KR101616050B1 - 사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소나 균체와 담체를 포함하는 비드를 압축처리하여 비드 크기를 감소시키고 팽윤을 감소시켜 사이코스 생산량을 증가시키고, 장기간 안정적으로 사용할 수 있는 사이코스 생산용 압축 비드 및 이의 제조방법과, 상기 사이코스 생산용 압축 비드를 이용하여 장기간 안정적으로 높은 사이코스 생산량을 제공할 수 있는, 사이코스 생산방법을 제공하는 것이다.

Description

사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법{Psicose-producing bead and preparation method for the same}

본 발명은 사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 효소나 균체와 담체를 포함하는 비드를 압축처리하여 비드 크기를 감소시키고 팽윤을 감소시켜 사이코스 생산량을 증가시키고, 장기간 안정적으로 사용할 수 있는 사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 사이코스 생산용 비드를 이용하여 장기간 안정적으로 높은 사이코스 생산량을 제공할 수 있은, 사이코스 생산방법을 제공하는 것이다.

효소나 균체를 담체에 고정화시키는 경우, 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경이 제공될 수 있어 효소나 미생물을 이용한 산업적 생산방법에서 고정화가 이용되고 있다. 상기 효소 또는 균체를 고정화하기 위한 담체로서 다양한 물질이 사용되고 있으며 예를 들면 알긴산 또는 이의 염 등이 있다.

알긴산은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누론산(β-D-mannuronic acid)과 글루론산(α-L-gluronic acid)으로 구성되며, 식품첨가물로서 유산균 캡슐, 음료 등과 의료용 조직공학 재료 및 약품 전달체 등 다양한 분양에서 사용되고 있다. 알긴산은 하이드롤겔을 쉽게 형성하므로 담체(비드)로 많이 이용되어 특히 효소 및 세포의 고정화에 많이 이용되고 있다. 또한, 알긴산 또는 이의 염을 이용한 비드(alginate bead)는 팽윤성 및 신축성이 있는 다공성 물질로서 무작위로 베타-1,4 결합을 형성하므로, 균체나 효소가 안정적으로 고정화될 수 있어 유리하다.

그러나, 알긴산 또는 이의 염을 이용한 비드 수용액에 침지된 상태에서는 다공성의 특징이 잘 보존되나, 특별한 약품 및 오염에 대한 예방 없이는 수용액 외 보관 및 유통이 어려운 문제가 있다.

또한, 대부분의 효소 및 세포의 활성에 적정한 pH가 대부분 pH7 근처에 분포하고 있어, pH7 근처에서 알긴산 비드의 결합력이 약해짐에 의해 발생하는 팽윤(swelling) 및 분해되는 특징과 고온에서 그 결합력이 더욱 약해지는 특징을 가지고 있어 산업적으로 적용이 제한적이다.

본 발명은 알긴산 또는 이의 염을 이용한 비드의 보관 안정성을 증가시키고,압축처리를 통한 비드의 부피감소로 단위부피당 칼럼 충진율을 증가시켜 사이코스 생산량을 증가시키고, 사이코스 생산 반응에서 비드의 평윤(swelling)이 억제되어 장기간 안정적으로 사용할 수 있어 산업적으로 물리적 안정성이 개선된 사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 사이코스 생산용 비드를 이용하여 과당-함유 기질용액을 이용하여 장기간 안정적으로 높은 사이코스 생산량을 제공할 수 있은, 사이코스 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 효소나 균체와 담체를 포함하는 비드를 압축처리하여 비드 크기 및 팽윤현상을 감소시킨 사이코스 생산용 비드 및 이의 제조방법과, 상기 사이코스 생산용 비드를 이용여 장기간 안정적으로 높은 사이코스 생산량을 제공할 수 있은, 사이코스 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 예는 사이코스 생산 효소 또는 균체와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 압축처리된 압축 비드로서, 압축처리전 비드의 평균입경 100을 기준으로 압축 비드의 평균입경이 50 내지 100인 사이코스 생산용 비드를 제공한다.

상기 압축 비드의 평균입경이 압축처리전 비드의 평균입경 100을 기준으로 50 내지 100이며, 바람직하게는 55 내지 90이다. 또한, 상기 압축 비드는 동일 중량의 비드가 부피가 감소함으로써 밀도가 증가하며, 부피 감속, 밀도 및 강도 증가는 압축 처리에 의해서 비드내 화학적으로 결합력이 증가하고 물리적으로 밀도가 증가함에 따른 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 함수율은 비드 전체 중량중 수분 함량을 퍼센트로 나타낸 것이며, 본 발명의 일 예에 따른 압축 비드의 함수율이 15 내지 88 %일 수 있다. 본 발명에 따른 압축 비드를 제조하는 방법은 망간 이온 처리 방법과 망간 이온 처리 및 팽윤 억제제로 코팅하는 방법, 및 동결건조법을 포함할 수 있다. 망간 이온 처리 방법 또는 망간 이온 처리 및 팽윤 억제제로 코팅하는 방법으로 압축 처리를 수행한 비드의 경우, 압축 비드의 바람직한 함수율은 50 내지 88 %일 수 있다. 또한 동결건조법으로 제조된 압축 비드의 경우 바람직한 함수율은 10 내지 50 %일 수 있다.

본 발명에 따른 압축 비드는 액상 기질과 반응시 팽윤현상이 감소하며, 구체적으로 비드 평균입경의 팽윤율이, 액상기질과 접촉전 비드 입경의 팽윤율 100을 기준으로, 100 내지 155일 수 있으며, 예를 들어 100 내지 130, 또는 100 내지 125 등일 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 압축 비드는 금속 이온 첨가 반응에 의하여 비드의 크기를 감소 및 강도를 증가시켰으며, 양이온성 중합체인 키토-올리고당 코팅의 결합에 의하여 기존 알긴산의 팽윤 현상을 현저히 감소시켜 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것과 동결 건조 비드 제조에 의한 비드의 크기 감소로 생산성을 증가 및 팽윤 현상을 억제하여 안정성을 높여 산업적으로 적용성이 높은 비드를 제조하였다.

또한, 본 발명에 따른 압축 비드는 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산함에 있어서 보다 장기간 동안 높은 전환율 및 생산량을 제공할 수 있으며, 구체적 예로서, 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터 얻어지는 반응물의 사이코스 함량이 20 중량% 이상을 15일 이상의 기간 동안 제공할 수 있으며, 또한 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 조건에서 압축처리전 비드 대비 사이코스 생산량 1.5배 이상, 예를 들면 1.7배 이상, 바람직하게는 2.2 배 이상일 수 있다.

따라서, 상기 압축 비드는 비드의 부피를 감소시켜 단위 부피당 컬럼 충진량을 증가시켜 사이코스 생산량을 증가시켰으며, 알긴산 비드의 결합에 의해 안정성이 높은 비드를 제조하여 기존 문제시 되었던 평윤(swelling) 현상을 크게 낮추어 장기간 안정적으로 높은 사이코스 생산량을 제공할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 사이코스 생산 균체 또는 효소와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 혼합 용액을, 2가 양이온 염화 화합물이 포함된 반응액에 적가하여 효소 또는 균체-함유 비드를 형성하는 단계 및 상기 비드에 압축처리를 수행하는 단계;를 포함하는 사이코스 생산용 압축 비드의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조방법에 따라 얻어지는 압축 비드는 압축처리전 비드의 평균입경 100을 기준으로 50 내지 100, 바람직하게는 55 내지 90를 가질 수 있다. 상기 비드의 평균입경을 다양할 수 있으며, 예를 들면 1.1mm 내지 1.8mm 일 수 있다.

또한, 상기 압축 비드는 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터 얻어지는 반응물의 사이코스 함량이 20 중량% 이상을 15일 이상의 기간 동안 제공할 수 있으며, 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터, 비드가 동일 부피로 충진된 칼럼에서 전환 반응된 사이코스를 생산하는 조건에서, 압축처리전 비드 대비 사이코스 생산량 1.5배 이상, 바람직하게는 2.2 배 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 비드 형성단계는 사이코스 생산 균체 또는 효소와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 혼합 용액을, 2가 양이온 염화 화합물이 포함된 반응액에 적가하여 수행할 수 있다.

또한, 비드를 형성하는 단계 이후에, 균체 또는 효소-함유 비드를 경화하는 단계, 2가 양이온 염화화합물을 세척하는 단계, 및 균체 또는 효소-함유 비드를 과당-함유 기질로 처리하는 단계로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 처리단계를 포함할 수 있다. 상기 비드 형성후 추가 공정은 본 기술분야에서 통상의 전문가에게 알려진 방법으로 수행할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.

상기 비드 형성단계의 예는, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써 비드를 제조할 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 사용하며, 상기 알긴산염은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 알긴산나트륨, 알긴산칼륨, 알긴산마그네슘, 알긴산암모늄염 등이 있다. 예를 들면, 담체로서 알긴산, 알긴산나트륨 또는 알긴산칼륨염은 점도가 2,000 내지 50,000 cps를 갖는 것일 수 있다. 또한, 비드 형성단계에서 알긴산염 용액의 농도는 응집 형성 및 제조과정의 편의성을 고려하여 1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 8 중량%, 보다 바람직하게는 3 중량% 내지 5 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 압축 비드 및 이의 제조 방법에서, 비드에 포함된 활성물질은 사이코스 생산 효소 또는 균체일 수 있으며, 바람직하게는 사이코스 생산 균체일 수 있다. 상기 사이코스 생산 균체는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 야생형 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주일수 있다. 또는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주 또는 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 유전자가 도입된 재조합 균주를 얻고, 균주의 균체, 상기 균주로부터 얻어지는 효소일 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 균주로는 높은 안정성을 가지면서도 고수율로 사이코스 에피머화 효소를 생산할 수 있는 균주일 수 있으며. 상기 재조합 균주는 다양한 숙주세포, 예컨대 대장균, 바실러스속 균주, 살모넬라속 균주 및 코리네박테리움속 균주 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 GRAS 균주인 코리네박테리움속 균주일 수 있으며, 코리네박테리움 글루타리쿰일 수 있다.

상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens)로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

재조합 균주를 이용하는 경우 사이코스 에피머화 효소는 다양한 균주에서 유래된 효소의 암호화 유전자를 사용할 수 있으며, 예를 들면 한국특허공개 2014-0021974에 기재된 트리포네마 프리미티아 유래 효소, 한국특허공개 2014-0080282에 기재된 루미노코코스 토르크 유래 효소 및 한국등록특허 10-1318422호에 기재된 클로스티리디움 신댄스 유래 효소일 수 있으며, 또한 엔시퍼 아드해렌스 유래 효소일 수 있다. 구체적인 일예에서, 본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 클로스티리디움 신댄스 유래 효소일 수 있으며, 예를 들면 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지며, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 핵산서열을 포함한다. 서열번호 8의 핵산서열은 대장균 최적화 핵산서열이고, 서열번호 9은 코리네박테리움에 적합하게 변형된 핵산서열이다.

상기 재조합 균주의 제조에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 핵산서열의 상부에 위치하는 조절 서열을 사용하여 효소의 발현을 조절할 수 있으며, 조절서열은 전사 프로모터를 필수적으로 포함하며, 추가로 리보솜 결합 영역 및/또는 스페이서 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 조절 서열을 구성하는 요소들은 직접 연결되거나 1개 내지 100개의 염기, 예를 들면 5개 내지 80 염기를 가지는 핵산서열의 링커를 하나 이상 포함하여 연결될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 전사 프로모터는 코리네박테리움속 균주에서 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 핵산서열을 발현하는 핵산분자일 수 있으나, tac1, tac2, trc, sod 프로모터일 수 있다. sod 프로모터는 코리네박테리움글루타리쿰에서 유래된 것이며, 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 코어영역으로 포함한다. trc프로모터는 대장균 유래 프로모터로서 trp프로모터과 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것이다. Tac1 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서, trp프로모터과 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것이다. Tac2 프로모터는 대장균 유래 프로모터로서 trp 프로모터와 lac UV5 프로모터의 조합으로 제조된 것으로서 상기 Tac1 프로모터의 서열을 변형하여 최적화한 형태이다.

상기 리보좀 결합 영역과 스페이서는 화학적으로 직접 연결되거나 그 중간에 링커 핵산서열을 개재하여 간적접으로 연결될 수 있다. 본 발명의 일예에서리보좀 결합 영역(ribosome binding region) 및 스페이서 서열은 5'부터 3'순으로 순차적으로 연결된 하나의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 프로모터 서열, 리보좀 결합 영역(ribosome binding region) 및 스페이서 서열의 핵산서열을 하기 표 1에 나타낸다. 표 1에서 진하게 밑줄로 표시된 부분은 조절서열중, 리보솜결합영역, 스페이서 서열, 링커서열 등을 나타낸다.

서열 번호	서열(5'--> 3')	명명
1	aagcgcc tcatcagcgg taaccatca cgggttcgggt gcgaaaaacc atgccataac aggaatgttc ctttcgaaaa ttgaggaagc cttatgccct tcaaccctac ttagctgcca attattccgg gcttgtgacc cgctacccgataaataggtc ggctgaaaaa tttcgttgca atatcaacaa aaaggcctat cattgggaggtgtcgcacca agtacttttg cgaagcgcca tctgacggat tttcaaaaga tgtatatgct cggtgcggaa acctac gaaagga ttttttaccc atggctg tatacgaact cccagaactc gactacgcat acgac gaaagga ttacaaa	Sod promoter
2	tgacaattaatcatcggctcgtatattgt gtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagaattcccggg gaaagga ttacaaa	tac1 promoter
3	tgacaattaatcatccggctcgtataatgt taacaatttgtggaattgtgagcggacacacaggaaacagaccatggaattcgagctcggtacccggg gaaagga ttacaaa	Tac2 promoter
4	tgacaattaatcatcggcctcgtataatgt	trc promoter
5	gaaagga	Ribosome binding region
6	ttacaaa	Spacer sequence

본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소는 효소활성 및 열안정성이 우수한 것이 바람직하고, 이에 본 발명의 구체예에서, 전사 프로모터 또는 조절서열은 사이코스 에피머화 효소를 코딩하는 유전자와의 조합이 중요하며, 본 발명에 사용된 사이코스 에피머화 효소와는 tac1, tac2, trc, sod 프로모터 모두 적정 이상의 단백질 발현을 제공할 수 있으며, sod 프로모터를 사용한 경우에는 단백질의 폴딩(folding)이 견고하여 열안정성이 높게 나타나는 결과를 얻을 수 있어 더욱 바람직하다 .

재조합 균주를 이용한 사이코스 생산방법 등은 한국특허공개 2014-0021974, 한국특허공개 2014-0080282 및 한국등록특허 10-1318422호에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있으나 특별히 한정되지 않는다.

상기 사이코스 생산용 압축 비드의 제조방법에서, 비드를 형성하는 단계 이후에 수행되는 비드의 압축처리 단계는, 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정, 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정, 및 비드를 동결건조하는 공정으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정으로 압축 처리하는 단계를 수행할 수 있다.

구체적으로서, 상기 압축 처리공정은 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정을 단독으로 수행하거나, 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정을 수행한 후에 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정을 수행할 수 있다. 또는, 상기 압축 처리공정은 비드를 동결건조하는 공정으로 수행할 수도 있다.

상기 2가 금속으로 처리하는 공정은, Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, 및 Cu²⁺ 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 2가 금속이온으로 비드를 처리할 수 있다. 구체적으로, 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액에, 효소 또는 균체를 함유하는 비드를 담지하거나, 상기 비드가 충진된 칼럼에 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액을 흘려주어 수행할 수 있다. 상기 2가 금속이온이 첨가된 수용액 또는 과당-함유 기질용액에 포함된 2가 금속 이온의 함량은 1mM 내지 15mM일 수 있으나, 비드의 충분한 압축 효과를 가지기 위해서는 바람직하게 5mM 내지 10mM로 처리한다.

상기 2가 금속이온을 비드의 외부 및 내부까지 충분한 압축 효과를 나타내기 위하여 함유하는 용액의 온도는 40 내지 60℃ 일 수 있으며, 처리시간은 1분 내지 120분 일 수 있으나 특별히 한정되지 않는다.

상기 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정은, 비드를 팽윤 억제제를 함유하는 용액에 침지하거나 첨가하여 수행할 수 있다. 상기 팽윤 억제제는 키토산, 키틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토-올리고당(Chito-oligosaccharide) 및 폴리라이신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 상기 팽윤 억제제는 키토산-올리고당을 사용하는 경우 중량평균 분자량이 700 내지 9,000범위일 수 있으며 특별히 한정하지는 않는다. 코팅 공정에서 팽윤 억제제 용액의 농도는 0.1 중량% 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 5 중량% 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일예에서, 상기 비드를 동결 건조하는 공정으로 비드를 압축처리하는 경우에는, 통상의 동결 건조방법으로 수행할 수 있으나, 비드에 포함된 활성물질이 사이코스 생산용 효소 또는 균체로서 사이코스 생산활성을 유지하는 것이 중요하므로, -90℃ 내지 -10℃ 온도 범위, 바람직하게는 -70 내지 -20℃ 온도 범위 에서 동결하고, 10 mtorr 미만의 압력하에서 -40℃ 내지 20℃ 온도범위에서 건조하는 것일 바람직하다.

본 발명의 추가적인 예는 상기 효소 또는 균체와 담체를 포함하는 압축 비드를 이용하여 과당-함유 기질을 이용하여 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 본 발명의 사이코스 생산 방법은 효소나 균체를 함유하는 비드를 컬럼에 충진시키고 과당-함유 기질 용액을 흘려 수행할 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 사용된 효소나 균체, 또는 고정화 담체에 따라 적합한 것으로 용이하게 선택하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 사이코스 에피머화 효소를 포함하는 균체가 충진된 충진상 컬럼에 과당 용액을 일정 농도로 공급하면, 고정화된 균체에 의해 에피머화 반응이 진행되어 과당이 사이코스로 전환된다. 전환된 사이코스는 분리탑을 이용해 분리 및 정제 후 순수한 사이코스로 이용 가능하다.

본 명세서에서 사용된 고정화 반응기는 사이코스를 생산하기 위한 반응이 담체에 고정화된 균체 또는 효소에 의해, 또는 담체에 고정화된 균체 또는 효소가 충진된 컬럼을 통해 일어나는 반응기를 의미한다. 즉, 고정화는 생물학적 활성을 제공하는 물질, 이 경우, 사이코스 에피머화 효소나 포도당 에피머화 효소 또는 이들을 포함하는 균체가 담체에 고정화되었다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 운전 안정성은 사이코스와 같은 목적 산물을 연속적으로 생산하기 위해 생물 반응기를 초기 활성 대비 적합한 수준의 생산성을 유지하면서 운전할 수 있는 것을 의미하며, 보통 운전 기간으로 표시된다. 본 발명에 따른 압축 비들 이용하여 사이코스를 생산하는 경우, 예를 들면 40 내지 50 brix 농도의 과당 함유 기질로부터 얻어지는 반응물의 사이코스 함량이 20 중량% 이상으로 15일 이상의 기간 동안 제공할 수 있다. 또한, 상기 압축 비드가 충진한 컬럼에 50 ℃ 온도 조건으로 공급하는 기질로부터 얻어지는 반응물의 최대 전환율의 90 내지 100의 범위를 가지는 유속에서 공급하여 사이코스 함량이 20 중량% 이하로 감소하는 시점까지 고정된 유속으로 공급하는 조건으로 수행하여 운전 안정성을 확보할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9.5, 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 75℃, 60 내지 75℃, 또는 68 내지 75℃의 조건 하에서 수행될 수 있다.

또한 상기 반응 시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 48 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48 시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36 시간, 3 내지 24 시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다.

따라서, 과당-함유 기질 용액에 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.5mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 예컨대, 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 금속 이온 첨가 반응에 의한 세포 고정 알긴산 비드의 가교 결합력을 증가로 비드의 부피를 감소시켜 컬럼 충진률을 개선하였으며, 양이온성 중합체들과 세포 고정 알긴산 비드의 결합에 의해 안정성이 높은 비드를 제조하여 기존 문제시 되었던 평윤(swelling) 현상을 크게 낮추는 방법에 관한 것과 알긴산 비드의 동결 건조로 비드의 부피 감소를 크게 높여 컬럼 충진률을 높여 생산성을 향상 시키는 동시 팽윤 현상을 억제하여 산업적으로 물리적 안정성이 개선된 비드를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

도 1은 실시예 1에서 사용한 재조합 벡터 (pCES_sodCDPE)의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 금속이온을 처리한 균체-함유 비드를 용기에 충전하하고, 충진 개시 시점의 비드와 30분 경과후 비드의 사진을 나타낸다.
도 3는 실시예 3에 따라 금속이온 첨가농도에 따른 반응물중 사이코스 함량 증가율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 4에 따라 금속 이온 처리 비드와 미처리 비드 팽윤도를 나타내는 사진이다.
도 5은 실시예 5에 따라 금속 이온 처리 및 고분자 코팅 처리후 얻어진 균체-함유 비드를 이용하여 과당 함유 기질로 고정화 칼럼 반응을 수행한 후에, 충진 비드의 팽윤도를 비교한 사진이다.
도 6은 실시예 1의 비드 (균체-함유 비드), 실시예 3 의 비드 (망간 함유 기질를 처리한 균체-함유 비드), 실시예 4 의 비드(금속 이온 처리 및 고분자 코팅 처리후 얻어진 균체-함유 비드) 및 실시예 5 (동결건조 균체-함유 비드)의 비드의 실체현미경 사진(배율 X40)을 나타낸다.
도 7는 실시예 6에 따라 동결건조 균체-함유 비드를 이용하여 과당 함유 기질로 고정화 칼럼 반응을 수행한 결과로서, 반응일수에 따른 전환율을 나타내는 그래프이다.

실시예 1: 균체-함유 비드의 제조

1-1: 사이코스 생산 균주의 준비

크로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소의 암호화 유전자(DPE gene; Gene bank: EDS06411.1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드(서열번호 2)와 pET21a 벡터로부터 확보한 sod 프로모터와 T7 터미네이터를 피씨알을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 피씨알(PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여, sod 프로모터(서열번호 1), 서열번호 8의 최적화 CDPE 서열 및 T7-터미네이터를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였다.

상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NotI과 XbaI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/사이코스 에피머화 효소(pCES_sodCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE)의 개열지도를 도 1에 개시하였다.

상기 제조된 재조합 벡터(pCES_sodCDPE) 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 콜로니를 picking하여 카나마이신(Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지(트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L) 4ml에 접종한 후, 배양조건 30 ℃ 및 250rpm에서 약 16시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다. Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 : 1로 혼합 후 100?에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 : running gel - 3.3 ml H2O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H2O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 약 50 분 동안 전기영동하여 단백질 발현을 확인하였다. CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하였다. 상기 제조된 형질전환 코리네박테리움 글루타리쿰은 전체 수용성 단백질을 16.62 mg 및 정제된 효소 단백질 1.74 mg을 생산하였다.

1-2: 균체-함유 비드

실시예 1-1에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주를 얻고자, 균주 배양액에서 원심분리로 세포를 회수하였다. 그런 후에 상기 균주 배양액의 세포 현탁액 농도를 5 ~ 10% (w/w) 맞춘 뒤, 최종 부피에 유화제(M-1695)를 0.05% (w/v) 처리하여 35 ℃(±)에서 60 분간 처리하였다.

상기 회수된 균체는 증류수와 혼합하여 균체 농도 5% (w/w)로 맞추고, 물에 용해된 4% (w/w) 알긴산과 회수된 균체 5% (w/w)를 1:1로 혼합하여, 최종 균체 농도 2.5%(w/w) 및 알긴산 2%(w/w)의 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액은 펌프에 연결된 실리콘 튜브로 이동하여 튜브의 끝 부분에 결합된 주사기(내경 0.20 ~ 0.30mm)을 통해 혼합액이 100 mM 염화칼슘 용액과 섞여 교반되면서 경화된 구형 또는 타원형의 비드(지름 1.9 ~ 2.1mm)를 형성하였다.

상기 제조된 비드는 내부의 알긴산 결합력을 더욱 증가시키기 위해 4 ~ 6시간 냉장 보관하면서 교반한 다음 새로운 100 mM 염화칼슘 용액과 교체하여 냉장 상태에서 약 6시간 정도 더 경화시켰다. 경화가 완료된 비드들은 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거하고 비드 부피 대비 2배 부피의 물을 투입한 후 10분간 교반을 하였고, 이러한 과정을 3회 반복하여 잔존 염화칼슘 용액을 제거하였다. 상기 제조된 비드의 실체현미경 사진(배율 X40)을 도 6에 나타냈다.

1-3: 과당-함유 기질의 처리

실시예 1-2에서 세척이 완료된 균체-함유 비드에 대해, 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거한 후, 과당이 함유된 기질(pH 6.8 ~ 7.0)을 비드 부피 대비 2배수로 투입하여 10분간 교반하였다. 이 과정을 3회 반복하여 비드 내부를 과당 함유 기질 용액으로 치환시켰다.

실시예 2: 금속이온 처리 비드의 제조

금속 이온의 처리로 균체-함유 비드의 부피 감소 및 강도를 달성하는 지 여부를 확인하고자, 물 (대조구)와 8 가지 금속이온 Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, Cu²⁺ 및 Li⁺ 이 각각 10mM 첨가된 수용액에, 실시예 1-2에서 제조한 균체-함유 비드 4g 중량을 충진하고, 50℃에서 30분간 담지하여 금속이온 처리를 수행하였다.

상기 금속이온 처리된 비드를 충진한 시점에서 9가지 실험군에서 모든 비드충진 부피가 4.2mL이었다. 30분 경과후 물과 Li⁺ 함유 수용액에서 비드 충진 부피가 다소 증가한 4.8mL이고, Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, Cu^{2 +} 을 포함하는 총 7가지 금속이온 처리구에서는 비드 충진 부피가 3.3~3.5mL로 감소 하였다. 충진 개시 시점의 비드와 30분 경과 후 비드의 사진을 도 2에 나타냈다. 이 결과 실시예 1-2의 비드 형성에 사용된 100mM 염화칼슘의 Ca^{2 +} 이온에 의해 형성된 비드에 부가적으로 2가 금속 이온이 알긴산의 카르복실기와 결합하여 비드의 부피 감소 및 강도 증가에 영향을 준 것으로 보여진다.

실시예 3: 망간 이온 처리에 의한 전환율 증가

실시예 1-1 재조합 균주의 사이코스 에피머화 효소는 금속 이온에 의해 특이적으로 과당으로부터 사이코스 전환 반응성이 증가하는 점이 있다. 특히, 상기 재조합 균주를 이용하여 제조된 비드는 실시예 2에서 비드의 부피 감소 및 강도 증가에 효과가 있는 Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, Cu^{2 +} 을 포함하는 총 7가지 금속 이온들로 금속 이온이 1mM 내지 15mM 포함된 과당 함유된 반응물 또는 금속 이온이 1mM 내지 15mM 포함된 물에서 30 ℃ 내지 70℃ 온도에서 10분 이상 담지하여 금속이온 처리를 수행하여 제조된 비드들을 사이코스 전환 반응성을 높이는 금속이온으로 사용될 수 있으나, 바람직하게는 망간 이온이 1mM 내지 15mM 포함된 과당 함유된 반응물 또는 금속 이온이 1mM 내지 15mM 포함된 물에서 상기 조건으로 반응하여 처리된 비드를 과당 함유 기질에서 반응시, 도 3에 나타난 결과와 같이 사이코스 전환 반응성의 증가에 사용될 수 있으며, 이와 동시 망간 이온 처리에 의한 비드의 부피 감소를 도 3과 같이 될 수 있어 망간에 의한 사이코스 전환 반응성 증가와 비드의 부피 감소 효과를 동시에 가질 수 있었다.

실시예 4: 금속이온 함유 기질을 이용한 비드의 처리

4-1: 망간 이온 처리 비드의 제조

실시예 1-2에서 얻은 균체-함유 비드를 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거한 후, 망간 이온 처리용 과당 함유 기질 (10mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50brix 결정 과당)을 비드의 충분한 반응을 위해 비드 부피의 2배 이상의 부피로 투입한 후 50℃ 항온 수조에서 30분 내지 60 분 동안 서서히 교반하여 비드에 망간 이온을 처리하였다. 그런 후, 채를 통해 비드 표면의 상기 과당 함유 기질을 제거 후, 사이코스 전환에 사용되는 생산용 과당 함유 기질 (1mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50bx 결정 과당)을 비드의 충분한 세척을 위해 비드 부피의 2배 이상으로 투입 후 10분간 교반하여 새로운 기질로 교체하는 방법으로 최소 2회 이상 반복 세척하여 기존 망간 이온 미 처리 알긴산 비드에 비해 생산성 향상 및 강도가 증가된 비드를 제조하였다. 상기 제조된 비드의 실체현미경 사진(배율 X40)을 도 6에 나타냈다.

4-2: 비드 물성 평가

실시예 4-1에서 제조된 망간 이온 처리 비드와 실시예 1-3 의 망간 이온 미처리 비드에 대해서, 비드입경, 비드 함수율 및 비드 팽윤율을 구하여 하기 표 2에 나타냈다. 비드 함수율은 비드 전체 중량중 수분 함량을 퍼센트로 나타낸 것이며, 팽윤율은 액상 기질에 접촉하기 전의 비드 입경 100을 기준으로, 액상 기질과 접촉시 비드 입경의 비율로 나타냈다.

측정 항목	망간 미처리구	망간 처리구
비드 입경(mm)	1.9~2.1	1.5~1.7
함수율 (%)	88.7%	80.6%
팽윤율 (%)	157	118

표 2에 나타낸 바와 같이, 망간 이온 처리 비드와 망간 이온 미 처리 비드의 특성을 비교하면, 망간 처리 비드는 망간 처리구 비드에 비해 비교적 입경 80% 수준, 함수율 90% 수준 그리고 팽윤율 75% 수준으로 비교적 망간 처리 비드에 비해 낮은 수치를 보였다. 이는 망간 처리비드에 비해 비드의 입경 감소로 비드 내부에 함유할 수 있는 수분 또는 기질 함유율이 낮아지는 것과 망간 처리에 의한 비드의 팽윤율이 감소했음을 보여준다.

4-3: 비드를 이용한 전환율 평가

실시예 1-3에서 제조된 균체 고정화 비드(망간 이온 미처리 비드)와 실시예4-1에서 제조된 망간 이온 처리 비드를, 하기의 고정화 반응 조건으로 생산용 과당 함유 기질 (1mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50bx 결정 과당)로부터 전환된 사이코스 전환 반응물의 사이코스 함유량을 반응 일수별로 비교한 결과를 표 3에 나타냈다.

또한, 실시예 4-1에 따라 금속 이온 처리 비드와 미처리 비드 팽윤도를 도 4에 나타냈다.

<고정화 반응 조건>

(1) 반응 온도: 60 ℃

(2) 반응 기질: 40 brix 결정 과당액 (pH 6.8 - 7.2 조절)

(3) 컬럼 반응: 동일 유속 비교 반응 (초기 유속 고정 반응)

(4) 안정성 기간: 사이코스 함량 25% 이상 유지 기간 비교

반응 일수 (Day)	실시예 1-3의 망간 미 처리 비드 (전환 반응물의 사이코스 함량 %)	실시예 4-1의 망간 처리 비드 (전환 반응물의 사이코스 함량 %)
1.0	29.28	29.49
2.0	29.28	29.49
2.5	29.47	29.54
3.0	27.88	28.88
3.5	25.48	28.47
4.0	23.15	27.95
5.0	18.07	26.06
6.0	17.81	25.87

표 3에 나타낸 것과 같이, 실시예 4-1의 망간 처리구와 실시예 1의 망간 미처리 비드를 적용한 고정화 컬럼에서, 반응초기에는 전환율이 모두 높았으나, 반응 3일차부터 망간 미처리구의 전환율이 점차 떨어져 반응 6일전에 초기 전환율의 절반으로 감소하였다. 반면, 망간 이온 처리구는 반응 6일차에서도 25% 이상의 전환율을 보였으며, 이는 망간 이온 처리구가 미처리구에 비해 높은 전환율을 나타낼 뿐만 아니라 장기간 안정하게 높은 전환율을 나타냄을 확인한 것이다.

4-4: 비드의 생산성과 안정성 평가

실시예 4-1에서 제조된 망간 처리 비드와, 실시예 1-3의 망간 미처리 비드에 대해서, 상기 고정화 컬럼에서 반응을 하여 비드의 부피 변화 및 사이코스 전환율 및 생산 안정성 등을 비교하여 표 4에 나타내었다. 고정화 반응의 조건은 실시예 4-3과 실질적으로 동일하게 수행하였다.

구분	실시예 1-3의 망간 미처리 비드	실시예 4-1의 망간 처리 비드
초기 비드 부피 (mL)	50	50
처리 후 비드 부피 (mL)	50	36
충진 부피 변화율 (%)	100	70
공간 유속 증가율	100	140
25 중량% 이상의 사이코스 함량 유지기간(일)	3.5	6.0
총 생산량 증가율	100%	173%

표 4에 나타낸 바와 같이, 고정화 컬럼 반응 전에 50mL의 비드를 잰 후 실시예 3-1의 망간 이온 처리에 의해 제조된 비드와 실시예 1-3의 망간 미처리에 의해 제조된 비드들을 고정화 컬럼에 충진하여 동일한 반응 유속으로 반응 결과 비드 부피가 감소된 망간 처리 비드는 실제 공간 유속이 1.4배 증가되었다. 또한, 사이코스 함량 25% 이상 유지 기간에서 망간 미처리구가 3.5일간 유지 된 반면 망간 이온 처리구는 6일간 유지되었다. 이 결과 총 생산량 증가율에서 망간 처리구가 망간 미처리구에 비해 약 1.7배 높은 생산량을 나타내었다.

실시예 5: 금속 이온 처리 및 팽윤 억제제 코팅 비드의 제조

5-1: 팽윤 억제제 코팅 비드의 제조

실시예 1-3에서 얻어진 세척이 완료된 균체-함유 비드에, 물에 녹인 키토-올리고당(중합도 20이하, 분자량 3500 Da이하)으로 코팅하여 보다 생산 안정성이 높은 비드를 제조하였으며, 망간 이온 처리로 비드의 크기 감소 및 강도를 증가시켜 생산성이 높은 비드를 제조하였다.

구체적으로, 실시예 1-3에서 100mM 염화칼슘으로 경화 과정 후 세척이 완료된 비드를, 비드 부피 2배 부피의 0.5% (w/v) 키토-올리고당 수용액에 첨가하여, 상온에서 30분간 교반하여 알긴산 비드에 키토-올리고당을 코팅시켰다. 키토-올리고당 코팅이 완료된 비드들은 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거한 후, 비드 부피 2배수의 물로 세척 및 채를 통해 제거하여 남아 있는 키토-올리고당을 제거하였다.

세척이 완료된 코팅 비드들에 과당이 함유된 기질(pH 6.8 ~ 7.0)을 비드 부피 대비 2배 부피로 투입하여 10분간 교반하였다. 이 과정을 3회 반복하여 비드 내부를 과당 함유 기질 용액으로 치환시켰다.

상기 비드의 표면 과당액을 제거 후, 망간 이온 처리용 과당 함유 기질 (10mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50brix 결정 과당)을 비드의 충분한 반응을 위해 비드 부피의 2배 이상의 부피로 투입한 후 50℃ 항온 수조에서 30분 내지 60 분 동안 서서히 교반하여 비드에 망간 이온을 처리하였다. 그런 후, 채를 통해 비드 표면의 상기 과당 함유 기질을 제거 후, 사이코스 전환에 사용되는 생산용 과당 함유 기질 (1mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50bx 결정 과당)을 비드의 충분한 세척을 위해 비드 부피의 2배 이상으로로 투입 후 10분간 교반하여 새로운 기질로 교체하는 방법으로 최소 2회 이상 반복 세척하여 기존 망간 이온 미처리 알긴산 비드에 비해 생산성 향상 및 강도가 증가된 비드를 제조하였다. 상기 제조된 비드의 실체현미경 사진(배율 X40)을 도 6에 나타냈다.

5-2: 비드 물성 평가

실시예 5-1에서 제조된 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드와, 실시예 1의 망간 미처리 비드에 대해서, 실시예 4-2에 기재된 측정방법과 동일한 방법으로 비드입경, 비드 함수율 및 비드 팽윤율을 구하여 하기 표 5에 나타냈다.

금속 이온	실시예 1-3 코팅전 균체-함유 비드	실시예 5-1 코팅 및 망간 처리 비드
비드 입경(mm)	1.9~2.1	1.6~1.8
함수율 (%)	88.7	82.3
팽윤율 (%)	157	103

표 5에 나타낸 바와 같이, 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드(실시예 5-1)와 이러한 처리를 하지 않은 단순 균체-함유 비드 (실시예 1-3)의 특성을 비교하면, 코팅 및 망간 처리 비드는 단순 균체-함유 비드에 비해 비교적 입경이 85% 수준, 함수율 92% 수준 그리고 팽윤율 66% 수준으로 비교적 단순 균체-함유 비드에 비해 낮은 수치를 보였다. 이는 코팅 및 망간 처리에 의해 비드의 입경 감소로 비드 내부에 함유할 수 있는 수분 또는 기질 함유율이 낮아지는 것과 코팅에 의한 비드의 팽윤율이 감소했음을 보여준다.

5-3: 비드의 전환율 평가

실시예 5-1에서 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드 (처리구)와 실시예 1의 단순 균체-함유 비드 (미처리구)을 고정화 반응 컬럼에 채운 후, 하기의 고정화 반응 조건으로 생산용 과당 함유 기질 (1mM MnCl₂.4H₂O 포함 중량 50bx 결정 과당)로부터 전환된 사이코스 전환 반응물의 사이코스 함유량을 반응 일수별로 비교한 결과를 표 6에 나타냈다.

<고정화 반응조건>

(1) 반응 온도: 50 ℃

(2) 컬럼 반응: 동일 유속 비교 반응 (초기 유속 고정 반응)

(3) 반응 기질: 40 brix 결정 과당액 (pH 6.8 - 7.2 조절)

(4) 안정성 기간: 전환율 20% 이상 유지 기간 비교

반응 일수 (day)	실시예 1-3의 비드 (전환 반응물의 사이코스 함량 %)	실시예 5-1의 비드 (전환 반응물의 사이코스 함량 %)
0	27.10	27.10
1	27.66	27.74
2	27.48	27.90
6	27.29	27.74
7	27.19	27.83
8	26.90	27.74
9	26.26	27.59
12	24.17	27.45
13	23.61	27.13
14	23.45	26.91
15	20.75	26.79
16	19.39	26.33
19	-	25.41
20	-	24.17
21	-	23.39
22	-	22.26
23	-	20.94

표 6에 나타낸 것과 같이, 실시예 5-1의 키토-올리고당 코팅 비드와 실시예 1-3의 망간 미처리 비드를 적용한 고정화 컬럼에서 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간을 비교한 결과, 망간 미처리 비드를 적용한 고정화 컬럼에서는 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간이 15일에 비해, 키토-올리고당 코팅된 비드의 경우 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간이 23일로서, 망간 미처리 비드 결과 대비 약 1.5배 안정성이 증가한 결과를 나타내었다. 이 결과 키토-올리고당 코팅 비드가 미처리 알긴산 비드에 비해 생산 안정성이 높게 나타냄을 확인한 것이다.

5-4: 비드의 생산성과 안정성 평가

실시예 5-1에서 제조된 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드와 실시예 1의 망간 미처리 비드에 대해서, 상기 고정화 컬럼에서 반응을 하여 전환율 및 생산 안정성을 비교하여 표 7에 나타내었다. 고정화 반응의 조건은 실시예 5-3과 실질적으로 동일하게 수행하였다.

또한, 실시예 5에 따라 금속 이온 처리 및 고분자 코팅처리후 얻어진 균체-함유 비드를 이용하여 과당 함유 기질로 고정화 칼럼 반응을 수행한 후에, 충진 비드의 팽윤도를 비교한 사진을 도 5에 나타냈다.

구분	실시예 1-3의 망간 미처리 비드	실시예 5-1의 망간 및 코팅처리 비드
반응 전 비드 부피 (mL)	50	50
반응 후 비드 부피 (mL)	71.3	52.6
충진 부피 변화율 (%)	142.5	105.3
20 중량% 이상의 사이코스 함량 유지기간 (일)	15.0	23.0
총 생산량 증가율(%)	100%	153%

표 7에 나타낸 바와 같이, 고정화 컬럼 반응 전에 50mL의 비드를 잰 후 실시예 5-1의 키토-올리고당 코팅 알긴산 비드와 실시예 1-3의 망간 미처리에 의해 제조된 비드들을 고정화 컬럼에 충진하여 동일한 반응 유속으로 반응 결과 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간 동안의 총 시럽 생산량 증가율에서 키토-올리고당 코팅 알긴산 비드구가 미처리 알긴산 비드에 비해 약 1.5배 높은 생산량을 나타내었다.

또한, 각 제조된 비드들을 50mL의 동일한 부피로 고정화 컬럼에 충진 후 반응 전과 후의 비드의 충진 부피를 비교한 하였을 때, 미처리된 알긴산 비드는 충진 부피의 변화율이 141.5%로 나타났으나 키토-올리고당 코팅 비드의 부피 변화율은 105.3%로 변화율이 매우 낮았다. 이는 키토-올리고당의 다량의 아민기가 알긴산의 카르복실기와 결합에 의해 강한 이온 결합력를 가져 기존 알긴산 비드의 단점인 열, 반응 pH 또는 반응 기질에 함유된 이온들에 의해 비드의 결합력이 약화되어 비드의 팽윤(swelling)이 일어난 것을 키토-올리고당 코팅에 의해 크게 감소 시킨 결과이다.

실시예 6: 동결 건조 비드

6-1: 동결 건조 비드의 제조

실시예 1-2에서 얻어진 세척이 완료된 비드를, 메쉬(mesh)가 있는 채를 통해 표면의 물기를 제거한 후, -70℃에서 2시간 이상 방치하여 비드를 동결한 다음 비드의 물기를 제거하여 동결 건조기에서 동결된 비드의 수분을 완전 제거하여 건조된 비드를 제조하거나 바람직하게는 -70℃에서 2시간 이상 방치하여 비드를 동결한 다음 비드의 물기를 제거한 후 -70℃에서 비드를 다시 한번 동결을 시킨 다음 비드들을 동결 건조기에서 동결된 비드의 수분을 완전 제거하여 건조된 비드를 제조하였다.

상기 동결 건조된 비드들은 실시예 4-1의 망간 이온 처리 비드의 제조 방법과 동일하게 망간 이온 처리를 하여 최종적으로 망간 이온 처리가 된 동결 건조 비드를 제조하였으며, 상기 제조된 비드의 실체현미경 사진(배율 X40)을 도 6에 나타냈다.

6-2: 동결 건조 비드 특성 평가

실시예 6-1에서 제조된 동결 건조 비드와 실시예 4-1의 망간 처리 비드에 대해, 실시예 4-2의 측정방법과 실질적으로 동일한 방법으로 비드입경, 비드 함수율 및 비드 팽윤율을 구하여 하기 표 8에 나타내었다.

구분	실시예 1-3의 망간 미처리 비드	실시예 6-1의 동결건조 비드
비드 입경(mm)	1.9~2.1	1.1-1.3
함수율 (%)	88.7%	15.3%
팽윤율 (%)	157	121

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 6-1의 동결 건조 처리 비드와 실시예를 1-3의 망간 미처리 비드의 특성을 비교하면, 코팅 및 망간 처리 비드는 동결 처리 비드에 비해 비교적 입경이 60% 수준, 함수율 17% 수준 그리고 팽윤율 78% 수준으로 망간 처리 비드에 비해 낮은 수치를 보였다. 이는 동결 건조 비드가 입경 감소로 비드 내부에 함유할 수 있는 수분 또는 기질 함유율이 낮아지는 것과 동결에 의한 비드의 팽윤율이 감소했음을 보여준다.

6-3: 비드의 전환율 평가

실시예 6-1에서 제조된 동결 건조처리된 비드를 하기 고정화 반응 조건에서 반응 일수 별로 반응 산물내 포함된 사이코스 함량 변화를 기록한 결과를 표 9에 나타내었다. 또한, 고정화 반응일수에 따른 사이코스 시럽 전환율을 도 7에 나타냈다.

<고정화 반응 조건>

(1) 반응 온도: 50 ℃

(2) 반응 기질: 50 brix 결정 과당액 (pH 6.8 - 7.2 조절)

(3) 컬럼 반응: 초기 유속 고정 반응

(4) 안정성 기간: 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간 비교

반응 일수 (day)	실시예 6-1의 비드 사이코스 함량 (%)
0	27.60
1	27.57
3	27.59
6	27.47
7	27.77
8	27.48
10	27.50
13	27.15
14	26.84
15	26.55
17	26.84
18	26.26
21	25.46
22	25.36
24	24.89
26	23.85
27	22.83
28	21.89
29	20.44
30	18.91

표 9에 나타낸 것과 같이, 상기 제조된 망간 처리된 동결 건조비드를 실시예 1-3의 망간 미처리 비드를 적용한 고정화 컬럼에서 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간을 비교한 결과 코팅된 비드의 사이코스 함량 20% 이상 유지기간이 23일로 나타나 망간 미처리 비드를 적용한 고정화 컬럼에서는 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간이 15일에 비해 약 1.5배 안정성이 증가한 결과를 나타내었다. 이 결과 키토-올리고당 코팅 비드가 미처리 알긴산 비드에 비해 생산 안정성이 높게 나타냄을 확인한 것이다.

실시예 7: 비드의 생산성과 안정성 평가

실시예 6-1에서 제조된 동결 건조된 및 망간 처리 비드와 실시예 5-1의 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드에 대해서, 상기 고정화 컬럼에서 반응을 하여 전환율 및 생산 안정성을 비교하여 표 10에 나타내었다. 고정화 반응의 조건은 하기와 같이 수행하였다.

<고정화 반응 조건>

(1) 반응 온도: 50℃

(2) 반응 기질: 50 brix 결정 과당액 (pH 6.8 - 7.2 조절)

(3) 컬럼 반응: 초기 유속 고정 반응

(4) 안정성 기간: 사이코스 함량 20% 이상 유지 기간 비교

구분	실시예 5-1 비드	실시예 6-1 비드
반응 전 비드 부피 (mL)	50	50
반응 후 비드 부피 (mL)	52.6	50
충진 부피 변화율 (%)	105.3	100.0
공간 유속 증가율 (%)	100	180
사이코스 함량 유지기간(일) (함량 20.0% 이상)	23.0	29.0
총 생산량 증가율 (%)	100	227

표 10에 나타낸 바와 같이, 고정화 컬럼 반응 전에 50mL의 비드 부피를 측정한 후 실시예 6-1의 동결 건조 비드와 실시예 5-1의 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드를 고정화 컬럼에 충진하여 동일한 반응 유속으로 반응 결과, 반응산물내 포함된 사이코스 함량을 20% 이상으로 유지 기간 동안 총 시럽 생산량 증가율에서 6-1의 동결 건조 비드가 5-1의 키토-올리고당 코팅 및 망간 처리 비드에 비해 약 2.2배 높은 생산량을 나타내었다.

이는 동일한 충진 부피 반응일 때, 실시예 4-1의 망간 처리 비드 및 실시예 5-1의 코팅 비드들에 비해, 실시예 6-1의 비드 크기가 1/2 수준으로 감소되는 것과 균체 활성의 감소가 거의 없는 동결 건조 처리 방법에 의해 동일한 부피의 비드 충진 고정화 컬럼 반응시 공간 유속 (SV)가 1.8배 증가한 결과를 나타내며, 특징적으로 동결 처리된 비드의 팽윤 현상(swelling) 감소 등으로 비드의 안정성을 높여, 사이코스 총 생산량에서 미 동결 처리 비드에 비해 2.2배 높은 생산량을 달성할 수 있었다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Psicose-producing bead and preparation method for the same <130> DPP20151030KR <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sod promoter (6) <400> 1 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgaaaggat tacaaa 356 <210> 2 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac1 promoter (4) <400> 2 tgacaattaa tcatcggctc gtatattgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 60 aggaaacaga attcccgggg aaaggattac aaa 93 <210> 3 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tac2 promoter (4) <400> 3 tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt taacaatttg tggaattgtg agcggacaca 60 caggaaacag accatggaat tcgagctcgg tacccgggga aaggattaca aa 112 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trc promoter (1) <400> 4 tgacaattaa tcatcggcct cgtataatgt 30 <210> 5 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ribosome binding region <400> 5 gaaagga 7 <210> 6 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer sequence <400> 6 ttacaaa 7 <210> 7 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of an enzyme protein originated from Clostridium scindens <400> 7 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys <210> 8 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence (1) of the enzyme protein of SEQ ID NO: 7 <400> 8 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaataa 870 <210> 9 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified nucleic acid sequence(2) of the enzyme protein of SEQ ID NO:7 <400> 9 atgaagcacg gcatctacta cgcatactgg gagcaggagt gggcagcaga ctacaagcgc 60 tacgttgaga aggcagcaaa gctgggcttc gacatcctgg aggttggcgc agcaccactg 120 ccagactact ccgcacagga ggttaaggag ctgaagaagt gcgcagacga caacggcatc 180 cagctgaccg caggctacgg cccagcattc aaccacaaca tgggctcctc cgacccaaag 240 atccgcgagg aggcactgca gtggtacaag cgcctgttcg aggttatggc aggcctggac 300 atccacctga tcggcggcgc actgtactcc tactggccag ttgacttcgc aaccgcaaac 360 aaggaggagg actggaagca ctccgttgag ggcatgcaga tcctggcacc aatcgcatcc 420 cagtacggca tcaacctggg catggaggtt ctgaaccgct tcgagtccca catcctgaac 480 acctccgagg agggcgttaa gttcgttacc gaggttggca tggacaacgt taaggttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaggag tcctccatcg gcgacgcaat ccgccacgca 600 ggcaagctgc tgggccactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggttcc aggcaagggc 660 cgcaccccat ggcgcgagat cggcgacgca ctgcgcgaga tcgagtacga cggcaccgtt 720 gttatggagc cattcgttcg catgggcggc caggttggct ccgacatcaa ggtttggcgc 780 gacatctcca agggcgcagg cgaggaccgc ctggacgagg acgcacgccg cgcagttgag 840 ttccagcgct acatgctgga gtggaagtaa 870

Claims (24)

1. 사이코스 생산 효소 또는 균체와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 압축처리된 압축 비드로서, 압축처리 전 비드의 평균입경 100을 기준으로 압축 비드의 평균입경이 50 내지 100이고, 액상 기질과 반응에서 비드 평균입경의 팽윤율이 100 내지 155인 사이코스 생산용 압축 비드로서, 상기 압축처리는 균체 또는 효소가 함유된 비드를 2가 금속이온으로 처리하거나, 효소 또는 균체와 담체를 함유하는 비드를 동결건조하는 것인, 압축 비드.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 압축 비드는 15 내지 88%의 함수율을 갖는 것인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 압축 비드는 액상 기질과 반응에서 비드 평균입경의 팽윤율이 100 내지 155인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 압축비드의 평균입경이 1.1mm 내지 1.8mm 인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 압축 비드는, 40 내지 50 brix 농도의 과당-함유 기질로부터 얻어지는 반응물의 사이코스 함량이 20 중량% 이상을, 15일 이상의 기간 동안 제공하는 것인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 압축 비드는, 40 내지 50 brix 농도의 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 조건에서 압축처리전 비드 대비 사이코스 생산량 1.5배 이상인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 사이코스 생산 균체는 코리네박테리움속 균주인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 비드 압축처리는, Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, 및 Cu^{2 +} 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 2가 금속이온으로 처리하는 것인 사이코스 생산용 압축 비드.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 비드 압축처리는, 균체 또는 효소가 함유된 비드를 2가 금속이온 처리 후 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 것인 사이코스 생산용 압축 비드.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 팽윤 억제제는 키토산, 키틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토-올리고당(Chito-oligosaccharide) 및 폴리라이신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 사이코스 생산용 압축 비드.
    
12. 삭제
13. 제 1 항에 있어서, 상기 동결건조는 -90℃ 내지 -10℃ 온도 범위에서 동결하고, 10 mtorr 미만의 압력하에서 -40℃ 내지 20℃ 온도범위에서 건조하는 것인 사이코스 생산용 압축 비드.
    
14. 사이코스 생산 균체 또는 효소와 담체로서 알긴산 또는 이의 염을 포함하는 혼합 용액을, 2가 양이온 염화화합물이 포함된 반응액에 적하하여 효소 또는 균체-함유 비드를 형성하는 단계; 및 상기 비드에 압축처리를 수행하는 단계;를 포함하는 사이코스 생산용 압축 비드의 제조방법으로서,
    상기 압축 비드의 평균입경은, 압축처리전 비드의 평균입경 100을 기준으로 50 내지 100이고, 액상 기질과 반응에서 팽윤율이 100 내지 155인 사이코스 생산용 압축 비드의 제조방법.
    
15. 제 14 항에 있어서, 상기 제조방법은 비드를 형성하는 단계 이후에,
    균체 또는 효소-함유 비드를 경화하는 단계, 2가 양이온 염화화합물을 세척하는 단계, 및 균체 또는 효소-함유 비드를 과당-함유 기질로 처리하는 단계로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 처리단계를 포함하는 것인 제조방법.
    
16. 제 14 항에 있어서, 상기 압축처리 단계는, 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정, 팽윤 억제제로 비드를 코팅하는 공정, 및 비드를 동결건조하는 공정으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정으로 수행되는 것인 제조방법.
    
17. 제 16 항에 있어서, 상기 2가 금속이온으로 비드를 처리하는 공정은, Mn^{2 +}, Zn²⁺, Co^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +}, Fe^{2 +}, 및 Cu^{2 +} 로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 2가 금속이온으로 처리하는 것인 제조방법.
    
18. 제 16 항에 있어서, 상기 비드 압축처리는, 균체 또는 효소와 담체가 함유된 비드를 2가 금속이온 처리후 팽윤 억제제로 코팅하는 것인 제조방법.
    
19. 제 18 항에 있어서, 상기 팽윤 억제제는 키토산, 키틴, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌이민(PEI), 키토-올리고당(Chito-oligosaccharide) 및 폴리라이신으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 제조방법.
    
20. 제 16 항에 있어서, 상기 동결건조는 -90℃ 내지 -10℃ 온도 범위에서 동결하고, 10 mtorr 미만의 압력하에서 -40℃ 내지 20℃ 온도범위에서 건조하는 것인 제조방법.
    
21. 제1항 내지 제11항 및 제 13항 내지 제16항중 어느 한항에 따른 사이코스 생산용 압축 비드를 이용하여 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법.
    
22. 제 21 항에 있어서, 상기 과당-함유 원료는 과당을 40 내지 75%(w/w)의 농도로 포함하는 것인 방법.
    
23. 제 21 항에 있어서, 상기 사이코스 생산용 압축 비드를 고정화 칼럼에 충진하여 과당-함유 기질로부터 사이코스를 생산하는 방법.
    
24. 제 23 항에 있어서, 상기 방법은 40 내지 50 brix 농도의 과당-함유 기질로부터 얻어진 반응물의 사이코스 함량이 20 중량% 이상을, 15일 이상의 기간 동안 제공하는 것인 방법.
    

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