KR20000052815A

KR20000052815A - 디-아스파르트산의 제조방법 및 이의 제조를 위한 조성물

Info

Publication number: KR20000052815A
Application number: KR1019990703639A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 피. 팬타레오네; 이안 지. 포더링함; 제니퍼 엘. 톤
Original assignee: 제랄드 오브레난, 쥬니어; 엔에스씨 테크놀로지즈 엘엘씨
Priority date: 1996-10-28
Filing date: 1997-10-28
Publication date: 2000-08-25
Also published as: EP0934426A1; CA2269094A1; WO1998018954A1; JP2001503979A; US5834259A

Abstract

D, L-아스파르트산으로부터 D-아스파르트산과 β-알라닌을 제조하는 방법 및 조성물로, D-아스파르트산과 β-알라닌을 생산하기에 적합한 조건하에서 D,L-아스파르트산 또는 이들의 염을, 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 100μmol 이상인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 가지는 조성물과 접촉시키는 것을 특징으로 한다.

Description

디-아스파르트산의 제조방법 및 이의 제조를 위한 조성물{PROCESS AND COMPOSITION FOR PREPARING D-ASPARTIC ACID}

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제는 L-아스파르트 산으로부터 β-알라닌의 생성반응을 촉매한다. 나카노 등은 대장균 B 로부터 추출한 조추출물의 형태에서 효소의 활성을 증명하고 있다. 나카노, 와이 등, 생화학지, 70권, 327-334면(1971년) 참고. 윌리암슨 등은 외견상 균질하게 정제된 대장균 B 내의 효소의 활성을 좀 더 연구하였다. 윌리암슨, 제이 등, 생화학지, 254권(16), 8074-8082면(1979년, 8월) 참고. 이 같은 발표들은 실험적인 호기심을 넘어서 어떤 유용한 양의 효소 제조를 제시하지는 못하였다. 아래에서 좀 더 상세하게 논의되듯이, 본 발명은 나카노 등과 윌리암슨 등의 참고 문헌에 개시된 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성의 100∼2000배의 활성을 갖는 조성물을 이용한다.

로젤(Rozzell)의 미국특허 제5,019,509호는 L-알라닌과 그것의 유도체들의 제조방법과 제조를 위한 조성물들을 개시하고 있다. 그러나, 로젤은 아스파르테이트-β-디카르복시라제를 암호화하는 유전자와 L-알라닌을 제조하기 위한 이의 사용을 개시하고 있을 뿐이다. 호웅(Houng) 등의 미국특허 제5,552,317호와 제5,552,318호는 맥아 또는 캔디다 리폴리티카로부터 추출한 리파제를 사용하여 광학적으로 활성이 있는 아미노산들과 이들의 에스테르들을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 호웅 등의 방법들에서는 아미노산들의 분할이 통상적으로 아미노산들의 유도체들에서 실제적으로 수행되기 때문에 부가적인 화학적 단계들을 필요로 하는데, 이와는 대조적으로, 본 발명의 방법은 호웅 등의 방법들에서와 같은 통상적인 분할이 아니다. 대부분의 경우에, 라세미 에스테르들은 에스테라제들/리파제들로 처리되거나, N-아세틸-아미노산들은 아실라제들로 처리된다.

라세미 아미노산 아미드들에 작용하는 아미다제를 사용하는 다른 분할방법이 공지인데, 여기에서 효소는 하나의 이성체에 대해서만 특이적이다. 미국 특허 제4,880,737호 참조. 그러나, 본 발명은 기질을 제조하기 위하여 부가적인 화학적 변형이 없는 아주 더 단순한 방법을 제공한다.

본 발명은 풍부한 자원인 D, L-아스파르테이트로부터 두 개의 고도로 유용한 화합물들을 제조하는 손쉬운 루트를 제공한다. D-아스파르트산과 이의 유도체들은 약제로서 널리 증명되어있다. 이들 용도들은 제한을 하지는 않지만, 패혈증 또는 시토킨-유발 전신 저혈압증을 예방하거나 또는 치료하는데 유용한 아르기니오 숙시네이트 합성효소 활성의 억제를 포함하며, 면역억제제로 사용된다. D-아스파르트산의 다른 용도로는 식품들을 위한 맛 개선 조성물과 화이저 회사에 의해 알리테임(Alitame^TM)이라는 상품명으로 개발중인 새로운 감미제가 포함된다. 또한 β-알라닌은 코엔자임(coenzyme) A의 합성을 위해서 필요한 판토텐산의 합성에 사용된다. β-알라닌은 또한 α부위가 치환된 β-아미노산들의 합성을 위한 키랄 합성단위체(synthon)로서 사용되는 것으로 알려져 있다. β-알라닌의 유도체들은 전기 도금 산업분야에서 완충제로 사용되어 왔다.

발명의 요약

아스파르트산 이성체들(D와 L)의 라세미 혼합물을 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제(E.C. 4.1.1.11)를 암호화하는 panD 유전자를 포함하는 미생물 또는 이 효소의 적당한 소우스과 함께 항온처리 한다. 효소는 다음반응을 촉매한다.

효소는 입체특이적으로 L-아스파르테이트를 β-알라닌과 CO₂로 탈카르복시화 반응시키는데 반하여, D-아스파르테이트는 미반응의 상태로 남아있다. 이 반응은 CO₂의 방출이 따르는 본질적으로 비가역 반응이기 때문에, 생성물의 고전환이 실현된다. 이 반응은 실온과 중성 pH와 같은 온화한 조건하에서 실행될 수 있으므로, 매우 환경 친화적이며 고도로 바람직하다.

본 발명은 라세미 아스파르트산으로부터 D-아스파르트산의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 상세하게는 본 발명은 라세미 아스파르트산의 효소적 탈카르복시 반응에 의한 D-아스파르트산과 β-알라닌의 제조방법에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pIF309의 제조를 보여준다.

도 2는 본 발명의 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제에 의해 촉매화되는 D, L-아스파르테이트 기질용액의 D-아스파르테이트와 β-알라닌으로의 생물학적 전환을 보여주며, 이는 용액 중에 남아있는 L-아스파르테이트의 양의 감소에 의하여 증명된다.

도 3은 도 2에서 예시된 반응의 완결 후에 남아있는 상등액에 대한 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 효소 제제의 신선한 세포들의 활성을 보여준다.

도 4는 신선한 D, L-아스파르테이트 기질용액에 대한 이미 사용된 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성을 보여준다.

도 5는 D, L-아스파르테이트의 1.0M 용액에 대한 50g/l와 100g/l의 상이한 농도의 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성을 보여준다.

도 6은 NH₄OH로 중화된 D, L-아스파르테이트 기질에 대한 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성을 보여준다.

도 7은 D, L-아스파르테이트, D, L-글루타메이트와 D, L-알라닌같은 여러 가지의 아미노산 기질에 대한 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성을 비교한다.

도 8은 37℃, 45℃와 50℃에서 D, L-아스파르테이트의 생물학적 전환의 결과를 비교한다.

본 발명은 D-아스파르트산과 β-알라닌을 제조하기 위한 적절한 조건하에서, D, L-아스파르트산 또는 이들의 염으로 이루어진 용액을 미생물의 세포들 또는 이들의 추출물들을 포함하는 조성물과 함께 항온처리하는 것을 포함하는 D, L-아스파르트산으로부터 D-아스파르트산을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 조성물은 세포 그램당 시간당 사용된 L-아스파르테이트가 100μmol 이상인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는다.

여기에서 L-아스파르테이트-1-디카르복시라제, 아스파르테이트-α-디카르복시라제 또는 E.C. 4.1.1.11로서도 인용되는 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제는 다음의 반응계통도에 따라서 라세미 아스파르트산으로부터 D-아스파르트산을 제조 하기 위해 본 발명에 사용된다.

기질과 반응생성물들은 산과 염의 형태에 따라 여기에서는 택일적으로 인용된다. 예를 들면, 기질 D, L-아스파르트산은 여기에서는 D, L-아스파르테이트로도 인용된다. 당업자들에게 산의 형태와 명칭은 산이 존재하는 용액의 pH에 따라서 달라질 수 있다고 인식되어 있다. 아래에서 더 상세히 논의되듯이, 본 발명의 방법은 기질의 산과 염의 형태 모두를 사용할 수 있게 넓은 pH 범위에 걸쳐서 유용하다. 본 명세서에서는 본 발명 개시내용을 위해서 산과 염을 바탕으로 하는 명명은 같은 의미로 사용된다.

효소를 암호화는 대장균 K12의 panD 유전자는 β-알라닌과 D-아스파르트산을 제조하기 위하여, 전세포 생물학적 형질전환(whole cell biotransformation) 시스템에 사용되는 다수의 복사 플라스미드 벡터 상에서 대장균에 클론되었다. "전세포 생물학적 형질전환 시스템"은, 효소를 정제하기 위하여 추출되지는 않았지만, 한외여과 되거나 또는 발효배지로부터 분리될 수 있고, β-알라닌과 D-아스파르트산을 제조하기 위한 반응을 촉매하기 위해 용액에 직접 첨가될 수 있는 효소를 포함하는 세포들의 사용을 뜻한다. 다른 "시스템들"이 본 발명의 범위를 벗어나지 않고도 특허청구된 발명을 실시하는데 사용될 수가 있다. 이러한 방법들은 제한을 하지는 않지만 고정화된 세포 분획의 사용, 고정화된 전체효소 또는 효소분획의 사용을 포함한다. 세포분획과 정제된 효소와 효소분획을 만드는 방법들은 당업자들에게는 잘 알려져 있다. 고정화의 바람직한 방법은 아래에서 논의된다.

여기에서 L-아스파르테이트-1-디카르복시라제 또는 E.C. 4.1.1.11로서도 인용되는 효소 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제는 β-알라닌을 만들기 위하여 L-아스파르테이트로부터 α-카르복실기의 제거를 촉매화한다.

본 발명은 미생물의 세포들 또는 이들의 추출물들을 포함하는 조성물을 또한 제공하며, 상기 조성물은 세포 그램당 시간당 사용되는 L-아스파르테이트가 100μmol 이상인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는다.

일 실시예에 있어서 조성물은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 암호화하는 panD 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물의 세포들이나 세포들의 추출물을 포함한다. 예를 들면 벡터는 여기에서 설명된 pIF309와 같은 플라스미드일 수 있다. 그 후에 벡터는 예로서 대장균같은 박테리움과 같은 미생물의 형질전환에 사용된다. 바람직한 실시예에서 조성물은 대장균 NS3291의 세포들 또는 세포들의 추출물들을 포함한다.

본 발명의 조성물은 세포 그램당 시간당 사용되는 L-아스파르테이트가 100μmol 이상인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 가지며, 바람직하게는 세포 그램당 시간당 사용되는 L-아스파르테이트가 약 100∼2000μmol 이상인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는다.

특허청구된 조성물들의 효소 활성도는 참고 문헌으로서 위에서 설명된 윌리암슨 등에 의해 예시된 활성도를 사용해서 계산된다. 이 참고문헌에서 조추출물은 400g의 세포들로부터 6,700 U의 활성도를 보여주며, 여기에서 사용된 1U는 42℃에서 1분당 유리되는 CO₂의 1nmol과 동일하다. 따라서 16.75 U/g 세포들은 세포 그램당 분당 유리된 CO₂16.75 nmol과 동일하다.

아스파르테이트 1몰이 β-알라닌 1몰과 CO₂1몰로 완전히 전환되는 것으로 가정하면, 세포 그램당 분당 사용된16.75 nmol의 L-아스파르테이트는 세포 그램당 시간당 사용된 L-아스파르테이트 약 1μmol로 될 수 있다. 여기의 실시예에서 예시된 바와 같이 본 발명의 조성물은 선행기술에서 공지된 효소의 활성보다 100배 이상의 더 큰 활성도를 제공한다. 윌리암슨 논문의 표 Ⅲ으로부터 정제한 효소의 특이적 활성도는 650 U/mg 단백질이다. 전체 세포 단백질의 50%가 이 활성을 가졌다고 가정하면, 본 발명의 방법과 조성물은 세포 그램당 시간당 사용된 2000μmol L-아스파르테이트에 이르는 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성도를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 조성물은 세포 그램당 시간당 사용된 약 100∼2000μmol L-아스파르테이트에 이르는 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는다. 다른 실시예에서 조성물은 세포 그램당 시간당 사용된 약 100∼1000μmol L-아스파르테이트에 이르는 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는다.

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 유전자의 클로닝은 적당한 공여체 미생물로부터 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA단편을 분리하고, 그 분리한 DNA 단편을 당업자들에게 공지된 적당한 벡터에 융합시킴으로써 달성될 수 있다. 적당한 공여체 미생물들은 L-아스파르테이트를 β-알라닌으로 α-탈카르복실화를 촉매하는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 갖는 모든 미생물들을 포함한다. 예를 들면 제한을 하지는 않지만 대장균 B, 대장균 K12, 대장균 NIHJ와 대장균 테네시를 포함하는 대장균 속으로부터의 박테리아 ; 프로테우스 불가리스 ; 박테리움 카다베리스 ; 아조토박터 바인랜디 ; 리조비움 레구미노사룸 ; 알. 트리폴리 ; 또는 바실러스속의 박테리움을 포함한다.

본 발명의 방법에 유용한 적당한 클로닝 벡터들은 정상적으로 숙주세포 내에서 벡터의 안정성을 유지하고 형질전환체의 확인을 촉진시키기 위하여 복제의 개시점과 선택 마커(marker)를 포함한다. L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 유전자의 클로닝에 유용한 몇가지 방법들과 재료물질들의 설명은 분자클로닝(Molecular cloning)에서 알 수 있다. 실험실 매뉴얼 [티. 매니아티스, 이. 프리찌와 제이. 샘부룩, 콜드 스프링 하버 레버라토리(1982)] 참고.

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA단편은 그 후에 발현된다. L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 유전자의 발현을 위한 일반적인 전략은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA단편을 당 분야에 수 많은 예들이 잘 알려져 있는 바람직한 숙주세포에 적합한 발현벡터에 결찰(ligation)시키는 것을 포함한다. 적합한 발현벡터들은 통상적으로 복제의 개시점, 프로모터 또는 다른 전사 증진 서열, 리보솜 결합부위와 전사종료서열의 존재에 의하여 특징지워진다. 발현벡터는 선택 마커로서 항생물질에 대해 내성을 갖는 유전자를 포함할 수 있으나 ; 원한다면, 성장과 생존을 위하여 숙주 미생물에 의해 필요한 단백질을 암호화하는 어떤 다른 유전자를 포함하는 플라스미드들을 선택 마커로서 사용할 수가 있다. 재조합 DNA 구성에 유용한 프로모터들의 예는 제한을 하지는 않지만 트립토판, 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-락타마제와 P_L프로모터 시스템과; tac와 같은 둘 이상의 공지의 프로모터 시스템으로부터의 성분들 또는 구조체들로 이루어진 하이브리드 프로모터 시스템을 포함한다. 이들이 박테리아 숙주 균주에서 사용되는 가장 통상적인 프로모터들인 반면에, 유전적 조작에 따른 다른 균주들과 미생물종들 및 이들 숙주 균주들에 유용한 다른 프로모터들이 사용될 수도 있다.

결찰후에 본 발명의 합성벡터는 프로모터에 작동적으로 결합된 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 유전자를 포함함으로써, 이 벡터로 형질전환된 숙주세포들은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 제조할 수 있게 된다. 벡터로 형질전환되기 위한 적당한 숙주들은 예를들면 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 암호화하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 박테리움과 같은 어떤 미생물을 포함한다. 상기 예에는 제한을 하지는 않지만 에스케리키아, 바실러스, 크렙시엘라, 슈도모나스, 살모넬라, 프로테우스, 아조토박터 및 리조비움 속이 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 유전자 발현을 위한 숙주 균주는 대장균 균주일 수 있으며 특히 대장균 W3110이며, 프로모터 시스템은 미국특허 제5,120,837호(Fotheringham 등)에 설명된 변형된 pheA프로모터이다. 유전자의 발현은 선택된 숙주 균주내에서 유전자발현을 위하여 벡터내로의 유전자의 결찰에 의해 이루어진다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서 대장균에서 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 발현을 위해 사용되는 벡터는 pBR322 또는 pIF309와 같은 pBR322로부터 유래된 플라스미드이다. 플라스미드 pBR322는 엠피실린과 테트라사이클린 내성을 암호화하는 유전자들을 포함하며, 이는 형질전환된 세포들의 손쉬운 동정을 가능하게 한다.

바람직한 실시예로서 pIF309가 사용되는 경우에는 효소의 발현이 일정한 속도로 이루어진다. 열에 민감한 프로모터가 사용되는 경우, 예를 들어 λcI857 억제인자/프로모터 시스템이 사용되는 경우에는 온도변화 예를 들면 30℃로부터 40℃로 발효온도를 높혀줌으로써 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 합성유도를 이룰 수 있다. L-아스파르테이트-α-디카르복시라제는 세포내에서 전체단백질의 약 5%에서 약 40%에 이르는 수준으로 생산되리라 기대되며, 따라서 매우 높은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지닌 효소 조성물을 포함하는 전체 세포들을 얻게 된다.

유전자의 발현에 의해 효소가 세포내에서 또는 세포밖에서 생산되느냐는 본 발명에는 중요하지 않다. 왜냐하면 원하는 생성물은 편리하게 회수될 수가 있고 또 원한다면 당 기술분야에 공지된 방법에 의하여 더 정제될 수도 있기 때문이다. 별개의 바람직한 실시예에 있어서 유전자는 효소의 열에 대한 안정성을 강화하는 유전자내의 돌연변이를 확인하기 위하여 열안정성이 있는 미생물에 도입될 수가 있으며, 이렇게 함으로써 본 발명의 방법을 고온에서 실시할 수 있게 된다.

본 발명의 방법에 있어서 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 높은 수준으로 제조하는 세포들은 D, L-아스파르트산 또는 이들의 염을 포함하는 용액과 접촉될 수 있으며, 반응 혼합물 중의 L-아스파르트산의 최소한 일부분은 β-알라닌,유리된 CO₂와 D-아스파르트산으로 전환된다. 세포들은 세포내, 세포외로의 기질과 생성물의 확산을 증진시키기 위해 투과성이 되도록 처리될 수 있다. 이 같은 투과성은 저농도의 계면활성제로써 세포들을 처리함으로써 이룰 수가 있으며, 이 계면활성제는 제한을 하지는 않지만 트윈 80, 트리톤 X-100, 노니뎃 P40, 세틸 피리디늄 클로라이드, 데옥시 콜린산, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 또는 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다. 또한, 제한을 하지는 않지만 N,N-디메틸 포름 아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 저농도의 에탄올 또는 아세톤 등을 포함하는 유기용매들도 투과성을 증가시키는데 사용된다.

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제는 조추출물, 부분 정제된 또는 정제된 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 포함하는 세포추출물의 형태로서 D, L-아스파르테이트를 포함하는 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 세포추출물은 당 기술분야 종사자들에게 공지된 세포파괴와 효소의 회수를 제공하는 방법에 따라 제조된다. 세포파괴는 기계적인 또는 비기계적인 장치에 의해 이룰 수가 있다. 대개의 경우에는, 박테리아 현탁액을 얻기위해서 후렌치 압력 셀, 초음파처리(ultrasonication), 비드밀 또는 맨톤-가우린 호모게나이저와 같은 기계적 장치들이 공지된 방법으로 특별히 사용된다. 스코프스, 알. 케이. "단백질 정제"(1982년) (스프링거-베르락, 뉴욕) 참고.

그 후 상술된 전세포(whole cell)방법과 유사한 방법으로 세포추출물을 사용하는 반응을 실시한다.

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 포함하는 세포들, 또는 이들의 추출물들 또는 정제된 효소나 효소 분획들도 바람직하다면 고정될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 고정화 방법은 폴리머겔 내에 포획, 공유결합 부착, 교차결합, 흡착 및 캡슐화와 같은 잘 알려진 방법들을 포함한다.

이러한 방법들의 몇가지 예들은 사이언스, 219:722-727 (1983)에 개시된 A.M. 클리바노브의 예 및 이의 참고문헌들과 본 명세서의 참고문헌으로 포함된 효소학(1976), 44권.(K.Mosbach editor)에서의 방법에 설명되어 있다. 미국특허 제 5,019,509호에 개시된 고정화 방법중의 하나로, 적어도 중량비로 20%의 실리카 또는 알루미나를 포함하는 지지물질을 아미노알킬 실란, 폴리에틸렌이민, 또는 폴리알킬아민같은 아미노알킬 화합물과 접촉시키고, 이어서 글루타르알데히드로 활성화 시키는 것이 있다. 그 다음으로 효소포함용액을 활성화된 지지체와 접촉시켜, L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 고정화된 효소조성물을 생성시킨다. 본 발명의 실시에 유용한 다른 고정화 지지체들은 제한을 하지는 않지만, 다공성 유리, 다공성 세라믹, 벤토나이트, 규조토, 차콜, 세파로즈 (Sepharose )와 세파로즈유도체들, 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 유도체들, 폴리아크릴아미드와 폴리아크릴아미드 유도체들, 폴리아제티딘, 알지네이트, 카라기난과 크로모솝을 포함한다.

세파로즈(파마시아 파인 케미컬, 웁살라, 스웨덴)는 아가로즈로부터 제조된 구슬형의 겔이다. 제조자의 생산품 설명서는 아가로즈는 자연상태에서, 아가로서 명명되는 전하를 띤 중성의 폴리사카라이드의 착혼합물의 일부로서 존재함을 알려주고 있다. 단지 극소수의 잔류 대전기(charged group)만을 가진 겔을 제공하기 위하여 대전된 폴리사카라이드를 제거하는 정제공정에 의하여 세파로즈를 만드는데 사용되는 아가로즈를 얻는다. 당업자는 세포들 또는 이들로부터 유래된 추출물들의 고정화에 적합한 수많은 다른 물질들 또한 본 발명의 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 고정화에 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 바람직하다면, 이들 지지물질은 당 기술분야에서 잘 알려진 기술들에 의하여 활성화 될 수 있다.

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 포함하는 세포들 또는 상술한 세포들로부터 유래된 추출물들을 포함하는 조성물들을 이용하는 D-아스파르트산을 제조하기 위한 반응은 적어도 일부의 L-아스파르테이트가 β-알라닌으로 전환될 수 있는 조건하에서 D, L-아스파르테이트를 포함하는 용액을 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제와 함께 접촉시켜 수행된다. D, L-아스파르테이트의 농도는 이 반응에서 중요하지 않으며 2M 정도의 높은 농도가 유용할 것으로 예측된다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시예에서, 세포들 또는 세포들의 추출물들은 0.5M 농도의 D, L-아스파르테이트 수용액과 접촉한다. 각각의 바람직한 실시예에서, D, L-아스파르테이트 용액의 농도는 1.0M이다.

본 발명의 효소반응들은 약 4℃~약 70℃ 범위의 온도에서 수행되며, 바람직하게는 약 20℃~약 60℃ 사이의 온도에서 실시된다. 바람직한 실시예에서, 반응온도는 상온(ambient temperature)이다. 본 발명을 수행하는데 있어 "상온"은 자연상태에 놓여있는 반응용기의 온도로부터 반응용기의 온도를 올리거나 또는 내리기 위하여 아무런 방법 또는 장치들이 사용되지 않았음을 의미한다. 반응을 위한 최적의 pH 값은 약 2.0으로부터 약 12.0의 범위이고, 더 바람직하게는 약 4.0~약 9.0 사이이며, pH 7.0이 가장 바람직하다.

D-아스파르테이트와 β-알라닌은 공지방법에 의하여 분리되어 회수될 수 있으며, 또는 D-아스파르테이트/β-알라닌 혼합물이 회수되거나 또는 혼합물로서 직접 사용될 수 있다. 방사성 또는 비방사성 동위원소 표지를 포함하는 β-알라닌 또는 β-알라닌/D-아스파르테이트 혼합물의 제조에 본 발명의 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 조성물을 또한 적용할 수 있다. 이러한 생성물들은 적절히 표지된 아스파르테이트 전구체를 사용하여, 그리고/또는 동위원소 표지된 용매 존재하에서 반응을 수행하므로써 쉽게 제조될 수 있다. β-알라닌 과/또는 D-아스파르테이트 생성물들로 혼입될 수 있는 동위원소 표지들의 예는, 제한을 하지는 않지만,¹⁴C,¹³C,¹³N,¹⁵N,²H,³H,¹⁷O 및¹⁸O를 포함한다.

본 발명은 다음의 실시예들에 의하여 더 예시될 수 있으나, 그 이하의 청구항들에서 정의된 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없으며 제한하려고 해석해서는 안된다.

실시예 1

플라스미드 pIF309의 제조

L-아스파르테이트-1-디카르복시라제를 암호화하는 panD 유전자를 아래의 방법들을 사용하여 PCR로 대장균 K12의 염색체로부터 분리하였다.

A. 염색체 DNA의 제조

대장균 균주 W3110을 콜리 유전자 보관센터(예일대, 뉴헤이븐, CT)로부터 입수하였다. 이 균주를 공급자 설명서에서 지시하는 바에 따라 회수하여, 50㎖의 루리아 브로스를 500㎖ 플라스크에 담아 37℃에서 하루밤동안 진탕하면서 배양하였다. 배양액의 10㎖ 분취액을 10,000 XG에서 4분간 원심분리하였다. 상등액은 버리고, 덩어리는 pH 8.0의 50mM Tris/염산 1㎖, 10mM EDTA와 100㎍/㎖ RNase A(시그마사 제품)를 포함한 용액에 재현탁하였다. 이를 상온에서 10분간 항온처리하였다. 여기에 0.4%(중량/부피) 소듐 도데실 설페이트("SDS")와 100㎍/㎖ 프로테아제 K(시그마사 제품)를 포함하는 용액을 2㎖ 첨가하였다. 이 용액을 37℃에서 20분간 항온처리하였다. 여기에 pH 5.2의 소듐 아세테이트를 첨가하여 최종 농도가 300mM이 되도록 하였다. 그 후 이 용액을 37℃에서 동일 부피의 페놀로 3번 추출하고, 2.5배 부피의 에탄올로 침전시켰다. 그 후 살균한 루프를 이용하여 DNA를 옮겨서 pH 5.2의 300mM 소듐 아세테이트 400㎕에 다시 용해시켰다. 옮긴 DNA를 2.5배 부피의 에탄올에서 다시 침전시켜 건조하고, pH 8.0의 10mM Tris와 1mM EDTA 500㎕에 녹였다. 최종 농도는 약 200㎍/㎖였다.

B. PCR에 의한 panD의 증폭

상기와 같이 제조된 100ng의 대장균 염색체 DNA, 각 2㎕의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP(각각 10mM), 15mM MgCl₂, 500mM KCl, pH 8.3의 100mM Tris와 0.01%(중량/부피) 젤라틴을 포함하는 완충액 10㎕, Taq DNA 폴리머라제(암플리텍^TM) 5U, 그리고 어플라이드 바이오시스템 380B DNA 합성기를 사용하여 공지의 방법으로 합성된 각각 10nmol/㎖ 농도의 다음 올리고뉴클레오타이드 프라이머들의 용액 5㎕를 0.2㎖ 마이크로엠프^TM반응 튜브(퍼킨엘머, 노르워크, CT)에 첨가하여 PCR에 의한 대장균 panD 유전자의 증폭을 수행하였다.

(MB1682)

5' CGC GGA TCC ACT ATG ATT CGC ACG ATG CTG CAG GGC 3'

(MG1683)

5' CAG CGT GCA TGC TCA AGC AAC CTG TAC CGG AAT CGC 3'

반응은 퍼킨 엘머 9600^TMPCR 써멀 사이클러(퍼킨 엘머)내에서 수행되었다. 증폭은 94℃에서 3분간 예열한 후 94℃에서 30초 동안 30사이클의 변성후, 50℃에서 30초동안 천천히 냉각(annealing)하고, 72℃에서 2분 동안 연장(extension)하여 수행되었다. 반응 혼합물은 4℃에 보관하였다.

C. panD의 클로닝

증폭된 panD 유전자를 플라스미드 pBR322로부터 유래된 플라스미드 벡터에 클론하였다. 이 플라스미드를 pIF309라고 명명하였다. panD 유전자를 가진 단편을 제한효소 BamHI와 SphI로 완전히 소화시키고, 이와 유사하게 쪼개어진 벡터의 특이적인 BamHI와 SphI 위치 사이에 결찰하였다. 대장균 K12 pheA 프로모터 부위의 변형체를 지닌 합성 DNA 단편을 HindⅢ과 BamHI 위치 사이에 삽입하였다. 이 단편은 어플라이드 바이오시스템 380B DNA 합성기에서 완전합성되었으며, 포더링햄 등과 공동소유인 미국특허 제 5,120,837에서 다음과 같이 특징지어지는 서열로부터 유래되었다:

HindⅢ

AAGCTTTTTTGTTGACAGCGTGAAAACAGTACGGGTATAATACT

AAAGTCACAAGGAGGATCC

BamHI

플라스미드 pIF309를 도 1에 나타내었다. 뉴 잉글랜드 바이오랩에서 공급받은 효소들을 이용하였으며, 제조자 설명서(NEB, Beverly, MA)에 따라 사용하여 제한 소화를 수행하였다. 타카라 바이오케미칼(Panvera Corp., Madison WI)에서 공급받은 결찰 키트를 사용하고 제조자 설명서의 방법에 따라 DNA 단편들의 결찰을 수행하였다.

하기의 설명에 따라 성장시킨 NS3291 균주의 배양액으로부터 제조된 추출물내에서의 L-아스파르테이트-1-디카르복시라제 활성을 생물학적으로 분석하므로써 panD의 발현을 결정하였다.

실시예 2

대장균 균주 NS3291의 생산과 발효

본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 제 5,354,672에서 설명된 조건들을 사용하고, 대장균 균주 W3110을 형질전환하는데 플라스미드 pIF309를 사용하여 균주 NS3291을 생산하였다.

다음의 성장배지 1L를 넣은 2800㎖ 페르나바흐 플라스크(Fernabach flask)에 균주 NS3291을 접종시켰다:

포타슘 포스페이트 (이염기) 13 g

포타슘 포스페이트 (일염기) 2 g

암모늄 포스페이트 4 g

페릭 암모늄 시트레이트 0.24 g

효모 추출물 2 g

마그네슘 설페이트(7ㆍH₂O) 1 g

물 930 ㎖

살균 후 다음 성분들을 첨가하였다:

글루코오즈 (50% 중량/부피 스톡) 70 ㎖

암피실린 0.2 g

플라스크를 진탕 인큐베이터에서 진탕하며 37℃에서 항온처리하였다. 균주를 800~1100 클렛(Klett) 유니트까지 배양하여 발효기에 접종하는데 사용하였다. 발효기는 바이오라파이트 78-100(St. Germain-en Laye, 프랑스) 20L짜리이다. 발효기는 다음 조건하에서 작동되었다:

진탕 500 rpm

온도 37 ℃

역 압력(back pressure) 0.7 Bar

pH (NH₃로 조절) 7.2

통기 1 vvm

설정 부피(set volume) 10 L

접종 100 ㎖

작동시간 16 시간

발효 배지는 따로 표시하지 않는 한, 리터(L)당 다음 성분을 포함한다:

마그네슘 설페이트(7ㆍH₂O) 5.35 g

페릭 암모늄 시트레이트 0.13 g

포타슘 포스페이트 (이염기) 4.6 g

망간 설페이트 0.023 g

포타슘 아이오다이드 0.74 mg

니켈 설페이트 0.74 mg

안티폼 (마주르 마주 DF204) 0.4 ㎖

효모 추출물 5 g

L-아스파르트산 10 g

수돗물 10 L

접종전에 25g/l 농도의 글루코오즈를 첨가하였다. 처음의 글루코오즈가 모두 소비된 후, 총 290g의 글루코오즈가 16시간 후에 1g/l보다 적게 남는 공급속도로 글루코오즈를 공급하였다. 탱크의 최종부피는 12.2L였다. 발효는 10,352 클렛 유니트이고 건조세포 중량은 24.2 g/l에 이르렀다. 발효기 브로스를 10℃이하로 냉각시키고, 중공 섬유(hollow fiber) 카트리지(분자량 500,000 컷오프)를 사용하여 건조세포 중량 158g/l가 되도록 한외여과하였다. 농축된 세포 덩어리를 4℃에 보관하였다.

이 균주를 다음의 실시예들에서 사용하였다.

실시예 3

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제에 의한 D/L-아스파르테이트의 생물학적 전환(Bioconversion)

D/L-아스파르테이트(시그마, A-9006) 66.5g(0.5M)을 칭량하여 2L 비이커에 넣고 10N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 탈이온수를 넣어 부피를 963㎖로 하였다. 세포(상술된 NS3291) 137㎖를 7.31g/10㎖의 다져진 세포부피(packed cell volume :PCV)로 첨가하여 최종부피를 1.1L로 만들었다. 시료들을(각각 약 1㎖) 일정시간에 걸쳐 제거하고, 원심분리한 후 상등액을 HPLC하여 D-와 L- 아스파르트산 함량을 분석하였다.

본 명세서의 모든 실시예에서, D-와 L-아스파르트산 이성질체들은 다음의 컬럼전 유도체화 방법을 사용하여 HPLC로 정량되었다. 오르소-프탈알데히드와 N-아세틸-L-시스테인을 사용하여 아스파르트산을 부분입체 이성질체들로 전환하였다. 부분입체 이성질체들은 Supelcosil^TMLC-18DB, 3μ, 150 ×4.6㎜ 컬럼으로 분리하였으며, 이동상은 A: 20% 메탄올/80% 트리에틸아민 포스페이트와 B: 메탄올을 사용하고 다음과 같은 구배 단계를 사용하였다:

시간(분) A(%) B(%)

6.5 100 0

7.0 40 60

11.5 40 60

12.0 100 0

휴렛-페커드 1090M 크로마토그래프를 사용하여 자동으로 유도체화하였으며, 검출은 338nm(밴드폭 4)에서, 유속은 1.0 ㎖/분으로 하였다. D-아스파르트산의 체류시간(RT)은 4.19분이고, L-아스파르트산은 4.54분이었다.

생물학적으로 전환한 시료들을 미량원심분리기에서 원심분리하여 세포들을 제거하고, HPLC 결과치가 표준곡선의 직선 범위내에 들어가도록 상등액을 적절히 희석하였다. 탈이온수로 대개 1:100과 1:200 사이로 희석하였다.

실시예들에서 아스파르트산의 각각의 이성질체에 대하여 "D-Asp"와 "L-Asp"로 간략히 표기하였다.

표 1의 데이타를 도 2에 나타내었다. 약 24시간 후에 남아있는 L-아스파르테이트의 백분율은 무시할 만큼의 적은 양으로, 약 0.17㎎/㎖이다. 본 생물학적 전환에서 쓰여진 조성물의 효소활성은 다음과 같이 계산된다.

0.5M D,L-Asp = 0.25M D-Asp + 0.25M L-Asp

0.25mol/L ×1.1L = 0.275mol L-Asp

효소활성은 시간당 세포 중량(g)당 이용된 L-아스파르트산이 114.6μmol과 같거나 또는 선행기술에서 알려진 효소활성보다 100배 높다. 이때의 에난티오머 강화(enrichment)는 다음과 같이 계산된다:

전세포(whole-cell) 생물학적 전환반응 후에 원심분리 또는 한외여과로 세포들을 제거하였다. 세포가 제거된 생물학적 전환 혼합물의 pH는 무기산, 대개 황산으로 조절하며, 일반적으로 pH 2.0~2.5 사이로 조절하여 D-아스파르트산은 고체로서 침전되고 β-알라닌은 용액으로 남도록하였다. 여과 또는 다른 수단으로 고체를 모으고 찬물로 세척하여 D-아스파르트산을 얻었다. 회수율은 50~90%였다.

실시예 4

상등액의 신선한 세포들로의 재처리

본 실시예에서는 실시예 3의 상등액을 신선한 세포들로 재처리하였다. 68시간 후에 멈춘 실시예 3에서의 반응액을 GS-3 로터에서 7000rpm으로 45분간 원심분리하였다. 상등액 990㎖를 세포들로부터 분리하였다. 이 상등액의 963㎖를 137㎖의 신선한 세포들과 혼합하여 2L 발효기내에 넣었다. 생물학적 전환은 자동 pH 조절없이, 37℃, 300rpm에서 혼합하므로써 일어났다. 약 1㎖의 시료들을 일정시간에 걸쳐 제거하고 실시예 3에서와 같이 분석하였다.

표 2의 데이타를 도 3에 도식적으로 나타내었다. t=0에서의 L-아스파르트산 농도가 높지는 않았으나(0.43㎎/㎖), 본질적으로 23.5시간까지 농도가 0으로(0.07㎎/㎖) 감소되었다. 비록 외생의 효소들로부터의 동시 합성에 기인한다는 것이 배제되어질 수는 없지만, 23.5시간 후의 L-아스파르트산 농도의 증가는 증발에 기인하는 것으로 믿어진다. 반응의 종결시(68.5시간)에는 단지 0.55㎎/㎖의 L-아스파르트산만이 있었다.

실시예 5

세포들의 재이용

실시예 3에서 이미 사용된 세포들이 여전히 활성이 있는지를 결정하기 위하여 새로운 기질내에 넣었다.

새로운 D/L-아스파르테이트 기질은 실시예 3에서 설명된 방법으로 제조되었다. 실시예 3으로부터의 세포들을 탈이온수에 재현탁하여 100㎖로 하였다. 기질(900㎖, 0.5M D/L-Asp)의 pH는 NaOH를 사용하여 7.0으로 조절하였다. 2L 발효기에 넣고, 세포들(100㎖)을 첨가하였다. 기질에 대하여 pH 조절은 하지 않았으며, 탈이온수를 사용하였다. 일정시간에 걸쳐 시료들을 제거하고 원심분리한 후 D- 및 L- 아스파르트산을 정량하기 위하여 상등액을 적당히 희석하였다. 온도는 37℃로 맞추었다.

표 3의 데이타는 도 4에 도식적으로 나타내었다. 이들 결과는 한 사이클 이후에도 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성이 여전히 남아있었으며, 따라서 이 생물학적 촉매는 재사용될 수 있다는 것을 알려준다.

실시예 6

효소세포의 다양한 농도에 대한 기질로서의 D/L-아스파르테이트

100g/l 세포를 반응 "A"라 하고, 50g/l 세포를 반응 "B"라고 하여, 두가지 농도의 효소 세포에 대해 1.0M D/L-아스파르테이트를 기질로 하여 시험하였다.

D/L-아스파르트산 133.1g을 약 600㎖의 탈이온수에 녹이고, 10N NaOH 100㎖와 소량의 1.0N NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 탈이온수로 반응 A에 대한 기질부피를 963㎖로 만들었다. 냉소에 보관하였던 137㎖의 세포들로 반응을 출발시켰다. 반응 B에 대해서는 기질부피를 981.5㎖로 하였다. 65.0㎖ 세포들로 반응을 출발시켰다.

두 반응 모두 2L 발효기내에서 pH의 일정한 조절없이 pH 7.0, 37℃에서 수행되었다. 일정시간에 걸쳐 시료들을 제거하고 원심분리하였으며, 상등액은 희석하여 D-, L-아스파르트산의 HPLC 분석에 제공되었다. 표 4에 반응 A의 결과를 나타내었고, 표 5에 반응 B의 결과를 나타내었다.

표 4와 5의 데이타를 도 5에 도식적으로 나타내었다. 100g/l에 대한 전환율이 50g/l에 대한 전환율보다 빠르다는 결과를 보여주고 있다. 그러나, 1.0M D/L-아스파르테이트의 기질농도에서의 속도는 0.5M에서의 속도보다 느렸다(실시예 3과 도 2 참조). 또한, 72.0시간 후에 1.0M 기질에서 L-아스파르테이트는 출발농도 53.6㎎/㎖에서 5.39㎎/㎖로, 90% 감소되었다.

실시예 7

L-아스파르테이트-α-디카르복시라제에 대한 NH₄OH 중화된 기질

본 실시예에서는 기질 D/L-아스파르테이트를 이전의 실시예에서 사용된 NaOH 대신 NH₄OH를 사용하여 중화하는 효과를 보여준다. 세포들은 -80℃에서 동결 보관되었다. 133.1g(1몰) D/L-아스파르트산을 약 600㎖ 탈이온수에 녹이고 진한 NH₄OH를 사용하여 pH를 7로 조절하였다. 기질의 최종부피를 963㎖로 하고, 여기에 막 해동시킨 세포 137㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 2L 발효기에 넣고 온도를 37℃로 조절하였다. 자동 pH 조절기는 사용하지 않았으나 시료들을 제거하면서 pH를 점검하고, 50% NH₄OH로 pH를 조절하였다. 약 1㎖의 시료들을 주기적으로 제거하고 원심분리하였으며, 상등액은 희석하여 HPLC분석 전까지 냉동보관하였다.

표 6의 데이타를 도 6에 도식적으로 나타내었다. Na⁺염에 비교시 NH₄ ⁺염에서의 L-Asp의 이용속도가 더 느린 것으로 나타난다.

실시예 8

D/L-글루타메이트 및 D/L-알라닌에 대한 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성

본 실시예에서는 D/L-글루타메이트 및 D/L-알라닌에 대한 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제의 활성을 보여준다. D/L-아스파르테이트를 대조구로 실시하였다.

약 75㎖의 탈이온수에 고체의 아미노산 라세미체를 용해하여 기질들을 제조하였고, pH는 10N NaOH로 7.0으로 조절하였다. 탈이온수로 기질 부피를 100㎖로 하였다. 약 1달동안 냉동보관되었다가 해동시켜 실험 실시전 약 1달간 냉장보관되었던 세포들이 사용되었다.

반응은 이전의 실시예들에서 설명된 것과 같이 수행되었다. 약 0.20㎖인 상등액 시료들을 일정시간에 걸쳐 제거하고 원심분리하였으며, 이전의 실시예에서 설명하였듯이 HPLC분석 전에 냉동보관하였다. 표 7에 반응결과를 나타내었다.

표 7의 데이타를 도 7에 도식적으로 나타내었다. 이 결과는 청구된 방법의 특이성과 L-아스파르트산을 제외한 사용된 기질의 모든 이성질체들이 효소 존재하에서 55시간까지 안정한 효소제조의 특이성을 보여주며, 이는 L-아스파르트산만이 이 효소에 대한 기질이라는 것을 알려준다. 본 명세서를 통하여 설명된 L-아스파르트산은 출발물질의 1.23%로 감소하였다.

실시예 9

온도 연구

본 실시예는 37℃, 45℃와 50℃에서의 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 반응의 활성을 보여준다.

D/L-아스파르트산 133.1g(1몰)을 탈이온수에 녹이고 10N NaOH 약 100㎖로 조절하여 pH를 7.0으로 하였다. 최종농도 100g/l이 되도록 -80℃에서 새로 해동시킨 세포들을 첨가하였다. 세개의 2L 발효기들에 963㎖의 기질용액과 세포 137㎖를 채우고 300rpm으로 혼합하면서 37℃와 45℃로, 또는 450rpm으로 혼합하면서 50℃로 가열하였다. 약 1㎖의 시료들을 일정시간에 걸쳐 제거하고 NaOH나 HCL을 사용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 원심분리하여 세포들을 제거한 후, 상등액의 D-와 L-아스파르트산을 분석하였다.

표 8에 37℃에서의 반응결과를 나타내었고, 표 9에 45℃에서의 결과, 표 10에 50℃에서의 결과를 나타내었다.

표 8, 표9 및 표 10의 데이타를 도 8에 도식적으로 함께 나타내었다. 이들 결과는 세 온도 모두에서 D-이성질체가 안정하다는 것을 나타낸다. 37℃에서, L-이성질체는 99.75시간까지 거의 모두 소비된다. 45℃, 50℃에서는 보다 높은 온도에서 초기속도가 증가되는 것을 보이나, 보다 장기간에 걸친 후에는 효소가 불안정해지고 불활성화되는 것으로 보인다. 청구된 방법 및 조성물에 대해서는 온건한 온도가 바람직하나, 반응온도를 상승시킴에 따라 반응속도는 증가될 수 있다.

Claims

D, L-아스파르트산 또는 이들의 염을 미생물 세포 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 조성물은 D-아스파르트산과 β-알라닌을 생산하기에 적합한 조건하에서 시간당 및 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 100μmol 보다 더 높은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 D-아스파르트산의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 및 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~ 약 2000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 및 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~ 약 1000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 암호화하는 panD 유전자로 형질전환된 미생물의 세포 또는 이러한 미생물 세포의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 미생물은 박테리움인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 박테리움은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 크렙시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 프로테우스(Proteus), 아조토박터(Azotobacter) 및 리조비움(Rhizobium)속의 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6항에 있어서, 박테리움은 대장균 W3110 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 panD 유전자는 대장균 B, 대장균 K12, 대장균 NIHJ; 대장균 테네시(Escherichia coli Tennessee); 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris); 박테리움 카다베리스(Bacterium cadaveris); 아조토박터 바인랜디(Azotobacter vinelandii); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum); 및 리조비움 트리폴리(Rhizobium trifolii)를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리움으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 박테리움은 대장균 K12 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 조성물은 대장균 NS3291 세포들 또는 이의 추출물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 접촉은 D, L-아스파르트산 또는 이들의 염을 조성물과 함께 약 4℃~ 약 70℃ 사이의 온도 및 pH 약 2~ 약 12에서 항온처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 접촉은 D, L-아스파르트산 또는 이들의 염을 조성물과 함께 상온 및 pH 약 7.0에서 항온처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 활성화된 기질에 고정화된 세포 또는 세포들의 추출물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 활성화된 기질은 다공성 유리, 다공성 세라믹, 벤토나이트, 규조토, 차콜, 세파로즈 및 세파로즈 유도체들, 셀룰로오즈와 셀룰로오즈 유도체들, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드 유도체들, 폴리아제티딘, 알지네이트, 카라기난 및 크로모솝을 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
(a) D, L-아스파르트산 또는 이들의 염의 수용액을 제조하고; (b) D,L-아스파르트산 또는 이들의 염의 수용액을 약 4℃~약 70℃ 온도, pH 약 2~약 12에서, 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 100μmol 보다 더 높은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 조성물과 함께 항온처리하고, (c) D-아스파르트산과 β-알라닌을 회수하는 것을 포함하는 D-아스파르트산의 제조방법
제 15항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~약 2000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~약 1000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 조성물은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제를 암호화하는 panD 유전자로 형질전환된 유기체의 세포들 또는 이의 추출물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 유기체는 박테리움인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 19항에 있어서, 상기 박테리움은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 크렙시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 프로테우스(Proteus), 아조토박터(Azotobacter) 및 리조비움(Rhizobium)속의 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 20항에 있어서, 상기 박테리움은 대장균 W3110 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 18항에 있어서, 상기 panD 유전자는 대장균 B, 대장균 K12, 대장균 NIHJ; 대장균 테네시(Escherichia coli Tennessee); 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris); 박테리움 카다베리스(Bacterium cadaveris); 아조토박터 바인랜디(Azotobacter vinelandii); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum); 및 리조비움 트리폴리(Rhizobium trifolii)를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리움으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 22항에 있어서, 상기 박테리움은 대장균 K12 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 18항에 있어서, 상기 조성물은 대장균 NS3291의 세포들 또는 이의 추출물들인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 접촉은 D, L-아스파르트산 또는 이들의 염을 조성물과 함께 상온 및 pH 약 7.0에서 항온처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 100μmol 보다 더 높은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26항에 있어서, 상기 조성물은 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 효소를 암호화하는 panD 유전자를 가진 벡터로 형질전환된 미생물의 세포들 또는 이의 추출물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 28항에 있어서, 상기 플라스미드는 pIF309인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서, 상기 미생물은 박테리움인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 30항에 있어서, 상기 박테리움은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 크렙시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 프로테우스(Proteus), 아조토박터(Azotobacter) 및 리조비움(Rhizobium)속의 박테리아를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 31항에 있어서, 상기 박테리움은 대장균 K12 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 27항에 있어서, 상기 panD 유전자는 대장균 B, 대장균 K12, 대장균 NIHJ; 대장균 테네시(Escherichia coli Tennessee); 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris); 박테리움 카다베리스(Bacterium cadaveris); 아조토박터 바인랜디(Azotobacter vinelandii); 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum); 및 리조비움 트리폴리(Rhizobium trifolii)를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리움으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 27항에 있어서, 상기 조성물은 대장균 NS3291 세포들 또는 이의 추출물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~ 약 2000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 26항에 있어서, 상기 조성물은 시간당 세포 그램당 이용된 L-아스파르테이트가 약 100~약 1000μmol인 L-아스파르테이트-α-디카르복시라제 활성을 지니는 것을 특징으로 하는 조성물.