará en ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, el ión amonio, migrará hacia el cátodo, en donde éste se transformará en amoníaco, en el compartimiento de sal subsistirá el agua y el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo no transformado, se reciclará hacia la columna de hidrólisis.

Mediante el procedimiento por calentamiento, se recupera el ácido, procediendo a desplazar el equilibrio sal de amonio, ácido libre, calentando la solución acuosa rica en HMTBS y trasegando el amoníaco de esta forma liberado. Puede llegarse a este resultado, calentando, bajo la acción del vacío, o a presión atmosférica, con tratamiento de agotamiento o sin él. Con objeto de facilitar el desplazamiento del equilibrio, puede preverse el empleo de CO_{2} bajo presión. Se obtiene, de esta forma, una mezcla de HMBTS y de HMTBA, a razón de una tasa comprendida dentro de unos márgenes que van del 5 al 99,9% de HMTBA y, de una forma preferible, a una tasa comprendida dentro de unos márgenes que van del 10 al 50% de HMBTA, con relación a la suma de HMTBS y HMTBS. La viscosidad de estas soluciones, se encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1200 y 30 mm^{2} \cdot s^{-1} (1200 y 30 cSt) y, de una forma preferente, dentro de unos márgenes situados entre 200 y 50 mm^{2} \cdot s^{-1} (200 y 50 cST) a 25ºC.

Las soluciones acuosas, pueden descompensarse mediante extracción del ácido, con la utilización de productos disolventes, parcialmente miscibles, o no, con agua. Existe un gran número de disolventes posibles para la separación. Los disolventes preferidos, son las cetonas de C5 a C8, de una forma particular, la metilisobutilcetona; los éteres como el isopropiléter; los acoholes como el isopropanol; los ésteres; la aminas terciarias como la trioctilamina. En el ámbito de la invención, los disolventes preferidos, son: la acetona, la MIBK, el isopropanol, el acetato de isopropilo, el éter isobutílico o propílico o el THF, la trioctilamina. La relación de la fase acuosa y de la fase orgánica, no es crítica. Mientras tanto, por razones de grado de eficiencia, no debe descenderse por debajo de una relación mínima de 1/1 y, por razones de rentabilidad, no ir más allá de una relación de 1/3. Se prefiere una relación 1 / 1,5 a 2,0.

La extracción, puede realizarse en forma de lotes (batch), o en continuo, mediante cualquier tipo de tecnología de extracción líquido - líquido. Se pueden citar, por ejemplo, la cascada de mezcladores decantadores a co- o a contra-corriente, los extractores centrífugos, las colonias guarnecidas o de placas, etc.

La solución acuosa, empobrecida en ácido libre, puede tratarse de nuevo y, tantas veces como se desee, hasta el agotamiento completo del amoníaco, en caso de que se desee.

La fase orgánica, se somete a un tratamiento para aislar el HMTBA. Esto se realiza, de una forma preferente, mediante evaporación del disolvente, o mediante una extracción al agua caliente. Con objeto de evitar una eventual deterioración del HMTBA, se podrá mantener la solicitación térmica, tan reducida como posible, mediante la aplicación de vacío.

En estos dos procedimientos de disociación de la sal de amonio, se genera una solución acuosa de amoníaco. Ésta última, puede tratarse, con el fin de concentrar el amoníaco. Se preferirá la destilación y la concentración de amoníaco, en una o varias etapas, con o sin presión. Puede preverse una etapa previa de agotamiento. La solución concentrada de amoníaco, puede reenviarse a la síntesis del ácido cianhídrico, el cual entra en juego, en la síntesis del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

En una quinta etapa, se procede a concentrar la solución acuosa de HMTBS y / o de ácido libre. Esto se realiza, de una forma preferible, mediante la evaporación de agua.

La invención, tiene igualmente como objeto, una instalación para la puesta en ejecución del procedimiento según la invención. Una instalación de este tipo, se ilustra esquemáticamente en la figura 2, y comprende los conductos 1,2, destinados a introducir, respectivamente, la cianhidrina del AMTP, y el agua, en el reactor 3. El reactor 3, es un lecho fijo de recirculación, el cual se encuentra provisto de las cepas o enzimas inmovilizadas. Una parte de la solución, se trasiega del reactor 3 y se envía a un reactor de acabado 4. El reactor de acabado 4, es del tipo de lecho fijo, provisto de las cepas o enzimas inmovilizadas. Una solución concentrada en HMBTS, se recupera, a continuación, en la salida del reactor 4, vía el conducto 5.

Esta solución concentrada en HMBTS, puede seguir dos tratamientos totalmente independientes, según el tipo de producto pretendido.

Si se desea recuperar un producto que contiene una fuerte proporción de HMTBS, la solución del conducto 5, se conduce al interior de un evaporador 6, el cual permite concentrar el producto, y se recupera, en el conducto 8, una solución concentrada principalmente del HMBTS y que contiene un poco de ácido libre. El agua en exceso, así como una fracción del amoníaco, se evacuan mediante el conducto 7.

Si se desea recuperar un producto que contiene una fuerte proporción de ácido libre, la solución concentrada de HMTBS del conducto 5, se conduce al interior de un sistema de electrodiálisis bipolar 9. En este aparato, el amoníaco, se separa más o menos, del ácido, mediante electrodiálisis. La mezcla, empobrecida en amonio, se recupera en el conducto 11 y, a continuación, se concentra en el evaporador 12, con el fin de obtener una solución concentrada compuesta principalmente de ácido libre, que contiene poco HMTBS, o nada en absoluto. La solución rica en amoníaco, se trasiega, mediante el conducto 10. El amoníaco, se recupera, por agotamiento 15.

Este efluente de amoníaco, puede concentrarse mediante destilación 16, de agua, y recuperarse en 18. La solución de amoníaco concentrado 17, puede retornarse a la síntesis del HCN.

Los ejemplos que se presentan a continuación, ilustran la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación y secuencia Nter de la nitrilasa

Se procedió a purificar la nitrilasa en cuatro etapas. El resumen de la purificación, se proporciona en la tabla 1.

Las células de Alcaligenes faecalis, se cultivan durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de 30ºC, en un medio mínimo, en presencia de benzonitrilo (0,5 g / l). Después de la centrifugación del cultivo, la torta residual, se recoge en un tampón TG (25 mM, Tris-HCl, 10% (peso / volumen) glicerol, pH 7,5. La suspensión celular, se trata con ultrasonidos y, a continuación, se centrifuga, con el fin de obtener el extracto bruto. El extracto bruto, se trata, a continuación, con sulfato de amonio, hasta un 30% de la saturación. El precipitado obtenido, se vuelve a suspender en el tampón TG y, a continuación, se dializa contra 2 litros del mismo tampón, durante el transcurso de tiempo de una noche. La solución obtenida, se deposita, a continuación, sobre una columna intercambiadora de aniones del tipo Q Sepharose Fast Flow HR 26 / 10, previamente equilibrada con tampón TG. La actividad, se eluye, a continuación, con un gradiente de 0 a 1 M NaCl. Las fracciones activas, se depositan, a continuación, sobre una columna intercambiadora de aniones del tipo Mono Q HR 5/5, previamente equilibrada con tampón TG. La nitrilasa, se eluye con la ayuda de un gradiente de 0 a 1 M NaCL. Para finalizar, las fracciones que contienen la actividad, se reúnen, la concentración en sulfato de amonio se conduce, a continuación, a un valor 1 M. Esta solución, se deposita entonces sobre una columna de interacciones hidrófobas del tipo Phenyl Superose HR 5/5, previamente equilibrada con tampón TG, adicionado con 1 M (NH_{4})_{2}SO_{4}. La actividad, se eluye, a continuación, mediante un gradiente de 1 M a 0 M en sulfato de amonio.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Resumen de la purificación de la nitrilasa

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Condiciones operativas: [nitrilo] 50 mM; tampón fosfato 100 mM pH 7,0; 30ºC.

Los pesos moleculares de la proteína, se determinan mediante filtración en gel. Éste es de aproximadamente 260kDa. Sobre gel de SDS-PAGE, se observa una única banda de 43 kDa (pureza del 95%). Es, por lo tanto, probablemente, una proteína de estructura \alpha, que pesa 43 kDa.

Ejemplo 2 Clonación de la nitrilasa de alcaligenes faecalis ATCC8750

La secuencia NH2 presentada en el ejemplo 1, presenta una indentidad total con la secuencia del extremo N-terminal de la nitrilasa de A. faecalis JM3 (Kobayashi y colegas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:247-251), mientras que, las extremidades N-terminales de las nitrilasas bacterianas, presentan de un 35 a un 57% de la identidad sobre 14 residuos. Los inventores, han emitido la hipótesis de que, la nitrilasa de la invención, purificada a partir de la cepa ATCC8750, era parecida a la descrita por parte de kobayashi y colegas (anteriormente citada). La estrategia de clonación, ha consistido, entonces, en amplificar, por reacción de PCR, sobre el ADN genómico, de la cepa ATCC8750, el género de esta nitrilasa, con la ayuda de dos sondas nucleotídicas determinadas a partir de la secuencia dada por Kobayashi y colegas (anteriormente citada).

La dos sondas, se sintetizaron, pudiéndose una de ellas hibridar con la parte 5' de la secuencia dada por Kobayashi y colegas (anteriormente citada) y, la otra, con la parte 3':

Parte 5' (PCRAF1): CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC

Parte 3' (PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT

El cebador PCRAF1, comporta 12 nucleótidos en 5', que permiten introducir, aguas arriba del codón de iniciación ATG, los sitios de restricción de las enzimas EcoRI de Ndel. El cebador PCRAF2, permite introducir el sitio de la restricción de la enzima BamHI. El ADN genómico de la cepa A. faecalis ATCC8750, se extrajo según el protocolo de CTAB, descrito por parte de Ausubel y colegas (Current Protocols in Molecular Biology, - Protocoles actuales en biología molecular, - John Willey & Sons Inc. Ed. 2,4,1-2.4.5) y 100 ng, se utilizaron para cada reacción de PCR. Con el fin de jugar sobre la especificidad de amplificación, se procedió a someter a test de ensayo, diferentes concentraciones de MgCl_{2}, tal como se indica en la obra de Ausubel y colegas (anteriormente citado), en un volumen total de muestra de 100 \mul y con 2,5 unidades de Taq DNA polimeresa (Perkin Elmer). Se realizaron dos reacciones suplementarias, con 1,5 mM MgCl_{2} y 5% DMSO o 5% formamida. Se programó un termociclador Perking Elmer 9600, con la siguiente programa de coordinación: 5 minutos a 95ºC, 30 ciclos (30 segundos a 95ºC), 30 segundos a 55ºC, 45 segundos a 55ºC, 45 segundos a 72ºC y, 4 minutos a 72ºC. Los diferentes productos de amplificación, se determinaron sobre gel de agarosa 0,8%. Una banda mayoritaria, cuya talla correspondía al tamaño esperado, de 1,15 kb, se amplificó en todas las reacciones, pero, más específicamente, con 1,5 mM MgCl_{2} y 5% DMSO. Se retuvieron, a continuación, los productos de la reacción, en estas condiciones. La muestra, se trató con proteinasa K, precipitada con etanol, después de una extracción fenol-cloroformo. La torta residual vuelta a poner en suspensión, se incubó, durante un transcurso se tiempo de 2 horas, a una temperatura de 37ºC, con 40 unidades de enzima EcoRI y 40 unidades de enzima BamH1. Después de migración sobre gel de agarosa 0,7%, la banda de 1,15 kb, se cortó y se extrajo, para clonarse en el vector pBSK^{-} (Stratagene, La Jolla Usa), abriéndose, EcoRI-BamHI, mediante procedimientos clásicos. Cinco clones independientes, denominados pRPA - BCAT 1 a 5, se analizaron por digestión enzimática del ADN plasmídico, con las enzimas Ndel, EcoRI, BamHI, BspMI y Bg/II (figura 3). Los perfiles obtenidos, correspondían a los perfiles de restricción teórica de un plásmido obtenido por este método, con la secuencia descrita por Kobayashi y colegas (anteriormente citada). La cepa XL1 Blue (pRPA-BCAT3), se depositó en la CBS, bajo el número
CBS 998-96.

Ejemplo 3 Secuenciación de un fragmento de 1130 pb que contiene ADN codificante para el polipéptido que tiene una actividad nitrilasa

El inserto clonado en el plásmido pRPA-BCAT3, se secuenció por la firma Génome Express S.A. (Grenoble, Francia), a partir de una preparación de ADN realizada en el laboratorio (kit Witzzard Midi-prep, Promega). La estrategia de secuenciación de este fragmento, realizada según procedimientos clásicos conocidos por parte de la persona especializada den este arte de la técnica, se indica en la figura 4. Los diez nucleótidos internos (indetificados por los números 623 a 629 y 681 a 682, en fa figura 4), se sintetizaron según la secuencia de la nitrilasa de A faecalis JM3 (Kobayashi y colegas, anteriormente citada). Este conjunto, se completó mediante los cebadores universales "Reverse" y "M13 Forward". Cada región, se iluminó por lo menos una vez, sobre cada hebra del ADM.

La secuencia de ADN, obtenida, presenta dos diferencias, con relación a la secuencia publicada: la una, en la estructura supuesta como sirviendo de terminador de transcripición y, la otra, en el gen de la nitrilasa, denominado nitB, que conduce a la sustitución Asn^{127} -> Asp. Estas dos regiones, se secuenciaron, entonces, en el laboratorio, sobre los plásmidos pRPA-BCAT1, 2, 4, 5, con dos cebadores específicos 710 y 682 (véase la figura 4). El cambio C->T a la posición 1412 (en conformidad con la numeración de Kobayashi, anteriormente citada), en el terminador, se encontró en todos los clones. Se trata de una mutación que diferencia las dos cepas de A. faecalis. El cambio A->G a la posición 1138, no se encuentra presente más que en el plásmido pRPA-BCAT3. Se trata, por lo tanto, de una mutación introducida en el momento de la PCR, mediante la Taq DNA Polimerasa.

Ejemplo 4 Expresión de la nitrilasa en E. coli BL21(DE3)

Con el fin de confirmar la identificación de la secuencia de ADN clonada con el gen de la nitrilasa purificada, el gen nitB, se emplazó sobre el control del promotor del gen \Phi phago T7 (PT7), según el modo operativo descrito a continuación: los insertos Ndel-BamHI de 1,13 -kb de los plásmidos pRPA-BCAT3 y pRPA-BCAT4, se clonaron en el vector pXL2432, para proporcionar, respectivamente, los vectores pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT13, descritos en la figura 5. El vector, pariente, pXL2432, es un híbrido entre la región del plásmido pET9 (Studier y colegas, 1990, Methods in Enzymol, 185, 60 - 89), comprendida entre los sitios ACCI y Eco RI, que engloba el origen de la replicación (ORI) y el marcador de selección, portador de la resistencia a la kanamicina (Kan), y la región comprendida entre los sitios EcoRI y AccI del plásmido pET11a (Nogagen Inc., Madison WI, USA), que engloba la casete de expresión, el gen del represor IacI y el gen del regulador del número de copias ROP.

Los cultivos, se realizaron en condición de inducción, según el modo operativo que se facilita a continuación: La cepa BL21(DE3) (Novogen Inc., Madison WI, USA), que contiene el plásmido pRPA-BCAT12, la cepa BL21(DE3), que contiene el plásmido pRAP-BACT13, así como la cepa BL21(DE3), que contiene el plásmido pXL2432, se cultivaron durante un transcurso de tiempo de 16 horas en medio LB, a una temperatura de 37ºC (Miller, 1972, Expermiments in Molecular Genetics, - Experimentos en Genética Molecular-, Cold Springer Harbor Laboratory, Cold Springer Harbor, N.Y.), con un contenido de 50 \mug/ml de kanamicina y, a continuación, se diluyeron a un valor de 100^{ma} (una centésima parte), en el mismo medio y a la misma temperatura. Cuando los cultivos alcanzaron una DO600, comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,5 y 1, se añadió IPTG, a la concentración final de 1 mmM. Después de un transcurso de tiempo de 6 horas de cultivo, se procedió a recolectar las bacterias. Se adoptó un modo operativo similar, para cultivar la cepa BL21(DE3) que contenía los plásmidos pRPA-BCAT12 y pXL2231, la cepa BL21(DE3) que contenía los plásmidos pRPA-BCA13 y pXL2231, así como la cepa BL21(DE3) que contenía los plásmidos pXL2432 y pXL2231, añadiendo tetraciclina, al medio de cultivo, a razón de 12 \mug/ml de medio. El plásmido pXL2231, el cual deriva del vector pxL1635 (Solicitud de patente francesa FR 90/05185 del 24/04/1990), pertenece al grupo de incompatibilidad IncP, y es por lo tanto compatible con los plásmidos pRPA-BCAT12 y 13, los cuales poseen el origen de replicación del plásmido ColE1. Su marcador de selección, es la resistencia a la tetraciclina, y éste porta un fragmento EcoRI, HinIII de 2,2 kb, que contiene los genes GroES y GroEL, que codifican para las caperuzas moleculares de E. coli (Fayet y colegas, 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 435-445).

La expresión de la nitrilasa, se analizó en gel 10% SDS-PA, en la fracción bruta, después de sonificación de las células y, después de la centrifugación, en la torta residual, y en el sobrenadante. Los resultados, se presentan en la figura 6, y muestran un nivel elevado de expresión de la nitrilasa (NitB), en los extractos de células, en donde, uno de los plásmidos, contiene por lo menos el inserto nitB; de todos modos, esta proteína, se encuentra esencialmente en forma de insoluble, si bien la presencia del plásmido pXL2231, permite aumentar la cantidad de polipéptido nitrilásico, en la fracción soluble.

Sobre la figura 6, M representa un marcador de pesos moleculares; éstos se indican en kDa. Por otra parte, las pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:

- A, D, G, representan las fracciones brutas, respectivamente de BL21(DE3) + p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL
2232;

- B, E, H, representan los sobrenadantes obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;

- C, F, I, representan las tortas residuales obtenidas respectivamente a partir de estas mismas cepas;

- J, N, Q, representan las fracciones brutas obtenidas respectivamente a partir de BL21(DE3) + pXL2231 + p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2232;

- K, O, R, representan los sobrenadantes obtenidos respectivamente a partir de estas cepas;

- L, P, S, representan las tortas residuales obtenidas respectivamente a partir de estas cepas.

La cepa BL21(DE3) / p/RPA-BCAT12 + pXL2231, se denominó RPA-BIOCAT 126. La cepa BL21(DE3) / p/RPA-BCAT13 + pXL2231, se denominó RPA-BIOCAT 127. La actividad nitrilasa de los cultivos de RPA-BIOCAT126, RPA-BIOCAT 127, y RPA-BIOCAT 66, que corresponde a BL21(DE3) / pXL2432, se determinaron de la forma que sigue: los cultivos, se condujeron según el protocolo descrito anteriormente, arriba, procediendo a modificar el volumen de cultivo (50 ml) y la concentración final de IPTG (0,1 mM). Los cultivos, se centrifugaron y, las tortas residuales celulares, se recogieron en 10 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM pH 7. La hidrólisis del HMTBN, se realizó con 500 \mul de esta suspensión añadida a 500 \mul de solución HMTBN 200 mM pH 7. Se obtuvo una cinética de hidrólisis, procediendo a mezclar 10 \mul de esta mezcla a 900 \mul de ácido fosfórico 0,1 N, a intervalos regulares, durante un transcurso de tiempo de 1 a 4 horas. Las cantidades de HMTBA producido, se analizaron mediante HPLC, tal y como de describe en la solicitud de patente internacional WO 96 / 09403. Los resultados, se recopilan en la tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Actividades de las cepas RPA-BIOCAT 86, 126 y 127

RPA-BIOCAT	Medio	Inducción	Tiempo de cultivo	0D660	Actividad (U)
66	LB Km	0,1 mM IPTG	24 h	2,5	0
126	LB Km Tc	0,1 mM IPTG	24 h	2,4	15
127	LB Km Tc	0,1 mM IPTG	24 h	1,9	10
Abreviaciones:
Km : \; Kanamicina 60 \mug/ml
Tc : \; Tetraclina 12 \mug/ml
h : \; \; horas
U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco.

Con el fin de mejorar la solubilización del polipéptido nitrilásico expresado, el plásmido pRPA-BCAT37, se construyó tal y como se describe posteriormente, a continuación. El plásmido pXL2391, se obtuvo procediendo a ligar el fragmento de 5,9 kb EcoRI-PvuII del plásmido pDSK591 (Keen y colegas, 1988, Gene 70: 191-197), tratado con la polimerasa Klenow, con el fragmento Hindi de 2056 bp, extraído del plásmido pHP45\OmegaSp (Prentki y Krisch, 1984, Gene 29: 303-313), tratado con Nucleasa Mung Bean. El plásmido pXL2391, se digirió, a continuación, mediante SmaI y SacI, y se introdujo el inserto de 2,3 kb, que porta el operón GroESL, extraído del plásmido pXL2231, digerido mediante HinKK, tratado con Klenow, y digerido mediante SacI. El plásmido, pRPA-BACAT 37, es por lo tanto un derivado del plásmido RSF-1010, de un mayor número de copias que el plásmido pX2231, compatible con los plásmidos portadores del origen CoIE1, y que portan un marcador de resistencia de estreptomicina. Este plásmido, se introdujo en la capa BL21(DE3) / pRPA-BCAT12, para proporcionar la cepa RPA-BIOCAT 171. Se procedió a determinar la actividad de un cultivo conducido según una forma de cultivo similar a la descrita anteriormente, arriba, pero reemplazando la tetraciclina por la estreptomicina, a 100 \mug/ml, y ésta, se recopila en la tabla 3.

TABLA 3 Actividades de las cepas RPA-BIOCAT 171

RPA-BIOCAT	Medio	Inducción	Tiempo de cultivo	0D660	Actividad (U)
171	LB Km Sm	0,1 mM IPTG	24 h	3,2	14
Abreviaciones:
Km : \; Kanamicina 50 \mug/ml
Sm : \; Estreptomicina 100 \mug/ml
h : \; \; horas
U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco.

Ejemplo 5 Expresión de la nitrilasa en E. coli DH5 alpha

Se procedió a construir el plásmido pRPA-BCAT6, clonando sobre pBACT3 (véase la figura 3), el fragmento de 0,6 kb Scal-Ndel de pXL2158, que contenía el promotor Ptrp y el sitio de fijación del ribosoma RBScII (Levy-Schill y colegas, 1995, Gene 161: 15-20). La expresión, se realizó con la cepa DH5alpha, que contenía el plásmido pRPA-BCAT6 y / o el plásmido pXL2035 (Levy-Schill y colegas, anteriormente citado, arriba), mediante el modo operativo siguiente: el precultivo, se incubó, durante un transcurso de tiempo de 16 h, a una temperatura de 37ºC, en medio M9 glucosa (Miller, J. H. 1972, Experiments in Molecular Genetics, - Experimentos en Genética Molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), con un contenido de un 0,4% de casaminoácidos, 100 \mug/ml de triptofano, 100 \mug/ml de carbenicilina. Para las cepas que contenían pXL2035, se añadió kanamicina, a razón de 50 mg/l. La expresión, se hizo después de la dilución a 1/100 de cultivo saturado, en un medio idéntico, pero sin triptofano e incubación, durante un transcurso de tiempo de 8 a 16 horas, a una temperatura de 37ºC.

El análisis de SDS-PAGE de los extractos de diferentes cepas, se realizó tal y como se describe en el ejemplo precedente, y se presenta sobre la figura 7.

- L, I, F, C, representan las fracciones brutas obtenidas respectivamente a partir de las cepas DH5alpha + p/RPA-BCAT/3,/6,/6 + pXL2035, RPA-BIOCAT76;

- K, H, E, B, representan los sobrenadantes obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;

- J, G, D, A, representan las tortas residuales obtenidas respectivamente a partir de estas mismas cepas.

El plásmido pRPA-BACT6, permite obtener una débil acumulación de un polipéptido de 43 kDa, mayoritariamente insoluble. La coexpresión de GroE a partir del plásmido pXL2035, reduce la sobreexpresión, pero, después de tres trasplantes sucesivos de la cepa DH5alpha (pRPA-BCAT6 + pXL2035), la cepa RPA-BIOCAT76 seleccionada, encuentra un nivel inicial de expresión del polipéptido nitrilásico, siendo, éste último, completamente soluble. Las dosificaciones de los cultivos realizados según los modos operativos descritos anteriormente, arriba, y en el ejemplo precedente, se presentan en la tabla 4.

TABLA 4 Actividad de las cepas DH5alpha (pRPA-BACT3), DH5alpha(pRPA-BACT6), Dh5alpha(pRPA-BACT6+pXL2035), RPA-BIOCAT76

Cepa	Medio	Tiempo de	0D660	Actividad
		cultivo		(U)
DH5alpha (pRPA-BCAT3)	M9 Cb	24 h	4	0
DH5alpha (pRPA-BCAT6)	M9 Cb	24 h	4	0,6
DH5alpha Km (pRPA-BCAT6 + pXL 2035)	M9 Cb km	24 h	3	1,6
RPA-BIOCAT76	M9 Cb km	24 h	3,8	5
Abreviaciones:
Km : \; Kanamicina 60 \mug/ml
Cb : \; Carbenicilina 100 \mug/ml
h : \; \; horas
U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco.

Estos datos, muestran el hecho de que, la expresión de GroE, permite mejorar la expresión de la nitrilasa y que, una selección de la cepa clásica por trasplantes sucesivos, contribuye, también, a la mejora de la actividad recombinante.

Ejemplo 6 Expresión de la nitrilasa en pseudomonas putida y alcaligenes faecalis.

Para producir la nitrilasa, en la Pseudomonas putida y A. faecalis, se utilizó el sistema de expresión descrito en el ejemplo 5. Se procedió a introducir el fragmento de 1,14 kb de NdeIl-XbaI de pRPA-Bact6, que contenía el gen nitB, en los sitios NdeI-XbaI del vector pXL1289. El vector pXL1289, es un derivado de pKT230 (Bagdasarian y colegas, 1981, Gene 15; 237-247) que porta el origen de replicación (oriV) multi-huésped, en las bacterias Gram-negativas y que contiene un fragmento EcoRI-NdeI de 120 bp portador del promotor Ptrp y del RBScII de pXL534 (Latta y colegas, 1990, DNA T Cell Biology, 9: 129-137), un inserto Ndel-Xbal codificante para el gen cobA (Crouzet y colegas, 1990, J. Bacteriol. 172:59689-5979) y un inserto Xbal-BamHI de 500 bp, que contiene el terminador TrmB de pXl534 (Latta y colegas, 1990, DNA T cell Biology, 9: 129-137). El plásmido obtenido pRPA-BCAT14, es por lo tanto un derivado de pKT230, que contiene un gen que confiere la resistencia a la kanamicina (Kan) y el gen nitB, bajo el control de Ptrp:RBScII (figura 8).

En el momento de la introducción de este plásmido en la cepa de E. coli DH5alpha, se seleccionó un clon particular: éste expresaba una nitrilasa, cuyo peso molecular, sobre gel SDS-PA, es de 44 kDa, en lugar de 43 kDa. El plásmido hospedado por el clon, presenta el mismo perfil de restricción que el pRPA-BACT14, y se denominó pRPA-BCAT24. Finalmente, se construyó el plásmido pRPA-BACT-23, según el mismo modo operativo que el utilizado para pRPA-BACT14, pero con la siguiente modificación: el fragmento de 136 pb StuI-BsmI de pRPA-BACT6, se reemplazó por el fragmento StuI-BsmI, de pRPA-CAT4. El plásmido pRPA-BACT23, expresa, por lo tanto, una nitrilasa NitB, con un residuo Asn en la posición 279.

Se procedió a introducir los plásmidos pRPA-Bact-14, 23 y 24, mediante electroporación, en la cepa Pseudomonas putida G2081. La cepa G2081, se deriva de la cepa KT2440 (Bagdasarian y Timmis, 1981, en Hofschneid y Goebel, Topics in Microbiology and Immunology, - Tópicos en Microbiología e Inmunología -, 47, Springer Verlag, Berlin), mediante selección de la resistencia espontánea al ácido nalidíxico, y a la rifampicina. Como plásmido de control, se utilizó el vector pK230.

Los plásmidos pRPA-BCAT14, pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 y pK230, se extrajeron, entonces, de la cepas de P. putida, para introducirse, mediante electroporación, en la cepa de A. faecalis ATCC8750 (= RPA-BIOCat1).

Las cepas G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), G2081 (pK230) y RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24), RPA-BIOCAT1 (pKT230), se cultivaron, durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 30ºC, en medio LB, que contenía 50 mg/l de Kanamicina. Estos precultivos, se diluyeron a 1/100, en medio M9, que contenía 50 mg/l de kanamicina, y se incubaron, durante un transcurso de tiempo de 20 horas, a una temperatura de 30ºC.

Después de sonificación de la células, se procedió a medir la expresión de la nitrilasa, sobre un gel 10% SDS-PA, en la fracción bruta, después de sonificación de las células, y después de centrifugación en la torta residual y en el sobrenadante. Los resultados, se presentan en la figura 9. Para las cepas RPA-BIOCAT1 (pKT230) y G2081 (pK230), solamente se depositaron los extractos brutos (pistas A e I, respectivamente). En esta figura, M, representa el marcador de pesos moleculares: éstos se indican en kDa. Por otra parte, las pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:

- B, D, F, representan las fracciones brutas obtenidas respectivamente a partir de las cepas y RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24);

- C, E, G, representan los sobrenadantes obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;

- H, representa la torta residual obtenida a partir de RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24);

- J, L, O, representan las fracciones brutas obtenidas respectivamente a partir de las cepas G2081 (pRPA-BCAT14), G20081 (pRPA-BCAT23), G20181 (pRPA-BCAT24);

- K, N, P, representan los sobrenadantes obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;

- Q, representa la torta residuales obtenida a partir de G20081 (pRPA-BCAT24).

Esta experiencia, muestra el hecho de que, las cepas de P. putida, expresan cantidades importantes de los tres polipéptidos nitrisilásicos solubles y que, únicamente el polipéptido nitrilásico de 44 kDa, se sobreexpresa mediante la cepa A. faecalis. Las dosificaciones de actividad de estos cultivos, realizados según el protocolo descrito en el ejemplo 4, muestran el hecho de que, las cepas G2081 (pRPA-BCAT23), G20081 (pRPA-BCAT24), y RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24), tienen una actividad nitrilásica sobre el HMTBN.

Ejemplo 7 Expresión de la nitrilasa en Corynebacterium glutamicum

Se procedió a realizar la expresión de la nitrilasa, en la cepa CGL 1010 (= ATCC 12752), con la ayuda de PcspB (Peyret y colegas, 1993, Molecular Microbiol. 9:97-109). Se Amplificó un fragmento de 530 bp, que contenía el promotor PcspB, a partir del plásmido pCGL815 (Peyret y colegas, anteriormente citado, arriba), con la ayuda de los cebadores KS1 y KS2 siguientes:

KS1: 5'-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'

KS2: 5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'

Después de la digestión mediante Sal I, el fragmento de 530 bp amplificado, se clonó en el plásmido pBSK (Statagene, La Jllla USA), abierta mediante Sal I, y EcoRV, para proporcionar el plásmido pCGL1084. Se procedió a fabricar un adaptador EcoNI y NdeI, hibridando los dos oligonucleótidos KS8 y KS9 siguientes.

KS8: 5'-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3'

KS9: 5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'

Se procedió a extraer el gen de la nitrilasa, del plásmido pRPA-BCAT6, en forma de un fragmento Ndel-Xbal de 1,1 kb. Éste se introdujo en pCGL1084, abierto con EcoNI y Xbal, utilizando el adaptador EcoNI/NdeI, descrito a continuación, para proporcionar el plásmido pCGL1086. El fragmento de Sal I-BamHI de pCGL1086 que contenía PcspB:nitB, se clonó, a continuación, en el vector pCGL482 (Peyret y colegas, anteriormente citado, arriba), en los sitios Sal I y BamHI, conduciendo al plásmido pCGL1087. El plásmido pCGL1087 (figura 10), es por lo tanto un vector vehículo a base de pBI1 (Santamaría y colegas. 1984, J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246), que contenía el origen de replicación de pACYC 184, reconocido en E. coli, un gen que confería la resistencia al cloranfelicol (Cm) y la fusión PcspB::nitB.

Los plásmidos pCGL1087 y pCGL 482, se introdujeron, por electroporación, en CGL 1010, tal y como se describe por parte de Bonnamy y colegas, 1990 (FEMS Microbiol. Lett. 66:263-270). Después de un transcurso de tiempo de 20 horas de cultivo, a una temperatura de 30ºC, en medio Brain Heart Infusión 3,7% (Daifco Laboratories, Detroit USA), adicionado de cloranfelicol 5 mg/l, se realizaron actividades nitrilasa sobre muestras de cultivo, tal y como se ha descrito en el ejemplo 4. Los resultados obtenidos, muestran el hecho de que, la cepa CGL 1010 (pCGL1087) posee una actividad nitrilasa, mientras que, la cepa CG1010 (pCGL482), no la tiene.

Ejemplo 8 Expresión de la nitrilasa en Streptomices lividans

Se procedió a realizar la expresión de la nitrilasa, en la cepa de S. Lividans TK24 (Hopwood y colegas, 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces; A laboratory Manual, - Manipulación genética de Streptomyces; un manual de laboratorio -, The John Innes Foundation, Norwich)), con la ayuda del plásmido plJ6021 (Talano y colegas, 1995, Gene 166; 133-137), utilizando el promotor PtipA (Holmes y colegas, 1993, EMO J. 123:3183-3191).

El plásmido pUC19 (Yanisch-Perron y colegas, 1985, Gene; 103-119) se modificó, procediendo a dividir el fragmento Tfi I de 140 bp, mediante digestión Thi I, tratamiento mediante Klenow y ligadura del vector sobre sí mismo. El plásmido obtenido, se abrió con EcoRI y BamHI, con el fin de clonar el fragmento de 1,15 kb EcoRI-BamHI de pRPA-BCAT3, que contiene el gen nitB. El plásmido obtenido pOS48.4, de esta forma obtenido, posee un sitio único Tfi I situado entre el gen nitB y el sitio BamHI. Este sitio, se utilizó para injerir un fragmento \Omegahyg de 2,3 kb extraído del plásmido pHP45\Omegahyg (Blondelet-Rouault y colegas, Gene, submitted), después de digestión mediante BamHI y tratamiento mediante Klenow. El fragmento \Omegahyg, contiene el género de la higromicina fosfotransferasa (hyg), de Streptomices hygroscopicus (Zalacain y colegas, 1986, Nucl. Acids Res., 14: 1565-1581) y confiere a S. Lividans, una resistencia a la higromicina. El plásmido pOS48,5 de esta forma obtenido, se utilizó para aislar un fragmento NdeI y BamHI, de 3,45 kb, que contiene el gen de la nitrilasa, seguido del gen hyg, el cual se clonó en el plásmido pIJ6021 (Talano y colegas, anteriormente citado, arriba), abierto mediante NdeI y BamHI. Al no replicarse el plásmido pIJ6021, más que en Streptomyces, la mezcla de ligación, se transformó en S. Lividans TK24, mediante procedimientos clásicos (Hopwood y colegas, anteriormente citado, arriba), seleccionando los clones que resisten a 200 mg/l de higromicina (Boehringer Manheim). Los ADN plasmídicos de estos clones, se extrajeron mediante procedimientos clásicos (Howood y colegas, anteriormente citado, arriba) y sus perfiles de restricción, correspondían correctamente a la construcción esperada, la cual se denominó pOS48,7 (figura 11).

Se cultivaron dos clones de S. Lividans, que contenían pOS48,7, así como un clon que contenía el plásmido pKJ6021, en 50 ml de medio TSB (Trytic Soy Broth, Difco), a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 72 horas, con una selección de kanamicina 5 mg/l y, a continuación, se añadió thiostrepton, a una concentración de 5 mg/l y, el cultivo, se prolongó, todavía, durante un transcurso de tiempo de 18 horas, según las condiciones descritas (Hopwood y colegas, anteriormente citado, arriba). El cultivo, se recolectó y, la dosificación de actividad, la cual se realizó en las condiciones descritas en el ejemplo 4, mostraba el hecho de que, la cepa S. Lividans TK24 (pOS48,7), expresaba una actividad nitrilasa, contrariamente a la cepa TK24(pIJ6021).

Ejemplo 9 Hidrólisis del HMTBN, con otras nitrilasas

La secuencia primaria de la nitrilasa de Comamonas testosteroni sp, descrita en Levy-Schill y colegas 1995 (anteriormente citado, arriba), presenta un 31% de identidad con la secuencia primaria de la nitrilasa descrita en esta invención. La cepa recombinante de E. coli TG1 (pXL2158, pXL2035), la cual expresa la nitrilasa de C. Testosteroni, se cultivó en las condiciones descritas por parte de Levy-Schil y colegas (anteriormente citada arriba), y se incubó una torta celular, en un tampón fosfato 100 mM a pH 7, con 50 mM HMTBN, a una temperatura de 30ºC. La actividad medida, era de 2,3 kg/h CS. Como la nitrilasa de la invención, la nitrilasa de C. testosterni, es capaz de hidrolizar el HMTBN.

Además, los datos presentados en el ejemplo 4, con los plásmidos pBCAT12 y pBCAT13, muestran el hecho de que, la sustitución Asn279 ->Asp279 sobre la nitrilasa de A. faecalis ATCC8750, permite el conservar la actividad sobre HMTBN.

Ejemplo 10 Aporte del soporte

Se procedió a añadir 5 g de células secas a 20 g de agua, ajustada a un valor pH de 7,0. Se añadió la cantidad de soporte (CELITE 545, Prolabo, Francia) indicada y, a continuación, después de una perfecta homogeneización, se procedió a reticular la suspensión, mediante la adición de un 15% de glutaraldehido, basado en la masa seca total, seguido de un 10% de polietilenimina (SEDIPUR, BASF, Alemania). La suspensión, se agita durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente.

Se procede, a continuación, a flocular la suspensión, mediante la ayuda de un 0.001% de un floculante aniónico. Superfloc A100. La masa reticulada, se recupera mediante filtración.

Esta masa, se retícula de nuevo, mediante la adición de un 10% de poliazetidina (KYMENE 557, Hércules, USA), basado en la masa seca total. La masa, todavía húmeda, se extrusiona, a continuación, a través de un orificio de 0,5 mm de diámetro, y se seca.

La actividad de las partículas obtenidas, se determina, a continuación, siguiendo un procedimiento descrito en la patente internacional WO 96 / 09403.

g de soporte	Actividad (en %)
0	100
2,5 g	215
5 g	250

La adición de soporte, para las células, mejora notablemente la actividad.

Se procede a repetir la experiencia, sustituyendo la CELITE por gluten de trigo (Roquette, Francia), parcialmente soluble en agua, o gelatina (SBI, Francia), totalmente soluble en agua.

g de soporte	Actividad (en %)
0	100
5 g de gluten	160
5 g de gelatina	nd*
* La suspensión celular, no flocula, y no es filtrable.

Este ejemplo, muestra el hecho de que, el gluten, puede solubilizarse con CELITE. Como contrapartida, si la adición es gelatina (totalmente soluble), el procesado para dotar de forma al catalizador, es imposible, mediante la técnica descrita anteriormente, arriba (extrusión).

Ejemplo 11

Se procedió a mezclar 10 g de Escherichia coli BIOCAT171, del ejemplo 4, preparados mediante un cultivo aeróbio, en un medio LB, con 10 g de CLAREL 78 (CECA, Francia), en 500 g de tampón fosfato 100 mM pH 7,0. Después de la homogeneización, se procedió a añadir 6 g de glutaraldehido 25% y, la suspensión, se agitó durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a la temperatura ambiente. Se añadieron, a continuación, 2 g de polietilenimina, así como 6 g de glutaraldehído, a un 25%. Se procedió a añadir la totalidad, durante un transcurso se tiempo de una hora, a la temperatura ambiente. EL conjunto, se floculó, con la ayuda de 5 ml de una solución de SUPERFLOC A 100, a un 0,2% (CYTEC, Francia). La masa, se filtró y, la pasta obtenida, se mezcló con 16 g de poliazetidina, a un 12,5% (KYMENE 557, Hercules) y, a continuación, se extrusionó a través de un orificio de matriz, de 0,5 mm de diámetro. Los "macarrones" obtenidos, se secaron a una temperatura de 35ºC, en una estufa y, a continuación, se sumergieron, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en un baño de NaBH_{4}, a un 1%, preparado en un tampón borato 50 mM, pH 10,0. Se procedió, a continuación, a lavar el biocatalizador, con agua destilada. El catalizador, se conservó, a una temperatura de 5ºC, o a la temperatura ambiente, en un tampón fosfato 500 mM, pH 8,0.

Se procedió a llenar una columna provista de termostato, de 3 cm de diámetro interior, y de 45 cm de altura, con 100 g de biocatalizador. Esta columna, se llenó con una bomba, vía un bucle de recirculación. El volumen total del reactor, era de 430 ml. La boca, se llenó con una solución de sal de amonio del ácido hidroximetiltiobutírico, a un 25%. La solución, se alimentó, por la parte superior de la columna, hacia abajo, a un caudal horario, correspondiente a 20 l/h. El agua que circulaba a través de la doble pared de la columna y en el intercambiador térmico, permite el mantener la temperatura a 35ºC. El agua desmineralizada, se añadió, al bucle, a un caudal de 80 g/h. Se procedió a añadir el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, a un caudal de 20 g/h. El excedente de volumen del medio de reacción, se evacuó por la parte de abajo, de la columna, de tal forma que, el volumen del bucle, permaneciera constante. Así, de esta forma, se obtuvo un flujo continuo, con una tasa de transformación del nitrito, del 95%. Además de ello, la concentración de la solución acuosa de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico obtenida en la salida del reactor, era del 25%.

Ejemplo 12

El electrodializador utilizado, se encontraba constituido por un conjunto consistente en un apilamiento, de 9 células, de 2 dm^{2} de superficie activa, compuestas, cada una de ellas, de 2 compartimientos designado de la forma que sigue:

- compartimiento sal / ácido: limitado del lado del cátodo, mediante una membrana intercambiadora de cationes CMB de Toluyama Soda y, del lado del ánodo, mediante la cara catiónica de una membrana bipolar Aqualytics.

- compartimiento base: limitado del lado del ánodo, mediante la membrana catiónica y, del lado del cátodo, mediante la cara aniónica de la membrana bipolar.

El ánodo, se encuentra constituido de titanio platinado. El cátodo, es en acero inoxidable.

El electrolito, se encuentra constituido por una solución acuosa de sulfato de sodio, que tiene una conductividad de 100 mS/cm, a una temperatura de 40ºC. El caudal de circulación, en los electrodos, es de 2 x 100 l/b. El volumen, es de 5 l.

El compartimiento "base", se llenó, inicialmente, con 5 litros de una solución de sulfato de amonio a un 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llenó, inicialmente, con 5 litros de una solución de 1,44 mol/litro de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metitio)butanóico.

El caudal de recirculación de las soluciones, se fijó, inicialmente, a 130 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a 190 l/h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se efectúa de forma discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura media de 40ºC. La intensidad, se impone a un valor de 9 A, es decir, a una densidad de corriente de 0,45 kA/m^{2}.

Después de un transcurso de tiempo funcionamiento, de 155 minutos, la conductividad del compartimiento sal / ácido, pasa de 59 a 7,8 mS/cm.

El compartimiento sal / ácido, contenía 1,35 mol/l de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico, a un 100%, en forma de ácido.

El rendimiento farádico, se estimó en un 71% y, el consumo energético, ara de 0,53 kW/h, por kg de ácido formado.

Ejemplo 13

El electrodializador utilizado, se encontraba constituido por un conjunto consistente en un apilamiento, de 8 células, de una configuración idéntica a la del ejemplo 12.

El compartimiento "base", se llenó, inicialmente, con 5,27 litros de una solución de sulfato de amonio a un 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llenó, inicialmente, con 4,85 litros de una solución de 1,39 mol/litro de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metitio)butanoico.

El caudal de recirculación de las soluciones, se fijó, inicialmente, a 60 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a 150 l/h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se efectuó de forma discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura media de 40ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 9 A, es decir, a una densidad de corriente de 0,45 kA/m^{2}.

Después de un transcurso de tiempo funcionamiento, de 172 minutos, la conducitividad del compartimiento sal / ácido, pasa de 59 a 9,5 mS/cm.

El volumen final del compartimiento sal / ácido, era de 4,67 litres.

La composición, era la siguiente:

: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 1,24 mol/l

: 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,149 mol/l

La tasa de transformación, era de un 86%. El producto final, era de un 89%, en forma de ácido.

El rendimiento farádico, se estimó en un 74%. El consumo energético, era de 0,53 kW/h, por kg de ácido formado.

Ejemplo 14

Se utiliza un dispositivo análogo al utilizado en el ejemplo 13.

El compartimiento "base", se llenó, inicialmente, con 5,46 litros de una solución de sulfato de amonio a un 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llenó, inicialmente, con 5,23 litros de una solución de 1,24 mol/litro de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metitio)butanóico.

El caudal de recirculación de las soluciones, se fijó, inicialmente, a 90 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a 150 l/h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se efectuó de forma discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura media de 40ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 14 A, es decir, a una densidad de corriente de 0,7 kA/m^{2}.

Después de un transcurso de tiempo funcionamiento, de 105 minutos, la conductividad del compartimiento sal / ácido, pasa de 57,6 9,8 mS/cm.

La composición final de compartimiento sal / ácido, era la siguiente:

: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 1,28 mol/l

: 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,14 mol/l

El producto final, era, por lo tanto, de un 90%, en forma de ácido.

Ejemplo 15

Se utilizó un dispositivo análogo al del ejemplo 13.

El ensayo, se realizó con el contenido de compartimiento base obtenido a la salida del ejemplo 14.

El compartimiento "sal / ácido", se llenó, inicialmente, con 5,2 litros de una solución de 1,44 mol/litro de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metitio)butanoico.

El caudal de recirculación de las soluciones, se fijó, inicialmente, a 50 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a 150 l/h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se efectuó de forma discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura media de 42ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 19 A, es decir, a una densidad de corriente de 0,95 kA/m^{2}.

Después de un transcurso de tiempo funcionamiento, de 53 minutos, la conductividad del compartimiento sal / ácido, pasa de 59 a 27 mS/cm.

El volumen final del compartimiento sal / ácido, era de 4,85 litres.

La composición, era la siguiente:

: ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 0,87 mol/l

: 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,56 mol/l

La tasa de transformación, era de un 56%. El producto final, era de un 61%, en forma de ácido.

El rendimiento farádico, era de un 83%. El consumo energético, se estimó en 0,7 kW/h, por kg de ácido formado.

Ejemplo 16

Se procedió a concentrar, en batch, (en lote) 200,1 g de solución de HMBTS, a 1,5 M, en un evaporador rotativo. La temperatura del baño, era de aproximadamente 45 \pm 5ºC. La presión, se reguló en las proximidades de 2,5 \cdot 10^{3} Pa (25 mbar). La temperatura, en el hervidor, evolucionó, desde un valor de 25ºC, en el inicio de la destilación, hasta un valor de 40ºC, en el final de la destilación. Al cabo de un transcurso de tiempo de 3 horas, se recuperaron 41,9 g de un medio viscoso, amarillo, cuyas características, son las siguientes:

\newpage

Viscosidad a 25ºC	1150
(mm^{2} \cdot S^{-1})
% HMTBA (Br/BrO_{3}-)	83,3

Después de ajuste del título (dilución con H_{2}O), se obtiene un producto, cuyas características, son las siguientes:

Viscosidad a 25ºC	396
(mm^{2} \cdot S^{-1})
% HMTBA (Br/BrO_{3}-)	79,5

Mediante potenciometría, se obtuvo el reparto másico siguiente:

% HMBTS	81,6
% HMTBA	6,0

Se procedió a medir, mediante CLHP, la relación de las superficies monómero o dímeros (monómero + dímeros).

monómero / (monómero + dímeros) 100

dímeros (monómero + dímeros) (*) 0

(*) Dímeros no detectados

Ejemplo 17

Se procedió a concentrar, en "batch" (en lote), 200, g de solución de HMBTS, a aproximadamente 1,5 M, en un evaporador rotativo. La temperatura del baño, era de 121 \pm 5ºC. La presión, se reguló en las proximidades de 9,5 \cdot 10^{4} Pa (25 mbar). La temperatura, en el hervidor, evolucionó, desde un valor de 100ºC, en el inicio de la destilación, hasta un valor de 113ºC, en el final de la destilación. Al cabo de un transcurso de tiempo de 3 horas, se recuperaron 41,5 g de un medio viscoso, marrón, cuyas características, son las siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

Viscosidad a 25ºC	-
(mm^{2}\cdotS^{-1})
% HMTBA (Br/BrO_{3}-)	90,7

\vskip1.000000\baselineskip

Viscosidad a 25ºC	117
(mm^{2} \cdot S^{-1})
% HMTBA (Br/BrO_{3}-)	78,8

Mediante potenciometría, se obtuvo el reparto másico siguiente:

\vskip1.000000\baselineskip

% HMBTS	52,2
% HMTBA	28,7

monómero / monómero + dímeros) 95,0

dímeros (monómero + dímeros(*) 5,0

Ejemplo 18

Se procede a añadir, a 100,0 g del medio descrito en el ejemplo nº 17, 40,0 g de H_{2}O. El medio, se extrae, con 75,,0 g de éter isopropílico. Después de la separación de las fases, se recuperan, en la fase orgánica, después de evaporación, 25,6 g de HMTBA, cuyas características son las siguientes:

Determinación
Monómero/(monómero + dímeros) (% de superficie)	97,0
Dímeros /(monómero + dímeros) (% de superficie)	3,0
Viscosidad a 25º (mm^{2} \cdot s^{-1})	55

Ejemplo 19 Envejecimiento de las soluciones descritas en los ejemplos precedentes

	Ejemplo nº16	Ejemplo nº 17	Ejemplo nº18
Duración del almacenaje a 25º	40 días	40 días	100 días
Viscosidad (mm^{2} \cdot s^{-1})	387	116	66
Monómero/(monómero + dímero)	100,0	95,0	82
Dímeros/(monómero + dímeros)	0,0	5,0	18

Los volúmenes de los ejemplos 16 y 17, no evolucionaron en su contenido en dímeros, después de un tiempo de almacenaje de 40 días.

Claims

1. Procedimiento de preparación del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y / o de la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, mediante la hidrólisis enzimática del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, caracterizado por el hecho de que:

b) en una segunda etapa, se procede a inmovilizarlo,

e) en una quinta etapa, se concentra el producto obtenido en la etapa c) o d).

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, la actividad nitrilasa, se obtiene a partir de una nitrilasa de Alcaligenes, de una forma preferible, faecalis.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que se utiliza la información genética que codifica a la nitrilasa, la cual se expresa en un microorganismo huésped.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que, el microorganismo huésped, se elige de entre Escherichia coli, o un miembro del género Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromices, Penicillium y Aspergillus.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, la actividad nitrilasa, se obtiene a partir de la nitrilasa codificada por el gen clonado en el plásmido pRPA-BCATT3, depositado en la CBS, con el número CBS998-96.

6. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por el hecho de que, la nitrilasa, se co-expresa con una proteína de cobertura.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, la proteína, es GroESL en E. coli.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que, el material biológico, de la etapa a), se inmoviliza sobre un soporte sólido.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, tiene una granulometría comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 \mum y 3 mm, de una forma preferente, comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 \mum y 2 mm, y por el hecho de que, éste, se añade a razón de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,01 a un 500%, de una forma preferente, a razón de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 10 a un 200%, en peso, del material biológico.

10. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, se elige entre:

-: las resinas intercambiadoras de iones,

-: la alúmina,

-: los sílices de síntesis o diatomeas y los geles de sílice,

-: las zeolitas,

-: los carbones,

-: las proteínas parcialmente solubles en agua, y,

-: los polisacáridos.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, es el gluten.

12. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que se utilizan uno o varios agentes químicos, para reticular y / o insolubilizar el material biológico y el soporte.

\newpage

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizada por el hecho de que, los agentes químicos, se eligen entre:

- los polímeros de poliazetidina,

- los polímeros de polietileninimina,

- los polímeros de poliamidas,

- los polímeros de isocianatos,

- los geles de alginato,

- los geles de k-carragenano,

- las aminas,

- los aldehídos,

- los ácidos carboxílicos, y

- los isocianatos.

14. Procedimiento, según las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por el hecho de que, el material biológico, y el soporte, se mezclan en presencia de agentes químicos, para obtener una pasta que se extrusiona y, a continuación, se seca.

15. Procedimiento, según las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por el hecho de que, el material biológico y los agentes químicos, se mezclan y, a continuación, se depositan sobre el soporte, en forma de una capa fina.

16. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por el hecho de que, se obtiene una mezcla del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, que contiene por lo menos un 60% de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y, de una forma preferente, por lo menos un 80% del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, siendo, el complemento, sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, por disociación electrolítica de la sal de amonio correspondiente.

17. Procedimiento, según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que, la disociación, se realiza en un electrodializador de membranas bipolares, de tres compartimientos.

18. Procedimiento, según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que, la disociación, se realiza en un electrodializador de membranas bipolares, de dos compartimientos.

19. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por el hecho de que se obtiene una mezcla de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, mediante calentamiento de una solución de sal de amonio.

20. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por el hecho de que, el amoníaco liberado, se destila, se concentra y se recicla en la síntesis de HCN.

21. Solución acuosa, obtenida según las reivindicaciones 16 a 19, constituida por una mezcla del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, en donde, la relación ponderal ácido / (ácido + sal), es de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 5 a un 99,9% y, de una forma preferente, de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 10 a un 50%.

22. Instalación para la puesta en ejecución del procedimiento según la presente invención, el cual comprende:

- uno o varios reactores (3,4), provistos de enzimas inmovilizadas que tienen una actividad nitrilasa, o de microorganismos huésped inmovilizados, que expresan una enzima de actividad nitrilasa,

- eventualmente, uno o varios medios de electrodiálisis (9),

\newpage

- medios de concentración (6/12), del producto final.

23. Plásmido pRPA-BACT3, depositado en la CBS, bajo el número CBS 998-96.