CN107164361B - 一种固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L‑天冬氨酸‑α脱羧酶的固定化方法，属于生物工程技术领域，以聚氨基酸改性的二氧化钛为载体，将L‑天冬氨酸‑α脱羧酶结合在载体表面，所述聚氨酸为γ‑聚谷氨酸或ε‑聚赖氨酸。分别以改性前后的载体对L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶进行固定化研究，发现改性后的载体的酶固载量约为改性前的8倍。

Description

一种固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其制备方法与应用。

背景技术

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,EC4.1.1.11,缩写为PanD，ADC)又称L-天冬氨酸-1-脱羧酶，能催化脱去L-天门冬氨酸的α-羧基，生成β-丙氨酸。PanD是一个不寻常的酶，它的催化能力依赖于自身加工形成的丙酮酞基。Ramjee等提出四聚体酶合成时，每个单体首先形成一个无活性的酶原(π-蛋白)，其中三个单体在特殊的Gly-Ser键上进行剪切，形成C-末端含有羟基的β-亚基和N-末端含有丙酮酰基的α-亚基，酶原经加工后，用荧光素氨基硫脲标记显示，其四聚体包含三个丙酮酰基，说明该四聚体的三个亚基发生了剪切并产生了活性。

β-丙氨酸，又名β-氨基丙酸。1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解产物中发现。它是一种非蛋白质的氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸主要的生理活性作用是合成泛酸，辅酶A。现代医学研究发现，在哺乳动物的神经系统中，它可作为大脑中神经传递者；具离子通道的激活作用；可治疗由组织缺氧引起的肝损伤。目前β-丙氨酸采用化学合成法生产。化学合成法有三种工艺：(1)丙烯腈法：此法丙烯腈经与氨在二苯胺和叔丁醇溶液中反应，生产β-氨基丙腈，再进行碱解即得；此法的缺点是产物中存在有40％以上的NaCl和杂质，需要反复纯化，反应过程中产生的NH3污染大气；(2)β-氨基丙腈法：β-氨基丙腈与氢氧化钡反应生产β-氨基丙酸钡和氮气，通入CO₂，钡盐析出，产生β-氨基丙酸，钡离子用树脂去除，此法的缺点是生产成本高；(3)琥珀酰亚胺降解法：琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中生成β-氨基丙酸，反应液用盐酸调pH,用3倍量的95％乙醇使无机盐析出，滤液用4倍量的蒸馏水稀释，离子交换树脂交换，交换液脱色，浓缩结晶，此法需大量的乙醇，生产成本高，生产场地安全性要求高。总之化学合成法的原料、中间体及副产物有毒，对环境污染严重。

聚氨基酸(PAA)是一类重要的功能性高分子，利用生物法可制得结构特殊、分子量可控的聚氨基酸，如γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和ε-聚赖氨酸(ε-PL)。γ-PGA是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成的一种阴离子异形肽，γ-PGA是一种多功能的生物高分子，相对分子质量一般在100～200×10⁴Da。ε-聚赖氨酸(Poly-L-lysine,ε-PL)是由StreptomycesalbulusPD-1生物合成的一种分子量约为3kDa的天然氨基酸均聚物，其具有较好的热稳定性、水溶性、生物相容性、抑菌性、无毒性以及独特的链接结构。聚氨基酸拥有游离羧基或氨基使其成为一种理想的固定化材料。

许多介孔材料已经成功作为固定化载体应用于多种酶的固定化。TiO₂作为纳米介孔材料具有比表面积大、生物相容性好以及协调性好的特点。以TiO₂为固定化载体进行固定化的方法一般有静电吸附和共价结合。Wei等将β-葡糖苷酶固定在巯丙基改性的TiO₂表面，得到的固定化β-葡糖苷酶具有较好的操作稳定性。Wang等以氨丙基三乙氧基硅烷对TiO₂进行化学改性，制备的固定化谷氨酰转肽酶也拥有较好的操作稳定性。

随着基因工程技术的迅速发展，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高某种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有普通微生物难以企及的酶催化效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以聚氨基酸修饰的TiO₂为固定化载体的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。

本发明还要解决的技术问题是提供上述固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是上述固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶在制备β-丙氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法，以聚氨基酸改性的二氧化钛为载体，将L-天冬氨酸-α脱羧酶结合在载体表面，所述聚氨基酸为聚谷氨酸、聚赖氨酸中的一种或两种的混合物，所述聚氨基酸优选聚谷氨酸。所述聚谷氨酸可以是γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，所述聚赖氨酸可以是ε-聚赖氨酸(ε-PL)。

该L-天冬氨酸-α脱羧酶的未剪切之前的基因序列如SEQ ID NO.1所示，经过自剪切之后该酶才具有催化活性。

其中，所述聚氨基酸改性的二氧化钛的制备方法如下：

(1)将纳米二氧化钛浸泡于50～100mM、pH 5.0～6.0磷酸缓冲溶液中，超声清洗，再真空冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-20℃；

(2)将1～100g步骤(1)得到的纳米二氧化钛浸泡在100～5000mL含有1.0％～10％(w/w)聚氨基酸的磷酸缓冲溶液中，10～40℃震荡1～100h，真空抽滤后，用蒸馏水洗涤以除去未与载体链接的聚氨基酸，所得固体即为聚氨基酸改性二氧化钛载体，所述聚氨基酸为聚谷氨酸或聚赖氨酸。

优选地，所述L-天冬氨酸-α脱羧酶按照如下方法制备得到：

(1a)诱导表达：将L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌接种于LB液体培养基中，培养过夜，再转接入LB液体培养基中，20～40℃发酵培养1～3h，再加入终浓度0.1～10g/L的乳糖或终浓度0.1～1.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20～40℃下诱导表达3～48h，离心收集菌体；

(2a)L-天冬氨酸-α-脱羧酶纯化：用生理盐水洗涤步骤(1a)得到的菌体，离心，超声破碎，收集上清液，连接蠕动泵，将上清液通过2个串联的5mL Ni柱，先用除杂溶液除去杂蛋白，再用洗脱液洗脱L-天冬氨酸-α-脱羧酶，收集洗脱液，最后在3000Da～10000Da的超滤管中离心得到纯化的L-天冬氨酸-α-脱羧酶；

所述的除杂溶液的配方如下：500mM NaCl、50mMTris-HCl、50mM咪唑、10％甘油；

所述洗脱溶液的配方如下：500mM NaCl、50mMTris-HCl、500mM咪唑、10％甘油；

(3a)L-天冬氨酸-α-脱羧酶自剪切：将步骤(2a)得到的纯酶投入剪切缓冲液中，在40～50℃条件下反应12～64h，所述剪切缓冲液为pH 5.0～8.0的磷酸缓冲液或Tris缓冲液，所述剪切缓冲液中含有ZnCl₂、ZnSO₄、MnCl₂、MnSO₄、NiCl₂、NiSO₄、CoCl₂、CoSO₄中的一种或几种；

所述ZnCl₂、ZnSO₄的浓度为0.1～5M，优选0.5～2M；MnCl₂、MnSO₄的浓度为0.1～5M，优选0.5～2M；NiCl₂、NiSO₄的浓度为0.1～5M，优选0.5～2M；CoCl₂、CoSO₄的浓度为0.1～5M，优选0.5～2M。

步骤(1)中，所述L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌的构建方法如下：

(1b)将SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到表达质粒上，得到重组质粒；

(2b)将重组质粒转化宿主菌，既得到L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌。

步骤(1b)中，所述的表达质粒为pET-28a。

步骤(2b)中，所述宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

上述L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法制备得到的固定化的L-天冬氨酸-α脱羧酶在本发明的保护范围之内。

上述固定化的L-天冬氨酸-α脱羧酶在制备β-丙氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。

具体的催化条件如下：0.1～10g固定化酶加入L-天冬氨酸浓度为1～1000g/L的5～100mmol/L、pH 5～8Tris-HCl缓冲液中，在20～40℃条件下反应，优选50mmol/L、pH7.5Tris-HCl缓冲液。

所述L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌的具体构建方法如下：

(1)含有L-天冬氨酸-α-脱羧酶的表达载体的构建：

根据Genbank公布的来源于大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)基因的序列，运用Vector NTI软件设计下述引物：

panD-up：5’-CGGGATCCATGATTCGCACGATGCTG-3’；

panD-down：5’-CCCAAGCTTTTAAGCAACCTGTACCGGAAT-3’；

分别提取处于对数生长期的大肠杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，得到L-天冬氨酸-α-脱羧酶的PCR扩增产物；回收所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的PCR扩增产物，将L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因经限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET28a-panD；将重组质粒pET28a-panD转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有250μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

(2)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取单克隆于5mL含有250μg/mL卡纳霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，获得L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因工程菌；

其中，PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL，panD-up和panD-down各2μL，dNTP4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O 34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min。

上述的基因工程菌在制备β-丙氨酸中的应用。

利用上述基因工程菌，以L-天冬氨酸为底物制备β-丙氨酸的工艺如下：

(1)基因工程菌的诱导表达：将所述基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以0.5～10％(v/v)的接种量转接入LB培养基中，20～40℃发酵培养1～3h，再加入终浓度0.1～10g/L的乳糖或终浓度0.1～1.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20～40℃下诱导表达3～48h，离心收集菌体；

或者将所述基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以0.5～10％(v/v)的接种量转接入发酵培养基中，直接于20～40℃下诱导表达3～48h，离心收集菌体，其中，所述的发酵培养基包含质量比2:1:2的乳糖、蛋白胨或酵母粉和NaCl，pH值为4～10，经高压湿热灭菌处理；

(2)L-天冬氨酸-α-脱羧酶纯化

收集基因工程菌发酵液500mL，8500rpm,离心15min，生理盐水洗涤再离心，超声破碎得上清，连接蠕动泵，通过2个串联的5mLNi柱，再将得到的洗脱液，用3000Da的超滤管，5500rpm,30min,上层即为浓缩液。

(3)考察pH、金属离子对PanD纯酶和基因工程菌中PanD酶自剪切的影响。

为了PanD纯酶和基因工程菌细胞中PanD的自剪切效果，考察了pH(4.0～9.0)和金属离子对该酶自剪切影响。

(4)转化反应：以25～100g/LL-天冬氨酸为底物，加入(3)中已剪切的基因工程菌细胞进行转化反应，用量以湿菌计为10～100g/L，pH值为5～12，反应温度40～80℃，转化时间12～48h，反应结束后，液相检测β-丙氨酸的含量；

或者，以25～100g/L L-天冬氨酸为底物，加入1～15mmol/L Mn²⁺离子和0.2～5mmol/LCo²⁺离子，然后加入自剪切后L-天冬氨酸-α-脱羧酶纯酶液20-100μl进行转化反应，pH值为5～12，反应温度40～80℃，转化时间12～48h，反应结束后，液相检测β-丙氨酸的含量。

有益效果：

(1)本发明选择大肠杆菌作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了L-天冬氨酸-α-脱羧酶的编码基因panD，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效过表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因工程菌。

(2)通过菌株发酵和表达条件优化，获得了最优的过表达条件。对L-天冬氨酸-α-脱羧酶剪切条件进行研究，大大提高了该酶的生物活性。

(3)对该酶进行固定化的研究，以TiO₂为固定化酶基础载体，用聚氨基酸对其进行改性制备了具有良好生物相容性和优越的纳米介孔结构的固定化酶载体。分别以改性前后的载体对L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行固定化研究，发现改性后的载体的酶固载量约为改性前的8倍。虽然固定化前后PanD的最适温度和最适pH并未发生变化，但固定化酶的最适范围变宽；PanD-PAA-TiO₂的热失活半衰期约是游离酶的3倍以上，是PanD-TiO₂的2倍。

附图说明

图1panD产物PCR的琼脂糖凝胶电泳验证，泳道1～2为panD产物PCR，M为标准DNA分子量，自上而下的条带分别为(kb)：5.0，3.0，2.0，1.5，1.0，0.75，0.5，0.2，0.1。

图2重组质粒pET28a-panDPCR产物核酸胶验证，其中泳道1～2为重组质粒1～2号对panD的PCR产物，泳道M为标准DNA分子量，自上而下的条带分别为(kb)：2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1。

图3 L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因工程诱导表达SDS-PAGE图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道1：空pET-28a对照；泳道2：基因工程菌发酵液A全细胞；泳道3:基因工程菌发酵液A上清；泳道4：基因工程菌发酵液B全细胞；泳道5：基因工程菌发酵液B上清。

图4Ni柱与超滤浓缩纯酶SDS-PAGE图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道1-2：全细胞；泳道3：上清液；泳道4：穿透液；泳道5：洗杂液；泳道6：洗脱液；泳道7：超滤浓缩液。

图5pH、金属离子对纯化后PanD自剪切影响的SDS-PAGE检测图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道1-9对应为表2中自剪切条件1-9。

图6pH、金属离子对基因工程菌中PanD自剪切影响的SDS-PAGE检测图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道1-9对应为表2中自剪切条件1～9。

图7金属离子和温度对纯化后PanD自剪切影响的SDS-PAGE检测图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道10-17对应为表3中自剪切条件10～17。

图8金属离子和温度对基因工程菌中PanD自剪切影响的SDS-PAGE检测图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道10-17对应为表3中自剪切条件10～17。

图9Zn²⁺浓度对基因工程菌中PanD自剪切影响的SDS-PAGE检测图，泳道M为标准蛋白分子量，泳道1：0.5M；泳道2：1M泳道3：2M。

图10产物混合样的液相检测图谱。

图11固定化载体改性前后的热重分析。

图12TiO₂改性前后的微观形貌，TiO₂(a)；PGA-TiO₂(b)；PL-TiO₂(c)。

图13起始给酶量对固酶量和固定化酶活回收率的影响；其中(a)PanD-TiO₂、(b)PanD-PGA-TiO₂、(c)PanD-PL-TiO₂。

图14 L-天冬氨酸-α-脱羧酶37℃热失活半衰期。

图15固定化酶催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸的重复使用次数。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：含有L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因表达质粒载体的构建。

根据Genbank上已报道的来源于大肠杆菌(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)基因的序列，运用Vector NTI软件设计引物，引物序列如表1所示：

表1引物序列

按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的大肠杆菌杆菌N(Escherichia coli str.K-12substr.MG1655)的基因组DNA，并用1％(10g/L)琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进行检测，分别以提取的大肠杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。

PCR(聚合酶链式反应)的扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物panD-up和引物panD-down各2μL，dNTP 4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O 34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min；

将PCR产物于1％(10g/L)琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1。发现与预期分子量(381bp)大小相符的DNA条带后分别用Axygen公司的柱式割胶回收试剂盒回收。

用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的限制性内切酶对获得的PCR产物panD进行酶切反应。所用的限制性内切酶是BamH I和Hind III。酶切体系为：PCR产物12.5μL，BamH I 1μL，Hind III 1μL，10×M缓冲液2.5μL，ddH₂O 8μL，总体积25μL。将酶切后的PCR产物经过DNA纯化试剂盒纯化。

使用同样的限制性内切酶和酶切体系对pET-28a质粒进行酶切，由于所选用的两个酶切位点在pET-28a质粒的多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS)上相距很近(约20bp)，因此酶切之后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒即可达到纯化的目的。

将经过纯化的PCR产物和pET-28a质粒进行连接。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物6μL，酶切纯化的pET-28a质粒2μL，T4连接酶1μL，10×T4连接酶缓冲液1μL。在37℃连接2h后即可获得重组质粒pET28a-panD。

重组质粒pETDuet-araA转化感受态大肠杆菌细胞使用氯化钙法：

(1)取10μL重组质粒pET28a-panD于50μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上2～3min。

(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。

(4)取200μL菌体涂布于含有250μg/mL卡那霉素的LB固体培养基表面。37℃培养12～16h至单菌落出现。

重组子pET28a-panD的鉴定：将单菌落接种于含有卡那霉素(250μg/mL)的LB液体培养基中37℃过夜培养并分别提取质粒，对各质粒进行菌落PCR验证，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示。实验结果说明获得的重组质粒pET28a-panD是正确的。

实施例2：基因工程菌的诱导表达。

采用两种方式对实施例1中获得的基因工程菌诱导表达：

(1)配制种子液1L，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)，经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL广口三角瓶中。用接种针向种子液接入一环实施例1中基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L的LB培养基1000mL，分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL；将上述LB培养基于121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液1mL，将三角瓶置于37℃摇床以200rpm的转速培养，约1.5h后加入终浓度为0.1～10g/L的乳糖或者终浓度为1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，并置于37℃摇床以200rpm转速进行诱导作用6h，得到基因工程菌发酵液A，发酵液离心收集得到基因工程菌菌体A。

(2)配制种子液1L，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，用NaOH调节pH值为7.0)，经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL广口三角瓶中。用接种针向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有乳糖10g/L、蛋白胨(或酵母粉)5g/L、氯化钠10g/L的发酵培养基1000mL，分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL；将上述发酵培养基于121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液1mL，将三角瓶置于25℃摇床以200rpm的转速培养，乳糖既作碳源又作为诱导剂，进行诱导作用22h，得到基因工程菌发酵液B。发酵液离心收集，得到基因工程菌菌体B，通过SDS-PAGE检测，结果如图3所示。结果表明重组菌株与对照菌株相比，基因工程菌株有非常明显的18.4kDa左右的特征蛋白条带出现，表达量比较大，重组蛋白的分子量大小与核酸序列理论推算的蛋白质分子量的相符，表明来自于大肠杆菌中目的基因panD在基因工程菌中获得了表达。

实施例3：Ni柱纯酶与超滤浓缩

取基因工程菌发酵液500mL，8500rpm，离心15min，生理盐水洗涤再离心，超声破碎得上清，连接蠕动泵，通过2个串联的5mLNi柱，再将得到的洗脱液，用3000Da的超滤管，5500rpm,30min上层即为浓缩液。通过SDS-PAGE检测，结果如图4所示，全细胞，上清中均有相应大小的特征蛋白，穿透液和洗杂液中没有，洗脱液中也有特征蛋白，且量非常大，浓缩液中更加明显，因此该酶可通过Ni柱吸附和超滤管浓缩两种方式中的任一种进行纯化。

实施例4：考察pH、金属离子对纯化后及基因工程菌中PanD自剪切的影响

为了PanD纯酶和基因工程菌细胞中PanD的自剪切效果，在50℃条件，考察pH(4.0～9.0)和1M金属离子对该酶自剪切影响，剪切时间48h，具体条件如表2所示。通过SDS-PAGE检测，结果如图5和图6所示，纯酶和基因工程菌全细胞剪切效果相当，且48h剪切不完全，pH6.0和pH7.5条件下剪切效果其他条件略优，金属离子Ni²⁺和Co²⁺对该酶的自剪切有促进作用。选用的金属化合物为LiCl₂、NiCl₂、CoCl₂。

表2 PanD自剪切条件

实施例4：考察金属离子和温度对纯化后及基因工程菌中PanD自剪切的影响

在pH7.5条件下，自剪切64h，金属离子浓度为1M，其他条件如表3所示，经过SDS-PAGE检测，如图7和8所示，Zn²⁺和Mn²⁺对酶自剪切有促进作用，Cu²⁺对该酶自剪切有抑制作用；温度对该酶自剪切的影响最大，在50℃条件下，纯化后和基因工程菌细胞中PanD全部自剪切完全。选用的金属化合物为ZnCl₂、MnCl₂、CuSO₄、MgCl₂、KCl。

表3 PanD自剪切条件

实施例5：考察金属离子浓度对基因工程菌中PanD自剪切的影响

在pH7.5条件下，自剪切64h，考察了0.5M、1M和2M浓度Zn²⁺对基因工程菌中PanD自剪切的影响，经过SDS-PAGE检测，如图9所示，2M浓度Zn²⁺对该酶自剪切作用效果最佳，基因工程菌中PanD全部自剪切完全。选用的金属化合物为ZnCl₂。

实施例6：利用基因工程菌制备β-丙氨酸

取1.2g已剪切完全的基因工程菌全细胞投入到100mM pH7.5磷酸钠缓冲配置的30g/L L-天冬氨酸进行催化反应，反应条件是温度37℃，摇床转速180rpm。每4小时取样，测定生成的β-丙氨酸含量，24h后反应结束。HPLC氨基酸分析检测β-丙氨酸的转化率达到45％。

实施例7：利用PanD纯酶制备β-丙氨酸

取20μl已剪切完全的PanD纯酶投入到100mM pH7.5磷酸钠缓冲配置的30g/L L-天冬氨酸进行催化反应，反应条件是温度37℃，摇床转速180rpm。每4小时取样，测定生成的β-丙氨酸含量，24h后反应结束。HPLC氨基酸分析包检测β-丙氨酸的转化率达到84％。

实施例8：利用PanD纯酶制备β-丙氨酸(加金属离子)。

取20μl已剪切完全的PanD纯酶投入到100mM pH7.5磷酸钠缓冲配置的30g/L L-天冬氨酸进行催化反应，反应条件是温度37℃，添加10mM Mn²⁺和1mM Zn²⁺，摇床转速180rpm。每4小时取样，测定生成的β-丙氨酸含量，24h后反应结束。HPLC氨基酸分析包检测β-丙氨酸的转化率达到95％。产物HPLC图谱见图10所示。

实施例9：纳米TiO₂的表面改性。

纳米二氧化钛(TiO₂)浸泡于磷酸缓冲溶液(50mM,pH 6.0)中，经过超声清洗30min后真空抽滤，真空冷冻干燥备用。将10g纳米TiO₂浸泡在400mL分别含有3.0％(w/w)聚赖氨酸磷酸缓冲溶液和3.0％(w/w)聚谷氨酸磷酸缓冲溶液中，25℃震荡10h。真空抽滤后，用蒸馏水洗涤三次以除去未与载体链接的聚赖氨酸或者聚谷氨酸，所得固体即为聚赖氨酸改性载体(PL-TiO₂)或聚谷氨酸改性载体(PGA-TiO₂)，真空冷冻干燥备用。

对改性前后的TiO₂进行热衷分析，从热重分析图11中可以看出，由于水分的挥发/蒸发在25℃至105℃范围内，纳米TiO₂热失重为1.97％，聚赖氨酸改性的载体热失重为1.61％，聚谷氨酸改性载体失重为1.57％。随后，TiO₂并没有随着温度的升高而发生热失重现象。在105℃至800℃范围内，PL-TiO₂热失重5.02％，PGA-TiO₂热失重7.62％。这说明在TiO₂经过聚氨基酸改性之后，有部分游离羧基或氨基与TiO₂通过静电吸附作用结合在一起。

本实验以S-4800场发射电子扫描显微镜观察固定化前后TiO₂和PL-TiO₂的微观形貌，如图12所示。TiO₂和PL-TiO₂颗粒呈密集有序的孔结构相似分布。SEM图像显示三者表面颗粒大小都在22-50nm范围内。此外，与天然的TiO₂相比，改性后的TiO₂载体颗粒更为圆润，这可能是因为聚氨基酸在TiO₂表面发生自组装现象。可以初步判断为聚氨基酸已成功与TiO₂结合。

实施例10：L-天冬氨酸-α-脱羧酶的固定化。

固定化载体PGA-TiO₂、PL-TiO₂和TiO₂分别放入含有不同浓度(0.35–3.5mg/mL)的panD磷酸缓冲溶液(50mM，pH 6.0)中，25℃100rpm条件下固定6h，进行酶的固定化操作。所得固定化PanD-PGA-TiO₂、PanD-PL-TiO₂和PanD-TiO₂用磷酸缓冲溶液洗涤三次，除去未与载体结合的酶分子，利用真空抽滤得到固定化酶，4℃保存待用。

高效固定酶分子是介孔材料作为固定化载体的重要特征之一。载体的固定化能力由酶的固载量评估。由图13a可知，随着起始酶浓度增加，PanD-TiO₂酶活上升趋缓，而酶活回收率逐渐下降。当酶浓度大于1.75mg/mL时，PanD-TiO₂酶活力未随酶浓度的变大而出现明显差异，但其酶活回收率仅为20.34％，选择酶活回收率(83.75％)最高时的L-天冬氨酸-α-脱羧酶浓度(0.35mg/mL)进行固定化操作，此时L-天冬氨酸-α-脱羧酶的固载量为17.4mg/g。如图13b所示：随着酶浓度的增加，PanD-PGA-TiO₂酶活力随之上升，当酶浓度为2.4mg/mL时，PanD-PGA-TiO₂酶活回收率高达89.03％，固载量为142.0mg/g(约为前者的8倍)。继续增加起始酶浓度，酶的固载量缓慢增加，最后保持在151.2mg/g左右，PanD-PGA-TiO₂酶活力先升高后再下降，但酶活回收率急速下降。如图13c所示，随着酶浓度的增加，PanD-PL-TiO₂酶活力也随之上升，当酶浓度为3.2mg/mL时，PanD-PGA-TiO₂酶活回收率高达85.25％，固载量为131.6mg/g(约为前者的7.5倍)。从酶与载体有效结合的角度考虑，选择酶活回收率最高时的酶浓度进行固定化操作。比较三种载体对固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶的能力可以发现：聚氨基酸的存在改善了载体与酶分子之间的生物相容性以及增强了他们之间连接强度。

实施例11：固定化酶半衰期的确定

取L-天冬氨酸-α-脱羧酶分别在37℃孵育0.5、1、1.5、2、4、8、16、32h后快速移至冰浴中冷却降温，测定经过热处理的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的参与酶活力(Ut)，以未作处理的L-天冬氨酸-α-脱羧酶活力作为起始酶活(U0)。以实验得到的数据根据一级不可逆失活方程ln(UtU0)＝-Kdt进行作图，得到的曲线的斜率即为一级速率常数Kd，酶的热失活半衰期由方程t1/2＝ln2/Kd算出。

分别将37℃孵育的游离酶和固定化酶按标准的酶活测定方法测定其残余酶活力Ut，以未作处理酶活力作为初始酶活定义为U₀。panD的失活属于一级不可逆失活，可根据一级不可逆失活方程ln(UtU0)＝-Kdt进行作图，得到的曲线如图14所示。拟合得到的失活方程如表4所示。各条曲线的斜率即为panD的一级速率常数Kd，酶的热失活半衰期由方程t1/2＝ln2/Kd算出，游离L-天冬氨酸-α-脱羧酶的固定化的热稳定性最差，panD-PGA-TiO₂的最好，其半衰期约是游离酶的3倍，是的panD-TiO₂的2倍，由此可以说明，固定化之后panD的热稳定性都得到改善，但固定在聚谷氨酸改性载体表面的panD具有更好的稳定性。

表4游离酶和固定化酶的热失活方程

实施例12：利用固定化酶多批次转化L-天冬氨酸生产β-丙氨酸。

将0.5g固定化酶加入L-天冬氨酸浓度为100g/L的50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中，在37℃100rpm条件反应8h，测定反应液中β-丙氨酸的浓度。每连续反应三个批次，固定化酶用磷酸缓冲洗涤一次，进行下一批次转化。游离细胞每完成一批反应后，磷酸缓冲洗涤一次，然后加入新的底物溶液，进行下一批转化。每批次的反应液经过适当稀释后用高压液相色谱仪分析L-天冬氨酸的转化率。

比较了利用游离酶与固定化酶多批次生产β-丙氨酸稳定性的影响，结果如图10所示，游离酶第一批反应转化率可达68％，但转化到第4批时转化率下降到16％，而固定化酶在10批反应过程中前9批的转化率都维持在60％左右，说明该固定化酶具有持续、稳定、高效的β-丙氨酸生产能力。固定化细胞多批次稳定催化生产β-丙氨酸具备工业化应用前景。

固定化酶作为一种常见的工业生物催化剂，具有良好的重复使用稳定性是极为重要的。为了确定固定化酶在最优条件下的实际的可重复使用性，对PanD-TiO₂、PanD-PGA-TiO₂和PanD-PL-TiO₂进行重复批次催化反应。PanD-TiO2(图15)表现出一般的操作稳定性，L-天冬氨酸转化率在第5批次之后就小于90％，在反应第10批次之后转化率下降至50％，其催化半衰期在55h左右。在第13批反应之后，PanD-PL-TiO₂的底物转化率在95％左右，但是在第17批之后转化率就变为50％，其催化半衰期为104h，在第16批反应之后，PanD-PGA-TiO₂的底物转化率仍然保持在95％以上,但是在第19批之后转化率就变为50％，其催化半衰期约为152h。聚氨基酸改性的固定化酶转化率的降低是因为在重复使用的过程中载体与酶分子之间的相互作用力减弱，导致酶分子从载体表面逐渐脱落；这一现象的另一个原因可能是经过长时间的催化反应，酶的构象发生变化，酶的催化活性部分或完全丧失。PanD-PL-TiO₂和PanD-PGA-TiO₂优于已报道的固定化细胞，这将归功于聚氨基酸的存在。以上结果可以证明此种新奇的固定化酶方法有应用于工业化生产β-丙氨酸的潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一种固定化L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其制备方法与应用

<130> SG20170707

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 381

<212> DNA

<213> L-天冬氨酸-α-脱羧酶

<400> 1

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgcttg a 381

Claims (7)

1.一种L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法，其特征在于，以聚氨基酸改性的二氧化钛为载体，将L-天冬氨酸-α脱羧酶结合在载体表面；

所述聚氨基酸为聚谷氨酸；

所述聚氨基酸改性的二氧化钛的制备方法如下：

(1) 将纳米二氧化钛浸泡于50~100 mM、pH 5.0~6.0磷酸缓冲溶液中，超声清洗，再真空冷冻干燥；

(2) 将1~100g步骤(1)得到的纳米二氧化钛浸泡在100~5000mL含有w/w为1.0%~10%聚氨基酸的磷酸缓冲溶液中，10~40°C震荡1~100h，真空抽滤后，用蒸馏水洗涤，得到聚氨基酸改性二氧化钛载体；

所述L-天冬氨酸-α脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法，其特征在于，所述L-天冬氨酸-α脱羧酶按照如下方法制备得到：

(1a) 诱导表达：将L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌接种于LB液体培养基中，培养过夜，再转接入LB液体培养基中，20~40°C发酵培养1~3 h，再加入终浓度0.1~10 g/L的乳糖或终浓度0.1~1.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20~40°C下诱导表达3~48h，离心收集菌体；

(2a) L-天冬氨酸-α-脱羧酶纯化：用生理盐水洗涤步骤(1a)得到的菌体，离心，超声破碎，收集上清液，连接蠕动泵，将上清液通过2个串联的5mL Ni柱，先用除杂溶液除去杂蛋白，再用洗脱液洗脱L-天冬氨酸-α-脱羧酶，收集洗脱液，最后在3000Da~10000Da的超滤管中离心得到纯化的L-天冬氨酸-α-脱羧酶；

(3a) L-天冬氨酸-α-脱羧酶自剪切：将步骤(2a)得到的L-天冬氨酸-α-脱羧酶投入剪切缓冲液中，在40~50℃条件下反应12~64h，所述剪切缓冲液为pH 5.0~8.0的磷酸缓冲液或Tris缓冲液，所述剪切缓冲液中含有ZnCl₂、ZnSO₄、MnCl₂、MnSO₄、NiCl₂、NiSO₄、CoCl₂、CoSO₄中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌的构建方法如下：

(1b) 将SEQ ID NO.1所示的基因序列克隆到表达质粒上，得到重组质粒；

(2b) 将重组质粒转化宿主菌，既得到L-天冬氨酸-α脱羧酶生产菌。

4.根据权利要求3所述L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法，其特征在于，步骤(1b)中，所述的表达质粒为pET-28a；

步骤(2b)中，所述宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

5.权利要求1~4任一所述L-天冬氨酸-α脱羧酶的固定化方法制备得到的固定化的L-天冬氨酸-α脱羧酶。

6.权利要求5所述固定化的L-天冬氨酸-α脱羧酶在制备β-丙氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，催化条件如下：以固定化的L-天冬氨酸-α脱羧酶为催化剂， L-天冬氨酸为底物，催化反应得到β-丙氨酸。

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