ES2277027T3 - Polinucleotido que codifica para una nitrilasa, y polipeptido expresado mediante el citado polinucleotido. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que codifica para una nitrilasa, que comprende el gen nitrilasa denominado Nit B, contenido en el plásmido pRPA-BCAT3, depositado en el CBS, con el número CBS 998 - 96.

Description

Polinucleótido que codifica para una nitrilasa, y polipéptido expresado mediante el citado polinucleótido.

La presente invención, se refiere a un polinucleótido que codifica para una nitrilasa, un polipéptido y un material que tiene una actividad nitrilasa.

La presente invención, se inscribe en un nuevo procedimiento para preparar ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)-butanóico (HMTBA) y / o su sal de amonio (HMTBS).

El ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico y sus sales, se han venido utilizando durante un largo período de tiempo, en la alimentación de animales, como reemplazante para la metionina, en donde, éstos, tienen la ventaja, con respecto a la última, de que éstos existen como un líquido, el cual facilita su uso por parte de empresas productoras de alimentos.

La forma de preparar químicamente el ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, ha venido siendo conocida desde un largo período de tiempo. A dicho efecto, deben mencionarse las patentes europeas EP 142 488 y EP 143 000, patentes éstas, las cuales describen la hidrólisis del 2-hidroxi-4-(metiltio)-hidroxibutironitrilo (HMTBN), mediante un procedimiento en dos etapas. La primera etapa, consiste en poner en contacto el 2-hidroxi-4(metiltio)hidroxibutiro-nitrilo, con un ácido mineral fuerte, tal como el ácido clorhídrico o el ácido sulfúrico. En una etapa subsiguiente, después de la dilución con agua, se completa la hidrólisis, a una alta temperatura. Se procede, a continuación, a extraer el ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, con un ácido orgánico no muy miscible con agua, tal como una cetona, de una forma preferible, una metilisobutilcetona y, a continuación, el disolvente, se elimina por evaporación. Este tipo de procedimiento, utilizado de una forma industrial, comporta, no obstante, algunos inconvenientes. Así, este produce una cantidad molar de sulfato amónico, que es por lo menos igual a la cantidad molar del nitrilo introducido, cuyo sulfato, debe ser eliminado, generando, con ello, residuos industriales que van en contra de las políticas medioambientales. Este procedi-
miento, necesita también el uso de cantidades significantes de disolvente, el cual es absolutamente necesario reciclar.

Otros procedimientos, tales como los que se describen en las patentes estadounidenses US 3.773.927 y US
4.353.924, consisten en hidrolizar el 2-hidroxi-4-metiltio)-hidroxibutironitrilo con ácido clorhídrico y, a continuación, concentrar el medio, con separación del cloruro amónico formado. La sal obtenida, es tan difícil de eliminar, como la sal previa y, además, el ácido obtenido, tiene una fuerte coloración.

Un procedimiento para la hidrólisis química del metiltiohidroxipropionitrilo, se describe, adicionalmente, en la patente europea EP 330 521, la cual, de la misma forma que antes, consiste en realizar la hidrólisis, en un medio sulfúrico. La mezcla, se neutraliza parcialmente con amoníaco. Aparece, entonces, una separación bifásica. La fase orgánica, contiene la mayoría de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico y, la fase acuosa, contiene la mayoría de la sal de amonio producida. Se procede, a continuación, a filtrar la fase orgánica, después de la evaporación del agua contenida, con objeto de recuperar el sulfato amónico disuelto. A continuación, se procede a diluir el ácido 2-hidroxi-4-metiltio-butírico, con una reducida cantidad de agua, y éste se estabiliza con una pequeña cantidad de ácido sulfúrico. Con la solución amónica, después de haber eliminado el agua, puede obtenerse directamente sulfato amónico, apto para su comercialización. Este procedimiento, resuelve parcialmente los inconvenientes de los procedimientos correspondientes al arte anterior de la técnica, en cuanto a lo referente al uso de disolventes orgánicos, pero éste no resuelve, en ningún caso, los problemas relacionados con los rechazos de las sales minerales.

Entre las patentes pertenecientes a las sales del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, pueden mencionarse las patentes estadounidenses US 2.745.745, US 2.938.053 y US 3.175.00, las cuales se refieren a sales de calcio y / o de amonio. La mezcla obtenida mediante la hidrólisis de 2-hidroxi-4-metil-tiobutironitrilo, se trata con hidróxido o carbonato cálcico. Entonces, el sulfato cálcico, precipita, liberando amoníaco, el cual forma la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico. Aquí, otra vez, subsiste el problema consistente en la eliminación del sulfato cálcico.

En la publicación de solicitud de patente internacional WO 96 / 01 808, se describe adicionalmente un procedimiento el cual consiste en realizar una hidrólisis y una extracción, mediante un disolvente orgánico, de la misma forma que en el primer documento de la arte anterior de la técnica citado y, a continuación, la neutralización de la solución orgánica, mediante amoníaco. Este procedimiento, de la misma forma que la mayoría de los procedimientos descritos anteriormente, tiene como resultado la formación de por lo menos un mol de sulfato o de cloruro amónico, por mol introducido de nitrilo, y requiere el reciclado de cantidades significativas de disolvente orgánico. Con ello, no es posible obtener una solución de una sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltio-butírico, a un coste industrialmente atractivo.

El documento de patente internacional WO 96 / 09 403, se describe adicionalmente el uso de una nitrilasa, como catalizador para hidrolizar un grupo nitrilo en un ácido carboxílico. No obstante, el procedimiento descrito en este documento, no puede utilizarse a escala industrial, debido a la insuficiente actividad del microorganismo, el cual sintetiza estas nitrilasas.

Se ha descubierto ahora, mediante el procedimiento descrito posteriormente, a continuación, el cual aplica varias etapas específicas, el hecho de que era posible el obtener ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutanóico y / o su sal de amonio, de una forma enzimática, y a una escala industrial, con un alto rendimiento productivo, sin necesidad de utilizar disolventes, y sin una producción concomitante de sales minerales.

Este procedimiento para la preparación del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y / o la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, mediante la hidrólisis enzimática del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, consiste en el hecho de que:

a) en una primera etapa, se prepara un material biológico, con una actividad nitrilasa,

b) en una segunda etapa, éste se inmoviliza,

c) en una tercera etapa, el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, se pone en presencia del material biológico de esta forma inmovilizado, con objeto de obtener la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico,

d) en una cuarta etapa, la sal obtenida en la etapa c) se convierte opcionalmente en el correspondiente ácido, y

e) en una quinta etapa, se concentra el producto obtenido en la etapa c) ó en la etapa d).

Con objeto de obtener el material biológico con la actividad nitrilasa, requerida para aplicar el procedimiento anteriormente definido, arriba, la presente invención, propone, de una forma notable, un polinucleótido que codifica para una nitrilasa, que comprende el gen nitrilasa denominado Nit B, contenido en el plásmido pRPA-BCAT3, depositado en el CBS, con el número CBS 998-96, y un polipéptido con una actividad nitrilasa, el cual comprende una secuencia de nitrilasa, capaz de poderse obtener mediante la expresión del gen nitrilasa, denominado Nit B, clonado en el plásmido pRPA-BCAT3, depositado en el CBS, con el número 998-96.

La invención, se expondrá ahora, de una forma detallada, en la descripción que se facilita a continuación, para la cual, se hará referencia a las figuras anexadas, en la cuales.

- La figura 1, ilustra un diagrama de una célula de electrodiálisis, utilizada en la etapa opcional d).

- La figura 1A, ilustra una célula de electrodiálisis, con una membrana bipolar con tres compartimientos.

- La figura 1B, ilustra una célula de electrodiálisis, con una membrana bipolar con dos compartimientos.

- La figura 2, ilustra un diagrama de una instalación para aplicar el procedimiento en concordancia con la invención.

- La figura 3, ilustra el mapa de restricción de plásmidos pROA-BCAT1-5.

- La figura 4, ilustra la estrategia para las secuenciación del fragmento de 1.130 pb, que contiene la secuencia de DNA (designada mediante nit B, en la figura) que codifica para el polipéptido con una actividad nitrilasa en concordancia con la invención. Los números, se refieren a la identidad de los cebadores utilizados para la secuenciación, así como también las notaciones M13FWD y M13REV.

- La figura 5, ilustra el mapa de restricción de los plásmidos pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT-13.

- La figura 6, ilustra la electroforesis sobre gel SDS-PAGE al 10%, mostrando la expresión de secuencias de DNA en concordancia con la invención, en las cepas: E. coli BL21 (DE3) / pRPA - BCAT-12, BL21(DE3) / pRPA-BCAT-13, BL21(DE3) / pRPA-BCAT-12 + pXL2231, BL21(DE3) / pRPA-BACT-13 + pXL2231. Cada pista, corresponde a una cantidad de 10 \mug de proteínas solubles, y un volumen equivalente de fracción bruta e insoluble.

- La figura 7, ilustra la electroforesis sobre gel SDS-PAGE al 10%, mostrando la expresión de la secuencias de DNA de referencia en concordancia con la invención, en las cepas E. coli DH5\alpha / pRPA-BCAT3, DH5\alpha / pRPA-BCAT6, DH5\alpha / pRPA-BCAT6 + pXL2035, RPA-BIOCAT76. Cada pista, corresponde a una cantidad de 10 \mug de proteínas solubles, y un volumen equivalente de fracción bruta e insoluble.

- La figura 8, ilustra el mapa de restricción del plásmido pRPA-BACT14.

- La figura 9, ilustra la electroforesis sobre gel SDS-PAGE al 10%, mostrando la expresión de secuencias de DNA en concordancia con la invención, en las cepas P. putida G2081 (pRPA - BCAT-14), G2081 (pRPA-BCAT-23), G2081 (pRPA-BCAT-24), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT-14), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT-23), A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BACT-24).

Cada pista, corresponde a una cantidad de 10 \mug de proteínas solubles, y un volumen equivalente de fracción bruta y posiblemente insoluble.

- La figura 10, ilustra el mapa de restricción del plásmido pCGL1087.

- La figura 11, ilustra el mapa de restricción del plásmido pOS48.7.

La primera etapa, consiste en la preparación de material biológico con una actividad nitrilasa.

El material biológico, puede consistir en una solución enzimática, tal cual, o en células enteras o rotas, que tengan una actividad nitrilasa.

De una forma ventajosa, se utiliza un microorganismo que exprese nitrilasa.

La nitrilasa, puede proceder, notablemente, de un microorganismo, de una forma particular, de un microorganismo del género Alcaligenes, Rhodococcus ó Gordona, notablemente, Alcaligenes faecalis, Rhodoccus sp. HT 29-7, Gordona terrae, de una forma preferible, las cepas descritas en la publicación de patente internacional WO 96 / 09 403.

Se utiliza, de una forma ventajosa, un microorganismo que exprese actividad nitrilasa, tal y como se obtiene mediante la transferencia de información genética que codifique para la nitrilasa, de un microorganismo madre, en un microorganismo huésped. De una forma particular, en el E. coli, se puede utilizar una co-expresión de proteínas de caperuza (de acompañamiento) Gro ESL, para mejorar las prestaciones de la cepa recombinante.

Para este propósito, se utiliza cualquier vector de expresión apropiado, de una forma notable, un vector plásmido.

La secuencia de nucléotido utilizada en este caso, se emplazará, entonces, bajo el control de señales, que permitan el expresarla en un huésped celular. El huésped celular utilizado, puede seleccionarse de entre sistemas procarióticos, tales como bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, o eucariotas, tales como, por ejemplo, levaduras, hongos, o cualquier otra sistema. Las señales que controlan la expresión de polipéptidos, se seleccionan en concordancia del huésped celular utilizado. Para este propósito, el DNA que codifica para una nitrilasa, puede insertarse en vectores auto-replicantes, en el huésped seleccionado, o vectores integrantes del huésped seleccionado. Tales tipos de vectores, se preparan mediante procedimientos usualmente utilizados por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica y, las construcciones resultantes, pueden introducirse en un huésped apropiado, mediante procedimientos standard, tales como una electroporación.

Como microorganismo huésped, se pueden citar, de una forma particular, los Alcaligenes faecalis, Pseudonomas putida, Escherichia coli, o microorganismos del género Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium y Aspergillus.

Como vector de expresión preferido en E. coli, es el plásmido pRPA-BACT6.

La segunda etapa del procedimiento, consiste en inmovilizar el material biológico. Esta inmovilización, se realiza, de una forma ventajosa, en presencia de un soporte sólido, y mediante el cual, se pueden obtener partículas sólidas, cuya talla, forma y resistencia mecánica, pueden ser controladas. Ésta permite, también, la utilización simultánea de polímero de poliazetidina y de otros agentes reticulantes.

Este procedimiento de inmovilización, puede involucrar a células enteras o permeabilizadas. Éste puede también aplicarse a una solución enzimática, exenta de células.

Las enzimas utilizadas para la permeabilización, son las nitrilasas.

El procedimiento de inmovilización, consiste en inmovilizar el material biológico activo, en un soporte sólido, con un tamaño de grano, notablemente comprendido dentro de unos márgenes situados entre 1 \mum y 3 mm, de una forma preferible, entre 10 \mum 3 mm, por mediación de agentes químicos que reaccionan con las funciones amina (NH_{2}, NH), carboxilo (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) o amida (CONH_{2}) del agente biológico y del soporte. Con estos agentes químicos, el material biológico y el soporte, puede también insolubilizarse en agua. La masa obtenida, es muy flexible, y a ésta, se le puede también dar forma, con objeto de obtener partículas con la deseada forma y el deseado tamaño. La cohesión y el tamaño de estas partículas, se obtienen, también, mediante secado.

El material biológico a ser inmovilizado, pueden también contener, posiblemente o eventualmente, un material biológico inactivo, en una cantidad correspondiente a unos porcentajes situados entre un 0 y un 200, en peso. EL material biológico inactivo, pueden ser proteínas (albúmina, gelatina) o polisacáridos (citosan, k-carragheenan, alginato).

El soporte inerte, sobre el cual se deposita el material biológico, y el polímero, pueden consistir en partículas orgánicas o inorgánicas, porosas o no porosas, hidrofílicas o hidrofóbicas. Entre estas partículas, se pueden citar, de una forma no limitativa:

- resinas intercambiadoras de iones,

- alúmina,

- sílices sintéticas o diátomos y geles de sílice,

- zeolitas,

- carbones

- proteínas insolubles en agua, tales como el gluten,

- polisacáridos, tales como el almidón.

El soporte inerte, puede añadirse en una cantidad correspondiente a un porcentaje que va de un 0,01 a un 500%, en peso, del material biológico y, de una forma preferible, del 10 al 200%.

Los agentes químicos utilizados para la insolubilización del material biológico, pueden ser polímeros o moléculas bifuncionalizadas, las cuales reaccionan con las funciones amina (NH_{2}, NH), carboxílica (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) ó amida (CONH_{2}). Se pueden mencionar:

- los polímeros de poliazetadina,

- los polímeros de polietilenimina,

- los polímeros de poliamina,

- los polímeros de isocianato,

- los geles de alginato,

- los geles de carragheenan,

- las aminas, tales como la hexametilendiamina,

- los aldehídos, tales como el gluturaldehído,

- los ácidos carboxílicos, tales como el ácido adípico, y

- los isocianatos.

El procedimiento de inmovilización, puede involucrar uno o más de estos agentes químicos. El agente químico, se añade en concordancia con una concentración correspondiente a un porcentaje situado entre un 1 y un 50%, en peso, de una forma relativa al material biológico y al soporte. Una cantidad correspondiente a un porcentaje situado entre un 5 y un 30%, será la preferida, con objeto de obtener partículas suficientemente sólidas, y retener una actividad significante, y que no tenga demasiados problemas de difusión interna.

El período de tratamiento de reticulación, es de 0,5 a 24 horas.

La temperatura del procedimiento, se encuentra comprendida, de una forma general, dentro de unos márgenes situados entre 4 y 65°C. Una temperatura situada entre 20 y 40°C, es la que se preferirá. La temperatura utilizada durante el procedimiento de inmovilización, será también dependiente de la estabilidad del material biológico utilizado.

El pH, durante la fase de inmovilización, se mantendrá dentro de unos valores de 5 y 11. Un pH entre unos valores de 6 y 10, es el que se prefiere, con una preferencia para los pHs alcalinos. El pH, se selecciona, también, en concordancia con la resistencia al material biológico, y se determinará fácilmente, por parte de una persona experta en el arte especializado de la técnica.

La forma del biocatalizador, debe permitir el que éste se pueda utilizar en cualquier sistema, notablemente, en lecho fijo.

Un procedimiento de formulación, puede ser el de extrusión. Para realizar este cometido, el material biológico y el soporte, se reticulan mediante la adición de uno o más agentes químicos. Después del tratamiento, la masa insoluble, se recupera mediante centrifugación, o después de floculación y filtración. Se prefiere un contenido de materia seca, de por lo menos un 10%. Se procede, a continuación, a extrusionar la masa. Con este procedimiento, se obtienen perfiles en forma de "macarrones" o "fideos", de una forma preferible, con un diámetro comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,3 y 0,5 mm, y una longitud comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 y 10 mm. A estos "fideos", se les puede dar forma de esferas. Se procede, a continuación, a secar las partículas obtenidas.

Otro procedimiento de formulación, puede ser el de recubrimiento mediante proyección pulverizada ("spray coating"). Parea realizar este cometido, el material biológico, se mezcla con uno o más agentes químicos. Después de la reacción, la mezcla, se proyecta por pulverización (spray), sobre el soporte, como una capa fina. Con este procedimiento, se obtienen gránulos, con un diámetro medio de partícula comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,1 y 2 mm.

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La partículas obtenidas, pueden entonces eventualmente sumergirse en una solución de un agente reductor, tal como el hidroboruro sódico, con objeto de reducir las funciones imina formadas, durante la reticulación.

Las partículas obtenidas, son lo suficientemente sólidas y resistentes al desgaste por fricción, como para poder ser utilizadas en un lecho fijo, un lecho fluidificado, o un reactor agitado.

La tercera etapa del procedimiento en concordancia con la presente invención, consiste en aplicar el material biológico inmovilizado en uno o más columnas de reactores. El propósito de esta etapa, es la de posibilitar la producción en continuo de la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, a partir del 2-hidroxi-4-metiltio-butironitrilo.

La(s) columna(s) o reactor(es), se alimenta(n) mediante una solución pura o diluida de 2-hidroxi-4-metil-tiobutironitrilo, o una mezcla que contenga 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, y la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico.

La(s) columna(s) o reactor(es), se aplica(n), de una forma preferible, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 y 60°C, y a un pH situado entre unos valores de 5 y 9.

El sistema aplicado, puede consistir en dos o más columnas conectadas las unas con las otras, en serie, con, según una primera forma de presentación de la invención, el suministro de la solución acuosa de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo localizado en la cabeza de la primera columna, con un suministro simultáneo para las otras columnas de la solución de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, en una cantidad limitada a la solubilidad de este compuesto, en la mezcla de reacción; este sistema, se denomina un sistema por etapas o zonas. En concordancia con una segunda forma de presentación de la invención, se utilizan una o más columnas conectadas la una con la otra, en paralelo, en un bucle de circulación. En concordancia con esta instalación, se procede a introducir de una forma continua, el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, en una solución acuosa, al interior del bucle y, el medio de circulación, se bombea de forma continua, de tal forma que, el volumen, en el bucle, se mantenga constante; este sistema, se denomina sistema de bucle.

El tipo de reactor utilizado en esta invención, puede ser de lecho fijo, del tipo de lecho fluidificado, o del tipo agitado de forma continua. Los reactores del tipo de lecho fijo, son los que se utilizan de una forma preferible, debido al hecho de que, éstos, reducen los problemas de desgaste por fricción que puedan experimentarse con las partículas de las células inmovilizadas. Si el microorganismo se utiliza tal cual, se utilizará entonces, de una forma preferible, un reactor agitado, acoplado con un módulo de ultrafiltración, para separar de una forma continua el microorganismo, del producto de interés.

La cuarta etapa, la cual es una etapa opcional, consiste en convertir la sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltio-butírico, en el correspondiente ácido. Esta etapa, puede realizarse en concordancia con dos procedimientos:

- bien ya se mediante electroforesis, por mediación de un electrodializador, con dos o tres compartimientos,

- o bien ya sea mediante el calentamiento de la solución acuosa, a lo cual puede seguir una extracción líquido - líquido.

Según el procedimiento de electrodiálisis, se utilizará un electrodializador con dos o tres compartimientos.

Por "compartimiento", se pretende dar a entender el espacio comprendido, o bien ya sea entre dos membranas, o bien ya sea entre una membrana bipolar y homopolar, o bien ya sea entre membranas homopolares adyacentes. Por "célula", se pretende dar a entender un juego de dos o tres compartimientos. Una apilamiento o montón, comprende de 5 a 300 células. El electrodializador, consiste en un apilamiento y, por supuesto, incluye un ánodo y un cátodo.

Las membranas homopolares que pueden ser utilizadas en el ámbito de la presente invención, se dividen en dos amplias familias, según su procedimiento de fabricación.

Así, de este modo, pueden utilizarse las membranas heterogéneas preparadas a partir de resinas intercambiadoras de iones, mezcladas con un ligante, tal como el poli(cloruro de vinilo), polietileno u otro ligante. El juego con ello formado, puede recubrir una trama o red, tal como, por ejemplo, un tejido de poliéster o de poliacrilonitrilo.

Las membranas homogéneas obtenidas mediante la introducción de un grupo funcional sobre un soporte inerte, mediante injerto químico o radioquímico, pueden también ser utilizadas. El procedimiento químico mayormente utilizado, consiste en funcionalizar látex, a partir de un polímero que incluya ciclos aromáticos, tales como, por ejemplo, los copolímeros de estireno - divinilbenceno o de estireno-butadieno. El látex de esta forma funcionalizado, puede entonces utilizarse para recubrir una trama o red, como para las membranas heterogéneas. El procedimiento radioquímico, incluye generalmente el injertar, bajo la influencia de una radiación, un compuesto aromático, tal como estireno, sobre un soporte inerte, tal como una película de polietileno o de politetrafluoroetileno. El ciclo aromático, se funcionaliza, a continuación, como en el procedimiento químico.

Las membranas intercambiadoras de iones, incluyen a los grupos de ácidos fuertes, lo más a menudo, grupos sulfonato, o grupos de ácidos débiles, a menudo, grupos carboxilato. Más raramente, los grupos de ácidos, pueden ser grupos PO_{3}^{2-}, HPO_{3}^{2-}, ASO_{3}^{2-}, SeO_{3}^{2-}.

Las membranas intercambiadoras de iones, incluyen a los grupos básicos fuertes, lo más a menudo, grupos de amonio cuaternario, o grupos básicos débiles, lo mas a menudo, grupos amina. Más raramente, los grupos básicos, pueden ser grupos de fosfonio cuaternario, o grupos de sulfonio.

En el presente procedimiento, las membranas catiónicas, incluyen, de una forma preferible, grupos de ácidos fuertes, y entre éstos últimos, de una forma preferencial, los grupos sulfonato y, las membranas aniónicas, incluyen, de una forma preferible, grupos básicos fuertes y, entre éstos últimos, grupos de amonio cuaternario.

Las membranas bipolares, son un ensamblaje de dos membranas, una catiónica, y otra aniónica. Cuando la membrana se somete a una campo eléctrico suficiente, el agua de sulfatación, en la interfase de la membrana, se disocia en iones de H^{+} y OH^{-}, los cuales migran, respectivamente, al cátodo, atravesando la fase (faz) catiónica, y al ánodo, atravesando la fase aniónica. Como membranas bipolares, pueden mencionarse, como ejemplos, las membranas comercializadas en el mercado, por parte de la firma Aqualitics, por parte de la firma Tokuyama Soda ó por parte de la firma FuMaTech.

El ánodo del electrodializador, puede consistir en materiales del tipo convencionalmente utilizados en electrodiálisis por ejemplo, grafito, níquel ó titanio, recubiertos con metales preciosos u óxidos de metales preciosos, notablemente, titanio platinado.

El electrodializador, se alimenta con la solución acuosa a ser tratada. Es también necesario el hacer circular una solución de un anolito, en el ánodo, y una solución de un catolito, en el cátodo. Puede utilizarse una solución individual de electrolito. En el presente procedimiento, es apropiado un circuito individual de electrolito. El rol interpretativo de la solución de electrolito, es la de proporcionar una conductividad suficiente. De una forma preferible, esta conductividad, será igual o mayor a 20 milisiemens por centímetro (mS/cm), sin que este límite inferior, deba ser considerado como crítico para la aplicación de este procedimiento.

El electrolito aplicado, es un compuesto ionizable, tal como una sal, un ácido o una base. El electrolito, se selecciona, de una forma preferible, de entre compuestos no electroactivos. Así, por ejemplo, es preferible el utilizar sales neutras, tales como los sulfatos, ácidos, tales como el ácido sulfúrico, y bases, tales como la sosa.

Las densidades de corriente aplicadas son, de una forma general, las correspondientes a un valor situado entre 0,2 y 1,5 kA/m^{2} y, de una forma preferible, situadas entre 0,4 y 1 kA/m^{2}.

La temperatura a la cual se aplica el procedimiento de la invención, es la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes compatibles con la estabilidad de las membranas. Se preferirá, normalmente, operar a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes situados entre 30 y 60°C.

El electrodializador, puede funcionar de diferentes formas. En primer lugar, éste puede funcionar de una forma continua, pasando, la solución a ser tratada, de una forma continua, a través del apilamiento o montón; se procede entonces a posicionar varias zonas o etapas en serie, en el caso en el que, la tasa de tratamiento a realizar, así lo requiera. Éste puede también funcionar en forma de lotes, es decir, de forma discontinua, recirculando entonces, la solución a ser tratada, en un tanque, hasta que se obtenga la deseada tasa de tratamiento. Finalmente, éste puede funcionar pasando directamente, con una recirculación parcial.

En concordancia con una primera alternativa, puede acontecer una disociación de la sal de amonio, convirtiéndose en ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, y en amoníaco, en una célula de electrodiálisis con membranas bipolares de tres compartimientos, tal y como se ilustra en la figura 1A, de una forma esquemática.

Un aparato de electrodiálisis apropiado para la aplicación del procedimiento, consiste en diferentes compartimientos, delimitados mediante membranas catiónicas (MC), membranas bipolares (MB) y membranas aniónicas (MA), respectivamente. Estos compartimientos, se dividen en un compartimiento de sal (S) que se empobrecen en compuestos a separar, en un compartimiento de base (B) y un compartimiento de ácido (A), en donde, el ácido y la base, regenerados a partir de la sal, se concentran, respectivamente.

La sal de amonio, se introduce en el compartimiento de sal. Bajo la acción del campo eléctrico, el ión amonio, migra hacia el cátodo, dejando el compartimiento (S), en donde éste se encuentra, a través de una membrana intercambiadora de cationes (membrana catiónica), y se combina con los iones OH^{-}, procedentes de la cara o fase catiónica de la membrana bipolar, dentro de la cual acontece la disociación de agua, bajo el efecto del campo eléctrico.

De una forma simultánea, los iones de carboxilato (2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato), migran hacia el ánodo, dejando el compartimiento (S) en donde éstos se encuentran, a través de una membrana intercambiadora de aniones (membrana aniónica). Después de pasar al interior del siguiente compartimiento (A), éstos se protonizan, mediante la adición de iones de H^{+}, procedentes de la cara catiónica de la membrana bipolar. Los tres compartimientos adyacentes (B), (A), (S), forman una célula de electrodiálisis.

En una segunda alternativa, puede acontecer una regeneración de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, en una célula de electrodiálisis, con membranas bipolares de dos compartimientos, tal y como se ilustra en la figura 1B. Estos compartimientos, se encuentran delimitados por membranas catiónicas y membranas bipolares, respectivamente. Estos compartimientos, se encuentran divididos en compartimientos de sal / ácido (S/A) y de base (B).

La sal de amonio, se introduce en el compartimiento de sal / ácido. Bajo la acción del campo eléctrico, el ión amonio, migra hacia el cátodo, saliendo del compartimiento (S/A), en donde éste se encuentra, a través de una membrana intercambiadora de cationes (membrana catiónica), y se combina con los iones OH^{-}, procedentes de la cara aniónica de la membrana bipolar, dentro de la cual, acontece la disociación del agua, bajo el efecto del campo eléctrico.

De una forma simultánea, el compartimiento S/A, se convierte en ácido, mediante la adición de iones H^{+}, procedentes de la cara catiónica de la membrana bipolar. Ambos, los compartimientos adyacentes (B) y (S/A), forman una célula de electrodiálisis.

Esta configuración, tiene la ventaja de un menor consumo, y permite el poder variar el deseado valor de relación sal / ácido.

Con objeto de poder obtener un apropiado funcionamiento del electrodializador, la conductividad eléctrica del compartimiento de base (así como también la del compartimiento de ácido, en el caso de la configuración de tres compartimientos), debe ser suficiente y puede ajustarse mediante la adición de un electrolito de soporte. Así, de este modo, la conductividad de la solución de amonio, puede incrementarse, mediante la adición de una sal de amonio, tal como sulfato amónico.

En una alternativa preferida, se procede a introducir una mezcla de una sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico y de 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, en el compartimiento de sal de una célula de electrodiálisis con tres compartimientos. La sal, se disociará de la misma forma que la anteriormente descrita, en un ión 2-hidroxi-4-metiltio-butirato, y migrará hacia el ánodo, en donde, éste, se transformará en ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico, el ión amonio migrará hacia el cátodo, en donde, éste se transformará en amoníaco; en el compartimiento de sal, permanecerán el agua y el 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo no convertido, el cual se reciclará a la columna de hidrólisis.

En concordancia con el procedimiento de calentamiento, el ácido, se recupera procediendo a desplazar el equilibrio sal de amonio / ácido libre, mediante al calentamiento de la solución acuosa rica en HMTBS, y retirando el amoníaco de esta forma liberado. Esto puede lograrse procediendo a calentar, bajo la acción del vacío, a la presión atmosférica, mediante tratamiento de agotamiento, o sin él. Puede considerarse el uso de CO_{2}, con objeto de facilitar el desplazamiento del equilibrio. Se obtiene una mezcla de HMTBS y de HMTBA, con un porcentaje del 5 al 99,9% de HMTBA y, de una forma preferible, del 10 al 50% de HMTBA, en base a la suma de HMTBA y HMTBS. Las viscosidades de estas soluciones, son las correspondientes a un valor comprendido entre 1.200 y 30 mm^{2}\cdots^{-1} (1.200 y 30 cSt -[centistokes] -) y, de una forma preferible, entre 200 y 50 mm^{2}\cdots^{-1} (200 y 30 cSt), a una temperatura de 25°C.

Las soluciones acuosas, pueden descomponerse mediante la extracción del ácido, con la utilización de productos disolventes, los cuales son parcialmente miscibles con agua, o no miscibles con agua. Existe un amplio número de posibles disolventes, para la separación. Los disolventes preferidos, son las cetonas C5-C8, de una forma particular, la metilisobutilcetona; éteres, tales como el isopropiléter; alcoholes, tales como el isopropanol; ésteres; aminas terciarias, tales como la trioctilamina. Dentro del ámbito de la invención, los disolventes preferidos, son: acetona, MIBK, isopropanol, acetato de isopropanol, éter isobutílico o éter propílico, ó THF, trioctilamina. El valor de relación de la fase acuosa y la fase acrílica, no es crítico. No obstante, por razones del nivel de eficiencia, este valor de relación, no debería ser inferior a una relación de 1 / 1 y, por rezones de la eficacia de la rentabilidad o coste, no debería ser inferior a una relación de 1 / 3. Se prefiere una relación de 1 / 1,5 - 2,0.

Esta extracción, puede aplicarse en forma de lotes (de forma discontinua), o de forma continua, en cualquier tipo de tecnología de extracción del tipo líquido / líquido. Pueden mencionarse, por ejemplo, las cascadas de los mezcladores decantadores a co- o a contra-corriente, extractores centrífugos, columnas cargadas o de placas, etc.

La solución acuosa empobrecida en ácido libre, puede tratarse, otra vez, y ello, tantas veces como se desee, hasta el agotamiento completo de amoníaco, en caso deseado.

La fase orgánica, se somete a un tratamiento para aislar HMTBA. Esto se realiza, de una forma mediante la evaporación del disolvente, o mediante la extracción con agua caliente. Con objeto de evitar la posible deterioración de HMTBA, la tensión térmica, puede mantenerse tan pequeña como sea posible, mediante la aplicación de vacío.

En ambos de estos procedimientos para disociar sal de amonio, se genera una sal de amoníaco. Ésta última, puede ser tratada, con objeto de concentrar el amoníaco. Se preferirá la destilación y concentración del amoníaco, en una o varias zonas o etapas. Podrá contemplarse una etapa previa de agotamiento. La solución concentrada en amoníaco, puede enviarse de vuelta a la síntesis del ácido cianhídrico, la cual se encuentra involucrada en la síntesis del 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.

En la primera etapa, se procede a concentrar la solución acuosa de HMTBS y / o ácido libre. Esto se realiza, de una forma preferible, mediante la evaporación del agua.

En la figura 2, se ilustra, de una forma esquemática, una instalación para aplicar el procedimiento, y ésta comprende los conductos 1, 2, respectivamente, para introducir cianhidrina de AMTP y agua, en el interior del reactor 3. El reactor 3, es un lecho fijo con recirculación, el cual se carga con cepas o enzimas inmovilizadas. Se procede, a continuación, a recuperar una solución concentrada de HMBTS, en la salida del reactor 4, vía el conducto 5.

Esta solución concentrada de HMBTS, puede experimentar dos tratamientos totalmente independientes, en concordancia con el tipo de producto final deseado.

En el caso en el que se desee recuperar un producto que contenga una alta proporción de HMBTS, la solución del conducto 5, se lleva al interior de un evaporador 6, con el cual se procede a concentrar el producto, y se recupera una solución concentrada consistente principalmente en HMBTS, y que contiene una reducida cantidad de ácido libre, en el conducto 8. El agua en exceso, así como una fracción del amoníaco, se descargan a través del conducto 7.

En el caso en el que se desee recuperar un producto que contenga una alta proporción de ácido libre, la solución concentrada de HMBTS del conducto 5, se lleva al interior de un sistema de electrodiálisis bipolar 9. En este aparato, el amoníaco, se separa, más o menos, del ácido, mediante electrodiálisis. La mezcla empobrecida en amonio, se recupera en el conducto 11 y, a continuación, se concentra en el evaporador 12, con objeto de obtener una solución concentrada, consistente, principalmente, en ácido libre y que contiene poco o nada de HMTBS. La solución rica en amoníaco, se recupera mediante un agotamiento 15.

Este efluente de amoníaco, pueden concentrarse mediante destilación, 16 y, el agua, se recupera en 18. La solución concentrada de amoníaco 17, puede enviarse de vuelta a la síntesis de HCN.

Los ejemplos que se facilitan a continuación, ilustran la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación y secuenciación Nter de nitrilasa

Se cultivan células de Alcaligenes faecalis, durante un tiempo de 24 horas, a una temperatura de 30°C, en un medio mínimo, en presencia de benzonitrilo (0,5 g/l). Después de la centrifugación del cultivo, se recoge la torta de centrifugación, en un tampón TG (25 mM Tris-HCl, 10% (peso / volumen) glicerol, pH 7,5. La suspensión celular, se trata mediante ultrasonidos, y se centrifuga, con objeto de obtener el extracto bruto. Se procede, a continuación, a tratar el extracto bruto, con sulfato amónico, hasta un 30% de saturación. El precipitado obtenido, se resuspende en tampón TG y, a continuación, se dializa con 2 litros del mismo tampón, durante el transcurso de toda una noche. La solución obtenida, se deposita, a continuación, sobre una columna intercambiadora de iones del tipo Q Sepharose Fast Flow HR 26/10, equilibrada previamente con tampón TG. La actividad, se eluye, a continuación, con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. La fracciones activas, se depositan, a continuación, sobre una columna intercambiadora de iones del tipo Q HR 5/5, equilibrada previamente con tampón TG. La nitrilasa, se eluye con gradiente de NaCl de 0 a 1 M. Finalmente, se procede a colectar las fracciones que contienen actividad y, la concentración en sulfato de amonio, se lleva, entonces, a un valor 1 M. Esta solución, se deposita, a continuación, en columna de interacción hidrofóbica de Fenil Superosa HR 5/5, con tampón TG, al que se le ha adicionado previamente (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M. A continuación, la actividad, se eluye mediante un gradiente de sulfato amónico de 1 M a 0 M.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Resumen de la purificación de nitrilasa

1

Condiciones operativas: [nitrilo] = 50 mM; tampón fosfato 100 mM, pH 7,0; 30°C.

El peso molecular de la proteína, se determina mediante filtración en gel. Éste es de aproximadamente 260 kDa. Sobre gel SDS-PAGE, se observa una banda individual de 43 kDa (95% de pureza. Así, por lo tanto, se trata probablemente de una proteína de una estructura \alpha_{6}, pesando, \alpha, 43 kDa.

Ejemplo 2 Clonación de la nitrilasa de Alcaligenes faecalis ATCC8750

La secuencia NH_{2}-terminal mostrada en el ejemplo 1, tiene una identidad total con la secuencia del extremo N-terminal de la nitrilasa de A. faecalis JM3 (Kobayashi et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 247 - 251), mientras que, los extremos N-terminales de las nitrilasas bacterianas, tienen una identidad del 35 al 57%, sobre 14 residuos. Los inventores, han planteado la hipótesis de que, la nitrilasa de la invención, purificada a partir de la cepa ATCC8750, era similar a la descrita por parte de Kobayashi et al., (anteriormente citada). La estrategia de clonación, consistía, entonces, en la amplificación, por PCR, del gen de esta nitrilasa, sobre DNA genómico de la cepa ATCC8750, por mediación de dos sondas nucleotídicas, determinadas a partir de la secuencia dada por Kobayashi et al., (citada anteriormente).

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Se procedió a sintetizar las dos sondas: una de ellas, puede hibridar con la parte 5'de la secuencia dada por Kobayashi et al. (anteriormente citada) y, la otra, con la parte 3'.

	Parte 5'	(PCRAF1):	CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC
	Parte 3'	(PCRAF2):	TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT

El cebador PCRAF1, incluye 12 nucleótidos en 5', permitiendo la introducción de los sitios de restricción de las enzimas EcoRI y NdeI, corriente arriba del codón de iniciación ATG. El cebador PCRAF2, permite la introducción del sitio de restricción de la enzima BamHI. El DNA genómico de la cepa A. faecalis ATCC8750, se extrajo, en concordancia con el protocolo CTAB, descrito por parte de Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, - Protocolos actuales en biología molecular -, John Wiley & Sons Inc., ed., 2.4.1 - 2.4.5) y se utilizaron 100 ng, para cada reacción de PCR. Con objeto de actuar en la especificidad de amplificación, se procedió a someter a tests de ensayo, diferentes concentraciones de MgCl_{2}, tal como se indica en Ausubel et al., (anteriormente citado), en un volumen total de muestra de 100 \mul, y con 2,5 unidades de Taq DNA-polimerasa (Perking Elmer). Se llevaron a cabo dos reacciones de adición, con 1,5 mM MgCl_{2} y 5% DMSO ó 5% formamida. Se programó un termociclador Perkin Elmer 9600, con la siguiente secuencia: 5 minutos a una temperatura de 95°C, 30 ciclos (30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C, 45 segundos a 72°C, y 4 minutos a 72°C. Los diferentes productos de amplificación, se analizaron en gel de agarosa al 0,8%. Se procedió a amplificar, en todas las reacciones, una banda mayoritaria, cuyo tamaño correspondía a al tamaño esperado de 1,15 kb, pero, de una forma más específica, con 1,5 mM MgCl_{2} y 5% DMSO. Se procedió, por lo tanto, a retener los productos de la reacción, bajo estas condiciones, para la continuación. La muestra, se trató con proteinasa K, y se precipitó con etanol, después de una extracción con fenol-cloroformo. La torta obtenida, la cual se recogió como una suspensión, se incubó durante un transcurso de tiempo de 2 horas, a una temperatura de 37°C, con 40 unidades de enzima EcoRI y 40 unidades de enzima BAMHI. Después de la migración sobre gel de agarosa al 7%, la banda de 1,15 kb, se cortó, y se extrajo, con objeto de clonarla en el vector pBSK^{-} abierto EcoRI-BamHI (Stratagene, La Jolla, USA), mediante procedimientos convencionales. Se procedió a analizar cinco clones independientes, denominados pRPA-BCAT1-5, mediante la digestión enzimática del ADN plásmido, con las enzimas NdeI, EcoRI, BamHI, BspMI y Bg1II (figura 3). Los perfiles obtenidos, correspondían a los perfiles teóricos de restricción de un plásmido obtenido mediante este procedimiento, con la secuencia descrita por parte de Kobayashi et al. (anteriormente citado). La cepa XL1Blue (pRPA-BCAT3), se depositó en el CBS, con el número CBS 989 - 96.

Ejemplo 3 Secuenciación de un fragmento de 1.130 pb, que contiene DNA que codifica para el polipéptido con actividad nitrilasa

El inserto clonado en el plásmido pRPA-BCAT3, se secuenció por parte de la firma Genome Express S.A. (Grenoble, Francia), a partir de una preparación de DNA, realizada en el laboratorio (kit Wizzard Midi-Prep, Promega), La estrategia para la secuenciación de este fragmento, realizada en concordancia con procedimientos convencionales que son conocidos por parte de las personas expertas en el arte especializado de la técnica, se indican en la figura 4. Los diez cebadores nucleotídicos internos (identificados mediante los números 623 - 629 y 681 - 682, en la figura 4), se sintetizaron a partir de la secuencia de la nitrilasa de A. faecalis JM3 (Kobayashi et al., (anteriormente citado). Este juego, se completó mediante los cebadores universales "Reverse" y "M13 Forward". Cada región, se leyó por lo menos una vez, en cada cepa hebra de DNA.

La secuencia de DNA obtenida, tiene dos diferencias, de una forma relativa, con respecto a la secuencia publicada: una de ellas, en la estructura que se supone que va ser utilizada como un terminador de transcripción y, la otra, en el gen de nitrilasa, denominado nitB, que conduce a la sustitución Asn 279 \rightarrow Asp. Se procedió, a continuación, a secuenciar ambas regiones, en el laboratorio, sobre los plásmidos pRPA-BCAT1, 2, 4, 5, con dos cebadores específicos, el 710 y el 682 (véase la figura 4). El reemplazo C \rightarrow T, en la posición 1412 (en concordancia con la numeración de Kobayashi - anteriormente citado, más arriba), en el terminador, se encontró, otra vez, en otros clones. Esto es una mutación, la cual diferencia ambas cepas de A. faecalis. El reemplazo A \rightarrow G, en la posición 1138, se encuentra únicamente presente, en el plásmido pRPA - BCAT3. Esto es, por lo tanto, una mutación introducida durante la PCR, por la Taq DNA-Polimerasa.

Ejemplo 4 Expresión de nitrilasa en E. coli BL21 (DE3)

Con objeto de confirmar la identificación de la secuencia de DNA clonada con el gen de nitrilasa purificada, se procedió a emplazar el gen nitB, bajo el control del promotor de gen \Phi fago T7 (PT7), según el procedimiento operativo que se describe a continuación: se procedió a clonar los insertos NdeI-BamHI de 1,13-kb, de los plásmidos pRPA-BCAT3 y pRPA-BCAT4, en el vector pXL2432, con objeto de proporcionar respectivamente los vectores pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT13, descritos en la figura 5. El vector madre pXL2432, es un híbrido entre la región de plásmido pET9 (Studier et al., 1990, Methods in Enzymol. 185, 60 - 69), comprendida entre los sitios AccI y EcoRI, la cual abarca el origen de la replicación (ORI) y el marcador de selección portador de la resistencia a la kanamicina (Kan), y la región comprendida entre los sitios EcoRI y AccI del plásmido pET11a (Novagen Inc., Madison Wi, USA). La cual abarca la casete de expresión, el gen del IacI, y el regulador del número de copias ROP.

Se procedió a realizar cultivos, bajo condiciones de inducción, en concordancia con el procedimiento operativo que se facilita a continuación: se procedió a cultivar la cepa BL21 (DE3) Novagen Inc, Madison WI, USA), que contenía el plásmido pRPA-BCAT12, la cepa BL21 (DE3) que contenía el plásmido pRPA-BCAT13, así como la cepa BL21 (DE3), que contenía el plásmido pXL2432, durante un tiempo de 16 horas, en medio LB, a una temperatura de 37°C (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, - Experimentos en genética molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y), que contenía 50 \mug/ml de kanamicina y, a continuación, se diluyeron a un valor correspondiente a una concentración 100 veces inferior, en el mismo medio, y la misma temperatura. Cuando los cultivos hubieron alcanzado una OD600 comprendida entre 0,5 y 1, se procedió a añadir IPTG, a una concentración final de 1 mM. Después de 6 horas de cultivo, se colectaron las bacterias. Se adoptó un procedimiento operativo similar, con objeto de cultivar las cepas BL21 (DE3), que contenía los plásmidos pRPA-BCAT12 y pXL2231, la cepa BL21 (DE3) que contenía los plásmidos pRPA-BCAT13 y pXL2231, así como la cepa BL21 (DE3) que contenía los plásmidos pXL2432 y pXL2231, procediendo a añadir tetraciclina, al medio de cultivo, en una cantidad de 12 \mug/ml de medio. El plásmido pXL2231, el cual deriva del vector pXL1835 (solicitud de patente francesa 90 / 05 185, de fecha 24.04.1990), pertenece al grupo de incompatibilidad IncP, y es por lo tanto compatible con los plásmidos pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT13, los cuales tienen el origen de replicación del plásmido ColE1. Su marcador de selección, es la resistencia la tetraciclina, y éste porta un fragmento de ecoRI-HindIII, de 2,2 kb, que contiene los genes GroES y GroEL, que codifican para caperuzas moleculares de E. coli (Fayer et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 425 - 445).

La expresión de nitrilasa, se analizó en un gel de SDS-PA al 10%, en una fracción bruta, después de la sonificación (tratamiento mediante ultrasonidos) de las células, y después de la centrifugación, en la torta, y en el sobrenadante. Los resultados obtenidos, se presentan en la figura 6, y éstos muestran una alto nivel de expresión de nitrilasa (NitB), en los extractos de células, en donde, uno de los plásmidos, contiene el inserto nitB; no obstante, esta proteína, se encuentra esencialmente en forma insoluble, si bien, con la presencia del plásmido pXL2231, puede incrementarse la cantidad de polipéptido de nitrilasa, en la fracción soluble.

En la figura 6, M, representa el marcador de pesos moleculares; éstos últimos, se indican en kDa. Por otra parte, las pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:

- A, D, G, representan las fracciones de BL21 (DE3) + pRPA-BCAT12 / pRPA-BCAT13 / KL2432; respectivamente;

- B, E, H, representan los sobrenadantes obtenidos a partir de estas mismas cepas, respectivamente;

- C, F, I, representan las tortas obtenidas a partir de estas mismas cepas, respectivamente;

- J, N, Q, representan las fracciones brutas, respectivamente obtenidas, a partir de

BL21 (DE3) + pXL2231 + pRPA-BCAT12 / pRPA-BCAT13 / KL2432;

- K, O, R, representan los sobrenadantes obtenidos a partir de estas cepas, respectivamente;

- L, P, S, representan las tortas obtenidas a partir de estas cepas, respectivamente.

Las cepas BL21 (DE3) / pRPA-BCAT12 + pXL2231, se denominó pRPA-BIOCAT126. La cepa BL21 (DE3) / pRPA-BCAT13 + PXL2231, se denominó pRPA-BIOBCAT127. Las actividades nitrilasa de cultivos de pRPA-BIOCAT126, pRPA-BIOCAT127 y pRPA-BIOCAT66, la cual corresponde a las de BL21 (DE3 = / pXL2432, se determinaron de la forma que sigue: los cultivos, se realizaron en concordancia con el protocolo descrito anteriormente, arriba, procediendo a cambiar el volumen de cultivo (50 ml) y la concentración final de IPTG (0,1 mM). Los cultivos, se centrifugaron y, las tortas de células, se recogieron en 10 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM, pH 7. La hidrólisis de HMTBN, se realizó con 500 \mul de esta suspensión, añadida a 500 \mul de solución de HMTBN 200 mM, pH 7. La cinética de la hidrólisis se obtuvo procediendo a mezclar 100 \mul de esta mezcla, a 900 \mul de ácido fosfórico 0,1 N, a intervalos regulares, durante 1 a 4 horas. Las cantidades de HMTBA producidas, se analizaron mediante HPLC, tal y como se describe en el documento de solicitud de patente internacional WO 96 / 09 403. Los resultados, se recopilan en la tabla 2.

TABLA 2 Actividades de las cepas RPA-BIOCAT66, 126 y 127

2

	Abreviaciones: Km: Kanamicina 50 \mug/ml; Tc: tetraciclina 12 \mug/ml; hrs: horas; U: kg de HMTBA forma-
	dos por hora y por kg de peso en seco.

Con objeto de mejorar la solubilización del polipéptido de nitrilasa expresado, el plásmido pRPA-BCAT37, se construyó de la forma que se describe a continuación. Se obtuvo el plásmido pXL2391, procediendo a ligar el fragmento de 5,9 kb de EcoRI-PvuII del plásmido pDSK519 (Keen et al., 1998, Gene 70: 191 - 197), se trató con polimerasa de Klenow, con el fragmento de HindIII de 2.056 pb, extraído del plásmido pHP45\OmegaSp (Prentki y Krisch), 1984, Gene 29: 303 - 313), y tratado con Nucleasa de Mung Bean. Se procedió, a continuación, a digerir el plásmido pXL2391, con SmaI y SacI y, el inserto de 2,3 que porta el operón GroESL, extraído del plásmido pXL2231, digerido con HinIII, tratado con Klenow y digerido con SacI, se introdujo en éste. El plásmido pRPA-BCAT37, es por lo tanto un derivado del plásmido RSF1010, con un mayor número de copias que el plásmido pXL2231, compatible con el plásmido que porta el origen ColE1, y que porta un marcador de resistencia a la estreptomicina. Este plásmido, se introdujo en la cepa BL21 (DE3) / pRPA-BCAT12, con objeto de proporcionar la cepa RPA-BIOCAT171. Se procedió a determinar la actividad de un cultivo realizado en concordancia con un procedimiento operativo similar, tal y como el que se ha descrito anteriormente, arriba, pero reemplazando la tetraciclina por la estreptomicina, a 100 \mug/ml, y ésta se proporciona en la tabla 3 que se facilita a continuación.

TABLA 3 Actividades de la cepa RPA-BIOCAT171

3

Abreviaciones: Km: Kanamicina 50 \mug/ml; Sm: estreptomicina 100 \mug/ml; hrs: horas; U: kg de HMTBA

formados por hora y por kg de peso en seco.

Ejemplo 5 Expresión de la nitrilasa en E. coli DH5alpha

Se procedió a construir el plásmido pRPA-BCAT6, clonando, sobre pBCAT3 (véase la figura 3), el fragmento de 0,6 kb de ScaI-NdeI de pXL2158, que contiene el promotor Ptrp y el sitio para fijar el ribosoma RBScII (Levy-Schill et al., 1995, Gene 161: 15 - 20). La expresión, se realizó con la cepa DH5lalpha, que contiene el plásmido pRPA-BCAT6 y / o el pXL2035 (Levy-Schill et al., mencionado anteriormente), mediante el siguiente procedimiento operativo: Se procedió a incubar el pre-cultivo, durante un transcurso de tiempo de 16 horas, a una temperatura de 37°C, en medio M9 glucosa (Miller, J.H. 1972. Experiments in Molecular Genetics, - Experimentos en Genética Molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), que contiene un 0,4% de casaminoácidos, 100 /g/ml de triptofano, 100 \mug/ml de carbenicilina. Para cepas que contengan pXK2035, se añade kanamicina, en una cantidad 50 \mug/l. La expresión, se realiza, después de la dilución a un valor 100 veces inferior, al de la concentración del cultivo saturado, en un medio idéntico, pero sin triptofano, e incubación durante un tiempo de 8 a 16 horas, a 37°C.

El análisis en SDS-PAGE de los extractos de las diferentes cepas, se realizó de la misma forma que la que se ha descrito en el ejemplo previo, y se muestra en la figura 7.

En esta figura, M, representa el marcador de pesos moleculares; éstos últimos, se indican en kDa. Por otra parte, las pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:

- L, I, F, C representan las fracciones brutas obtenidas a partir de las cepas DH5alpha + pRPA-BCAT/3, /6, /6 + pRPA-BIOCAT76, respectivamente;

- K, H, E, B, representan los sobrenadantes obtenidos a partir de estas mismas cepas, respectivamente;

- J, G, D, A, representan las tortas obtenidas a partir de estas mismas cepas, respectivamente.

Con el plásmido pRPA-BCAT6, puede obtenerse una pequeña acumulación de un polipéptido de 43 kDa, mayoritariamente insoluble. La co-expresión del Groe a partir del plásmido pXL2035, reduce la sobreexpresión, pero, después de tres trasplantes sucesivos de la cepa DH5alpha (pRPA-BCAT6 + pXL2035), la cepa RPA-BIOCAT76 seleccionada, se encuentra, otra vez, con un elevado nivel de expresión del polipéptido de nitrilasa, siendo éste último casi completamente soluble. Los ensayos de las actividades de los cultivos realizados en concordancia con los procedimientos operativos descritos anteriormente, arriba, y en los ejemplos previos, se muestran en la tabla 4.

TABLA 4 Actividad de la cepas DH5alpha (pRPA-BCAT3), DH5alpha (pRPA-BCAT6), DH5alpha (pRPA-BCAT6 + pXK2035), RPA-BIOCAT76

4

	Abreviaciones: Km: Kanamicina 50 \mug/ml; Cb: carbenicilina 100 \mug/ml; hrs: horas; U: kg de HMTBA
	formados por hora y por kg de peso en seco.

Estos datos, muestran el hecho de que, la co-expresión de GroE, posibilita la expresión de la nitrilasa a ser mejorada, y que, una selección de cepas convencional, mediante transplantes sucesivos, contribuye también a mejorar la actividad de los recombinantes.

Ejemplo 6 Expresión de la nitrilasa en Pseudomonas putida y Alcaligenes faecalis

Se utilizó el sistema descrito en el ejemplo 5, para producir nitrilasa en Pseudomonas putida y Alcaligenes faecalis. Se procedió a introducir el fragmento de 1,14 kb de NdeI-XbaI de pRPA-BCAT6, que contenía el gen nitB, en los sitios NdeI-XbaI del vector pXL1289. El vector pXL1289, es un derivado de pKT230 (Bagdasarian et al., 1981, Gene 15: 237 - 247), que porta un origen de replicación multi-huésped (oriV), en bacterias Gram negativas, y el cual contiene un fragmento de 120 pb de EcoRi-NdI, que porta el promotor Ptrp y del PBScII de pXL534 (Latta et al., 1990, DNA and Cell Biology, - Biología del DNA y de la célula -, 9: 129 - 137), un inserto XbaI-BamHI, que codifica para el gen cobA (Crouzet et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 5968 - 5979) y un inserto XbaI-BamHI, de 500 pb, que contiene el terminador TrrnB de pXL534 (Latta et al., 1990, DNA and Cell Biology, - Biología del DNA y de la célula -, 9: 129 - 137). El plásmido pRPA-BCAT14 obtenido es, por lo tanto, un derivado del pKT230, que contiene un gen que imparte resistencia a la kanamicina (Kan) y el gen nitB, bajo el control de Ptrp:RBScII (Figura 8).

En el momento de la introducción de este plásmido en la cepa de E. coli DH5 alpha, se seleccionó un clon particular: éste expresaba una nitrilasa, para la cual, el peso molecular sobre gel de SDS-PA, es de 44 kDa, en lugar de 43 kDa. El plásmido hospedado mediante este clon, tiene el mismo perfil de restricción que el pRPA-BCAT14, y se denominó pRPA-BCAT24. Finalmente, se construyó el plásmido pRPA-BCAT23, en concordancia con el mismo procedimiento operativo que para el pRPA-BCAT14, pero con los siguientes cambios: el fragmento de 135 pb StuI-BsmI de pRPA-BCAT6, se reemplazó mediante el fragmento StuI-BsmI de pRPA-BCAT4. El plásmido pRPA-BCAT23, por lo tanto, expresa una nitrilasa NitB, con un residuo Asn en la posición 279.

Los plásmidos pRPA-BCAT14, 23 y 24, se introdujeron, mediante electroporación, en la cepa Pseudomonas putida G2081. La cepa G2081, deriva de la cepa KR2440 (Bagdasarian y Timmis, 1981, en Hofschneid y Goebel, Topics en Microbiology and Immunology, - Tópicos en microbiología e inmunología, 47, Springer Verlag, Berling), mediante la selección de la resistencia espontánea al ácido nalidíxico y a la rifanpicina. El vector pKT230, se utilizó como un plásmido de control.

Los plásmidos pRPA-BCAT14, pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 y pKT230, se extrajeron, a continuación, de las cepas de P. putida, con objeto de introducirse, mediante electroporación, en la cepa de A. faecalis ATCC8750 (=pRPA-BIOCAT1).

Las cepas G2081 (pRPA-BIOCAT14), G2081 (pRPA-BIOCAT23), G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-
BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), (pRPA-BIOCAT1) (pKT230, se cultivaron durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 30°C, en medio LB que contenía 50 mg/l de kanamicina. Estos precultivos, se diluyeron hasta un valor correspondiente a una concentración 100 veces menor, respecto a su concentración inicial, en medio M9, que contenía 50 mg/l de kanamicina, y se incubaron durante 20 horas, a una temperatura de 30°C.

Después de la sonificación (tratamiento mediante ultrasonidos) de las células, se procedió a medir la expresión de nitrilasa sobre un gel 10% SDS-PA, después de la sonificación de las células, y después de la centrifugación, en la torta, y en el sobrenadante. Los resultados obtenidos, se presentan en la figura 9. Para las cepas RPA-BIOCAT1 (pKT230) y G2081 (pKT230), se depositaron únicamente los extractos brutos (pistas A e I, respectivamente. En esta figura, M, representa el marcador de pesos moleculares; éstos últimos pesos, vienen indicados en kDa. Por otra parte, las pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:

- C, D, F, representan las fracciones obtenidas a partir de las cepas RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24), respectivamente;

- C, E, G, representan los sobrenadantes obtenidos a partir de estas mismas cepas, respectivamente;

- H, representa la torta obtenida a partir de RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24),

- J, L, O, representan las fracciones brutas, respectivamente obtenidas, a partir de las cepas G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), respectivamente;

- K, N, P, representan los sobrenadantes obtenidos a partir de estas mismas cepas, respectivamente;

- Q, representa la torta obtenida a partir de G2081 (pRPA-BCAT24).

Este experimento, muestra el hecho de que, las cepas de P. putida, expresan grandes cantidades de los tres polipéptidos de nitrilasa solubles, y que únicamente el polipéptido de nitrilasa de 44 kDa, se sobre-expresa mediante la cepa de A. faecalis. Los ensayos de actividad de estos cultivos, realizados en concordancia con el protocolo descrito en el ejemplo 4, muestra el hecho de que, las cepas G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), y RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24), tienen una actividad nitrilasa en HMTBN.

Ejemplo 7 Expresión de nitrilasa en Corynebacterium glutamicum

Se procedió a realizar la expresión de la nitrilasa, en la cepa CGL1010 (= ATCC 14757), por mediación del promotor PcspB (Peyret et al., 1993, Molecular Microbiol. 9: 97 - 109). Se amplificó un fragmento de 530 pb, que contenía el promotor PcspB, a partir del plásmido pCGL815 (Peyret et al., anteriormente citado, arriba), por mediación de los siguientes cebadores KS1 y KS2.

	KS1:	5'-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'
	KS2:	5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'

Después de la digestión mediante SalI, el fragmento amplificado de 530 pb, se clonó en el plásmido pBSK (Stratagene, La Jolla USA), y se abrió mediante SalI y EcoRV, con objeto de proporcionar el plásmido pCGL1084. Se fabricó un adaptador EcoNI/NdeI, mediante hibridación, de ambos de los dos oligonucleótidos KS8 y KS9 siguientes:

	KS8:	5'-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3'
	KS9:	5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'

El gen de la nitrilasa, se extrajo del plásmido pRPA-BCAT6, como un fragmento NdeI-XbaI, de 1,1 kb. Éste se introdujo en pCGL1084 y se abrió con EcoNI y XbaI, mediante la utilización del adaptador EcoNI/NdeI, descrito anteriormente, arriba, con objeto de obtener el plásmido pCGL1086. El fragmento SalI-BamHI de pCGL1086 que contiene PcspB::nitB, se clonó en el vector pCGL482 (Peyret et al., citado anteriormente), en los sitios Sal I y BamHI, conduciendo al plásmido pCG1087. El plásmido pCG1087 (figura 10), es por lo tanto un vector lanzadera, basado en pBI1 (Santamaría et al., 184, J. Gen. Microbiol. 130: 2237 - 2246), que contiene el origen de replicación de pACYC 184, reconocido en E. coli, un gen que imparte resistencia al cloranfenicol (Cm) y la fusión PcspB::nitB.

Los plásmidos pCGL1087 y pCGL 482, se introdujeron, mediante electroporación, en CGL1010, tal y como se describe por parte Bonnamy et al., 1990 (FEMS Microbiol. Lett. 66: 263 - 270). Después 20 horas de cultivo a una temperatura de 30°C, en medio de infusión Brain Heart 3,7% (Difco Laboratories, Detroit, USA) aditivado con 5 mg/ml de cloranfenicol, se realizaron ensayos de actividad nitrilasa, en muestras de cultivo, tal y como se describe en el ejemplo 4. Los resultados, muestran que, la cepa CGL1010 (pCGL1087), tiene actividad nitrilasa, mientras que, la cepa CGL1010 (pCGL482) no tiene ninguna actividad.

Ejemplo 8 Expresión de la nitrilasa en Streptomyces lividans

Se procedió a realizar la expresión de la nitrilasa, en la cepa TK24 de S. Lividands (Hopwood et al., 1985, Genetic manipulation of Streptomyces; A laboratory Manual, - Manipulación genética de Streptomyces; Un manual de laboratorio -, The John Innes Foundation, Norwich), por mediación del plásmido pIJ6021 (Takano et al., 1995, Gene 166: 133 - 137), mediante la utilización del promotor PtipA (Homes et al., 1993, EMBO J. 12: 3182 - 3119)).

Se procedió a la modificación del plásmido pUC19, (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103 - 119), sometiendo a deleción el fragmento Tfi I, de 140 pb, mediante la digestión de Tfi I, tratando con Klenow y ligando el vector sobre sí mismo. El plásmido obtenido, se abrió con EcoRI y BamHI, con objeto de clonar el fragmento de 1,5 kb de EcoRI-BamHI de pRPA-BCAT3, que contenía el gen nitB. El plásmido pOS48.4 de esta forma obtenido, tiene un sitio individual Tfi I, localizado entre el gen nitN y el sitio BamHI. Este sitio, se utilizó para insertar un fragmento \Omegahyg de 2,3 kb, expresado a partir del plásmido pHP45\Omegahyg (Blondelet - Rouault et al., Gene, submmited - [propuesto]-), después de la digestión mediante BamHI y tratamiento con Klenow. El fragmento \Omegahyg, contiene el gen de higromicina-fosfotransferasa (hyg) de Streptomyces Hygroscopicus (Zalacain et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14: 1565 - 1581, e imparte, a la S. lividans, resistencia a la higromicina. El plásmido pOS48.5 de esta forma obtenido, se utilizó para aislar un fragmento NdeI-BamHI de 3,45 kb, que contenía el gen de la nitrilasa, seguido por el gen hyg, el cual se clonó en el plásmido pIJ6021 (Takano et al., citado anteriormente), abierto mediante NdeI y BamHI. Puesto que, el plásmido pIJ6021, sólo se replica en Streptomyces, la mezcla de ligación se transformó en S. lividans TK24, mediante procedimientos convencionales (Hopwood et al., citado anteriormente), mediante la selección de clones que resisten a 200 mg/l de higromicina (Boehringer Manheim). Los DNAs plasmídicos de estos clones, se extrajeron mediante procedimientos convencionales (Hopwood et al., anteriormente citado), y sus perfiles de restricción, correspondían propiamente a la construcción esperada, la cual se denominó pOS48.7
(figura 11).

Los clones de S. lividans que contienen pOS48.7, así como el clon que contiene el plásmido pIJ6021, se cultivaron en 50 ml de medio TSB ((Triptic Soy Broth, Difco), a una temperatura de 30°C, durante un transcurso de tiempo de 72 horas, con una selección de kanamicina de 5 mg/l, y después, se añadió tioestreptón a la concentración de 5 mg/l y, el cultivo, se continuó durante un transcurso de tiempo 18 horas más, bajo las condiciones descritas (Hopwood et., anteriormente citado). El cultivo, se recolectó y, el ensayo de actividad, realizado bajo las condiciones descritas en el ejemplo 4, muestra el hecho de que, la cepa S. lividans TK24 (POS48.7), expresa actividad nitrilasa, contrariamente a la cepa TK24 (pIJ6021).

Ejemplo 9 Hidrólisis de HMTNB con otra nitrilasa

La secuencia primaria, de la nitrilasa de Comanonas testosteroni sp., descrita en Levy-Chill et al., 1995 (citado anteriormente, arriba), presenta un 31% de identidad con la secuencia primaria de la nitrilasa descrita en esta invención. La cepa recombinante de C. coli TG1 (pXL2158, pXL2035), la cual expresa la nitrilasa de C. testosteroni, se cultivó mediante las condiciones descritas por parte de Levy-Schill et al., (citado anteriormente, arriba), y se procedió a cultivar una torta de células, en un tampón fosfato 100 mM, a un pH 7, con 50 mM HMTBN, a una temperatura de 30°C. La actividad medida, era de 2,3 kg/h.kg CS. De la misma forma que la nitrilasa de la invención, la nitrilasa de C. testosteroni, es capaz de hidrolizar el HMTBN.

Adicionalmente, los datos mostrados en el ejemplo 4, con los plásmidos pBCAT12 y pBCAT13, muestran el hecho de que, con las sustitución Asn 279 \rightarrow Asp 279 sobre la nitrilasa de A. faecalis ATCC8750, sobre la nitrilasa de A. faecalis ATCC8750, puede retenerse la actividad sobre HMTBN.

Ejemplo 10 Aporte del soporte

Se procedió a añadir 5 g de células secas, a 20 g de agua, ajustada a un valor pH de 7,0. La cantidad indicada de soporte (CELITE 545), Prolabo, Francia), se añade, a continuación y, después de una perfecta homogeneización, la suspensión, se reticula mediante la adición de un porcentaje del 15% de gluturaldehído, en base al peso total de la masa en seco, seguido de un 10% de polietilenimina (SEDIPUR, BASF, Alemania). La suspensión, se añade durante 1 hora, a la temperatura ambiente.

Se procede, a continuación, a flocular la suspensión, mediante la adición de un floculante aniónico Superfloc A100. A continuación, se recubre la masa, mediante filtración.

Esta masa, se suspende a continuación, otra vez, mediante la adición de un 10% de poliazetidina (KYMENE 557, Hercules, USA), en base al peso total de la masa en seco. La masa todavía húmeda, se extrusiona, a continuación, a través de un orificio 0,5 mm de diámetro, y se seca.

La actividad de las partículas obtenidas, se determina, a continuación, según un procedimiento descrito en el documento de patente internacional WO 96 / 09 403.

5

La adición de soporte para las células, mejora notablemente la actividad.

Se procedió a repetir el experimento, reemplazando el CELITE por gluten de trigo soluble en agua (Roquette, Francia), o gelatina totalmente soluble en agua (SBI, Francia).

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *  \begin{minipage}[t]{150mm}La suspensión celular, no flocula,
y no es filtrable.  Este ejemplo, muestra el hecho de que, el
gluten,  puede ser sustituido por CELITE. Por otro lado, si la
adición es gelatina (totalmente soluble), es imposible  el proceder
a dar forma al catalizador, mediante la técnica descrita
anteriormente, arriba
(extrusión).\end{minipage} \cr}

Ejemplo 11

Se procedió a mezclar 10 g de Escherichia coli BIOCAT171 del ejemplo 4, preparada mediante cultivo aeróbico en un medio LB, con 10 g de CLAREL 78 (CECA, Francia) en 500 g de tampón fosfato 100 mM pH 7,0. Después de la homogeneización, se añadieron 6 g de gluturaldehído al 25% y, la suspensión, se agitó durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a la temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 2 g de polietilenimina, así como 6 g de gluturaldehído al 25%. El conjunto en su totalidad, se agitó durante un tiempo de una hora, a la temperatura ambiente. El conjunto en su totalidad, se floculó mediante la adición de 5 ml de una solución de SUPERFLOC A100 al 0,2% (CYTEC, Francia). La masa, se filtró y, la suspensión obtenida, se mezcló con 16 g de poliazetidina al 12,5% (KYMENE 557, Hércules) y, a continuación, se extrusionó a través de un orificio de 0,5 mm de diámetro. Los perfiles en forma de fideos o de macarrones obtenidos, se secaron a una temperatura de 35°C, en un horno, y a continuación, se sumergieron durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en un baño de NaBH_{4} al 1%, preparado en un tampón borato 50 mM, pH 10,0. Se procedió, a continuación, a lavar el biocatalizador, con agua destilada. El catalizador, se almacenó a una temperatura de 5°C, a la temperatura ambiente, en un tampón fosfato 500 mM pH 8,0.

Se procedió a cargar una columna con control de temperatura mediante termostato, con un diámetro interior de 3 cm y una altura de 45 cm, con 100 g de biocatalizador. Esta columna, se encuentra conectada a una bomba, vía un bucle de recirculación. El volumen total del reactor, es de 430 ml. El bucle, se llena con una solución de sal de amonio al 25% del ácido hidroxilmetiltiobutiríco. La solución, se introduce, desde la parte superior de la columna, hacia el fondo, a un caudal por hora correspondiente a un valor de 20 l/h. El agua que circula en la doble manta de la columna y el intercambiador de calor, permite el que se mantenga la temperatura, a una nivel de 35°C. Se procede a añadir agua desmineralizada al bucle, a un caudal de flujo de 80 g/h, Se añade 2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo, a un caudal de 20 g/h. El exceso de volumen del medio de reacción, se descarga desde el fondo de la columna, de tal forma que, el volumen del bucle, permanezca constante. Así, de este modo, se obtiene un flujo continuo, con una tasa de conversión de nitrilo del 95%. Adicionalmente, además, la concentración de la solución acuosa de la sal de amonio de ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutírico obtenido en la salida del reactor, es del 25%.

Ejemplo 12

El electrodializador utilizado, consiste en un apilamiento de 9 células o celdas, con 2 dm^{2} de superficie activa, consistiendo, cada una, en 2 compartimientos que se designan continuación:

- compartimiento sal / ácido: limitado en el lado del catalizador, mediante una membrana intercambiadora de cationes del tipo Neosepta CMB de la firma Tokuyama soda, y en el lado del ánodo, mediante la cara catiónica de una membrana bipolar Aqualitics.

- compartimiento base: limitado en el lado de la membrana catiónica, y sobre el lado del cátodo, mediante la cara aniónica de la membrana bipolar.

El ánodo, consiste en titanio platinado. El cátodo, es de acero inoxidable.

El electrolito, consiste en una solución acuosa de sulfato de sodio, con una conductividad de 100 mS/cm, a una temperatura de 40°C. El caudal de circulación, en los electrodos, es de 2 x 100 l/h. El volumen, es de 5 l.

El compartimiento "base", se llena, inicialmente, con 5 litros de una solución de sulfato amónico al 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llena inicialmente con 5 litros de una solución de 1,44 mol/l de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-metiltiobutanóico.

El caudal de recirculación de la solución, se fija, inicialmente, a un valor de 130 l/h para el compartimiento sal / ácido, y a un valor de 190 /h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se realiza en forma de lotes, es decir, en forma discontinua (régimen de funcionamiento en recirculación, a una temperatura media de 40°C. la intensidad, se impone que sea la correspondiente a un valor de 9 A; es decir, una densidad de corriente correspondiente de 0,45 kA/m^{2}.

Después de 155 minutos de funcionamiento, la conductividad del compartimiento sal / ácido, ha cambiado de 59 mS/cm, a 7,8 mS/cm.

El compartimiento sal / ácido, contiene 1,35 mol/l de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico, 100% del cual, es en forma de ácido.

El rendimiento de Faraday, se estima que es el correspondiente a un valor de un 71% y, el consumo de energía, es estima que es de 0,53 KWh, por kg de ácido formado.

Ejemplo 13

El electrodializador utilizado, consiste en un apilamiento de 9 células o celdas, con una configuración idéntica a la configuración del que se ha descrito en el ejemplo 12.

El compartimiento "base", se llena, inicialmente, con 5,27 litros de una solución de sulfato amónico al 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llena inicialmente con 4,8 litros de una solución de 1,39 mol/l de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico.

El caudal de recirculación de la solución, se fija, inicialmente, a un valor de 60 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a un valor de 150 /h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se realiza en forma de lotes, es decir, en forma discontinua (régimen de funcionamiento en recirculación, a una temperatura media de 40°C. la intensidad, se impone que sea la correspondiente a un valor de 9 A; es decir, una densidad de corriente correspondiente de 0,45 kA/m^{2}.

Después de 172 minutos de funcionamiento, la conductividad del compartimiento sal / ácido, ha cambiado de 59 mS/cm, a 9,5 mS/cm.

El volumen final del compartimiento sal / ácido, es de 4,67 litros.

La composición, es la siguiente:

ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 1,24 mol/l

2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato amónico: 1,48 mol/l. 100% del cual, es forma de ácido.

La tasa de conversión, es del 86%. El 89% del producto final, es en forma de ácido.

El rendimiento de Faraday, se estima que es el correspondiente a un valor de un 74%. El consumo de energía, es estima que es de 0,58 KWh, por kg de ácido formado.

Ejemplo 14

Se utiliza, en este ejemplo, un electrodializador semejante al que se ha utilizado en el ejemplo 13.

El compartimiento "base", se llena, inicialmente, con 5,46 litros de una solución de sulfato amónico al 1%.

El compartimiento "sal / ácido", se llena inicialmente con 5,23 litros de una solución de 1,24 mol/l de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico.

El caudal de recirculación de la solución, se fija, inicialmente, a un valor de 90 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a un valor de 150 /h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se realiza en forma de lotes, es decir, en forma discontinua (régimen de funcionamiento en recirculación, a una temperatura media de 40°C. la intensidad, se impone que sea la correspondiente a un valor de 14 A; es decir, una densidad de corriente correspondiente de 0,7 kA/m^{2}.

Después de 105 minutos de funcionamiento, la conductividad del compartimiento sal / ácido, cambia de 57,6 mS/cm, a 9,8 mS/cm.

La composición final del compartimiento sal / ácido, es la siguiente:

ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 1,28 mol/l

2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato amónico: 0,14 mol/l.

90% del producto final, es en forma de ácido.

Ejemplo 15

Se utiliza, en este ejemplo, un electrodializador semejante al que se ha utilizado en el ejemplo 13.

El test de ensayo, de aplica con los contenidos de compartimiento base que se han obtenido al completar el ejemplo 14.

El compartimiento "sal / ácido", se llena inicialmente con 5,2 litros de una solución de 1,44 mol/l de sal de amonio del ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico.

El caudal de recirculación de la solución, se fija, inicialmente, a un valor de 50 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y a un valor de 150 /h, para el compartimiento base.

La electrodiálisis, se realiza en forma de lotes, es decir, en forma discontinua (régimen de funcionamiento en recirculación, a una temperatura media de 42°C. la intensidad, se impone que sea la correspondiente a un valor de 19 A; es decir, una densidad de corriente correspondiente de 0,95 kA/m^{2}.

Después de 53 minutos de funcionamiento, la conductividad del compartimiento sal / ácido, cambia de 59 mS/cm, a 27 mS/cm.

El volumen final del compartimiento sal / ácido, es de 4,85 litros.

La composición final del compartimiento sal / ácido, es la siguiente:

ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico: 0,87 mol/l

2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato amónico: 0,56 mol/l.

90% del producto final, es en forma de ácido.

La tasa de conversión, es del 56%. El 61% del producto final, es en forma de ácido.

El rendimiento de Faraday, es del 74%. El consumo de energía, es estima que es de 0,7 KWh, por kg de ácido formado.

Ejemplo 16

Se procede a concentrar, por lotes (es decir, de forma discontinua), 200,1 g de solución de HMTBS, a aproximadamente 1,5 M, en un evaporador rotativo. La temperatura del baño, es de 45 +/- 5°C. La presión, se controla a un valor de alrededor de 2,5\cdot10^{3}Pa (25 mbar). La temperatura, en la caldera, cambia, desde una temperatura de 25°C, al principio de la destilación, a una temperatura de 40°C, al final de ésta. Después de un transcurso de tiempo de 3 horas, se recuperan 41,9 g de un medio viscoso amarillo, cuyas características, son las siguientes:

7

Después de ajustar el contenido (dilución con H_{2}O), se obtiene un producto, cuyas características son las siguientes:

8

\newpage

Mediante potenciometría, se obtiene la siguiente distribución de masas:

9

Se procede a medir, mediante HPLC, el valor de la relación de las superficies monómero ó dímeros / (monómero + dímeros):

monómero / (monómero + dímeros)	100
dímeros / (monómero + dímeros)(*)	0
(*) no se detectan dímeros

Ejemplo 17

Se procede a concentrar, por lotes (es decir, de forma discontinua), 200,0 g de solución de HMTBS, a aproximadamente 1,5 M, en un evaporador rotativo. La temperatura del baño, es de 121 +/- 5°C. La presión, se controla a un valor de alrededor de 9,5\cdot10^{4}Pa. La temperatura, en la caldera, cambia, desde una temperatura de 100°C, al principio de la destilación, a una temperatura de 113°C, al final de ésta. Después de un transcurso de tiempo de 3 horas, se recuperan 41,5 g de un medio viscoso marrón, cuyas características, son las siguientes:

10

Después de ajustar el contenido (dilución con H_{2}O), se obtiene un producto, cuyas características son las siguientes:

11

Mediante potenciometría, se obtiene la siguiente distribución de masas:

12

Se procede a medir, mediante HPLC, el valor de la relación de las superficies monómero ó dímeros / (monómero + dímeros):

monómero / (monómero + dímeros)	95,0
dímeros / (monómero + dímeros)(*)	0

Ejemplo 18

A 100,0 g del medio descrito en el ejemplo nº 17, se le añaden 40,0 g de H_{2}O. El medio, se extrae con 75,0 g de éter de isopropilo. Después de la separación de las fases, se recuperan 25,6 g de HMTBA, en la fase orgánica, después de la evaporación, siendo, las características de éste último, las siguientes.

13

Ejemplo 18 Envejecimiento de las soluciones descritas en los ejemplos previos

14

Las soluciones de los ejemplos 26 y 17, no cambiaron, en su contenido en dímeros, después de 40 días de almacenaje.

Claims (9)

1. Un polinucleótido que codifica para una nitrilasa, que comprende el gen nitrilasa denominado Nit B, contenido en el plásmido pRPA-BCAT3, depositado en el CBS, con el número CBS 998 - 96.

2. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1.

3. Un vector, según la reivindicación 2, que consiste en un plásmido.

4. Un polipéptido con actividad nitrilasa, que comprende una secuencia de nitrilasa, capaz de obtenerse mediante la expresión del gen nitrilasa denominado Nit B, clonado en el plásmido pRPA-BCAT3, depositado en el CBS, con el número CBS 998 - 96.

5. El polipéptido, según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que, la secuencia de nitrilasa, se co-expresa con una proteína de caperuza.

6. El polipéptido, según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que, la proteína de caperuza, es la proteína GroESL de Escherichia coli.

7. El polipéptido, según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por el hecho de que, la secuencia de nitrilasa, es susceptible de poderse obtener mediante la expresión del gen nitrilasa, en un microorganismo huésped.

8. El polipéptido, según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que, el microorganismo huésped, se selecciona de entre el grupo formado por Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, y los géneros Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillium y Aspergillus.

9. Material biológico, que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.