CZ145499A3 - Způsob přípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zařízení k přípravě této kyseliny - Google Patents

Způsob přípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zařízení k přípravě této kyseliny Download PDF

Info

Publication number
CZ145499A3
CZ145499A3 CZ991454A CZ145499A CZ145499A3 CZ 145499 A3 CZ145499 A3 CZ 145499A3 CZ 991454 A CZ991454 A CZ 991454A CZ 145499 A CZ145499 A CZ 145499A CZ 145499 A3 CZ145499 A3 CZ 145499A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nitrilase
acid
hydroxy
prpa
biological material
Prior art date
Application number
CZ991454A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298403B6 (cs
Inventor
Olivier Favre-Bulle
Jérôme Pierrard
Christophe David
Philippe Morel
Dominique Horbez
Original Assignee
Rhone-Poulenc Nutrition Animale
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Nutrition Animale filed Critical Rhone-Poulenc Nutrition Animale
Publication of CZ145499A3 publication Critical patent/CZ145499A3/cs
Publication of CZ298403B6 publication Critical patent/CZ298403B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/096—Polyesters; Polyamides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

- Vynález se J týká nového způsobu přípravy kyseliny
2-hydroxy-4-metylthiobutanové (HMTBA) a/.nebo jejích amonných solí (HMTBS).
Dosavadní stav techniky
Kyselina 2-hydroxy-4-metylthiomáselná a její soli se užívají již dlouho pro výživu zvířat jako náhražka za methionin, neboť jsou výhodně v kapalné formě, což usnadňuje využití ve firmách vyrábějících krmivá.
Příprava kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiobutanové chemickou cestou je známa již dávno. Evropské patenty EP 142 488 a EP 143 000 popisují hydrolýzu 2-hydroxy-4-metylthiohydroxy-butyronitrilu (HMTBN) ve dvoufázovém procesu. První fáze spočívá v tom, že se působí na 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril silnou anorganickou kyselinou jako je např. kyselina chlorovodíková nebo kyselina sírová. V následující * fázi, po naředění vodou, se dokončí hydrolýza při zvýšené teplotě. Kyselina 2-hydroxy-4-metylthiobutanová se pak , 2. _. .......Aex t r ahu j,e _, „ o. r.g ani c k ým__ — rozpouštědlem, kte r é__ „není _dob ře~ mísitelné s vodou, jako je např. keton, výhodně metylisobutylketon, a rozpouštědlo se pak odstraní odpařením. Avšak tento způsob výroby, který se využívá v průmyslu, má některé nevýhody. Zvláště tu, že je produkováno značné množství síranu amonného, přinejmenším odpovídající látkovému množství vneseného nitrilu, který se musí odstraňovat, a tak se vytváří průmyslový odpad, což není v souladu s politikou ,4' ochrany životního prostředí. Tento způsob výroby navíc vyžaduje velké - množství rozpouštědla, které se musí recyklovat.
Jiné způsoby, např. popsané v patentech USA č. 3 773 927 a 4 353 924,. spočívají1 v hydrolýze 2-hydroxy-4metylthiobuťyronitrilu kyselinou chlorovodíkovou a pak koncentraci -média á separaci 'vytvořeného chloridu amonného·. Je obtížné odstranit sůl stejně jako v předchozím . zmíněném případě a navíc vzniklá kyselina má silné zabarvení.
Způsob- přípravy chemickou hydrolýzou metylthiohydroxypropionitrilu,-který spočívá, podobně jako předchozí způsoby, v provedení hydrolýzy . v prostředí se sírou, je 'popsán v evropském patentu č. 330 521: Směs se částečně neutralizuje hydroxidem amonným a pak následuje, dvoufázová', separace. Organická fáze obsahuje většinu .kyseliny 2-h.ydroxy-4-m.etylthiomáselné a vodná fáze·- obsahuje většinu vzniklého síranu amonného. Organický roztok se, po odpaření vody, kterou také obsahuje, filtruje, aby se odstranil rozpuštěný síran amonný·.
Kyselina· 2-hydroxy-4-metylthiobutanová se pak .naředí malým množstvím vody a stabilizuje malým množstvím kyseliny sírové. Vodný roztok,' po eliminaci ; vody, umožňuje získat·' síran amonný, který lze- přímo uplatnit na trhu.· Takže tento způsob částečně odstraňuje nevýhody způsobů podle předchozího stavu techniky, ' alespoň ' co' se týče použití organických rozpouštědel, ale neřeší _vůbec problém spojený s odstraněním anorganických-solí.
Mezi patenty týkajícími se solí kyseliny 2-hydroxy-4metylthiomáselně je třeba uvést patenty USA č. 2 745 745, 2' 938 053 a 3 17 5 000, které se týkají vápenatých a amonných, solí. Na směs získanou hydrolýzou 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitrilu.se působí hydroxidem vápenatým nebo uhličitanem vápenatým. Síran vápenatý se pak vysrážícož vede k uvolnění • · • · · · • · • · • · · · • · · · • · · · · · · • · .·· ·· hydroxidu amonného, který vytvoří amonnou sůl kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné. Ale opět zde ' je problém .odstranit síran vápenatý, který zůstává. 1
Způsob, jak je popsán-· v prvním výše citovaném patente veiLt do· ku^ent u, h vH rn Ί v 7 \z a extrakce organickým rozpouštědlem a pak neutralizaci organického rozpouštědla hydroxidem amonným, je také popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 96/01808. Tento způsob, tak jako většina způsobů dříve popsaných, vede ke vzniku látkového množství 1 mol síranu amonného na každý '1 mol do reakce vstupujícího .nitrilu. a navíc vyžaduje recyklování velkého množství- organického rozpouštědla. Takže není- možné tímto způsobem získat roztok amonné soli/ kyseliny.2-hydroxy4-metylthiomáselné při vynaložení. průmyslově výhodných / .nákladů.
Použití nitrilázy jako katalyzátoru hydrolýzy nitrilové skupiny na karboxylovou skupinu jě poprvé popsáno jako. vynález v patentové přihlášce USA č. -08/809 184, podané
20. března 1997. Tento proces však není vhodný pro využití, v průmyslovém ' měřítku vzhledem- k nedostatečné aktivitě mikroorganismů, které syntetizují nitrilázu.
-Podstata vynálezu
v.. V. ^současnosti.^ bylo, yz. jištěno^ jak popisujje předkláda.ný vynález, ž.e jé možné získat ' kyselinu 2-hydroxy-4-metyl-thiobutanovou a/nebo · její .amonnou sůl enzymatickou cestou v průmyslovém· .měřítku,' s vysokým výtěžkem, ' bez použití rozpouštědel a bez průvodní, produkce anorganických ' solí.
Předmětem předkládaného vynálezu je proto. způsob přípravy kyseliny' 2-hydr’oxy-4-metylthiomá.selné (HMTBA) a/nebo. amonné soli kyseliny- 2-hydřoxy-'4-metylthiomáselné . (HMTBS) • · • · · · • · · · · · .· · · · enzymatickou .hydrolýzou 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitrilu, spočívající v tom, že
a) v prvním kroku se připraví biologický materiál, který má nitpilázovou aktivitu,
b) v druhém krcku se imobilizuje ' uvedený ' biologický materiál,' \ 1
c) . ve třetím kroku se . 2-hydroxy--4-metylthiobutyronitril . vystaví působení imobilizovaného biologického materiálu, aby se získala .amonná sůl kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné,
d) ve- čtvrtém kroku se sůl získaná podle bodu. c) volitelně přemění na odpovídající kyselinu a
e) v pátém,kroku se produkt získaný podle odstavce, c) nebo
d) koncentruje. '
Popis obrázků
Na .obrázky, které jsou v následující části popsány,, se odkazuje v průběhu podrobného popisu .předkládaného vynálezu.
Obr.. 1 představuje schematické znázornění elektrodialyzační buňky použité ve volitelné fázi d) , přičemž obr. 1A je elektrodialyzační buňka ' s bipolarní membránou, která má tři oddíly a obr. 1B přestavuje elektrodialyzační·, buňku ,s _.bipolární membránou a _dvěma oddíly.___ _
Obr. '2. je schéma- průmyslového zařízení k provádění způsobu podle předkládaného vynálezu. - ,
Obr. 3 je restrikční mapa plazmidu pRPA-BCAT 1 až '5.
·· ·*·· • *
Obr. 4 znázorňuje strategii sekvencování fragmentu velikosti 113.0 bp obsahujícího sekvenci DNA (na obrázku označena ni tB) .kódující polypeptid, - který má' nitrilázovou aktivitu podle předkládaného vynálezu. Čí slase · týkaj í identifikace primerů' použitých pro sekvencování a také označen;
Obr. 5 je restrikční mapa plazmidů pRPA-B.CAT12 a pRPA-BČAT13.
Obr. 6. ukazuje . výsledky elektroforézý.na 10% SDS-PAGE gelu: exprese sekvencí DNA podle předkládaného vynálezu ve kmenech E. coli BL21 (DE3)/pRPA-BCAT 12', ' BL21 (DE3) /pRPA-BCAT13, BL21 (DE3) /pRPA-BCAT12+pXL2231 a . BL21 (DE3) /pRPA-BCAT13+pXL2231 . Každá dráha odpovídá množství 10 gg rozpustných 'proteinů a případně, ekvivalentnímu objemu hrubé a nerozpustné frakce.
Obr. 7 ukazuj e.. výsledky elektroforézý na -10% SDS-PAGE gelu: exprese sekvencí- DNA podle předkládaného vynálezu ve kmenech E. COli ; DH5cc/pRPA-BCAT3, DH5a/pRPA-BCAT6, DH5a/pRPA-BCAT6+pXL2035 , RPA-BIOCAT.7 6. Každá dráha odpovídá množství 10 gg rozpustných proteinů a . případně ekvivalentnímu . objemu hrubé a nerozpustné frakce-. _
Obr. 8. je. restrikční mapa plazmidu pRPA.-BCAT14 .
...Obr . ...., 9..,. ukazuj,e ..výsledky .. elektroforézý na ,_l_0%_ j5DS-)PAGE gelu : exprese sekvencí DNA podle, předkládaného vynálezu ve- kmenech P. putida G2081 (pRPA-BCAT14) , G2081(pRPA-BCAŤ23) , G2081 (pRPA-BCAT24)', kmenech A. faecalis ATCC8750. (RPA-BCAT14 ) , ATCC8750 (RPA-BCAT23), ATCC8750(RPA-BCÁT24) . 'Každá. dráha odpovídá množství 10 gg rozpustných proteinů a případně ekvivalentnímu objemu hrubé a nerozpustné frakce. · , t <·
·.· ···· · · · ·· · · • · · ···' ·.··· • · · · · · · ··· • ···' ······ ·.· · ··· • ' - « · ··· · · ······ ··· ····
-- · .6
Obr. 10 představuje restrikční mapu plazmidu pCGL1087.
Obr. 11 je restrikční mapa plazmidu pOS48.7.
i
Podrobný popis vynálezu .
První krok -způsobu -přípravy kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné je příprava- biologického materiálu, který, má nitrilázovou aktivitu..' Biologický materiál může obsahovat vlastní enzymatický roztok jako takový anebo celé-buňky nebo části buněk mající nitrilázovou' aktivitu.
Výhodně , s.e použije mikroorganismus exprimující nitrilázu. Nitriláza může být z mikroorganismu, zvláště pak z mikroorganismu rodu. Alcaligenes, Rhodococcus nebo Gordona, výhodně se jedná o Alcaligenes faecalis, ' Rhodococcus sp. HT 29-7 a Gordona terrae, a- výhodněji jde o kmeny popsané v patentové přihlášce USA č. 08/809 184.
Výhodně se použije - mikroorganismus, který exprimuje nitrilázovou aktivitu, získaný přenosem genetické informace kódující nitrilázu rodičovského organismu do hostitelského mikroorganismu. Konkrétně je možné-užít kmene E. coli, který koexprimuje chaperoňový.protein GroESL, ke zvýšení výkonnosti rekombinantního kmene. K tomu účelu je možné použít jakýkoliv _vhodný^vekto_rz__z=vláště pak plazmidový vektor. ' .
Nukleotidová sekvence použitá v tomto případě;se umístí pod kontrolu signálů, které umožňují její . expresi v hostitelské buňce. Hostitelské buňky, se mohou vybrat buďto z prokaryo.ťických systémů jako jsou např. Gram-pozi(tivní nebo gram-negativní baktérie, nebo eukarýoťičkých systémů jako jsou např. kvasinky,, houby, nebo i jakékoliv další systémy. Signály pro řízení exprese se vyberou v závislosti na ίpoužitém hostiteli. Pro tento účel se DNA kódující nitrilázu vloží do vektorů· autonomně se replikujících uvnitř vybrané hostitelské buňky nebo do integrativních vektorů vybraného 'hostitele. Takové vektory je možné' připravit metodami, které jsou odborníkovi obecně známé a výsledné konstrukty se vloží , do vhodného hostitele standardními metodami- jako je např. elektroporace. ·
Jako hostitelské mikroorganismy je třeba zmínit zejména Alcaligenes faecalis, ' Pseudomonas putida, E.. coli, nebo mikroorganismy rodu Bacillus, Corynebacteríum, ' Streptomyces a Saccharcmyces, Kluyveromycas, Penicillium a Áspergíllus.
Výhodným vektorem pro ' expresi v E. coli je plazmid pRPA-BCAT6. Druhý krok způsobu'podle předkládaného vynálezu spočívá v imobilizáci biologického materiálu, tato imobi-lizace se výhodně provede v přítomnosti- pevné matrice, a umožní získat pevné částice, j-ejichž velikost, tvar a mechanický odpor je možné kontrolovat. ' Do dovoluje současné- použití polyazetidinového polymeru nebo jiných zesilovacích činidel.
Imobilizace · se může týkat* buďto . celých buněk nebo buněk, které byly permeabilizovány. Také -se může týkat enzymového roztoku zcela bez buněk. Enzymy použité pro imobilizáci jsou nitrilázy. '
Způsob imobilizace spočívá v imobilizáci aktivního biologického _materiá_lu y _p_evné matrici, ze jména s částicemi velikosti od 1 pm do 500 μια, výhodně - velikosti od 10 pm, do. 200 pm, á sice působením chemického činidla, které reaguje s aminovými (NH2, NH) , karboxylovými- (COOH), hydroxylovými (OH)., , thiolovými (SH) nebo ' amidovými - (CONH2) .'skupinami biologického materiálu a nosiče (matrice). Taková chemická činidla také činí biologický materiál a materiál nosiče nerozpustným · (insolubilizují) ve vodě. Získaná hmota' je velmi ·· ···· ·· · • · · · · · • · • · ·· tvárná a , umožňuje vytvářet částice' požadovaného tvaru a velikosti. Soudržnost a. tvrdost těchto částic je zvýšena usušením.
Biologický materiál pro imobilizaci může volitelně také mo ro ví ó 1 n r í ř/trnn ό T7 mm 7 chví 3^1 _L Ι·\. y .UlU. U X i U. X v iutXXOX-^l^w_l_ .0 až 200 % hmotnostních. Tímto inaktivním biologickým materiálem mohou být proteiny (albumin hebo želatina) ,nebo polysacharidy (chitosan,.·'k-karagen nebo algínáť) .
Inertní nosič (matrice), do kterého je biologický materiál vložen, ' je polymerní a může . být složen z hydrofobních nebo hydrofilních, porézních nebo neporézních, organických nebo anorganických částic. Vhodný materiál částic je, aniž by tento1 výčet vynález nějak omezoval, .napřiontoměničové pryskyřice, oxid hlinitý, syntetické oxidy křemičité, křemelina a silikagely, zeolity, dřevěné uhlí,' ve vodě nerozpustné proteiny jako- např. gluten a polysacharidy jako např. škrob.
Inertní materiál matrice se může přidat v množství 0,01 až -200 % hmotnostních ' vzhledem k množ.ství biologického materiálu, výhodně v množství 10 až 100 %.
Chemická činidla, použitá k odstranění rozpustnosti (insolubilizaci) biologického materiálu -mohou být polymery bifunkčních molekul, které reagují s aminovými (NH2, 'NH), karboxylovými (COOH), hydroxylovým.i (OH), thlolovými (SH) nebo amidovými.....(.CONHg) ^funkčními skupinami. K těmto.....polymerům patří např. polymery azetidinu, polyetyleniminu, polyamidu, a isokyanátu, alginátové -gely, gely k-karagenu, aminy jako např. hexametylendíamin, aldehydy jako např. glutaraldehyd, karboxylové kyseliny jako např. kyselina adipová a isokyanáty. , , i
Imobiliz.ace může být provedena s využitím j.ednoho nebo několika těchto chemických činidel. Chemické činidlo se přidá' • ·
9.
v takové koncentraci, že představuje 1 až ,50% hmotnostních vzhledem' k množství biologického materiálu a nosné matrice. Množství odpovídající 5 až 30 % je výhodné, aby se získaly dostatečně pevné částice, které si udrží vysokou aktivitu o 11' roň cen nrnhl Am \r c Wn 1 ť řn 1 Η 1 ffl7 1
CX CX. ΟΌΧ _y \_il iiO J OOLX v_xui.jf v_Trvání zesiťovacího ošetření je mezi 0,5 a 24 hodinami. ,
Teplota je při procesu imobilizace qbvykle v rozmezí 4 až 65 °C,' výhodná je .teplota 20 áž 40 °C. Teplota je při procesu imobilizace -velmi závislá na stabilitě použitého biologického materiálu.
Hodnota pH j.e při procesu imobilizace obvykle v rozmezí 5 až 11, výhodné je pH. 6 . až 10, výhodnější je směrem k alkalickému pH. Volba · pH je také závislá na rezistenci biologického materiálu a vhodné pH odborník snadno, určí.
Vytvoření biokatalyzátoru' by mělo umožnit jeho využití v libovolném systému, zejména na pevném loži.
Jedním ze způsobů přípravy může být extruze. Pro tento účel jsou biologický materiál a nosičový materiál zesiťovány přidáním jednoho, nebo několika zesíťovacích činidel..' Po tomto ošetření je nerozpustná hmota získána .'odstředěním nebo vyvločkováním (flokulací) a filtrací. Sušina ve výši alespoň 10% j.e-výhodou. Tato hmota je potom extrudována. Z extruderu se získají tenké válečky (vermicelli) výhodně s průměrem mezi 0,.3 až 0,5'mm a délkou.mezi 1 až 10 mm. Tyto' válečky se pak mohou sféronizovat (upravit_na kulovité částice). Poté se 'získané částice, suší. ' ' . .
’.' Dalším způsobem. . přípravy, může být obalování rozprašováním.. Při tomto způsobu se biologický materiál \
smíchá s jedním nebo- . několika' chemickými - činidly. Pó zreagováni je směs rozprašována na nosičový materiál v podobě tenké vrstvy. Tímto způsobem se získají granule s průměrnou hodnotou průměru mezi 0,1 až 0,2. mm. Volitelně se takt.o ·· ···· ·· · ·· • · · · · · « • · · ······ ··4 • · · · · · · získané . částice. mohou ponořit do - roztoku redukčního činidla, např. borohydridu sodného, aby se redukovaly iminové funkční skupiny vytvořené během zesítění.
Částice získané tímto způsobem jsou dostatečně odolné !>· ’-x L-. » » -1 Λ » τ Ί 4— jx. oucxu, a.kj y jc bjiu iilu^íio vyuz.it ^SVilCiLL lUli/ f 1 Uldii.íiLL loži nebo v míchaném reaktoru.
Třetí krok 'způsobu podle- předkládaného vynálezu znamená
I použít .imobilizovaný' biologický materiál v koloně, nebo v reaktoru. Cílem tohoto kroku je kontinuálně produkovat amonnou sůl kyseliny 2-hydroxy-4-met.ylt.hiomáselné z 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitr.ilu. Kolony nebo reaktory jsou naplněny· čistým nebo nařéděným roztokem 2-hydroxy-4metylthiobutyronitrilu nebo- směsí , obsahující 2-hydroxy-4metyl-thiobutyronitrii -a- amonnou sůl- kyseliny 2-hydroxy-4metyl-thiomáselné. - · . ..
Kolony nebo reaktory 'jsou výhodně používány při teplotě mezi' 10 až 60 °C a hodnotě pH mezi 5 až 9-.
První systém použitý pro výrobu '-podle předkládaného vynálezu může sestávat ze dvou nebo- více kolon navzájem spojených do série s náplní, vodného roztoku -2-hydroxy-4metylthiobutyronitrilu na vrcholu prvního 'sloupce a současně s doplňováním' 2-.hydroxy-4-metyl'thiobutyronitrilu do' ostatních kolon v- množství, které ,· je omezeno rozpustností této' sloučeniny v reakční směsi. .Tento systém se nazývá' stupňový systém.. __ ...... _______ ..... _ __ __ _......=..._.,... ________
V systému podle druhého -provedení předkládaného vynálezu se použije jed-na. kolona nebo několik .kolon spojených navzájem paralelně/do uzavřeného okruhu. V tomto sytému se nepřetržitě dodává 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril do okruhu a reakční médium' se nepřetržitě dodává pomoci pumpy, takže se udržuje konstantní objem v okruhu.. Tento systém se nazývá okruhový.Typ rektoru, použitý ve .způsobu, podle předkládaného vynálezu může být reaktor s pevným ložem, fluidním ložem nebo
·· ···· ·· · ·· ·· ί ·· ♦··· ···· · ··-······· • · · · · ···· · ··· ··· ······ · · ···· ·· ·· · ·· ·· š kontinuálně míchaným ložem. Výhodně jsou reaktory s pevným ložem, neboť jejich použití zmenšuje problémy, s oděrem, které mohou- nastat u imobilizovaných buněčných částic. Pokud se užije mikroorganismus jako takový, pak je výhodné použít míchaný reaktor spojený s ultrafiltrační jednotkou pro kontinuální separaci mikroorganismu od požadovaného produktu.·
Čtvrtý stupeň, který ·j e volitelný, spočívá .· v konverzi, amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné na . příslušnou kyselinu. Tento krok - je možně ' provést j'edním ze dvou . způsobů: buďto elektrodialýzou pomocí dvou- nebo tříkompartmentového elektrodialyzačníhó ; zařízení, nebo' zahříváním, vodného · roztoku následovaným extrakcí typu kapalina/kapalina. ‘ ·
V závislosti na použité elektródialyzační metodě’ je· možné použít buďto z dvou- . nebo tříkompartmentové elektródialyzační·zářízení. .'
Termínem kompartment se rozumí prostor, který je mezi dvěma- membránami, tj.mezi bipolární a homopolární membránou nebo dvěma přilehlými homopolárními memebránami. Termín buňka v souvislosti s elektrodilyzačním zařízením -označuje sadu dvou nebo tří kompartmentů. Termín zásobník označuje útvar složený z 5 až 300 takových buněk. Elektródialyzační zařízení (ele.ktrodialyzér). se skládá ze zásobníku a samozřejmě z anody a katody.
= ·.* :. = . -..Homopolár-ní —m-embrán-y-,™=k-ter-é - se—mohou využít ve způsobu · ·· · podle předkládaného vynálezu, ' se dělí. na dvě velké skupiny podle způsobu výroby. ’ ·· ·
Heterogenní -membrány jsou' .vyrobeny z iontoměničovýc.h pryskyřic ' smíchaných s pojivém jako je např. polyvinylichlorid, 'polyetylén apod. ' Takže sé; mohou vytvořit potažením např. tkaniny z polyesteru nebo. polyakrylonitrilu.
·· ···· • fc · ·· fcfc • · · · · · · · · fc • · fcfcfc,· ·· ·· • ··· ····«· ··· fcfcfc ······ ' · · • fcfcfc fcfc fcfc · fcfc fcfc
Je také možné užít homogenní membrány, získané zavedením funkčních skupřn do inertního nosiče chemickým nebo radiochemickým roubováním. Nejčastěji užívaná chemická metoda zahrnuje zavedení funkčních' skupin do .latexu' polymeru obsahujícího aromatické kruhy, .jako je např. styen/divinylbenzen- nebo stryren/butadien. Takto 'funkcionalizovaný latex může sloužit k nanesení na tkaninu, · podobně ; jako u heterogenních membrán. Radiochemická metoda obecně . spočívá v'tom, že se působením záření roubuje aromatická sloučenina, jako např.. -styrén, na inertní nosič jako např. polyetylénový nebo polytetrafluóroetylénový. list. Funkční skupiny jsou pak •vnesený na aromatické kruhy stejně jako v chemické metodě.·
Kationtové výměnné membrány obsahují silné kyselé' skupiny, většinou sulfohátové skupiny,' nebo slabé kyselé skupiny, často karboxylové skupiny. Méně často obsahují kyselé skupiny jako PO2 2’, HPO?“,' AsO32’ a SeO3’.
Aninotové výměnné membrány obsahují silné bazické skupiny, často kvarterní amoniové skupiny, nebo slabé bazické skupiny, často , aminové skupiny. Zřídka obsahují bazické skupiny· jako kvarterní .fosfoniové skupiny -nebo sulfoniové skupiny. . Ve způsobu podle předkládaného vynálezu' kationtové membrány výhodně obsahují silné kyselé skupiny ..a z nich.
.'výhodně sulfonátové ' skupiny. Aniontové membrány výhodně obsahují silné bazické skupiny, a·· z nich výhodně- kvarterní amoniové skupiny. '
Bipolární membrány jsou souborem dvou membrán,' jedné kationtové a druhé aniontové. Když je takováto membrána vystavenaJ působení · .odpovídajícího. ' elektrického ' pole, sol.vatačn.í voda v me^imembránovém. prostoru disociuje na ionty H+ a OH’, které migrují směrem ke katodě průchodem skrz kationtovou stranu a směrem k anodě průchodem skrz aniontovou
- ·· ···· ·· · • · · 9 9 9
9 9 9 9 9
9999999*
9 9 9 9 9
999 9 99 99 9
99 • · 9 9 ' 9 9 9
999 999
9
99 stranu membrány. Jako příklady takových membrán mohou být uvedeny bipolární membrány,, které prodávají firmy Aqualytics, Touyama Soda nebo FuMaTech. Anoda elektrodialyzéru je tvořena materiály obvykle.
užívanými pro elektrodialýzu jako je např. grafit, lzl titan pokrytý vrstvou vzácných kovů nebo jejich oxidů, zejména platinou. Katoda elektrodialyzéru je také tvořena materiály obvykle užívanými pro- elektrodialýzu jako je např. grafit,' nerezová ocel nebo nikl.
Elektrodialyzér je naplněn vodným roztokem, který se má zpracovat. Je také nezbytné cirkulovat roztok anolytu k anodě a roztok katolytu ke katodě.. Může se také užít roztok jediného elektrolytu. Ve způsobu podle .předkládaného vynálezu je okruh s jediným elektrolytem zcela postačující. Úlohou elektrolytu je zajistit dostatečnou vodivost. Výhodně je tato vodivost rovna nebo větší než 20 milisiemens na 1 .centimetr i
(mS/cm; , aniž by však spodní hranice této, hodnoty byla kritická pro provádění způsobu podle předkládaného vynálezu.
Použitý elektrolyt je ionizovatelná sloučenina jako např. sůl, kyselina nebo . baze. Elektrolytem .je výhodně neelektroaktivní sloučenina. Výhodné je použití neutrálních solí jako jsou sírany, kyselin jako, je kyselina sírová nebo baží jako je např. hydroxid sodný.
Použitá proudová hustota je obecně v rozmezí od .0,2- do 1,5 kA/tt -a -výhodně · j-e v rc zme z í od 0,4 * do 1 ·· kA/mc . · · . Vhodná teplota pro'provádění způsobu podle předkládaného vynálezu .musí být . v rozsahu 'kompatibilním' se stabilitou., membrán. .Výhodně je způsob prováděn při . teplotě- v rozmezí od 30 do 60 °C. ' . ..
Elektrodialyzér může . pracovat různými . způsoby. Může pracovat kontinuálně, tj. roztok kontinuálně protéká zásobníkem, čili několik stupňů může být umístěno v sérii,
0000
0 0 0 0 0 0 0·0
0 0000 00·0
0 0 0 0 0000 0 000 000
0 · 0 0 .0 0 0
0000 00 00 0 00 00
0* · ·· pokud to vyžaduje úroveň zpracování/ které má být dosaženo. \ Elektrodialyzér může. také pracovat dávkově, zpracovávaný roztok cirkuluje v zásobníku dokud není dosaženo požadované úrovně zpravování. A nakonec může elektrodialyzér pracovat < i v přímém průtokovém režimu s částečnou recirkulací.
Podle první varianty provedení předkládaného vynálezu disociace amonné soli na- kyselinu 2-hydroxy-4-metylthiobutanovou . a hydroxid amonný.- se uskutečňuje v elektrodialyzační buňce s bipolárními- membránami, která- má tři kompartmenty, jak je schematicky znázorněno'na obr. 1.
Elektrodialyzační zařízení vhodné . k provádění .způsobu podle předkládaného vynálezu. se kompartmentů, vymezených kationtovými bipolárními membránami (MB) a aniontovými membránami (MA) . Tyto- kompartmenty se dělí na solný kompartmet (S) , ze kterého se .čerpá' sloučenina pro separaci, bazický' kompartment · (B) a ' kyselinový kompartment (A), ' kde se baze a kyselina regenerované ze soli koncentrují.
Soli amoniaku jsou vneseny do^ solného kompartmentů. Působením elektrického pole amonné - ionty . migruj i směrem ke kompartment .
membránu a kombinuji se s'ionty OH- <z aniontoé strany bipolární membrány, kde dochází k disociaci vody- vlivem .elekrického skládá z .různých membránami (MČ),
S a -procházejí skrz (kationtovou membránu).
katodě a opouštějí? kationtovou - výměnnou Současně .karboxylátové.· ionty (2-hydroxy-4-metylthiobutanoát) migruj-í směrem .· k anodě, opouštějí kompartment S průchodem přes ' aniontovou'' výměnoví ' membránu (aniontovou membránu)·. Po průchodu da'lším kompartmentem (A) se protonují přebytkem H+ iontů z kationtové strany bipolární membrány. Tři sousedící. kompartmenty (B), (A) a (S) tvoří elektrodialyzační buňku.
·· ···· ) Ve druhé variantě provedení podle předkládaného vynálezu dochází k regeneraci 'kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiobútanové v elektrodialyzační buňce s bipolárními membránami se dvěma kompartmenty, jak jsou znázorněny na obr. 1B. Tyto dva kompartmenty jsou vymezeny kationtovými membránami a případně bipolárními membránami. Tyto kompartmenty tvoří solný/kyselinový kompartment ('S/Α) a bazický kompartment (B) .
Amonné soli se vnesou do kompartmentu S/A. Působením elektrického' pole 'amonné ' ionty migrují směrem ke' katodě a opouštějí kompartment S/A a procházejískrz kationtovou výměnnou membránu (kationtovou membránu) a kombinují· se s ionty OH’ ' z aniontové strany bipolární' membrány, kde dochází k disociaci vody vlivem elekrického. pole.
Současně se kompartment S/A okyseluje . (aciditikuje) v důsledku vzniku H+ iontů z kationtové strany bipolární' membrány. Dva sousedící kompartmenty (B) elektrodialyzační buňku.
'Toto uspořádání má . výhodu v nízké a navíc umožňuje měnit požadovaný poměr'sůl/kyselina.
Aby - elektrodialyzér- dobře pracoval, ' měla by být dostatečná el.ekrická vodivosť bazického kompartmentu (stejně . •tak jako -kyselinového kompartmentu v případě tříkompartméntového -uspořádání) á -je možné ji případně upravit podpůrným elektrolytem. Tedy -vodivost roztoku . hydroxidu -amonného - s e mů ž-e.. -z výš i-t „přídavkem amonné... ,.s c i. i .. j a kc , j e ...např ,.t síran amonný. ; o
Ve výhodné variantě předkládaného vynálezu se používá. 2-hydroxy~4-(metyl.thio) bú.tanoát amonný. .
Ve výhodném provedení podle předkládaného .vynálezu se do solného -kompartmentu tříkompartmentové ,elektrodialyzační buňky vnese .směs kyseliny 2-hydroxy-4-metylthiomáselné a 2-hydroxy-4-metyÍthiobutyronitrilu. Sůl se ďisočiuje jak bylo a (S/A) tvoří spotřebě - energie
uvedeno výše na 2-hydroxy-4-metylthiobutyrát a' migruje·, směrem k anodě, kde konvertuje na kyselinu 2-hydroxy-4-metylthiomáselnou, amonné ionty migrují směrem ke katodě, kde se přeměňují na hydroxid amonný, a v solném kompartmentu zůstává voda a nepřeměněný 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril, který je recyklován v hydrolyzační.koloně.
' ‘Pomocí tepelné metody je- kyselina přeměněna tím, · že se posune rovnováha mezi amonnou solí a - volnou kyselinou zahřá.tím vodného', roztoku, obohaceného HMTBS a .odstraněním uvolňovaného ; hydroxidu amonného. Toho lze··' dosáhnout, zahříváním ve vakuu nebo při atmosférickém tlaku buďto.' s anebo bez vytěsňování. 'Použití -CO2 pod tlakem je výhodné k usnadnění posunu rovnováhy. Směs - HMTBS a HMTB se získá s množstvím 5 . až 99,9 % HMTBA, výhodně s 10 až .50 % HMTBA vzhledem k celkovému součtu množství 'HMTBA a· HMTBS.'
Viskozita- těchto roztoků je mezi, 1200 a 30 mm2s’1 ('1200 až 30 cSt) a výhodně mezí 200 a 50. mm2s'1(200 až' 50- cSt) při 25 °C. ' , ' ; '
Vodné roztoky se mohou.rozložit extrakcí kyseliny,pomocí částečně s vodou mísitelného nebo s vodou ' nemísitelného rozpouštědla.' Existuje velký počet .rozpouštědel pro tentoúčel'. Výhodným rozpouštědlem jsou C5 až C-3 ketony (obsahující 5 až '8 atomů uhlíku), zvláště metylisobutylketon, étery jako např., isopropyléter, alkoholy jako např. isopropanol, estery, zerclální aminy j ako r.apř. c r i.ok-t-y.1 amin.Výhodná .ro.zpcuštědla. .. ve způsobu podle předkládaného vynálezu jsou aceton, MIBK, isopropanol,' isopropylacětát, isobutyléter nebo pro.pyléter, •THF nebo triokt-y lamin. Poměr vodné fáze k organické fázi není , ' kritický. Avšak z hlediska účinnosti by neměl být nižší než·. . minimální poměr 1:1/a z hlediska finanční výhodnosti by neměl přesáhnout· poměr 1:3. Výhodný podle'předkládaného.vynálezu je . poměr 1:1,5 až 1:2.
• ·
Extrakci je možné provádět kontinuálně nebo dávkově·, jakýmkoliv technologickým extrakčním kapalina/kapalina. Kaskádová nebo míchací/dekantační zařízení, odstředivé postupem typu protiproudová extráktory nebo náplňové či.patrové kolony jsou příklady vhodných zařízení.
Vodný ’ roztok zbavený volné kyseliny se může znovu zpracovávat, tolikrát kolikrát je potřeba, ' dokud se nedosáhne úplného odstranění hydroxidu amonného, pokud je to žádoucí.
Organická fáze se zpracovává tak, aby se izolovala
HTMBS. To se provádí výhodně odpařením rozpouštědla . nebo extrakcí horkou vodou.. Aby se zabránilo případnému poškození HMTBA, ošetření horkou vodou se může za pomocí vakua udržet tak ní,zko jak jeto jen možné.
V obou těchto způsobech disociace amonné soli vzniká vodný roztok hydroxidu- amonného. Ten se může zpracovat tak, aby se hydroxid amonný koncentroval. Destilace, a koncentrace hydroxidu amonného v jednom nebo několika stupních s tlakem nebo bez tlaku je- výhodná. Předběžný vytěsňovací stupeň by mohl* být výhodný. Koncentrovaný roztok hydrbxidu amonného se může vracet pro syntézu.' kyseliny kaynovodíkové, která je součástí syntézy 2-hydrbxy-4-metylthiobutyronitrilu.
V -pátém stupni se koncentruje vodný roztok HMTBS a/nebo volné kyseliny. To se výhodně provádí odpařením vody.
' Předmětem vynálezu je · také' výrobní zařízení pro .á 1 e z.u . .Tahové. .
způsobu podle předkládaného . vyné 1 zařízení, je schematicky znázorněno na obr. .2 a skládá, se' z přívodů 1 a 2_,. určených pro- vnášení MTPA kyanhydrinu a vody do reaktoru 2· Reaktor 3 má fixní lože s recirkulací, které je naplněno imobilizovanými enzymy nebo bakteriálními kmeny. Část roztoku se odvádí z reaktoru 3 do koncového reaktoru 4_. Ukončovací reaktor 4. je opět typ s pevným ložem s .imobilizovanými- -enzymy nebo bakteriálními kmeny.
Koncentrovaný roztok HMTBS se získává na výstupu z reaktoru 1 prostřednictvím výtoku 5.
Koncentrovaný roztok HMTBS je možné dále zpracovat dvěma zcela odlišnými způsoby v závislosti na požadovaném konečném produktu.
Pokud je požadavkem získat produkt obsahující vysoký podíl HMTBS, pak je produkt z výtoku 5 veden do .odpařovače _6,. který umožňuje·· koncentrovat ' produkt a pak’je na výtoku 8_ získán' koncentrovaný roztok obsahující- zejména HMTBS a malé množství volné kyseliny. Přebytečná voda a také. frakce hydroxidu amonného jsou odváděny výtokem ý.
Pokud se požaduje získat produkt obsahující vysoký·podíl volné kyseliny, koncentrovaný roztok HMTBS z výtoku 5 je veden do bipolárního dialyzačního systému 9.. V tomto systému je do větší či menší.míry hydroxid amonný oddělen od kyseliny elektrodialýzou.· Směs zbavená amoniaku sé pak získá ,na výtoku 11 a pak se koncentruje odpařovačem 12, aby se získal koncentrovaný roztok obsahující především volnou kyselinu a jen velmi málo nebo vůbec žádnou HMTBS. Roztok obohacený hydroxidem 'amonnými se odvádí výtokem 10. Hydroxid amonný se pak získá'vytěsněním v 15. 'Vytékající hydroxid amonný se může koncentrovat destilací v’ 16, voda se pak získává v 18 . ’ Koncentrovaný roztok hydroxidu amonného · sě pak může vracet pro syntézu HCN.
' ' ' V , ' .
= „. - = Nás leduj í cí přik.ladyM_př-edk.l.ádaného.,. vynálezu „.slouží..,., k ilustraci vynálezu aniž by ho jakkoliv omezovaly.· « · · · · · • · · • · • · · • · ·
Příklady provedeni vynálezu
Příklad1
Purifikace a sékvencování N-konce nitrilázy
Nitriláza byla purifikována ve čtyřech stupních.
Souhrnný přehled purifikace je uveden v tabulce 1.
. Buňky Alcaligenes faecalis byl-y kultivovány 24 hodin, ve ' °C v minimálním . médiu v přítomnosti benzonitrilu (0,5 g/1) . Po odstředění kultury byl pelet přenesen -do pufru TG (25mM Tris-HCl, - 10 % (hmot./objem) glycerol, pH -7,5) a .buněčná ' suspenze ' byla· ošetřena ultrazvukem, ' .aby se získal hrubý extrakt. Hrubý extrakt' byl pak ošetřen síranem amonným až do . 30 % saturace. Získaná sraženina se resuspendovala v pufru TG a pak dialyzovala proti 2 litrům stejného pufru přes noc. Získáný roztok se pak -nanesl.iontoměničovou kolonu Q SAepharose Fast ’ Flow HR 26/10. .předem ekvilibrovanou TG pufrem. Nitriláza' pak byla eluována pomocí gradientu NaCL od 0 do 1 M. Frakce obsahující aktivitu -byly smíchány a koncentrace síranu amonného byla- upravena na' 1 M. Roztok .byl pak nanesen na hydrofobní - interakční kolonu fenylsefarózy HR5/5 předem ekvilibrovanou . TG ' pufrem s přídavkem IM- (NHdJmSQí· Aktivita byla eluována gradientem síranu amonného od 1 M.do 0 M. . . ,
........ Molekulová .hmotnost.....p-roc.einu byla zj išťována^gelovou^
- filtrací' a byla určena na asi 260 kDa. Na gelu SÓS-PAGE byl pozorován jediný pás velikosti 43, kDa (95% čistota) . Jedná se tedy pravděpodobně o protein se strukturou cc6, kde hmotnost a j e 4 3 kDa.
Λ · ·· ····
Tabulka 1 .Souhrnný přehled purifikace nitrilázy
Frakce Celkový protein (mg) Celková . aktivita (pmol/Ti) Specifická aktivita ' (gmoi/h ..mg) Výtěžek proteinu / O. \ \ Ό / Purifik. faktor
Celé’buňky 955 4300 4,5 10.0 . '· 1
hrubý extrakt 2 4 0 0
síran.amonný . - 650
QHSL·' 26/10' 3 3 60 120 0,3 27
MonoQ HR 5/5 1,5 240 160 . 0, 15, 35 -
Fenylsefaróza l· 120 110 ' 0., 1 24
Podmínky: Koncentrace nitrilu .50 'mM, . fosfátový pufr lOOmM.pH 7,0, 30 °C. ·:
Příklad. 2 ' Klonování nitrilázy z Alcaligenes faecalis ATCC8750
Sekvence NH2-konce nitrilázy z příkladu 1 vykazuje úplnou identitu , se sekvencí N-konce nitrilázy z Alcaligenes faecalis JM3 (Koba-yashi et. al. , Proč. Nati. Acad. Sci. -USA 90: 247-251, 1993),. .přičemž . N-konce bakteriálních nitrilá-z.
vykazují 35 až 57% identitu ve- 14 zbytcích. Původce se proto domnívá, že nitrilá-za , . podle předkládaného vynálezu purif i kovaná z kmene AŤCC' 875.0 ” j e podcc-ná té, kterou popsal i Kobayashi et al. ' 1 ’
Klonovací - strategie zahrnovala''amplifikaci genu pro tuto nitrilázu pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) na genomové DNA kmene , ATCC8750. pomocí' dvou oligonukleotidových primerů odvozených- ha základě- sekvence, kterou publikovali •Kobayashi et al. · - -; ' iS·
01-igonukleotidové primery byly syntetizpovány tak, že jeden hybridizoval s 5'-koncem a druhý s 3'-koncem 'sekvence, kterou publikovali Kobayashi et al.
5'(PCRAF1):· CCGGGATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC (Sek id. č. 1) 3'(PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT (Sekvence id. č. 2)
Primer PCRAF1 obsahuje 12 nukleotidů na 5'-konci-, které umožnily vnesení restrikčního místa pro enzymy EcoRI a Ndel proti'směru (normální transkripce) od počátečního kodonuATG. Primer PCRAF2 umožnil vnesení restrikčního místa pro enzym • BamHI. Genomová DNA Alcaligenes fabcalis kmene ATCC8750 byla extrahována postupem s použitím CTAB, který publikoval Asubel et al., . Current Protocols in Molecular 'Biology, ' John . Willey & Sons, lne. > 2.4.1 - 2 .ι4.5) . 100 ng- DNA bylo· použito pro PCR. Aby se měnila specifičnost reakce, byly testovány různé koncentrace MgCl2 dle Asubela et al. v* celkovém objemu reakce 100 μί a s 2,5 jednotkami Taq D,NA polymerázy (Perkin Elmer) . 'Dvě další - reakce PGR byly provedeny s 1,5 mM MgCl2 a 5% DMSO . nebo .5% formamidem. Termocykler Perkin Elmer 9600 byl naprogramován 'pro následující posloupnost:' '5 minut 95°C, pak 30 cyklů (3é- sekund 95 °C, 30 sekund 55 °C, 45 sekund 72 °C) a nakonec -4 minuty 72 °C. Produkty amplifikace byly analyzovány elektrof orézou na 0/8% agarózovém gel-u. Hlavní — · ;'pás, j chož ·velikost odpovídala očekávané ve-l-ikosti -,-1,.1-5- kb, . ' byl amplifikován ve' všech reakcích,· ale s největší specifičností v reakci ,s .1,5 mM -MgCl2'. a 5% DMSO. Reakční produkt získaný v-těchto podmínkách byl ponechán pro další kroky. Vzorek bylo ošetřen proteinázou K, extrahován fenolem/chloroformem a, pak precipitován etanolem. Pelet byl. resuspendován a inkubován 2, hodiny ve 37 °C se 40 jednotkami enzymu EcoRI a 40 jednotkami enzymu BamHI. Po. rozdělení
44· · 4 4 elektroforézou na 0,7% agarózovém gelu byl vyříznut pás velikosti 1,15 kb a'extrahován. Takže DNA. mohla být klonována' do vektoru pBSK (Stratagene., La, Jolla, USA) otevřeného pomocí EcoRI-BamHI -obvyklým způsobem. 5 nezávislých- klonů nazvaných pRPA-BCAT 1 až 5 bylo pak analyzováno enzymatickým štěpením plazmidu enzymy ,NdeI, EcoRI, BamHI, BspMI a BglII (Viz obr. 3). Získaný vzorec odpovídal teoretickému restrikčnímu vzorciplazmidu získaného' stejným způsobem se sekvencí, kterou publikovali Kobáyashi .'et al. Kmen XLlBlue (pRPA-BCAŤ3) byl uložen v Holandské sbírce mikroorganismů ' Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) pod číslem' CBS 998-96.
Příklad 3
Sekvencování. fragmentu. 1130 bp obsahujícího DNA -kódující polypeptid s nitrilázovou aktivitou
Inzert klonovaný do plazmidu pRPA-BCAT3 -byl sekvencován firmou Genome Expres S.A. (Grenoble, Francie)z DNA připravené v laboratoři minipreparačí .(pomocí soupravy Wizard mini-prep,
Promega). Strategie provedeného obvyklým znázorněna na obr.· 4 sekvencování tohoto fragmentu, způsobem odborníkovi známým, -je Deset-vnitřních oligonukleotidových primerů (označených' čísly 623 až 629 a 681x až .682 na obr.
bylo synte-ti z ováno na základě sekvence nitrilázy
..z--Alca.-lig&nes,-.-^f-a.ecali-s·· -JM3,...„(Ko.bay.ashi ...et=_.,.žal,. I ..„ťlatA.^Aada^ .... primerů byla doplněna -univerzálními primery reverse a M12 forward. Každý úsek byl sekvencován nejméně jednou na každém ' řetězci DNA.
' Získaná ' DNA . sekvence vykazuje dvě odlišnosti ve srovnání s publikovanou sekvencí: jedna odlišnost je ve struktuře, . která je 'předpokládaným terminátorem,' transkripce, a druhá je v nitrilázovém genu, zvaném nitB, a sice
úseky byly znovu ·· ·
- ·· substituce Asn -> Asp. tyto dva sekvencovány v laboratoři na- plazmidech pRPA-BCAŤl, 2, 4 a 5 se dvěma specifickými primery 710 a 682 (viz obr. 4). Záměna C —> T v pozici 1412 (ve smyslu číslování genu jak ho publikovali Kobayashi et al.) v úseku terminátoru byla nalezena ve všech, klonech. Je to tedy mutace,, která odlišuje dva kmeny Alcaligenes faecalis . Záměna A —» G v pozici 1138 je přítomna pouze v plazmidu pRPA-BCAT3 . Jde tedy o mutaci vnesenou-Taq DNA polymerázou .v, průběhu PCR.
Příklad 4
Exprese nitrilázy v E. coli BL21 '(DE3) ;
Pro potvrzeni identifikace klonované sekvence DNA s-, nitrilázovým genem, byl gen ni tB umístěn pod kontrolu genového promotoru Φ10 fága T7. (PT7.) následuj ícím·. postupem. Inzerty Ndel-BamHI velikosti 1,13 kb. z -plazmidů pRPA-BCAT3 a pRPA-BCAT4 byly klonovány do vektoru pXL2432, .čímž vznikly vektory pRP-A-BCAT12 a pRPA-BCAT13 znázorněné na obr. 5. Rodičovský vektor pXL2432 je hybrid úseku plazmidu pET9 (Studier et alMethods in Enzymol. 185: . 60-89, 1990) mezi' místy AccI a EcoRI,' který .obsahuje replikační počátek (ORI) a selektova-telný markér'' kódující rezistenci 'ke· kanamycinu (Kan), a úseku mezi místy EcoRI a AccI plazmidu pETlla (Novagen lne Madison, WI, USA),’ který' 'obsahu je”, 'expresn-i kazetu, . represerový 'gen lad a gen regulující počet kopií ROP. ' - - > ' '
Kultivace bakterií byla1 prováděna v indukčních podmínkách. Kmen (Novagen ’ lne., Madison,. WI, USA) obsahující plazmid pRPA-BCAT12, kmen BL21(DE3) obsahující plazmid pRPA-BCAT13 a také kmen . BL21 (DE3) obsahující plazmid p.XL2432 byly kultivovány 16.hodin v médiu LB při 37 °C (Miller, 1972,
·· ···· *
2-4
Experimente in Molecular Genetics, Cold Sprong' harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) obsahujícím 50 pg/ml. kanamycinu. a pak bylo inokulováno stejné.médium .1/100 objemu při stejné teplotě. Když kultury dosáhly ODgoo mezi 0,5 a 1, vs Z- 4 v. ΤΠΦΓ’ μ r ± ua 11 _L r ± o v_y d± cunc
6hodínové kultivaci byly bakterie odebrány. Stejný postup byl aplikován při kultivaci kmenu BL21(DE3) obsahujícího plazmidy p'RPA-BCAT12 a pXL2231, kmenu BL21(DE3) obsahujícího plazmidy pRPA-BCAT13 a pXL2231. a také kmenu· . BL21 (DE3) obsahujícího, plazmidy pXL2432 a pXL2231 s tím, že byl do kultivačního média přidán tetracykiin v množství 12 pg/ml. Plazmid pXL2231, který je odvozený z vektoru pXL1635 (viz patentová, přihláška FR 90/05185 ž 24. 04. 1990) patří do inkompatibilní skupiny IncP a je proto kompatibilní s. plazmidy -pRPA-BCAT12 a pRPA.-BCATl3, která mají replikační počátek, plazmidu ColEl.. Jeho selektovatelným ,markérem je rezistence k tetracyklinu a nese fragment EcoRI-HindlII velikosti 2,2 kb obsahující geny GroES a GroEL kódující molekulární chaperoný E. coli .(Fayet et al. , 1986, Mol. Gen.·. Genet. 202, : 435-445) .’ Exprese nitrilázy byly analyzována na 10 % SDA-PA gelu v hrubé 'frakci po . sonikaci buněk . anebo po Odstředění v peletu a-supernatantu. ' Výsledky j sou ' znázo’rněny na obr,. 6 .a ukazují úroveň exprese nitrilázy (niťB) v extraktech buněk, ve kterých alespoň jeden plazmid obsahuje'inzert s ni£B, avšak protein 'jě v podstatě v nerozpustné formě ačkoliv'“ přítomonstT plazmidu pXL2231 umožňuje zvýšit rozpustnou frakci nitrilázy.
.Obr. 6 zná.zorňuje ukazuje, výsledek na gelu, kde M představuje molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDa a jednotlivé dráhy jsou.:
- A,. D a G představují hrubé frakce. BL21(DE3) +pRPA-BCAT12 .,
BL21(DE3) + pRPA-BCAT13 a BL21(DE3j + XL2432, • fc ···· • fc fcfc • fcfcfc · ·
B, E a H ' představují supernatanty získané ze stejných kmenů, ·
C, F. a I představují pelety získané ze stejných kmenů,
- J, Ν' a Q jsou hrubé frakce získané z BL21(DE3) + pXL2231 + pRPA-BCAT12, BL2i(DE3) + pXL2231 + pRPA-BCAT1.3 a BL2i(DE3) + CXL2231 + XL'2432, '
- K, 0 a'Ř jsou supernatanty získané' ze stejných kmenů a L, P a.S jsou pelety získané ze stejných kmenů.
Kmen BL21(DE3)/pRPA-BCAT12 + pXL2231 byl nazván
RPA-BIOCAT126, kmen ' BL21(DE3)/pRPA-BCAT13 + pXL2231 byl' na.zván RPA-BIOCAT127. Aktiv-ita nitrilázy v kulturách.
RPA-BIOCAT126 RPA-BIOCAT127 a v kultuře RPA-BIOCAT66, .která odpovídala BL21(DE3)/pXL2432, byla stanovena následujícím způsobem. Bakterie byly kultivovány stejně, jak bylo popsáno v předchozím . textu, až na to, že byl změněn 'celkový objem kultury (50 ml) a výsledná koncentrace IPTG (0,1 mM)'. Kultury byly odstředěny ' a.' pak pelet nasát do 10 ml lOOmM kaliumfosfátového pufru pH. 7,0. Hydrolýza 'HMTBN ’ byla provedena·, s 500 μΐ. této suspenze, která se přidala, ki 500 μΐ 200mM roztoku HMTBN pH 7,0. Kinetika hydrolýzy.byly získána smícháním 100 μΐ této směsi s 900 'μΐ 0,1Ν kyseliny·' fosforečné v pravidelných intervalech od 1 do 4 hodin. Množství vzniklé HMTBA bylo analyzováno pomocí HPLC jak je popsáno v patentové přihlášce USA č, 98/809 184.. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.
·· ft · · · ·· · • ft ftft • ftft ftftft
Tab? 2 .
Aktivity kmenů RPA-BIOCAT66, RPA-BI0CAT126 a RPA-BIOCAT127
RPA- Médium Indukce Doba ODsso Aktivita.
Ο T Γ\ΓΊ\ Τ’ .O -l j. 1 r η i 1 Ί T r ·*—i j\ií±o-lvciuc; /TT\ \ o }
. 66 LB Km 0,1 mM IPTG 24 hodin 2··, 5 0
126 LB Km Tc ' 0, 1' mM IPTG ' 24 hodin 2,4 15-
127 LB Km Tc 0,1 mM IPTG 24 hodin 1, 9 10
Zkratky: Km: kanamycin 50 gg/ml,· Tc: ,'tetracyk'liri 12 pg/ml, U: kg HMTBA vytvořené za 1 hodinu na 1 kg suché hmotnosti·
Pro ' zvýšení rozpustnosti exprimovaného polypeptidu nitrilázy, byl zkonstruován, plazmid pRPA-BCAT37. .Nejdříve byl připraven plazmid pXL2391 ligací fragmentu. ·ΕθΌΚΙ-ΡνηΙΙ velikosti 5,9 kb z plazmidu LpDSK519 (Keen et al., 1988,. Gene
191-197) ošetřeného polymerázou Klenowa s fragmentem
Hindi II. velikosti 2056 bp a Kr.isch, 1984, Gene 29: z fazolu (Phaseolus Aureus)..
z plazmidu pHP45QSp (Prentki. 303-313) ošetřeného 'nukleázou Plazmid'pXL2391 byl pak štěpen enzymy Smál a Sací a byl do něho vložen inzert; velikosti 2,3 kb; .nesoucí operon GroESL z plazmidu .pXL2231 naštěpeného HindlII a ostřeného Kleňowem a. pak štěpeného Sací. Plazmid pR?A-3CAT37 je tedy derivátemn- plazmidu RSF1010 s vyšším číslem počtu kopií než plazmid' pXL2231 a kompatibilní s plazmidy ' nesoucími . počátek colEl a - rezistenci ke streptomycinu, j ako markér, tento plazmid byl vložen do kmenu BL21(DE3j /pRPA-BCAT12, . čímž. ' vznikl .kmen RPA-BIOCAT171. Aktivita, uvedená v tab. 3, byla měřena na kultuře obdobné tomu, co již bylo' popsáno s tím rozdílem, že tetracyklin byl nahrazen streptomycinem v koncentraci 100 gg/ml.
······ ·· · ·· ··
Tab. 3 1
Aktivita'kmenu RPA-BI0CAT171
p„PA- BIOGAT Tufói iim J. XV— -L- OXiLk Indukc° pí kultivace nn.. _ ΰ V Ί i τ τ i + o i 04. V _1_ O- cx (U)
171 LB Km Sm 0,1 mM IPTG 24 hodin 3,2 • 14
Zkratky: Km:, kanamycin 50gg/ml, Sm: streptomycin 100 pg/ml, U: kg HMTBA vytvořené za 1 hodinu na 1 kg suché hmotnosti'
Příklad 5 :.'···
Exprese nitrilázy v.buňkách E. coli DH5cc'
Pro tento ' účel - byl zkonstruován plazmid· pRPA-BCAT6 klonováním- fragmentu Scal-Ndel velikosti 0,6 kb z pXL2158 obsahujícího promotor Ptrp a vazebné místo pro ribozom RBScII (Levy-Schill et al., 1995, Gene 161: 15-20) do plazmidů pBCAT3 (viz-obr. 3). Exprese bylo dosaženo v bakteriích kmene DH5ct obsahujících plazmid pRPA-BČAT6 · a/nebo plazmid pXL2-035 (Levy-Schill ' et al.) následujícím postupem. Prekultura byla inkubována 16 hodin ve 37 O|C v médiu M9 s· glukózou (.(Miller, 1972,- Experiments in .Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratorý,_ C_old_ Spring Harbor, N.Y.) obsahujícím 0,4% kaséinových aminokyselin,.. 100- gg/ml ' tryptofanu a 100 gg/ml kárbenicilinu. Pro kmeny obsahující ‘ pXL2035 byl přidán kanamycin v množství 50 ng/.l. Exprese se začala projevovat po naředění saturované kultury 1/100 stejným médiem ale bez tryptofanu při inkubaci 8 až 16 hodin ve 37 °C.
i
I * · · · · · · · • ···· · · · · • · · · ···· · ··· ··· • · · · · · • ·· · ·· ··
Analýza SDS-PAGE extraktů z různých kmenů byla provedena stejně jak bylo popsáno v předchozím příkladu a je znázorněno ne obr. 7.
Na obr. 7 . M představuje' molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDa a jednotlivé dráhy jsou:
L.> . I, F a C1' představují hrubé frakce DH'5ct+pRPABCAT/3,/6,/6 + pXL2035, RPA-BI0CAT76, . ...
K, H'E, a B' představují supernatanty -získané ze stejných ..kmenů a ’ . ' ,
- , J, G, D a A představují pelety získané ze stejných kmenů.
Plazmid pRPA-BCAT6 umožnil získat malé množství převážně . nerozpustného pólypeptidu velikosti . 43 kDa , Koexprese GroE z plazmidu·pXL2035 snížila expresi, ale po třech následných sub kul túrách- kmenu ' DH5a (pRPA-BCAT6+pXL2 03 5j se vybraný kmen. RPA-BIOCAT7 6 vrátil k . původní hodnotě exprese ', pólypeptidu/nitrilázy, který byl,prakticky zcela rozpustný. Těsty aktivity, byly· provedeny stejným způsobem jaký byl již popsán v předchozím příkladu a jejích výsledky jsou uvedeny v.tab. . 4 .
Tab. 4. ' ‘ ' . ... ' ' /
Aktivita kmenů. DH5a(pRPA-BCAT3) , DH5a(pRPA-BCAT6) , DH3a(pR?ABGAT6+'pXL2035) a RPA-BIOCAT76 .
Kmen .Médium Doba kultivace. ODgso Aktivita (U)
DH5a(pRPA-BCAT3) M9 Cb : 24 hodin 4 o ·
DHSct (pRPA-BCAT6) . M9 Cb 24 hodin- . 4 0,6
DH5á(pRPA-BCAT6+. p,XL2035) . M9 Cb Km 24 hodin 3 1,6
RPA-BIOCAT7 6 ; · M9 Cb Km . . ' 2'4 hodin 3,8 5 ,
• ft ftftftft • · · ♦ · • · • · ft ···· ·· • ft · • · · • · · · • · ftftftft • · · ·· · ftft ' ftft • ftft ft • ftft · • ·· · · · · • · ftft ftft
Zkratky: Km: kanamyein 50 pg/ml, Cb: karbenycilin 100 pg/ml, U: kg HMTBA vytvořené za 1 hodinu na 1. kg suché hmotnosti
Tato data ukazují, že koexprese GroE umožňuje, zvýšit expresi nitrilážy a že konvenční selekce kmenů v následných subkulturách také přispívá ke zvýšení aktivity rekombinant.
Příklad 6 a Alcaligenes kb z pRPA-BCAT6
Exprese nitrilážy v Pseudómonas putida a.Alcaligenes faecalis, Expresní systém' popsaný v příkladu 5 byl použit pro přípravu nitrilážy v Pseudómonas putida ·. faecalis._ Fragment Ndel-Xbal velikosti 1,14 obsahující gen nitB' byl vložen, do míst Ndel-Xbal vektoru pXLl-289. vektor pXL1289 je derivát pKT230 (Bagdasarian et al., 1981, gene, 15: 237-247) nesoucí multihostitelský řeplikační -počátek (oriV) pro- Gram—negativní '- bakterie a obsahující fragment Eco.RI-Ndel velikosti -120 bp ' nesoucí Pťrp promotor a RBScII z pXL534 (Latta et ai ., 1990, DNA And inzert Ndel-Xbal kódující gen cobA 17-2, 5968-5979)a inzert
IrrmB -z, pXL534 ' (Latta
CE11 Biol. 9: -1.29-137) a (Crouzet et al. 1990, J. Bacteriol
Xbal-bamHI- obsahující terminátor et al.', -1990, DNA And Cell- Biol. 9 :- 129-137) Získaný-plazmid pRPA-BCAT14 j e tedy . derivátem' pKT230 obsahujícím '' gen -rez-řsfeence ke kanamycinu · · (Kar · · a gen* ni tB · pod - konc rolou Ptrp:RBScII (viz. obr. 8).
V průběhu vnášení plazmidů do .Έ..coli kmene DH5a byl selektován -specifický . klon, který .exprimuje nitrilázu, jejíž molekulová hmotnost na SDS-PA gelu byla 44 . kDa místo .43 kDa. Plazmid nesený, tímto klonem přitom vykazuje stejný restrikční vzorec jako plazmid pRPA-BCAT14 a byl proto nazván pRPÁBCAT24. Nakonec byl zkonstruován ještě plazmid pRPA-BCAT23 fc· fcfc ···· fcfc
·. · · · fc • · fc.fc • fcfcfcfc ······ • fcfcfc fcfc fcfc fc • fc • fcfcfc • fcfc · • fcfc · fcfcfc fcfcfc • · • fc* fcfc stejným způsobem jako plazmid pRPA-BCAT14 až na následující modifikace: Fragment StuI-BsmI velikosti 136 bp z pRPA-BCAT6 byl nahrazen fragmentem StuI-BsmI z p'RPA-BCAT4, Plazmid pRPABČAT23 proto exprimuje nitrilázu.nitB se zbytkem Asn v pozici .279. '
Plazmidy pRPA-BCAT14, 23. a 24 byly vneseny, elektroporací do Pseudomonas putida kmene G2081. Kmen G2081 je odvozen od kmene- KT2440 (Bagdasarián a Timmis 1981, v Hofschneid a Goebel, Topics in Microbiology and Immunology,
47, Springer Verlag, Berlin) selekcí.'na spontánní rezistenci 'ke kyselině nalidixové a rifampycinu. Vektor pKT230 byl, užit jako kontrolní plazmid. . . '
Plazmidy pRPA-BCAT14·, pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 a ,pKT230 pak byla extrahovány z kmenů Pseudomonas , putida, aby mohly být znovu vneseny do kmene ATCC8750 Alcaligenes faecalis . ( = RPA-BIOCAT1).’ Kmeny G2081(pRPA-BCAT14), G2081(pRPA. BCAT-23), G2081 (pRPA-BCAT24). a G2081 (p.KT230) byly společně s kmeny RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT-14) , RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCA.T23 ) , .G2Ó81 (pRPA-BCÁT24)' a G2081 (pKT230) kultivovány přes noc při 30 °C v LB médiu obsahujícím 50 mg/1 kanamycinu.Prekulturý byly . naředěny. 1/100 do nového média M9 obsahujícího -50 mg/1 kanamycinu a inkubovány 20 hodin při 30°C.
.Exprese nitrilázy byla hodnocena na SDS-PA gelu v hrubé frakci po sonikaci buněk, v peletu po ..odstředění , a—v^-supernatant-u·.- Výsledky j sou...... uvedeny . na- obr. 9 V pří pádě · — kmenů RPA-BIOCAŤ1(pKT230) a G2081(pKT230) byl· nanesen na gel· pouze hrubý extrakt (dráhy A a I) .. '
Na obr. 9 M .představuje molekulový markér s velikostmi uvedenými v kDa a jednotlivé dráhy -jsou: . 1 y
- B, D a F představují hrubé, frakce RPA-BIOCATTl(pRPABCAT14), RPA-BIOCATTl (pRPA~BCAT23)' a RPA-BIOCATTl (pRPABCAT24) ·· ····
C, Ε a G představují supernatanty získané ze stejných kmenů,
- H . představuje pelet získaný z kmene RPA-BI0CATT1(pRPABCAT24) , • Iz o n i.
σ V τη onn
BCAT14), G2081(pRPA-BOAŤ23) a G2081(pRPA-BCAT24) ,
- K, N a P jsou supernatanty získané ze stejných kmenů a
Q je pelet získaný z.kmene G2081(pRPA-BCAT24).
Tento experiment ukázal·, že kmeny Pseudomonas putida exprimují velká, množství třech rozpustných polypeptidů - nitriláz a ' kmen Alcaligenes faecalis exprimuje pouze ·' j ediný polypeptid nitrilázy, a sice o velikosti 44 kDa. Testy aktivity, provedenéstejným způsobem. ' j a'k bylo již popsáno
I v předchozím příkladu..4, ukázaly že kmeny G2081 (pRPA-BCAT23)-, G2081(pRPA-BCAT24) a RPA-BI0CAT1(pRPA-BCAT24) projevují na HMTBN nitrilázovou aktivitu.
Příklad 7 '
Exprese nitrilázy v Corynebacterium glutamicum
Nitriláza byla exprimována v .kmeni . CGL1010 (= ATCC
14752) pomocí plazmidů . PcspB, (Peyret et al., 1993, .Molecular Microbiol. 9: 97-109). Fragment, velikosti 530 bp I obsahující promotor 'PďspB'7'býi 'ámplif íkováfi““z“ pTážTniďíí * p'CGE8T5 ('PeýřeT et al.) pomocí oligonukleotidových primerů KŠ1 a KS2,
KS1:· 5'-ACGCGTTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3' (Sekvence id. č. 4) KS2: 5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3' (Sekvecne. id. č. .4)
Po naštěpení Sáli byl fragment, velikosti 530 bp klonován do' plazmidů pBSK (Stratgene, La Jolla, USA) .y ·· ···« ·· ♦ • · · · • · <9 · · · otevřeného naštěpením Sáli a EcoRV, čímž vznikl plazmid pCGL1084. Adaptér EcoNI/Ndel byl připraven ' hybridizací oligonukleotidů KS8 a KS9:
KS8: 5'-TCAACGAGCCTTCGCCTCA-3' (sekvence.id. č . 5)
KS9: 5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3' (Sekvence id. . 6)
Nitrilázový gen byl extrahován - z plazmidů pRPA-BCAT6 ve formě fragmentu Ndel-Xbal velikosti’ 1,1 kb. Tento fragment byl pomocí adaptéru EcoNI/.Ndel vložen'do- pCGL1084 naštěpěného
EcoNI .a Xbal, čímž vznil plazmid pCGL1086. . Fragment !
Sall/BamHI z pCGL1086 obsahující PcspB::nitB byl pak klonován do plazmidů pCGL482 (Peyret et · al.) do míst Sáli a BamHI, což. dalo vzniknou plazmidů pCGL1087. Plazmid pCGL.1087 (viz obr. 10) je kyvadlový (shúttle) vektor založený na vektoru pBIl (Santamaria et . .al., 1984,. J. ’ gen/ Microbiol. 130: 2237-2246, který' obsahuje replikační počátek z pACYC 184 rozpoznávaný v E. coli, gen kódující rezistenci k chloramfenikolu (Cm) a fůzní gen PcspB::nítB.
Plazmidy pCGL 1087 a pCGL482 byly .vneseny elektroporací do buněk CGL1010 postupem který popsali . Bonnamy, et al., 1990 • (FEMS Microbiol. Lett. 66: 263-270). Po kultivaci 20 hodin ve 37. °C v 3,7% infúzním.·' médiu mozek-srdce (Difc.O Laboratories, Detroit,. USA) s přídavkem' 5 mg/1 chloramlenikolu.^,,.^...,.:. .. ,.........._ .. ,...!........... _ .. .. ....................
Testy nitrilázové aktivity bylý provedeny na vzorcích z kultur stejně jako v příkladu 4. Výsledky ukázaly, že kmen CGL1010 (pCGL1087,) měl nitrilázovou aktivitu, zatímco kmen; CGL1010/pCG'L482) neměl žádnou.
<
• ·
Příklad 8
Exprese nitrilázy v Streptomyces lividans
Niťriláza byla exprimována v kmenu' TK24 Streptomyces lividans (Hopwood et al., ' 1985,, Genetic Manipulation of Strepomyces: A Laboratorty Manual, The John Innes Foundation, Norwich) pomocí plazmidu pIJ6021 (Takano et al. , 1995, Gene.
'166': 133-137) a promotoru. PtipA (Holmes et al., 1993,. EMBO J-'.. 12 : 3183-3191) . '
Plazmid pUC19 (Yanisch-Perron et. al., 1985, Genom 33 : .
103-119) byl modifikován- delecí (odstraněním) fragmentu' Tfil velikosti 140 bp štěpením enzymem Tfil, ošetřením Klenowovým enzymem a opětovným uzavřením (šelfligací) vektoru. Takto získaný plazmid byla- otevřen štěpením EcoRI a BamHI, aby bylo možné klonovat ' fragment 'EcoRI-bamHI velikosti 1,15 kb . obsahující -gen ni tB z pRPA-BCAT3. .plazmid pOS48.4 takto získaný měl unikátní štěpné místo pro enzym Tfil mezi genem nitB . a- místem BamHI. Toto místo bylo využito pro vložení inzertu - fragmentu Ohyg '· velikosti 2,-3-- kb, získaného z plazmidu ·pHP45Qhyg (Blondelet-Rouault et al.,- Gene, podáno k publikaci) vystěpením ,BamHI . a po ošetření Klenowem. Fragment-. Qhyg. obsahuje gen- pro hygromycinfosfotransferázu- ,. (hyg) ze - Streptomyces hygroscopicus (Zalacain et al., 1986,
Nucl. Acids Res . 14: .1565-1581) a uděluje -Streptomyces i r :vrťe ηΗί”Έ'‘^ygr οΈγοϊηΐΓ. “RI az mid.'“JpO 1 ák t o” získány' byl použit .k.izolaci fragmentu Ndel-BamHI velikosti 3,,35' kb obsahujícího nitrilá.zový gen následovaný genem hyg,' který byl klonován do plazmidu pT.J6021 (Takano et al. ) otevřeného enzymy- Ndel. a BamHI. Jelikož se plazmid pIJ6021 replikuje pouze v buňkách' Streptomyces, byla-, ligační směs transformována, konvenčním způsobem (Hopwood.,. et al.) do . Streptomyces lividans TK24 . a byly selektovány klony.
• · · • · · «Β rezistentní k 200 mg/1 hygromycinu . (Boehringer Manheim).
Plazmidová DNA byla extrahována z těchto klonů standardním způsobem (Hopwood et al. ) a po analýze se ukázalo, že jejich restrikční vzorec 'skutečně odpovídal očekávanému konstruktu nazvanému pOS48.7 (viz obr. 11)·.
Dva kmeny Streptomyces lividans obsahující . pOS48.7 * '
a. také klon- obsahující plazmid pIJ6021 -byly - kultivovány s - v 50 ml média TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) při 30°C po dobu hodin se selekcí v . 5mg/l kanamycinu- a pak. byl přidán thiostrepton v 5mg/l koncentraci a kultivace pokračovala dalších 18 hodin v podmínkách podle Hopwooda et ál·. Pak byla kultura sklizena byl -proveden test aktivity stejně jako v příkladu 4. Výsledky ukázaly, že kmen Streptomyces lividans T.K24 (pOS48.7) exprimoval nitrilázovou aktivitu, zatímco kmen
TK24 (p'IJ6021) nikoliv. '
Příklad 9 .
Hydrolýza MHTBN jinými nitrilázami
Primární sekvence niťrilázy Comamonas. testosteroni sp., jak ji popsali Levy-Schil et al., 1995’vykazuje 31% Identitu s primární sekvencí nitrilázy podle předkládaného vynálezu.
. ' Rekombinantní kemn E. coli TG1; (pXL2158, pXL2035), který exprimuje nitrilázu z Comamonasitestosteroni byl kultivován ·-. . . λλ·.-podmínkách, dle Lcvy-Sch i. 1 e t .-„.al-.a- 199.5,.buněčnýpelcz by 1 ..
' pak- inkubován ve lOOmM fosfátovém pufru pH 7,0 s 50mM HMTBN při 30 °.C,. Změřená aktivita byla 2,3 kg/h.kg CS. Podobně jako nitriláza podle předkládaného vynálezu je. nitriláza z Comamonas testosteroni schopna hydrolyzovat HMTBN.'
Dále údaje uvedené v příkladu 4 s plazmidy.pRPA-BCAT12 a pRPA-BCAT13 ukazují, že- substituce . Asn279. -» Asp279 ,
'3 5 v nitriláze z· Alcaligenes faecalis umožňuje konzervovat aktivitu na HMTBN.
Příklad 10- ·
Přidávání nosiče' 5 -g suchých buněk bylo přidáno do 20 g vody s hodnotou pH nastavenou na 7,0. Potřebné množství (viz tabulka) nosiče (CELÍTE 545, Prolabo, Francie) bylo přidáno a .dokonalé homogenizaci byla suspenze ze.sítěna přídavkem 15 % glutaraldehydu (vzhledem k celkové -suché hmotnosti), a .pak '10 % polyetyleniminu (SEDIPUR, BASF, Německo). Suspenze se míchala 1 hodinu . při teplotě místnosti. Suspenze pak byla vyvločkována přídavkem 0, 001% ani.ontového flokulačního činidla Superfloc A100.- Zesítěná hmota pak byla izolována filtrací. .
Takto získaná hmota byla znovu zesítěná přídavkem 10 % polyazetidinu (KYMENE 5.57, Hercules, USA.) vzhledem k celkové . - i suché'hmotnosti. Hmota, ještě za vlhka, byla extrudována.skrz hubici s průměrem 0,5 mm a usušena.
Aktivita ‘částic získaných extruzí byla stanovena způsobem popsaným v patenové přihlášce USA č. 08/809 184, na' kterou se tímto odkazujeme. -
--=- - - Mqs l-č -(g) · -··...... - --== - Aktiv-i ta ý%-)- - . -
' 0 g 100
2,5 g. '215
. 5 g 250·
-Přídavek . nosiče k buňkám podstatně zvýšil jejich aktivitu. Pokus byl opakován s tím, že CELÍTE byl nahrazen flfl · · · · ··· ··· pšeničným glutenem (Roquett.e, Francie) částečně rozpustným ve vodě nebo želatinou (SB'I, Francie) úplně rozpustnou ve vodě.
Nosič (g) . Aktivita (%)
Π rr . i nn -
5 g glutenu 160
5 g želatiny nestanoveno*
* Nebylo stanoveno, - protože buněčná suspenze ’ nevločkovala a nebylo možné ji zachytit filtrací
·' Tento příklad- ukázal, že CELÍTE' může být - nahrazen
glutenem. V případě, že . . se použila želatina (zcela
rozpustná), vytvoření katalyzátoru ' výše popsaným způsobem
•(extruzí) je ;. nemožné.
Příklad 11
- .10 g E. coli BIOCAT17.1 : z příkladu . 4 připravených
aerobní kultivací vj LB médiu bylo smícháno s 10 g CLARCEL7 8.
•(CECA, Francie) v 500 g lOOmM fosfátového pufru, pH '7,0,. Po homogenizaci, se přidalo 6- g 25%.-glutaraldehydu a suspenze· se míchal al5 minut při teplotě místnosti. Pak se přidaly 2 g polyetyleniminu á ještě. 6 g^ 25% glutaraldehydu. Celá směs se míchala 1. hodinu při teplotě místnosti. Směs sej pak vyvločkovala. přídavkem 5 ml roztoku SUPERFLOC, Α1ΌΌ. na. 0,-2% (C.YTEC, Francie),. Vzniklá hmota se izolovala filtraci a do. získané pasty.se přimíchalo.16 g 12,5 % polýazetidinu (KYMENE 557, Hercules, USA) 'a pak byla extrudována hubicí s průměrem 0,5 mm. Takto získané tenké válečky./'nudličky1' ( vermícelli ) se usušily - při 35 °C .v sušárně a. pak byly ponořeny ha
0 · 0 0 0 0 minut do lázně 1% NaBH2 v 50mM borátovém pufru pH 10,0. Biokatalyzátor byl pak opláchnut destilovanou vodou. Biokatalyzátor byl uskladněn v 5°C nebo při' teplotě místnosti v.SOOmM fosfátovém pufru pH- 8,0.
Termostatovaná kolona s vnitřním průměrem)3 cm a výškou 45 cm byla. naplněna. 100 g biokatalyzátoru. Kolona byla napojena · na. pumpu · prostřednictvím recirkulační okruhu. Celkový objem takto vzniklého reaktoru byl 430 ml. Okruh byl naplněn 25% roztokem amoniové solí . kyseliny hydroxymetylthiomáselné. Roztok byl nanášen na kolonu směrem ze shora dolů průtokem -201/hod. Voda, která probíhala pláštěm kolony a výměníkem tepla umožňovala udržovat teplotu na 35°C. Demineralizovaná voda se přidávala do okruhu rychlostí 80 g/hod a 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril rychlostí 20 g/hod. Nadbytečný objem reakčního média se odpařoval dnem kolony, takže celkový objem v obvodu byl udržován konstantní. Takže byl získán kontinuální průtok s rychlostí konverze nitrilu 95%., Výsledná koncentrace vodného roztoku 1 amoniové soli 2-hydroxy-4-metylthiomáselné kyseliny na výstupu z reaktoru byla 25%..
Příklad 12 ' • Elektrodialyzér použitý: v tomto příkladu obsahoval , záso-bnúk^.s -devíti, buňkami .,.s. plochou . akr.ivního., povrchu 2 . dm2,, přičemž každá buňka byla složena' ze dvou kompartmentů následujícím způsobem':
solný/kyselinový kompartment: omezen na katodové straně .kationtovou výměnnou membránou Neosepta CMB od firmy
Tokuyama, Soda 'a na anodové straně kationtovou stranou bipolární membrány-Aquálytic, a .
• Φ **··
- bazický kompartment: omezený na anodové straně kationtovou membránou a na katodové straně aniontovou stranou bipolární membrány.
Anoda bylá vytvořena z titanu potaženého platinou.
Katoda byla z nerezové oceli.
Elektrolyt obsahující vodný roztok síranu sodného měl vodivos.t 1.00 mS/cm v-e 40 °C. Rychlost cirkulace v místě elektrod byla 2 x 100 1/hod. Objem byl 51.
Bazický .kompartment' byl na počátku naplněn 5 1 '1% roztoku' síranu amonného.
.Solný/kyselinový -kompartment byl na počátku naplněn 5 1 roztoku 1,44 mol/1 amóniové soli. kyseliny . 2-hydroxy-4metylthiobutanové. .
Rychlost recirkulace byla nejdříve nastavena na 130 1/hod pro solný/kyselinový kompartment a 190 1/hod. pro bazický kompartment.
Elektrodialýza byla provedena - dávkovým způsobem (s recirkulací) při průměrné teplotě 40 °G. Intenzita proudu bylá nastavena na 9A, což poskytovalo proudovou hustotu 0,45 kA/m2. 1
Po’ 155 ' minutách činnosti' zařízení 1 vodivostv solném/kyselém kompartmentu poklesla z 59 na 7,8 mS/cm.
Solný/kyselinový kompartment '. . obsahoval 1,35 mol/1 kyselirfy 2-hydroxy-4-metylthiobutanové, a to ze 100. % ve formě kyseliny.... . ........... ..
Faradický výtěžek byl vypočten na 71 % a spotřeba energie byla 0,53kWh na 1 kg vytvořené kyseliny. '
• · · · · · «· φ
Příklad 13
Elektrodialyzér použitý ' v tomto příkladu obsahoval zásobník s osmi buňkami uspořádanými stejně .jako v příkladu 12 .
Bazický kompartment byl na počátku naplněn .5,27 1 1% roztoku síranu amonného. ' ' Solný/kyselinový kompartment byl na počátku naplněn 4,851 roztoku 1,39 mol/1 amoniové soli kyseliny 2-hydroxy-4metylthiobutanové'.
Rychlost recirkulace byla nejdříve, nastavena ná 60 1/hod pro solný/kyselinový .kompartment a' 150 l./hod pro bazický kompartment. .
Elektrodialýza byla ' provedena dávkovým - způsobem (s recirkulací) při' průměrné teplotě' 40 °C. Intenzita proudu .byla nastavena na 9A, což poskytovalo proudovou hustotu 0,45 kA/m.2 .
Po '172. minutách - činnosti _ zařízení .- vodivost v.' solném/kyselém, kompartmentu poklesla z 59 9, 5 mS/cm.
Konečný objem solného/kyselého- kpmpartmentu byl '4, 67 1. Solný/kyselinový kompartment obsahoval 1,24 mol/1 kyseliny
2-hydroxy-4-metylthiobutanové a' 0,148. mol/1' 2-hydroxy-4metylthiobútanoát. Konverze.byla 8.6%. .Faradický výtěžek byl vypočten na 74 .% a spotřeba energie -byla určena na 0,.58 kWh na -ikg - vytvořené - kyseliny. ·—·' - — ~ - .:.. · . - - .....
Příklad 14 ' . V tomto příkladu bylo použito obdobné', zařízení jako v, příkladu 13 .
Bazický kompartment byl na· počátku naplněn 5,46 1 1% roztoku síranu amonného.. . '
'40
Solný/kyselinový kompartment byl na počátku naplněn 5,23 1 roztoku 1,24 mol/1 amoniové soli kyseliny 2-hydroxy-4metylthiobutanové. Rychlost.reciřkulace byla nejdříve -nastavena na 90 1/hod pro solný/kvselinový kompartment a 150 l./hod pro bazický kompartment. ' . Elektrodiaíýza ' byla provedena . dávkovým způsobem (s recirkulací) při průměrné teplotě 40 °C. Intenzita proudu byla nastavena na 14, A, což poskytovalo proudovou hustotu 0,7 kA/m2. ' .
Po 105 minutách činnosti zařízení vodivost v solném/kys.elém kompartmentu poklesla z 57,.6 na' 9,8 mS/cm.
Konečné složení roztoku v solného/kyselého kompartmentu bylo následující:
1/28 ' mol/1. - kyselina' 2-hydroxy-4-metylthiobutanová a 0,14 mol/1 2-hydroxy-4-metylthiobutanoát. Konverze byla 86%. Produkt byl tedy z 90% ve'formě kyseliny.
Příklad 15
Bylo použito zařízení podobné zařízení použitému v;příkladu. 13 .
. Pokus byl proveden s obsahem bazického- kompartmentu který byl získán jako výsledek příkladu 14. '
.. Solný/kysel.inový komparcment byi na -počátku - naplněn - 5,2 1 roztoku 1,44 mol/1 amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4metylthiobutanové. : , · '
Rychlost recirkulace by.la' nejdříve nastavena na 50 1/hod pro solný/kyselinový kompartment a 150 1/hod pro bazický kompartment.
Elektrodiaíýza byla provedena .dávkovým způsobem (s recirkulací) při průměrné teplotě 42 0 C. Intenzita proudu • « ·· ···· byla nastavena na 19 A, . což poskytovalo proudovou hustotu 0, 95 kA/m2 .
Po 53 minutách činnosti zařízení vodivost v solném/kyselém kompartmentu poklesla z 59 na 27 mS/cm.
Konečný objem solného/kyselého kompartmentu byl 4,85 1. Složení bylo následující: 0,87 mol/1 kyseliny
2-hydroxy-4-metylthiobutanové a 0,56 mol/1 2-hydroxy-4metylthiobutanoátu. Míra konverze byla 56%. Finální produkt byl . z 61% ve formě kyseliny.· Faradický výtěžek byl .vypočten na 83 % a spotřeba’ energie byla určena na 0,7 kWh na 1 , kg vytvořené .kyseliny. ' · · '
Příklad 16
200,1 g HMTBS koncentrace přibližně ' 1,5M .bylo koncentrováno dávkovým způsobem v rotační . odparce. 'Teplota lázně byla 45 ± 5 °C. · Tlak byl regulován na přibližně
2,5 x 103 Pa (25 itibar) , Teplota v destilačním zařízení se měnila od 25 .°C na počátku destilace až do 40 °C na jejím konci. Po třech hodinách bylo získáno ' 41,9 g žlutého’ viskózního média s následujícími Charakteristikami.
Viskozita. při 25 °C (mm2 s 3). • 1150'
%HMTBA (Br/BrO3) 83, 3
Po nastavení titru (naředěním vodou) byl získán produkt s následujícími charakteristikami:
Viskozita při 25 °C (mm2 s-1) 396
%HMTBA (Br/BrO3) 7 9,5.
·· ····
Potenciometricky byla zjištěna následující distribuce hmoty:
% ' HMTBS, 81,6 '
í HMTRA 6,-0
dimerů/(monomer +.dimery) byl
100 detekovány.
, Poměr ploch monomeru nebo stanoven pomocí HPLC:
' Monomer/(monomer + dimery)
- Dimery/(monomer + dimery) .
Což znamená, že žádné dimery nebyly
Příklad 17
200,0' g HMTBS koncentrace .přibližně 1,5 M bylo koncentrováno dávkovým způsobem v rotační odparce'. Teplota lázně byla’ 121 ± 5 °C. Tlak byl regulován na přibližně
9,5 x 104 Pa. Teplota v destilačním zařízení se měnila od100 °C na počátku destilace až do 113 °C. na jejím- konci. Po třech hodinách bylo získáno 41,5 g žlutého viskózního média s následujícími charakteristikami.
Viskozita při 25 °C (mm2 s 2) -
%HMTBA (Br/BrOa) 90,7
Po nastavení titru (naředěním vodou) byl získán produkts následujícími charakteristikami: .
Viskozita při 25 °C (mm2, s ť- 117
%HMTBA (Br/BrCR). - - -78,8
• · ·♦ ··*·
Potenciometricky byla zjištěna následující distribuce hmoty:
% HMTBS 8 1, 6 .
% HMTRA 6,-0
Poměr ploch monomeru nebo ,stanoven pomocí HPLC:
Monomer/(monomer +,dimery) Dimery/(monomer + dimery)..
dimerů/(monomer + dimery)· byl.
.5, 0
Příklad 18
g. H2O bylo přidáno ke 100,0 g. média z přikladu 17. Médium bylo' extrahováno 7 5,0 g i.sopropyléteru. Po rozdělení fází bylo po odpaření organické fáze získáno 25, 6 g HMTBA ' s následujícími charakteristikami.
Stanovení
Monomer/(monomer + dimery) (% plochy) 97
Dimery/(monomer + dimery) .(%^plochy) '3,0
Viskozita při 25 °C (mm2 s1) 55
/ ···· ,· · · • · · · • 0 0 · · · • ···· ·
Příklad 19
Stárnutí roztoků popsaných v předchozích příkladech
Příklad 16 Příklad 17 Pří klad 18
Doba uchovávání ve 25 °C 4 0 dnů 40 dnů 100 dnů t
Viskozita (mm2s-l) . 387 -116 66
Mononomer/(monomer+dimer) 100, 0 95,0 82 ' .
Dimery/(monomer+dimer) 0,0 ' ' 5, 0 , 18 ;
Roztoky v příkladech 16 a 17 nemění obsah -dimerů po '40 dnech skladování. . ’ 1 '

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY.
    Způsob . (HMTBA) přípravy kyseliny 2-hvdroxy-4-metylthiomáselné a/nebo amonné soli kyseliny 2-hydroxy-4-metyl/ Τ,Π/ΤΠΌΟ \ \ 1 11'1 enzymatickou hydrolýzou 2-hyaroxy-4metylthiobutyronitrilu, vyznačující se tím, že · ' a)v prvním kroku se, připraví biologický materiál, který má nitrilázovou aktivitu,
    b) v druhém kroku imobilizuje,
    c) ve třetím kroku vystaví působení se uvedený biologický ' materiál se 2-hydroxy-4-metylthiobutyronitril takto imobilizovaného biologického materiálu,'aby s.e . získala amonná sůl kyseliny - 2-hydroxy-. 4-metylthiomáselné, ,d)ve čtvrtém kroku se případně sůl získaná podle kroku c) přemění na odpovídající kyselinu a
    e)v pátém kroku se produkt získaný podle kroku c). nebo d) koncentruje.
  2. 2. Způsob podle ~ nároku. Ί vyznačující se tím; že nitrilázová aktivita se získá z nitrilázy Alcaligenes, ‘ výhodně druhu faecalis.
    .e ..i;ná.ro.ku.... 1.1 =.,.......Inebo„,i ,......,,..,-..,2..
    vyznačuj ící se tím, že nitrilázová aktivitase ,získá z genetické, informace kódující nitrilázu, .která se exprimuje v hostitelském organismu.
    mikroorgani-smus je Escherichia coli nebo patří do rodu
  3. 4. Způsob podle nároků vyzná č. u jící se tím, ze až 3 hostitelský • · ·· flfl 'flflflfl • · fl ' · • · • ·' ·· · · • flflfl flfl ' ' · 46
    Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces,
    Kluyveromyces , Penicillium a Aspérgillus.
  4. 5.. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, ze nitnlazova aktivita se zísxa z nitrilázy kódované * genem klonovaným do plazmidů pRPA-BCAT3, který jě uložen v CBS pod číslem CBS 998-96.
    *
  5. 6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích- nároků 1 až 5 vyznačující setím, že nitriláza je koexprimóvána s chaperonovým proteinem.
  6. 7 . Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že chaperonový, protein je GroESL z Escherichia coli.
  7. 8.. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků - vyzná č u j í c í se tím, že biologický materiál podle kroku a)· se imobilizuje na,pevný nosič.
  8. 9. Způsob podle nároku 8 vyznačující se tím, že pevný nosič má částice velikosti v rozmezí- 1 μιη až 500 μη, výhodně .
  9. 10 μη až 200 μιη, a je přidán v množství odpovídajícím 0,01 % až 200. % hmotnostních, výhodně. 10, % až 100 % hmotnostních biologického materiálu.'
    Ί5 - 10. Způsob podle nároku 9 vyznačující, se tím, že pevný nosič se vybere ze skupiny obsahující . '
    - iontomě-ničové pryskyřice,
    - - oxid hlinitý, . ? - syntetické oxidy křemičité, křemelinu a silikagely,
    - zeolity, '' - dřevěné uhlí, ·· ·· «· ·»·« ·· • · · ' · · · • · · · • · · · • · · · · ···· ·· ·· - 4 7
    - ve vodě částečně rozpustné proteiny a
    - polysacharidy.
  10. 11. Způsob podle nároku 10 vyznačující sé tím, ze pevný nosič je -gluten.
  11. 12. Způsob podle nároku 8 . v y z , n a č u j í c í se tím, že se použije alespoň jedno chemické činidlo k zesítění nebo zrušení rozpustnosti (insolubilizaci) biologického' materiálu a nosiče.
    - - polymery
    - polymery
    - polymery
    - polymery '
  12. 13..- Způsob podle nároku 12 v y z nadují c í s e ťí m, že chemické činidlo se vybere ze skupiny obsahující polyazetidinu, polyetyleniminu, ť polyamidu, , isokyanátu, '
    - alginátové gely, -' ' - karagenové gely’, ·
    - aminy, '
    - aldehydy,
    - karboxylové kyseliny a
    - isokyanáty.
  13. 14.
    -ZRŮ.spb/.....podle ,...... .
    vyznačuj ící a nosič se smíchají aby se získala pasta,
  14. 15:. Způsob podle vyznačující nároků ,=,10- .. .až se tím, že biologický materiál za přítomnosti chemického činidla, z která se extřuduje a suší.
    nároků 10 ’ až 13 se tím, že biologický materiál • Φ ···.· • ••Φ ·· φφ * • ♦ · • · φ · • φ *··· • · · ·· · • φ · · φ φ φ · φ φ φ · a alespoň jedno chemické činidlo se. smíchají a pak nanesou na nosič v podobě tenké -vrstvy.
    1.6.; Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, .že směs'HMTBS a HMTBA, obsahující alespoň 60% HMTBA, výhodně alespoň 80% HMTBA, doplněk je HMTBS, se získá elektrolytickou ' disociací odpovídající amonné soli, přičemž sé uvolňuje hydroxid amonný.·
    17. Způsob podle nároku 16 vyznačuj ící se tím,, že disociace ' se provádí v elektrodialyzačním zařízení s bipolárními membránami, které má tř.i kompartmenty.
    18. Způsob podle nároku 16 v y z n a č u j 1 c 1 s e t í m, že disociace se provádí v elektrodialyzačním · zařízení s bipolárními membránami, které má dva kompartmenty.
    Způsob, podle . kteréhokoliv ' z nároků 1 až 15 vyznačující setím, že směs HMTBS a HMTBA se získá zahříváním roztoku amonné soli. ·- 20. Způsob .podle vyzn.ačuj.ící amonný sě destiluje,
    - HCN. — nároků se tím, koncentruj e
  15. 16 - až 19 že uvolňovaný hydroxid a recykluje v syntéze
  16. 21. Vodný roztok získaný způsobem · podle--‘nároků 16 až '19, který ‘obsahuje směs HMTBA a HMTBS, přičemž' poměr
    I hmotností .HMTBA/(HMTBA + HMTBS) je' 5 % až .99,9 %, výhodně 10 % až 50 %.
    99 9999
    9999 99 • 9 9
    9 9 9
    9 9 9 9
    9 9 9 99 9
    9 9 9
    99 9
    99 99
    9 9 · ·
    9 9 9 9
    999 999
    9 · ·· 99
  17. 22. Zařízení k provádění způsobu podle nároku 1 vyznačující se t í m, že obsahuje jeden . nebo několik reaktorů (3,4) naplněných imobilizovanými enzymy s nitrilázovou aktivitou 'nebo imobilizovanými hostitelskými ..mikroorganismy exprimujícími enzym s nitrilázovou aktivitou,
    - případně alespoň jedno elekrodialyzační -zařízení (9) a, .- zařízení (6, 12) koncentrující výsledný produkt.
    . z *
  18. 23'. Plazmid pRPA-BCAT3, který je uložen v CBS. pod číslem CBS
CZ0145499A 1996-10-25 1997-10-24 Zpusob kontinuální prípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zarízení k príprave této kyseliny CZ298403B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9613077A FR2755143B1 (fr) 1996-10-25 1996-10-25 Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase
PCT/FR1997/001913 WO1998018941A1 (fr) 1996-10-25 1997-10-24 Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy 4-methylthio butyrique par utilisation d'une nitrilase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ145499A3 true CZ145499A3 (cs) 1999-08-11
CZ298403B6 CZ298403B6 (cs) 2007-09-19

Family

ID=9497056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0145499A CZ298403B6 (cs) 1996-10-25 1997-10-24 Zpusob kontinuální prípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zarízení k príprave této kyseliny

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6180359B1 (cs)
EP (2) EP1411126B1 (cs)
JP (1) JP4350801B2 (cs)
KR (1) KR100557404B1 (cs)
CN (1) CN1181204C (cs)
AT (2) ATE345384T1 (cs)
AU (1) AU738160B2 (cs)
BR (1) BR9712558A (cs)
CA (1) CA2268869A1 (cs)
CZ (1) CZ298403B6 (cs)
DE (2) DE69736961T2 (cs)
DK (2) DK1411126T3 (cs)
ES (2) ES2210504T3 (cs)
FR (1) FR2755143B1 (cs)
HK (1) HK1022170A1 (cs)
HU (1) HU226148B1 (cs)
IL (3) IL129395A0 (cs)
NZ (1) NZ335332A (cs)
PL (1) PL190773B1 (cs)
PT (2) PT934419E (cs)
RU (1) RU2216594C2 (cs)
WO (1) WO1998018941A1 (cs)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5905171A (en) * 1995-06-22 1999-05-18 Novus International, Inc. Process for the preparation of 3-(methylthio)propanal
JPH10179183A (ja) * 1996-12-20 1998-07-07 Daicel Chem Ind Ltd カルボン酸の製造方法
AU6029998A (en) 1997-01-17 1998-08-07 Regents Of The University Of Minnesota Dna molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability
FR2780416B1 (fr) * 1998-06-10 2002-12-20 Rhone Poulenc Nutrition Animal Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede
FR2787121B1 (fr) * 1998-12-11 2003-09-12 Aventis Cropscience Sa Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie
FR2791668B1 (fr) * 1999-04-02 2001-05-04 Rhone Poulenc Animal Nutrition Procede de preparation d' beta-hydroxy acides
US6368804B1 (en) * 1999-07-12 2002-04-09 E. I. Du Pont De Nemours & Company Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells
FR2800749B1 (fr) * 1999-11-08 2004-07-16 Rhone Poulenc Animal Nutrition Procede de modulation de la selective des nitrilases, nouvelles nitrilases obtenues par ce procede et leur utilisation
WO2001055409A2 (en) * 2000-01-25 2001-08-02 Regents Of The University Of Minnesota Microbes and methods for remediation
EP1167521A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-02 Aventis Animal Nutrition S.A. Coated enzyme-containing catalyst
FR2824823A1 (fr) * 2001-05-21 2002-11-22 Aventis Animal Nutrition Sa Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques
JP4884863B2 (ja) * 2006-07-18 2012-02-29 国立大学法人岐阜大学 ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法
JP5143838B2 (ja) * 2007-07-25 2013-02-13 日本曹達株式会社 α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩からのα−ヒドロキシ酸の製造方法
EP2338987A1 (en) 2009-11-16 2011-06-29 ZYRUS Beteiligungsgesellschaft mbH & Co. Patente I KG Whole cell biocatalyst
EP2658987B1 (en) 2010-12-30 2014-12-10 Metabolic Explorer Fermentative production of methionine hydroxy analog (mha)
CN102517274B (zh) * 2011-12-13 2013-12-25 重庆大学 一种制备固定化腈水解酶的方法
CN103933861B (zh) * 2013-08-02 2017-04-26 浙江赛特膜技术有限公司 一种双极膜电渗析制备蛋氨酸和氢氧化钠的方法
CN103497131B (zh) * 2013-10-08 2015-05-13 重庆紫光化工股份有限公司 2-羟基-4-甲硫基丁酸金属螯合物的制备方法
RU2738419C2 (ru) * 2016-06-24 2020-12-14 Новас Интернэшнл Инк. Составы аналогов гидроксиметионина, подходящие для применения в качестве специальных химических агентов
CN113274882B (zh) * 2021-06-09 2022-05-17 温州大学新材料与产业技术研究院 基于高温双极膜电渗析的己二酸铵废液回收方法及其装置

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5356385A (en) * 1976-10-29 1978-05-22 Ajinomoto Co Inc Preparation of immobilized
US4732851A (en) * 1982-03-16 1988-03-22 Purification Engineering, Inc. Immobilization of cells with a polyazetidine prepolymer
DK152764C (da) * 1985-06-14 1988-10-03 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt
DE3542861A1 (de) * 1985-12-04 1987-06-11 Huels Chemische Werke Ag Verfahren zur gewinnung von l-aepfelsaeure
US4800162A (en) * 1987-04-01 1989-01-24 Sepracor, Inc. Method for resolution of steroisomers in multiphase and extractive membrane reactors
DK589389D0 (da) * 1989-11-23 1989-11-23 Novo Nordisk As Immobiliseret enzympraeparat
US5629190A (en) * 1992-08-10 1997-05-13 Rhone-Poulenc Chimie Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides
DE69329202T2 (de) * 1992-10-02 2001-03-29 Research Corp. Technologies, Inc. Methoden der erhöhung der sekretion von überexpremierten proteinen
SK281956B6 (sk) * 1994-09-22 2001-09-11 Rhone-Poulenc Nutrition Animale Spôsob prípravy racemických alfa-substituovaných 4-metyltiomaslových kyselín
US5763652A (en) * 1995-03-08 1998-06-09 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for producing a carboxylic acid

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998018941A1 (fr) 1998-05-07
FR2755143A1 (fr) 1998-04-30
NZ335332A (en) 2000-11-24
PL190773B1 (pl) 2006-01-31
KR100557404B1 (ko) 2006-03-07
CN1181204C (zh) 2004-12-22
HK1022170A1 (en) 2000-07-28
AU4951397A (en) 1998-05-22
HUP9904513A3 (en) 2001-03-28
HU226148B1 (en) 2008-05-28
US6180359B1 (en) 2001-01-30
IL173394A0 (en) 2006-06-11
PL332958A1 (en) 1999-10-25
DE69736961D1 (de) 2006-12-28
KR20000052732A (ko) 2000-08-25
ES2210504T3 (es) 2004-07-01
AU738160B2 (en) 2001-09-13
EP0934419A1 (fr) 1999-08-11
PT1411126E (pt) 2007-02-28
HUP9904513A2 (hu) 2000-05-28
PT934419E (pt) 2004-03-31
DK0934419T3 (da) 2004-03-15
DE69725999D1 (de) 2003-12-11
RU2216594C2 (ru) 2003-11-20
EP0934419B1 (fr) 2003-11-05
DK1411126T3 (da) 2007-03-26
CA2268869A1 (fr) 1998-05-07
CZ298403B6 (cs) 2007-09-19
DE69725999T2 (de) 2004-12-23
IL129395A0 (en) 2000-02-17
EP1411126B1 (fr) 2006-11-15
JP2001502908A (ja) 2001-03-06
ATE253638T1 (de) 2003-11-15
DE69736961T2 (de) 2007-10-04
ATE345384T1 (de) 2006-12-15
BR9712558A (pt) 1999-10-19
FR2755143B1 (fr) 1998-11-27
CN1234074A (zh) 1999-11-03
JP4350801B2 (ja) 2009-10-21
EP1411126A1 (fr) 2004-04-21
IL129395A (en) 2006-06-11
ES2277027T3 (es) 2007-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ145499A3 (cs) Způsob přípravy 2-hydroxy-4-metylmáselné kyseliny pomocí nitrilázy a zařízení k přípravě této kyseliny
JP6947634B2 (ja) ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法
WO2019091366A1 (zh) 一种利用活性包涵体制备光学纯l-叔亮氨酸的方法
CN108239664B (zh) 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺
PT1412226E (pt) Processo de isolamento acústico de um corpo oco como, por exemplo, uma parte da carroçaria de um veículo automóvel
JP3827420B2 (ja) 微生物を用いたアミド化合物の製造方法
CN106011096B (zh) 工程化酮还原酶多肽及其用于制备(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法
WO2001053253A1 (fr) Procede de purification d&#39;un compose amide
KR20000052815A (ko) 디-아스파르트산의 제조방법 및 이의 제조를 위한 조성물
DK170992B1 (da) Immobiliserede enzymer samt fremstilling og anvendelse heraf
MXPA99003403A (en) Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase
CN118360229B (zh) 重组枯草芽孢杆菌及其构建方法、麦角硫因的生产方法
JP6527708B2 (ja) 新規微生物、ならびにそれを用いる２，３−ジヒドロキシナフタレンの製造法
CN116949119A (zh) 一种s-乳酰谷胱甘肽的制备方法
WO2024133888A1 (en) Efficient production of enantiopure d-3-hydroxybutyrate
WO2020059480A1 (ja) 固定化微生物の製造方法及びそれを用いたアミノ酸の製造方法
CN118497167A (zh) 一种l-苏氨酸转醛酶突变体及其在l-对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用
JP3515004B2 (ja) Ｌ−アスパラギン酸の製造方法
CN116376993A (zh) 一种异丙醇胺的制备方法
SG186221A1 (en) PROCESS FOR PRODUCING SULFUR-CONTAINING a-AMINO ACID COMPOUND
JPS61282079A (ja) 酢酸菌遺伝子の分離方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20081024