ES2322418B1 - Sistema de coexpresion enzimatica para la produccion de d-aminoacidos. - Google Patents
Sistema de coexpresion enzimatica para la produccion de d-aminoacidos. Download PDFInfo
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Abstract
Sistema de coexpresión enzimática para la
producción de D-aminoácidos. La presente invención
se refiere a un vector de coexpresión para la preparación de
D-aminoácidos o derivados de
D-aminoácidos, a partir de la mezcla racémica de la
D,L-5-hidantoína correspondiente y a
un sistema enzimático que da lugar a una ruta metabólica nueva de
utilidad en dicho procedimiento, que cataliza la conversión
estereoselectiva de D,L-5-hidantoína
hasta D-aminoácido y la racemización entre los
enantiómeros de la misma.
Description
Sistema de coexpresión enzimática para la
producción de D-aminoácidos.
Esta invención tiene su aplicación en los campos
de la industria farmacéutica, la industria química, la industria
de los alimentos y la agronomía.
Los D-aminoácidos son el
producto directo del procedimiento aquí descrito. Estos compuestos
son extremadamente valiosos en la preparación de sustancias
farmacológicamente activas. Por ejemplo, la
D-fenilglicina y la
D-parahidroxifenilglicina son precursores en la
síntesis de antibióticos como amoxicilina, ampicilina, aspoxicilina,
cefbuperzone, cefpiramide, cefalexin, cefadroxil y otras
penicilinas y cefalosporinas; la D-valina está
siendo utilizada para la síntesis de pesticidas como el
fluvanilato, y la D-alanina es precursora para la
síntesis de edulcorantes en la industria alimentaria (Sharna y col.
(1999) Current Science, 77,1,127-136).
La síntesis química de aminoácidos naturales o
no naturales da lugar a mezclas racémicas de
D,L-aminoácidos, que deben ser resueltas hasta sus
componentes ópticamente puros antes de ser utilizadas. Existen
métodos químicos y biológicos para este proceso y obtener
D-aminoácidos razonablemente puros. Estos métodos
incluyen la cristalización de sales estereoméricas, cristalización
en disolventes ópticamente activos, cromatografía y métodos
enzimáticos (Greenstein, J. P. y col. En Chemistry of the amino
acids, Krieger Publisher, USA, (1984) 1. 715-759).
Todos estos procedimientos tienen muy limitada aplicación
industrial debido a su bajo rendimiento, baja rentabilidad y fuerte
efecto contaminante del medio ambiente.
Los métodos que han recibido mayor atención en
los últimos años son los que parten de hidantoínas monosustituidas
en su carbono 5. Estos compuestos pueden ser fácilmente
sintetizados por varios métodos; los más importantes son: el de
Bucherer-Berg (Finkbeiner, H. J. Org.Chem., (1965)
30, 3414-3419), que utiliza el correspondiente
aldehido, cianuro potásico y carbonato amónico. La limitación de
este método es su elevada toxicidad. Otro proceso de síntesis
importante pero aplicable solo para la
p-hidroxifenilglicina, parte de ácido glioxálico,
urea y fenol (Ohashi, T., y col. (1981), Agric. Biol. Chem., 45,
831-838). Todos estos procedimientos tienen como
resultado una mezcla racémica de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas, y su
transformación química genera una mezcla de la que es difícil y
costoso purificar los D-aminoácidos puros. Un
ejemplo de ello está en el documento de patente FR 2.310.986. La
patente FR 2.317.357 describe un proceso en el que introduce una
importante novedad al utilizar una preparación enzimática para
hidrolizar una mezcla racémica estereoespecíficamente de
D,L-hidantoínas-5-sustituidas,
los
N-carbamil-D-\alpha-aminoácidos
formados son seguidamente oxidados por un método químico. No
obstante este procedimiento no es económicamente atractivo desde el
punto de vista industrial.
La racemización química espontanea de las
hidantoínas 5-sustituidas se realiza en condiciones
fuertemente alcalinas por tautomerismo ceto-enólico.
La velocidad de racemización depende de la electronegatividad
inductiva del susbtituyente del carbono 5. La reacción de
racemización de las hidantoínas sustituidas es de primer orden,
observándose que el tiempo medio de racemización varía desde 55.9
horas, en el caso de la isopropilhidantoína hasta 16 minutos, en el
caso de la fenilhidantoína. Solo esta última y la
para-hidroxifenilhidantoína racemizan a una
velocidad razonable para ser sometidas a las reacciones de
transformación en sus correspondientes
D,L-aminoácidos (Bommarius, A.S., y col. (1992)
nato asi Ser., Ser. C, 381, 161-174). Por tanto, la
inmensa mayoría de hidantoínas
D,L-5-sustituidas no racemizan
espontáneamente a una velocidad adecuada, alargando y encareciendo
la obtención de aminoácidos a partir de ellas.
La producción mediante catalizadores enzimáticos
de D-aminoácidos ópticamente puros desde sus
mezclas racémicas de hidantoínas
D,L-5-sustituidas es un
procedimiento más barato y técnicamente simple que los métodos de
síntesis química y quimioenzimática descritos, además es menos
contaminante (Kim G. J. y col. (1995) Enzyme Microb. Technol.,17,
63-67. Park J. H. y col. (2000) Biotechnol. Prog.,
16, 564-570). En esta transformación enzimática, en
primer lugar, el anillo de las hidantoínas
D,L-5-sustituidas sintetizadas
químicamente es hidrolizado por la enzima
D-hidatoínasa. Posteriormente, la hidrólisis del
D-N-carbamil aminoácido producido
es llegada a cabo per la enzima estereoespecífica estricta
N-carbamil-D-aminoácido
amidohidrolasa (D-carbamilasa). En esta reacción se
produce NH3, CO2 y el D-aminoácido correspondiente.
Puesto que el sustrato de partida (hidantoína
D,L-5-monosustituida) es una mezcla
racémica y la transformación es enantioselectiva, el rendimiento de
esta reacción para la mayoría de los sustratos es del 50% como
máximo. La única aplicación industrial rentable económicamente es
la que utiliza D-fenilhidantoína y
D-5-para-hidroxi-fenilhidantoína
ya que son hidantoínas con una velocidad de racemización espontanea
razonablemente rápida (Bommarius, A.S., y col. (1992) nato asi
Ser., Ser. C, 381, 161-174. Pietzsch, M. and
Syldatk, C. (2002) Enzyme catalysis in organic synthesis. Drauz, K.,
Waldmann, H., Eds.; Wiley-VCH, Weinheim,
761-799).
Las restricciones a la racemización espontanea
de la mayoría de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas limitan su
uso industrial, a pesar del valor económico de sus derivados. Pero
estos compuestos pueden ser racemizados rápida y eficientemente por
la acción catalítica de la enzima hidantoín racemasa. De tal forma
que, la utilización conjunta de esta enzima, la
D-hidatoinasa y la D-carbamilasa,
permite la transformación total del sustrato, hidantoína
D,L-5-monosustituida, en producto,
D-aminoácido. Solo dos hidantoín racemasas se han
estudiado a nivel bioquímico evaluándose su aplicación a la
síntesis de L-aminoácidos. (Watabe, K. y col. (1992)
J. Bacteriol. 74, 798q-7995. Wiese, A. y col.
(2000) J. Biotechnol., 80, 217-230. Wilms, B. y col.
(2001) J. Biotechnol., 86, 19-39).
Los documentos de patente:
EP-199.943, EP-309.310, U.S. Pat.
No. 4,312,948, ES 2 150 452, describen procedimientos para la
obtención de L ó D-aminoácidos por hidrólisis
enzimática de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas, en las cuales
las enzimas forman parte del equipo natural de biocatalizadores de
microorganismos aislados de medios silvestres. Estos procedimientos
presentan dos inconvenientes principales: a) solo son aplicables a
hidantoínas D,L-5-monosustituidas
que racemicen espontáneamente, por la falta de actividad hidantoín
racemasa, y b) baja producción de las enzimas necesarias, dado que
están sometidas a sistemas de control de la expresión genética que
son desconocidos y por tanto impredecibles.
Para superar este problema los genes de las
enzimas implicadas han sido aislados, clonados y expresados. La
patente WO9620275, presenta la hidrólisis de
D-hidantoínas por una enzima
D-hidatoinasa de microorganismos pertenecientes a
los genéros Bacillus, Agrobacterium o Pseudomonas, que está
producida en E. coli. El documento
EP-643.133, se refiere al uso de una
D-hidatoinasa recombinante que posee una fuerte
termorresistencia. En EP-739.978, se describe la
síntesis de
N-carbamil-D-aminoácidos
por una D-hidatoinasa estable a pH alcalino.
Ninguno de estos procedimientos tiene aplicación industrial por si
solo, ya que carecen de la enzima con actividad
D-carbamilasa que permite la producción de
D-aminoácidos. El mismo problema se plantea en el
documento ES 2 159 527, en el que solo se incluye en el organismo
recombinante productor a la D-carbamilasa, siendo
necesario empezar la síntesis de D-aminoácidos desde
D-carbamil-aminoácidos, lo que es
económicamente inviable.
Otros procedimientos posteriores han incluido la
actividad de las enzimas codificadas por los genes de la
D-hidatoinasa y la D-carbamilasa.
Concretamente la patente WO 94/00577 describe la producción de
D-aminoácidos desde hidantoínas
D,L-5-monosustituidas por
producción de D-hidatoínasa y
D-carbamilasa en E. coli y en células del
propio género Agrobacterium. Esta estrategia permite incrementar la
cantidad soluble de estas proteínas y controlar su producción
mediante la inducción de los promotores de los vectores
recombinantes utilizados. En la patente WO9600296 se da un paso
adelante en la técnica al inmovilizar las dos proteínas en una
columna de tipo cromatográfico. Esta novedad es de gran aplicación
industrial, al facilitar la purificación del enantiomero D, pero no
resuelve la imposibilidad de superar un 50% de rendimiento cuando
se utilicen mezclas racémicas de hidantoínas que no racemicen
espontáneamente.
Los sistemas recombinantes descritos arriba
tienen una serie de desventajas entre las que se pueden destacar el
incremento en los costes de producción, una cierta variabilidad en
los rendimientos de producción de las enzimas y que los adecuados
niveles de expresión en la mayoría de los microorganismos son
alcanzados en unas condiciones de inducción del promotor que no son
viables económicamente desde el punto de vista industrial (Syldatk y
col. (1987), Biotechnol. Lett., 9, 25-30). Una de
las posibles estrategias para la solución de algunos de estos
problemas se documenta en la patente U.S. No. 5,834,258. En ella se
describe la construcción y uso de un sistema recombinante en el que
los genes D-hidatoinasa y
D-carbamilasa de Agrobacterium están clonados en
tandem en el mismo vector y controlados por un promotor
constitutivo. De esta forma se evita la necesidad de añadir
inductores durante la fermentación y las dos enzimas se producen en
proporción estable en un mismo compartimento celular. Como en los
casos anteriores este sistema no incluye el gen de la hidantoín
racemasa, por lo que no puede ser aplicado a sustratos no
racemizables espontáneamente.
Las hidantoinas
D,L-5-sustituidas no racemizables
espontáneamente tienen un fuerte potencial de aplicación
industrial, puesto que permitirán obtener nuevos productos
derivados de estas hidantoinas. La limitación para la producción de
esta nueva línea de productos con aplicación farmacológica es la
carencia de sistemas de síntesis que comprendan las tres enzimas
necesarias: hidantoína racemasa, D-hidatoínasa y
D-carbamilasa.
La patente WO 01/23582 describe la construcción
y uso de células de E. coli capaces de degradar hidantoinas
D,L-5-monosustituidas hasta sus
correspondientes aminoácidos de forma completa. Pero no hace
referencia al enantiómero producido. Las células construidas son
portadoras de los genes de la hidantoína racemasa,
L-hidatoínasa y L-carbamilasa de
Arthrobacter aurescens DSM 3747. Las dos últimas enzimas
están descritas en la propia patente WO 01/23582 y en los
documentos Wilms B. y col. (2001), J. Biotechnol. 86,
19-30 y Wiese A. y col. (2001), Arch. Microbiol.,
176, 187-196, como L- específicas y
L-estereoselectivas. Esto significa, que la
D,L-isopropil-5-hidatoína
utilizada en los ejemplos de aplicación de esa patente es
transformada selectivamente en L-triptófano con un
rendimiento del 100%, pero este sistema no puede producir en ningún
caso D-aminoácidos, porque no contiene enzimas que
reconozcan como sustratos específicos a las hidantoínas
D-5-monosustituidas. Esta es la
gran diferencia con la invención que aquí se presenta, ya que este
nuevo sistema es el primero diseñado para producir selectiva y
únicamente D-aminoácidos a partir de mezclas
racémicas de D,L-hidantoínas. Recientemente se ha
comunicado la construcción de un sistema de producción de
D-aminoácidos, compuesto por dos plásmidos
portadores de una D-hidantoinasa y
D-carbamilasa de Flavobacterium en uno, y una
hidantoín racemasa de Microbacterium en otro (Nozaki y col. (2005),
J. Molecular Catalysis, 32, 231-218). En este
sistema los dos plásmidos van en la misma célula, con la
consiguiente necesidad de utilizar dos antibióticos para mantener
las células transformadas, además las enzimas utilizadas son de un
origen diferente a las utilizadas en esta patente. Este aspecto es
importante porque la actividad de este sistema es muy baja, en el
documento antes mencionado, no se demuestra su utilidad en la
transformación de D,L-hidantoínas que no posean una
racemización rápida y los genes de las enzimas están en dos
plásmidos diferentes. Por lo que su aplicabilidad industrial es muy
limitada.
En el documento
Martínez-Rodríguez y col. (2002) Biotechnol. Prog.
18, 1201-1206, se describe la utilización de un
procedimiento de síntesis de D-aminoácidos a partir
de mezclas racémicas de D,L-hidantoínas con alto
nivel de rendimiento y velocidad de reacción. Este sistema está
compuesto por tres tipos de células que independientemente expresan
una de las tres enzimas implicadas en el proceso y que puede
también actuar sobre hidantoínas con muy baja velocidad de
racemización. La limitación de este sistema esta en la necesidad de
cultivar tres tipos celulares distintos para disponer de las tres
enzimas necesarias, además el transporte de los intermediarios
metabólicos del proceso biosintético condiciona su rendimiento
final.
La presente invención proporciona un sistema
enzimático de utilidad en la preparación selectiva y exclusiva de
D-aminoácidos o derivados de los mismos a partir de
mezclas racémicas de D,L-hidantoínas
5-monosustituidas, caracterizado por estar
constituido por las enzimas hidantoína racemasa,
D-hidatoinasa y D-carbamilasa. Los
genes de dichas enzimas están insertados en la misma molécula
Plasmídica y clonados en células de E. coli.
Además, según la invención, se proporciona un
procedimiento para la preparación de dicho sistema enzimático por
sobre-expresión genética en microorganismos
transformados con los genes de hidantoína racemasa,
D-hidatoinasasa y D-carbamilasa, que
comprende la construcción de una factoría celular de E. coli
portadora de D-hidatoinasa,
D-carbamilasa de Agrobacterium tumefaciens
BQL9 e hidantoína racemasa de Agrobacterium tumefaciens C58;
clonación de los genes de los mismos en el mismo
plásmido,denominado pSER42, constituyendo un policistrón controlado
por las mismas señales de transcripción; expresión de estos genes
de forma simultanea dentro de la misma factoría celular; y
optimización de los parámetros cinéticos apropiados de un sistema
enzimático capaz de transformar todas las moléculas de una mezcla
racémica de hidantoinas
D,L-5-monosustituidas en su
correspondiente D-aminoácido.
En resumen, el procedimiento de este último
aspecto de la invención para la producción de
D-aminoácidos, se caracteriza porque el sustrato de
la reacción es una mezcla racémica de hidantoína
D,L-5-monosustituida, el
catalizador es un sistema enzimático en el que las enzimas son
producidas en factorías celulares de microorganismos portadores de
plásmidos recombinantes que incluyen los genes de las mismas,
dichos genes (hidantoína racemasa, D-hidatoinasa y
D-carbamilasa) están clonados en la misma célula y
deben ser inducidos con IPTG en condiciones específicas, la
transformación de la mezcla racémica sustrato es completa
obteniéndose una preparación del
D-aminoácido
puro.
puro.
A continuación se detallan los diferentes
aspectos de la invención.
Las hidantoinas
D,L-5-sustituidas sobre las que
tiene aplicación preferente esta invención son las que presentan
una baja o nula racemización química espontánea. Como se ha
comentado antes son precisamente la mayoría de ellas y
preferentemente las que no tienen grupos aromáticos en la posición
5. Aplicando esta invención con todas ellas se obtienen velocidades
de transformación total menores de dos horas.
Un aspecto importante de esta invención es que
los genes de las D-estereoselectivas
D-hidatoinasa y D-carbamilasa fueron
clonados como productos de la reacción en cadena de la polimerasa.
El DNA fuente fue extraído de la cepa BQL9 de Agrobacterium
tumefaciens, para el caso de la D-hidantoinasa
y la D-carbamilasa (Clemente y col. (2003)
Biotechnol. Lett. 25, 1067-1073). La hidantoín
racemasa fue clonada de la cepa C58 de A. tumefaciens (Las
Heras-Vázquez y col. (2003) Biochem. Biophhys. Res.
Commun. 303, 541-547.
Un aspecto de la mayor importancia de la
presente invención es la construcción de una célula de E.
coli portadora de una secuencia de DNA codificante de una
proteína con actividad hidantoín racemasa. La posible presencia de
un gen codificante de hidantoín racemasa en el genoma de
Agrobacterium tumefaciens C58 ha sido comunicada en los
documentos Goodner, B. y col. (2001) Science,
294,2323-2328, y Wood, D.W., y col., (2001) Sience,
294, 2317-2323. La hipotética secuencia codificante
de la hidantoín racemasa está depositada en el GenBank con el
número de acceso NC003063 y NC003305. En el desarrollo de esta
patente se obtuvieron, por vez primera, datos experimentales de que
esta secuencia efectivamente codifica una proteína con actividad
hidantoín racemasa. Y esta patente es el primer documento en el que
se demuestra la función hidantoín racemasa de estas secuencias
nucleotídicas.
Otro aspecto de esta invención es que las tres
enzimas que constituyen la nueva ruta biosintética están clonados
en el mismo tipo de vector plasmídico. Por tanto, en los tres casos
la inducción de la expresión genética se produce con IPTG, ya que
el promotor utilizado es derivado del operón lac. Igualmente los
tres están introducidos en células BL21 de E. coli, lo que
permite la manipulación y crecimiento de los microorganismos por
las mismas técnicas.
Todos los procedimientos de construcción y
manipulación de las moléculas recombinantes fueron extraídos y
optimizados de Sambrook, J. Y col. (1989) Molecular clonig: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor.
El sistema enzimático de la presente invención
puede ser obtenido por cultivo de células de E. coli BL21
transformadas con el plásmido pSER42. El cultivo de las células
debe realizarse en condiciones aeróbicas, con al menos una fuente
asimilable de carbono y nitrógeno así como varios tipos de aniones
y cationes. Opcionalmente pueden usarse vitaminas tales como
biotina y tiamina o aminoácidos. En general puede usarse
preferentemente el medio de cultivo LB
(Luria-Bertani) o una modificación de éste. El
medio de cultivo debe estar suplementado con una cantidad adecuada
de ampicilina, preferentemente 50-100 mL. En orden
a la utilización de esta invención, debe realizarse un precultivo
para sembrar con mayor rendimiento un fermentador del volumen
apropiado.
La fermentación es llevada a cabo en estrictas
condiciones aeróbicas a una temperatura de 26-30ºC y
un pH de 7.0 y 7.8. Una vez que el cultivo ha alcanzado una
densidad de población correspondiente a una turbidez de 0.4 y 0.6
unidades de densidad óptica se puede iniciar la fase de inducción
de la expresión. Se añade al fermentador IPTG
(Isopropil-\beta-D-tiogalactósido)
hasta una concentración comprendida entre 0.1 y 0.2 mM y se 3
prolonga la fermentación entre 3 y 4 horas.
Para el desarrollo óptimo de esta invención las
factorías celulares deben ser concentradas y lavadas por un
procedimiento clásico de concentración celular, preferentemente la
centrifugación a un máximo de 7000 g a 4ºC durante 10 minutos. La
biomasa, así obtenida, puede ser congelada y guardada hasta su
utilización. Esta biomasa enriquecida en enzimas se resuspende en
fosfato potásico 100 mM pH 8 hasta una D.O. de 10. El tiempo de
reacción es otro parámetro que debe ser optimizado para cada
hidantoína D,L-5-sustituida. De
manera general todas las hidantoinas
D,L-5-monosustituidas con grupos no
aromáticos, y que por tanto, no racemizan espontáneamente son los
sustratos ideales de este sistema. Todas las hidantoinas de
aminoácidos naturales son convertidas, en estas condiciones, en sus
correspondientes D-aminoácidos en menos de 2 horas.
Con un rendimiento del 100%.
Los D-aminoácidos preparados por
el procedimiento de la presente invención pueden ser purificados
desde el medio de reacción mediante medios convencionales del tipo
de la cromatografía de intercambio iónico o precipitación en su
punto isoeléctrico.
A continuación se pasa a describir de manera
breve un modo de realización de la invención, como ejemplo
ilustrativo y no limitativo de ésta. Para una mejor comprensión del
modo de realización, se incluyen las siguientes figuras:
Figura 1: Plásmido de transformación y expresión
en E. coli, portador de los genes de la hidantoín racemasa,
D-carbamilasa e hidantoinasa, bajo el promotor del
operón de la lactosa.
Figura 2: Tiempo de conversión y rendimiento de
la misma (50%) de D,L-metiltioetilhidantoína en
D-metionina. En presencia de un sistema de expresión
compuesto solo por D-hidantoinasa y
D-carbamilasa.
Figura 3: Tiempo de conversión y rendimiento de
la misma (100%) de D,L-metiltioetilhidantoína en
D-metionina. En presencia del sistema basado en el
plásmido pSER42, que incluye los genes de la hidantoín racemasa,
D-carbamilasa y D-hidantoinasa.
Figura 4: Determinación del intervalo óptimo de
pH para la reacción en la factoría celular de conversión de
D,L-metiltioetilhidantoína en
D-metionina, usando el sistema pSER42 de esta
invención.
Figura 5: Determinación del intervalo óptimo de
temperatura para la reacción en la factoría celular, construida en
esta invención de
D-L-metiltioetilhidantoína en
D-metionina. Obviamente utilizando la expresión de
los genes contenidos en pSER42.
Figura 6: Ejemplo de Actividad Específica en la
síntesis de varios D-aminoácidos a partir de sus
correspondientes D,L-hidantoinas momosustituidas.
El proceso se desarrolló como se describe en la utilización
preferente de la invención, utilizando factorías celulares
constituidas en esta invención con el vector de expresión
pSER42.
La producción de masa enzimática que actúa como
catalizador en esta invención, es obtenida por factorías celulares
portadoras del plásmido policistrónico pSER42. Estas células deben
ser cultivadas en un medio constituido por una fuente de carbono y
nitrógeno que puede ser preferentemente un hidrolizado de
aminoácidos en una cantidad de 10 gr/L, extracto de levadura 5 gr/L
y NaCl 5 gr/L. Se preparan precultivos de volúmenes crecientes que
son utilizados para sembrar cultivos de volumen cada vez mayor,
dependiendo del escalado industrial correspondiente al nivel de
producción deseado. Todos los cultivos se desarrollan en
condiciones aeróbicas, 28ºC y a pH 7.0. El inicio de la inducción
debe producirse una vez que la fermentación llega a un nivel de
población equivalente a 0.4 unidades de densidad óptica. En estas
condiciones las células pueden ser recolectadas y lavadas por
centrifugación, preferentemente a 7000 g, 4ºC durante 10 minutos.
Los sedimentos obtenidos deben ser congelados a -20ºC para su
posterior utilización.
El desarrollo de la conversión de hidantoínas
D,L-5-sustituidas se inicia con la
resuspensión de las células transformadas en un medio con fosfato
potásico 100 mM pH8, hasta una D.O. de 10 y la adición del sustrato
(mezcla racémica de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas)
correspondiente, según la necesidad industrial. Dos parámetros que
deben ser tenidos en cuenta para una eficiente conversión de
mezclas racémicas de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas en
D-aminoácidos son la afinidad del sistema enzimático
por cada sustrato específico y la solubilidad de éste en el medio
acuoso utilizado como medio de reacción. Por tanto, ambos parámetros
han de ser puestos a punto para cada D-aminoácido
que quiera obtenerse. Esta optimización se consigue ajustando las
cantidades relativas en peso de mezcla enzimática y sustrato. Para
las hidantoínas
D,L-5-monosustituidas cuyo
substituyente es una cadena de un aminoácido natural, esta relación
varia entre 1:10 y 1:50. Las hidantoínas
D,L-5-monosustituidas deben estar
disueltas, hasta saturación, en un medio acuoso compuesto por sales
de fosfato, carbonato, etc., y ajustadas a un pH de 8. Una vez
mezcladas en un recipiente con el diseño adecuado a la planta
industrial específica, la mezcla enzimática y la disolución de
hidantoína D,L-5-monosustituida, se
deja reaccionar a 50ºC, durante 2 horas para los sustratos más
solubles y 4 horas para los sustratos más insolubles. Las factorías
celulares con los genes correspondientes inducidos y la ruta
biosintética de interés activada puede estar compuesta por células
completas, también es posible utilizar células permeabilizadas con
un detergente o alcohol o células rotas por homogeneización.
Este procedimiento de conversión es
especialmente útil para hidantoínas
D,L-5-monosustituidas que no
racemizan espontáneamente o que lo hacen a una velocidad baja. Por
tanto, no es necesario considerar, en la aplicación industrial de
esta invención, la velocidad de racemización del sustrato, ya que
no es un factor limitante de la reacción. Esta es una ventaja
importante respecto a los otros sistemas de síntesis de
D-aminoácidos descritos. Ya que permite una
simplificación técnica y una disminución de costes que convierten
al sistema descrito en esta patente en el más versátil, eficiente
y económico.
Por este sistema, la mezcla racémica de
cualquier hidantoína
D,L-5-monosustituida es convertida
con un rendimiento del 100% en su correspondiente
D-aminoácido. Esto reduce los costes de purificación
de estos productos al evitar la necesidad de separar las
enantiómeros producidos por otros sistemas. Así los
D-aminoácidos pueden ser purificados por un
procedimiento simple de cromatografía de intercambio iónico, por
precipitación en su punto isoeléctrico o cualquier otro
procedimiento industrialmente viable.
Las grandes ventajas de la presente invención
respecto a los otros sistemas existentes son:
- a)
- Es aplicable a hidantoínas D,L-5-monosustituidas que no racemizan espontáneamente o que lo hacen a velocidad mayor a 30 minutos. A este grupo pertenecen todas menos las que poseen un grupo aromático en posición 5.
- b)
- Permite la modificación del rendimiento de cada una de las tres reacciones que componen la ruta biosintética de D-aminoácidos desde hidantoínas D,L-5-monosustituidas. Ya que se puede alterar la cantidad de hidantoín racemasa, D-hidatoinasa y D-carbamilasa que forman parte de la mezcla enzimática por alteración del orden de clonación en el vector. Puesto que la cantidad de enzima fabricada será mayor cuanto menor sea la distancia al promotor.
- c)
- La mezcla racémica de hidantoína D,L-5-monosustituida es convertida completamente en su correspondiente D-5 aminoácido con un rendimiento del 100%.
- d)
- El producto final está completamente puro, no siendo necesario un proceso ulterior de separación de enantiómeros.
- e)
- El proceso puede ser escalado fácilmente a nivel industrial o desarrollado en una columna de células inmovilizadas.
- f)
- Los productos intermediarios de la ruta biosintética no deben ser transportadas a diferentes células. Es decir, todo el proceso se realiza en la misma célula.
Los siguientes ejemplos experimentales
proporcionan una buena ilustración de la presente invención pero no
limitan su aplicación de ninguna manera.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de la hidantoín racemasa fue clonado como
producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
utilizando como molde el DNA de Agrobacterium tumefaciens
C58. Los oligonucleótidos cebadores de la reacción fueron diseñados
a partir de la secuencia depositada en el Genebank con número de
accesión AY436503. El cebador de 5' fue
5'-AACTGCAGGCAGGAAAGCTATTATGCGTGCGATGCAT-3'.
Este cebador dispone de un sitio de corte para la enzima de
restricción PstI, un sitio de unión a ribosomas, propio de E.
coli y un codón de inicio de la traducción. Por otra parte el
cebador de 3' fue 5' -GCCCTCGAGTTAGGCGCAGGCGA-3',
diseñado con un sitio de corte para la enzima XhoI y un codón de
parada para la traducción. La amplificación se llevó a cabo en un
termociclador Perkin Elmer 2400 programado como sigue:
desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 min., después cada ciclo
estuvo compuesto por 30 sec. A 94ºC para la desnaturalización, 30
sec. A 57ºC para el acoplamiento de los cebadores y 1 min. A 72ºC
para la síntesis. Después de 35 ciclos se realizó un paso de
síntesis final de 5 min. a 72ºC. El producto de PCR fue purificado
desde un gel de agarosa usando un preparado QIAquick de Qiagen y
siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto de PCR, una
vez purificado, fue cortado en sus extremos por las enzimas PstI y
XhoI, dando lugar a extremos cohesivos que permitieron su inserción
en el plásmido pBluescrip II SK(+), el cual había sido abierto con
las mismas enzimas, dando lugar la plásmido pSER14. Después del
ligamiento, el vector con el inserto (gen de la hidantoín racemasa)
fue clonado en células de E. Coli DH5\alpha. La secuencia
del inserto fue verificada por secuenciación automática con
dideoxinucleótidos en un Applied Biosystems ABI 377.
El gen de la D-carbamilasa fue
insertado y clonado en pSER14 por un procedimiento básicamente
igual al descrito para el gen de la hidantoín racemasa. Se
amplificó mediante PCR utilizando como DNA molde el genoma de
Agrbacterium tumefaciens BQL9. Los oligonucleótidos
cebadores fueron diseñados a partir de la secuencia depositada en
el GenBank con el número de accesión X91070. El cebador de 5' fue 5'
-GCTCTAGAGTGACAGGAAAGCTTTATGAC
ACGTCAGATGATACTTGC-3' y contiene un sitio de corte para la enzima XbaI, el correspondiente sitio de unión a ribosomas de E. coli y un codón de parada para la traducción. El cebador de 3' fue 5'-TTCTGCAGTTAGAATTCCGCGATCAGACCG-3' y contiene un sitio de corte para la enzima PstI y un codón de terminación de la traducción. El producto de PCR y el Plásmido pSER14 fueron cortados con las enzimas XhoI y PstI permitiendo, así, la inserción del gen de la D-carbamilasa en posición 5' del gen de la hidantoín racemasa. El plásmido resultante, portador de ambos genes, se denominó pSER15 y permitió el clonado de los mismos en células de E. Coli DH5\alpha.
ACGTCAGATGATACTTGC-3' y contiene un sitio de corte para la enzima XbaI, el correspondiente sitio de unión a ribosomas de E. coli y un codón de parada para la traducción. El cebador de 3' fue 5'-TTCTGCAGTTAGAATTCCGCGATCAGACCG-3' y contiene un sitio de corte para la enzima PstI y un codón de terminación de la traducción. El producto de PCR y el Plásmido pSER14 fueron cortados con las enzimas XhoI y PstI permitiendo, así, la inserción del gen de la D-carbamilasa en posición 5' del gen de la hidantoín racemasa. El plásmido resultante, portador de ambos genes, se denominó pSER15 y permitió el clonado de los mismos en células de E. Coli DH5\alpha.
El gen de la D-hidantoinasa fue
insertado y clonada en pSER15 por una metodología básicamente
idéntica a la utilizada para los genes anteriores. El DNA molde
para la reacción fue el correspondiente a el Plásmido pSBH1,
construido previamente en Clemente-Jiménez y col.
(2003) Biotechnol. Lett. 25, 1067-1073. Este
plásmido contiene el gen de la D-hidantoinasa de
A. tumefaciens BQL9 y también fue utilizado para el diseño
de Los cebadores de la amplificación. El cebador de 5' fue 5'
-AACTCGAGGCAGGAAAGCTTTATGGATATCATCATC-3', portador
de un sitio de corte para la enzima XhoI, un sitio de unión a
ribosomas reconocible por E. Coli y un codón de inicio de la
traducción. El cebador de 3' fue 5'
-AAGGTACCTTATTGCTTGTATTTGCGGCG-3', portador de un
sitio de corte para la enzima KpnI y un codón de parada para la
traduccción. El producto de PCR, después de purificado por
electroforesis en agarosa y el vector pSER15 fueron cortados por
las enzimas XhoI y KpnI, lo cual permitió insertar el gen de la
D-hidantoinasa en posición 3' del gen de la
hidantoín racemasa, dando lugar al plásmido pSER42 (Figura 1). Este
plásmido fue utilizado para su clonación en E. coli
DH5\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron células de E. Coli BL21
con el plásmido pSER11, construido en nuestro laboratorio de forma
que expresa el gen de la D-hidantoinasa de A.
tumefaciens BQL9. Igualmente se transformaron células de E.
Coli BL21 con el plásmido pJMC38 que porta y expresa el gen de
la D-carbamilasa de A. Tumefaciens BQL9. Las
construcciones BL21 pSER11 y BL21 pJMC38 contienen actividad
D-hidantoinasa y D-carbamilasa
respectivamente y fueron crecidas, independientemente, en medio LB
sólido suplementado con 100 \mug/mL de ampicilina a 37ºC durante
12 horas. Una colonia individual, de cada tipo celular, fue
utilizada para sembrar 10 mL de LB líquido con la misma
concentración de ampicilina. Este cultivo fue incubado a 37ºC
durante 12 horas con fuerte agitación. 1 mL de este cultivo se
utilizó para sembrar 100 mL de LB fresco con ampicilina. Después de
2 horas de incubación en agitación a 37ºC se llegó a una DO600 del
cultivo de 0.3 á 0.5. En este momento se inició la inducción de la
expresión de los genes clonados: D-hidatoinasa en el
caso de BL21 pSER11 y D-carbamilasa en el caso de
BL21 pJMC38. Se añadió IPTG hasta una concentración de 0.2 mM y el
cultivo fue continuado a 28ºC durante 4 horas. Para la producción
correcta de D-hidatoinasa se añadió MnCl2 a una
concentración de 2 mM. Las células fueron recogidas por
centrifugación a 7000 g a 4ºC durante 10 minutos. Los sedimentos
fueron congelados a -20ºC hasta el momento de su
uso.
uso.
Para la realización de la reacción de conversión
de
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidatoína,
un sedimento de cada tipo de enzima fue descongelado y resuspendido
en fosfato potásico 100 mM pH 8, hasta una DO600 de 10. 100 \muL
de cada tipo celular fueron mezclados con 200 \muL de una
disolución 15 mM de
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidatoína
en el mismo amortiguador. La mezcla se dejó reaccionar a 50ºC
durante 300 minutos. A cada periodo regular de tiempo se tomó una
alícuota en la que la reacción fue detenida con un volumen
equivalente de HCl 1 M. Estas muestras fueron centrifugadas y la
cantidad de
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidantoína,
carbamil D-metionina y D-metionina
fue analizada por HPLC (Breeze HPLC System, Waters, equipado con
una columna Symmetry C18 4.6 x 150 nm Waters). La fase móvil
utilizada, 20 mM de ácido fosfórico pH 3 (85%) y metanol (15%), fue
bombeada a un flujo de 0.75 mL/min. El detector UV a 210 nm
permitió cuantificar la evolución de cada compuesto a lo largo del
tiempo de reacción. Los resultados se representan en la figura 2.
Como puede verse, el sistema D-hidatoínasa,
D-carbamilasa convierte solo el 50% de la
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidantoína
en D-metionina en 200 minutos, pero a partir de ese
tiempo no se produce nueva formación de
D-aminoácido. Esto significa que la mitad del
sustrato, el enantiómero
L-5-(2-metiltioetil)-hidatoína,
queda sin transformar. Esto ocurre porque la
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidatoína
no tiene racemización química espontánea. El rendimiento máximo de
esta reacción es del 50% y es el mismo que pueden alcanzar los
procedimientos antes descritos para la síntesis de
D-aminoácidos a partir de hidantoínas
D,L-5-monosustituidas que no
racemizan espontáneamente y que no utilizan hidantoín racemasa.
La ruta enzimática para la reacción se obtuvo a
partir de células portadoras del vector pSER42, estas fueron
resuspendidas en un amortiguador de pH constituido por
borato-ClH 100 mM (pH 8), hasta una densidad celular
de 1 g/mL. El proceso de conversión de
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidantoína
en D-metionina y el análisis de los productos de la
misma se efectuó como se explica en el ejemplo 2. El seguimiento de
la conversión a lo largo del tiempo esta sumarizado en la figura 3.
Estos resultados demuestran que, en la presencia de la hidantoín
racemasa, toda la mezcla racémica de
D,L-5-(2-metiltioetil)-hidantoína
es convertida en D-metionina en un tiempo de 150
minutos, con lo que la reacción puede darse por finalizada. El
rendimiento, por tanto, de está conversión es del 100%, mejorando
en un 50% el de los otros procedimientos y realizando la misma a
una velocidad compatible con las necesidades de los procesos
industriales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron los valores de pH y temperatura de
reacción para la síntesis de D-metionina a partir
de su correspondiente
D,L-5-monosustituida hidantoina.
Para determinar el pH óptimo de reacción se prepararon células
portadoras de pSER42 y se determinó su actividad como se explica en
el ejemplo 3, pero se realizaron diferentes determinaciones a
diferentes pHs. Los medios de reacción cambiaron de pH en un rango
de 6 á 10.5; para ello se prepararon tres amortiguadores, el
primero fue fosfato potásico 200 mM para el intervalo de 6 á 8, el
segundo fue borato-HCl 100 mM para el intervalo de 8
á 9 y el tercero fue borato-NaOH para el intervalo
de 9 á 10.5. La síntesis de D-metionina varió a lo
largo de este rango de pHs como se indica en la figura 4,
presentando un máximo de actividad en el intervalo preferente de pH
de 8.8 á 9.7. Por otro lado, se determinó la temperatura óptima de
trabajo. La Producción de D-metionina fue medida
como en el ejemplo 2, pero a diferentes temperaturas; como se
demuestra en la figura 5 la temperatura optima para la síntesis es
de 55ºC, ya que el 100% de la
D,L-5-monosubstituida hidantoína se
transforma en menos de 100 minutos.
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De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
triptófano 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad
Específica del sistema de producción y los datos se incluyen en la
figura 6. El rendimiento de producción demuestra la capacidad de
las enzimas codificadas en pSER42 y de las células que las producen
para sintetizar D-triptófano puro. Igualmente el
sistema puede ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades
industriales específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
tiroxina 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad
Específica del sistema de producción y los datos se incluyen en la
figura 6. El rendimiento de producción demuestra la capacidad de
las enzimas codificadas en pSER42 y de las células que las
producen para sintetizar D-tiroxina pura. Igualmente
el sistema puede ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades
industriales específicas.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
Valina 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad
Específica del sistema de producción y los datos se incluyen en la
figura 6. El rendimiento de producción demuestra la capacidad de
las enzimas codificadas en pSER42 y de las células que las
producen para sintetizar D-Valina pura. Igualmente
el sistema puede ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades
industriales específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
ABA 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad Específica
del sistema de producción y los datos se incluyen en la figura 6.
El rendimiento de producción demuestra la capacidad de las enzimas
codificadas en pSER42 y de las células que las producen para
sintetizar D-ABA pura. Igualmente el sistema puede
ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades industriales
específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
PA 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad Específica
del sistema de producción y los datos se incluyen en la figura 6.
El rendimiento de producción demuestra la capacidad de las enzimas
codificadas en pSER42 y de las células que las producen para
sintetizar D-PA puro. Igualmente el sistema puede
ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades industriales
específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos, células
inducidas y portadoras de pSER42 con la D,L-5-
monosustituida hidantoína de Norvalina 15 mM. Terminada la reacción
se calculó la Actividad Específica del sistema de producción y los
datos se incluyen en la figura 6. El rendimiento de producción
demuestra la capacidad de las enzimas codificadas en pSER42 y de
las células que las producen para sintetizar
D-Norvalina pura. Igualmente el sistema puede ser
escalado hasta adaptarlo a las necesidades industriales
específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5- monosustituida hidantoína de Norleucina 15
mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad Específica del
sistema de producción y los datos se incluyen en la figura 6. El
rendimiento de producción demuestra la capacidad de las enzimas
codificadas en pSER42 y de las células que las producen para
sintetizar D-Norleucina pura. Igualmente el sistema
puede ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades industriales
específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos, células
inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
Metionina 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad
Específica del sistema de producción y los datos se incluyen en la
figura 6. El rendimiento de producción demuestra la capacidad de
las enzimas codificadas en pSER42 y de las células que las
producen para sintetizar D-Metionina pura.
Igualmente el sistema puede ser escalado hasta adaptarlo a las
necesidades industriales específicas.
De acuerdo con el procedimiento de síntesis
descrito en el ejemplo 2, se incubaron, durante 10 minutos,
células inducidas y portadoras de pSER42 con la
D,L-5-monosustituida hidantoína de
Leucina 15 mM. Terminada la reacción se calculó la Actividad
Específica del sistema de producción y los datos se incluyen en la
figura 6. El rendimiento de producción demuestra la capacidad de
las enzimas codificadas en pSER42 y de las células que las
producen para sintetizar D-Leucina pura. Igualmente
el sistema puede ser escalado hasta adaptarlo a las necesidades
industriales específicas.
Claims (9)
1. Sistema de coexpresión enzimática
caracterizado por una molécula plasmídica portadora que
comprende al menos tres secuencias nucleotídicas, controladas por
el promotor Lac y la transcripción y la traducción por células de
E. Coli.
2. Sistema de coexpresión enzimática según
reivindicación 1 donde las secuencias nucleotídicas están
codificadas por la enzima D-hidantoinasa de
Agrobacterium tumefaciens BQL9,
D-carbamilasa de Agobacterium tumefaciens
BQL9 y la enzima hidantoín racemasa de Agrobacterium tumefaciens
C58.
3. Sistema de coexpresión enzimática según
reivindicación 1 y 2 denominado pSER42, caracterizado por
estar compuesto por un plásmido de transformación y expresión en
E. coli, que contiene entre la zona promotora del operon Lac
y la zona terminadora, en primer lugar el gen
D-carbamilasa, seguido por el gen hidantoín racemasa
y por ultimo por el gen hidantoinasa. Cada gen comienza con un
inicio de la traducción (ATG) y finaliza con un triplete de parada
de la traducción (TAA). Corriente arriba de cada gen existe un
sitio de unión a ribosomas, que dista 10 nucleótidos del ATG de
inicio de la traducción. Los tres genes se transcriben como un ARN
mensajero policistrónico.
4. Procedimiento para la preparación del
sistema de coexpresión enzimática según reivindicación
1-3 por sobre-expresión genética en
microorganismos transformados con los genes de hidantoína racemasa,
D-hidantoinasa y D-carbamilasa,
caracterizado porque comprende las etapas de construcción de
una factoría celular de E. coli portadora de
D-hidantoinasa y D-carbamilasa de
Agrobacterium tumefaciens BQL9 e hidantoín racemasa de
Agrobacterium tumefaciens C58; clonación de los mismos en el
plásmido pSER42; expresión de estos genes conjuntamente para
constituir un sistema enzimático capaz de transformar todas las
moléculas de una mezcla racémica de hidantoinas
D,L-5-monosustituidas en su
correspondiente D-aminoácido.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque comprende las etapas de
sobre-expresión en células de microorganismos que
son obtenidos por transformación con plásmidos portadores de los
genes de dichas enzimas y cultivo de las mismas en un medio
derivado del medio LB (Luria-Bertani), con
suplemento de MnCl2 para mejorar la actividad de la
D-hidantoinasa.
6. Un procedimiento según las reivindicaciones 4
y 5, caracterizado porque los microorganismos hospedadores
utilizados son Escherichia coli transformados con el
plásmido pSER42.
7. Un procedimiento para la preparación de
D-aminoácidos por conversión estereoselectiva y
completa de una mezcla racémica de hidantoína
D,L-5-monosustituida, en donde la
reacción es catalizada por medio del sistema enzimático según las
reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque comprende
incubar proporciones definidas de dicho sistema enzimático y de una
mezcla racémica acuosa de una hidantoína
D,L-5-monosustituida; y recuperar
el D-aminoácido correspondiente por métodos
estándar y viables industrialmente. La hidantoín racemasa
componente de dicho sistema enzimático es capaz de catalizar la
conversión entre los enantiómeros ópticamente activos de las
hidantoinas D,L-5-monosustituidas,
donde el grupo sustituyente tiene entre uno y nueve átomos de
carbono y puede contener grupos sulfidrilo, amínicos, carboxilicos,
imidazol, aromáticos sustituidos o no y amídicos. Dichas
hidantoinas D,L-5-monosubstituidas
están caracterizadas porque no tienen que presentar
racemización espontánea. Aunque el hecho de que la presenten no
restringe su aplicación en esta invención.
8. Un procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la reacción de conversión se lleva a
cabo usando una relación en peso de biomasa húmeda de mezcla
enzimática/hidantoinas
D,L-5-monosustituidas comprendida
entre 1:10 y 1:50, a un intervalo preferente de temperatura de 50 á
60ºC y a un intervalo preferente de pH de 8.8 á 9.7.
9. Uso del sistema de coexpresión enzimática
según reivindicación de 1-8 para la preparación
selectiva y exclusiva de D-aminoácidos o derivados
de los mismos.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602619A ES2322418B1 (es) | 2006-10-02 | 2006-10-02 | Sistema de coexpresion enzimatica para la produccion de d-aminoacidos. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200602619A ES2322418B1 (es) | 2006-10-02 | 2006-10-02 | Sistema de coexpresion enzimatica para la produccion de d-aminoacidos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2322418A1 ES2322418A1 (es) | 2009-06-19 |
| ES2322418B1 true ES2322418B1 (es) | 2010-03-22 |
Family
ID=40739915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200602619A Active ES2322418B1 (es) | 2006-10-02 | 2006-10-02 | Sistema de coexpresion enzimatica para la produccion de d-aminoacidos. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2322418B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6713288B1 (en) * | 1999-09-28 | 2004-03-30 | University Of Stuttgart | Whole cell catalysts |
| FR2838554B1 (fr) * | 2002-04-15 | 2004-07-09 | St Microelectronics Sa | Dispositif semiconducteur de memoire, non volatile, programmable et effacable electriquement, a une seule couche de materiau de grille, et plan memoire correspondant |
-
2006
- 2006-10-02 ES ES200602619A patent/ES2322418B1/es active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GRIFANTINI, R. et al. Efficient conversion of 5-substituted hidantoins to D-alpha-aminoacids using recombinant Escherichia coli strains. 01.04.1998. Microbiology, Vol 144. Núm. 4, páginas 947-954. Todo el documento. * |
| HILS, M. et al. Cloning and characterization of genes from Agrobacterium sp. IP I-671 involved in hydantoin degradation. Applied Microbiology and Biotechnology. Diciembre 2001. Vol. 57, Núm. 5-6, páginas 680-688. Todo el documento. * |
| MARTINEZ-RODRIGUEZ, FJ. et al. Complete conversion of D,L-5- monosubstituted hydantoins with a low velocity of chemical racemization into D-amino acids using whole cells of recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Prog. Octubre 2002, Vol. 128, Núm. 6, páginas 1201-106, ISSN 8756-7938. Todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2322418A1 (es) | 2009-06-19 |
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