KR101607633B1

KR101607633B1 - 코리네박테리움속 균주를 이용한 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR101607633B1
Application number: KR1020140142930A
Authority: KR
Inventors: 허진솔; 김혜정; 권순규; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2014-10-21
Filing date: 2014-10-21
Publication date: 2016-04-11

Abstract

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 또는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물을 제공하여, 자당 지방산 에스테르를 사용하여 상기 균주의 사이코스 생산량 및 전환능을 증가시킬 수 있다.

Description

코리네박테리움속 균주를 이용한 사이코스 생산방법{Method for producing psicose using the corynebacterium}

본 발명은 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 또는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물에 관한 것으로서, 자당 지방산 에스테르를 사용하여 상기 균주의 사이코스 생산량 및 전환능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

사이코스는 다이어트 감미료로서 각광을 받고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 대량 생산하는 기술의 개발이 필요하다.

종래의 사이코스 제조 방법은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 방법이 대부분이었다. 효소적 방법에 의한 사이코스 제조방법에 관한 기술로는, 한국등록특허 10-0744479호 형질전환 대장균을 이용하여 아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소를 대량 생산하고, 생산된 효소를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 기재하고 있다.

그러나 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않았다. 또한 기존의 효소들은 느린 반응 속도로 인해 사이코스 수율이 저조하여 제조원가가 상승된다는 문제가 있었다. 또한, 효소를 정제하고 그 정제된 효소를 고정화하여 사이코스 생산성을 높이는 방향으로 연구되어왔다. 이처럼 효소를 정제하는 과정에는 시간 및 비용이 많이 요구되는 것이 현실이다.

코리네박테리움(corynebacterium)속 균주는 그람 양성(gram positive) 균주로서, GRAS(Generally regarded as safe) 등급의 균주로 산업 미생물로 많이 사용되고 있다. 예를 들면, 코리네박테리움속 균주는 글루타메이트, 라이신, 트레오닌과 같은 아미노산 및 이노신산과 같은 퓨린 계열의 핵산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰은 생장 조건이 간단하며, 대장균에 비해 4배 가량 고농도 배양이 가능하고, 안정적 유전체 구조를 가져 돌연변이 발생 확률이 낮다. 또한, 비병원성 균주이고 포자를 만들지 않아 환경에 유해한 영향을 미치지 않는 등 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다.

그러나, 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포벽은 두꺼운 층의 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로 이루어져 있기 때문에 기질과 생산물질이 균주의 세포벽을 통과하기 어려우며, 결과적으로 세포 반응을 통해 생산물질을 얻고자 할 때 낮은 수율로 생산물을 얻을 수 밖에 없다.

이러한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포에 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 또는 사이코스 생산량 또는 전환율을 증가시키는 방법을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 자당 지방산 에스테르를 포함하는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주의 세포에 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법, 및 자당 지방산 에스테르를 포함하며사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 세포한 사이코스 생산방법 또는 상기 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물에 있어서, 비이온 계면활성제인 자당 지방산 에스테르를 사용함으로써 상기 균주의 사이코스 생산량 및 전환능을 증가시킬 수 있다. 자당 지방산 에스테르는 비이온성 계면활성제의 일종으로서, 비이온성 계면활성제에 속하는 다른 유화제, 예를 들면 폴리솔베이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄지방산 에스테르 또는 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르 등과 달리, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포에 처리시 효소 활성이 증가시켜 과당-함유 원료를 이용한 사이코스 생산방법에 유효하게 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르는 반응산물에서 제거하기 어려우며, 코리네박테리움속 균주 세포의 세포 투과성을 지나치게 증가시켜 효소 손실 및 활성감소로 이어질 수 있다. 또한 자당 지방산 에스테르를 처리한 균주세포를 사이코스 전환에 사용하므로, 식품첨가물로 허용되는 자당 지방산 에스테르는 더욱 바람직하다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포에, 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움속 균주 세포를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는, 코리네박테리움속 균주 세포와 과당-함유 원료를 접촉하는 단계를 수행하기 전 또는 접촉하는 단계와 함께 수행될 수 있다. 과당-함유 원료를 접촉하는 단계를 수행하기 전에, 코리네박테리움속 균주의 전세포에 자당 지방산 에스테르 유화제를 처리하는 공정을 먼저 수행하는 경우에는, 유화제를 제거하고 상기 처리된 세포만을 분리하여 과당-함유 원료와 접촉하거나, 또는 상기 처리액에 과당-함유 원료를 첨가하여 사이코스 전환반응을 수행할 수 있다.

상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는, 코리네박테리움속 균주 세포를 포함하는 세포 현탁액에 자당 지방산 에스테르를 첨가하거나, 담체에 고정화된 코리네박테리움속 균주 세포에 자당 지방산 에스테르를 처리하여 수행될 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 상기 자당 지방산 에스테르는 탄소수 10 내지 18을 갖는 지방산을 포함하는 자당 지방산 에스테르일 수 있으며, 예를 들면 자당 스테아린산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 미리스틴산 에스테르 및 자당 라우린산 에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한, 상기 자당 지방산 에스테르는, 상기 지방산의 모노에스테르, 디에스테르, 트리에스테르 및 폴리에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 자당 지방산 에스테르는, 자당 지방산 에스테르 100 중량%를 기준으로 결합된 지방산이 60 내지 99 중량%일 수 있다.

자당 지방산 에스테르(sucrose esters of fatty acid)는 식품 첨가물로서 유화제 등으로 널리 사용되는 것으로 특히 본 발명과 같은 사이코스 제조공정에 더욱 바람직하다. 자당 지방산 에스테르의 구체적인 예를 하기 표 1에 나타낸다.

유화제	구성요소
유화제	결합지방산 함량 (중량%)	모노에스테르의 비율	디/트리/폴리에스테르의 비율
자당스테아린산에스테르(S-1170)	70%	55	45
자당스테아린산에스테르(S-1570)	70%	70	30
자당스테아린산에스테르(S-1670)	70%	75	25
자당팔미틴산에스테르(P-1570)	80%	70	30
자당팔미틴산에스테르(P-1670)	80%	80	20
자당미리스틴산에스테르(M-1695)	95%	80	20
자당라우린산에스테르(L-1695)	95%	80	20

본 발명에 따라 상기 자당 지방산 에스테르는 처리하는 단계는, 자당 지방산 에스테르를 분말상으로 균주 현탁액에 첨가하거나, 용매에 분산 또는 용해시킨 용액으로 첨가할 수 있다.

바람직하게는, 상기 자당 지방산 에스테르의 처리는 용매 및 자당 지방산 에스테르를 포함하는 용액으로 처리할 수 있으며, 상기 용액중 자당 지방산 에스테르의 함량은 0.02 내지 0.15 w/v%일 수 있다. 유화제 함량이 0.02 w/v%보다 적은 양으로 처리하면 충분한 유화제 처리효과를 달성하기 어려우며, 0.15%를 초과하는 경우에는 세포투과가 과도하게 발생되어 코리네박테리움속 균주의 사이코스 전환 효소의 활성에 좋지 않은 영향을 초래할 수 있다.

상기 용매는 물, 아세톤, C1-4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매일 수 있으며, 바람직하게는 물, 아세톤 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 구체적 일예에서, 자당 지방산 에스테르; 물; 및 아세톤, C1-4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 포함하는 조성물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 전체 용액 100 w/v% 기준으로, 상기 자당 지방산 에스테르는 0.02(w/v)% 내지 0.15(w/v) % 범위, 유기용매는 5 (v/v)% 내지 50(v/v)% 농도 범위 및 잔량의 물을 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명의 일예에서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 처리온도 20℃ 내지 50℃ 범위 및 처리시간 10분 내지 180 분으로 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일예에서, 탄소수 10 내지 18을 갖는 지방산을 함유하는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 바람직하게는 탄소수 10 내지 18을 갖는 지방산을 함유하는 자당 지방산 에스테르를 0.02 (w/v)% 내지 0.15 (w/v)%로 포함하는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물로서, 상기 자당 지방산 에스테르에 의해 과당-함유 원료로부터 사이코스의 생산량을 증가시키는 것인 조성물을 제공하는 것이다.

상기 자당 지방산 에스테르은 상기 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법에서 기술한 바와 같다.

구체적 일예에서, 본 발명에 따른 조성물은 자당 지방산 에스테르; 및 물, 아세톤, C1-4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 포함하며, 상기 용매는 물, 아세톤 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것이 더욱 바람직하다.

상기 조성물은 자당 지방산 에스테르; 물; 및 아세톤, C1-C4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 포함하며, 상기 전체 조성물 100 (w/v)% 기준으로 자당 지방산 에스테르는 0.02(w/v)% 내지 0.15(w/v) % 범위, 유기용매는 5 (v/v)% 내지 50(v/v)% 농도 범위 및 잔량의 물을 포함하는 것인 조성물일 수 있다.

자당 지방산 에스테르(sucrose esters of fatty acid)는 식품 첨가물로서 유화제 등으로 널리 사용되는 것으로 특히 본 발명과 같은 사이코스 제조공정에 더욱 바람직하다.

비이온성 계면활성제는 이온성 계면활성제와는 달리 수용액에서 이온으로 해리하지 않고, 수산기(-OH)나 폴리옥시에틸렌기(polyoxyethylene등의 친수기와 수화작용에 의하여 물에 분산 또는 용해하는 특징을 가지는 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제는 다양한 화합물을 포함한다. 비이온성 계면활성제에 속하는 폴리솔베이트, 예컨대 폴리옥시에틸렌 솔비탄모노스테아레이트와 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트 등 (상표명 Tween)과 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르 (상표명 Triton) 등이 널리 사용되고 있으나, 이들 계면활성제는 세포투과성을 지나치게 증가시켜 효소 유실 및 활성 감소로 이어질 우려가 있거나 사이코스 전환율 또는 생산량을 증가시키기에 충분한 효과를 달성하기 어려워 바람직하지 않다.

상기 코리네박테리움속 균주 세포는 사이코스 에피머라제가 충분히 발현될 수 있으면 특별히 제한되지 않는다. 상기 사이코스 에피머라제는 특별히 한정되지 않으나 예를 들면 클로스트리디움 신댄스 (Clostridiun scidens)에서 유래한 것으로, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이 제공될 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있으며, 서열번호 2의 핵산서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 핵산서열은 첨부 서열목록에 나타낸다.

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움속 균주 발현용 프로모터, 예를 들면 대장균의 sod 프로모터, tac 프로모터, tac2 프로모터, trc 프로모터 등 다양한 프로모터를 사용할 수 있고, 추가로 복제 기점, 리더(leader), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위 및 제한효소 인식부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 포함하는 벡터를 이용하여 형질전환된 균주일 수 있다.

예를 들면, 상기 코리박테리움속 균주는 코리네박테리움속 균주로서, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라쎄콜라 (melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (efficiens) 종 또는 브레비박테리움 속, 특히 브레비박테리움 플라붐 (flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바리카툼 (divaricatum) 종의 세균이다.

상기 코리네박테리움속 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 배양에 사용될 수 있는 배지는 배양 방식과 균주에 따라, 당업계에 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.

본 발명의 일예에 따른 사이코스 생산방법은 상기 코리네박테리움속 균주를 과당-함유 원료와 접촉하여 반응시키는 단계를 포함한다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9.5, 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물을 기준으로 0.1 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 0.1 내지 100mg(dcw)/ml, 0.1 내지 50mg(dcw)/ml, 0.1 내지 10mg(dcw)/ml, 1 내지 100mg(dcw)/ml, 1 내지 50mg(dcw)/ml, 1 내지 10mg(dcw)/ml, 2 내지 100 mg(dcw)/ml, 2 내지 50mg(dcw)/ml, 2 내지 10 mg(dcw)/ml, 3 내지 100mg(dcw)/ml 3 내지 50mg(dcw)/ml, 3 내지 10mg(dcw)/ml 또는 0.25 내지 5 mg(dcw)/ml일 수 있다.

상기 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다. 따라서, 상기 코리네박테리움속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주는 세포 현탁액 또는 담체에 고정화 세포로 자당 지방산 에스테르와 반응할 수 있다. 일예에서, 상기 효소 단백질 을 발현하는 균주와 과당-함유 원료를 접촉시키는 단계는, 예컨대, 상기 효소 단백질을 발현하는 균주 등을 과당-함유 원료와 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담 체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 과당으로부터 수득된 사이코스는 통상적인 방법에 의해 정제될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자에게 통상적인 기술에 속한다. 예를 들어 원심분리, 여과, 결정화, 이온교환 크로마토그래피 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법 또는 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물을 제공하여, 자당 지방산 에스테르를 사용하여 상기 균주의 사이코스 생산능, 생산량 및 전환능을 증가시킬 수 있으며, 자당 지방산 에스테르는 식품첨가물로 허용되는 유화제로서 상기 처리한 균주세포를 사이코스 전환에 사용하므로 더욱 바람직하다.

도 1은 일 실시예의 D-사이코스 3-에피머화 효소 단백질을 corynebacterium glutamicum에서 발현하기 위한 재조합 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라, 유화제 처리 과정을 통해 반응성을 향상시킨 코리네박테리움속 균주세포를 고정화 반응을 진행하였을 때 시간경과에 따른 사이코스 생산량을 보여주시는 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 유화제 용액을 이용한 사이코스 제조

실시예 1-1: 유화제 용액의 준비

하기 표 1에 기재된 여러 가지의 자당 지방산 에스테르 유화제를 물에 용해하여 0.1 중량/부피(wt/vol)%의 농도로 각각의 유화제 용액을 준비하여 실험에 사용하였다. 상기 사용한 유화제는 자당스테아린산에스테르(S-1170), 자당팔미틴산에스테르(P-1670), 자당미리스틴산에스테르(M-1695), 및 자당라우린산에스테르(L-1695)이며, 이들의 구체적 성분은 하기 표 2에 나타냈다.

유화제	HLB	구성요소
유화제	HLB	결합지방산	모노에스테르	디/트리/폴리에스테르
자당스테아린산에스테르(S-1170)	11	70%	55	45
자당 팔미틴산에스테르(P-1670)	16	80%	80	20
자당 미리스틴산에스테르(M-1695)	16	95%	80	20
자당 라우린산에스테르(L-1695)	16	95%	80	20

실시예 1-2: 균주 준비

사이코스 생산 효소인 sod-CDPE를 발현시킨 코리네박테리움 균주 SYC321-C를 LB배지 100 ml에 접종한 후 30℃에서 16 시간 동안 배양하여 균주를 확보하였다.

구체적으로, 클로스트리디움 신댄스(Clostridiuim scindens ATCC 35704)로부터 유래된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드(DPE gene; Gene bank: EDS06411.1)를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드로 합성하고 CDPE라 명명하고, 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드와 corynebacterium gDNA와 pET21a 벡터로부터 확보한 sod 프로모터와 T7 터미네이터를 피씨알(PCR)을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 피씨알(PCR) 법으로 하나의 주형으로 연결하여 T-vector cloning을 통해 pGEM T-easy vector에 클로닝하여 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였다.

상기 확인된 전체 폴리뉴클레오티드를 제한효소 NotI과 XbaI(NEB)을 사용하여 발현벡터인 pCES208(J. Microbiol. Biotechnol., 18:639-647, 2008)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pCES208/사이코스 에피머화 효소(pCES_sodCDPEII, pCDPE)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터 pCDPE의 개열지도를 도 1에 개시하였다.

제작한 플라스미드를 전기천공법(electroporation)을 사용하여 코리네박테리움 글루타리쿰을 형질전환시켰다. 콜로니를 picking하여 카나마이신(Kanamycin)을 최종농도 15ug/ml로 첨가한 LB 배지(트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L) 4ml에 접종한 후, 배양조건 30 ℃ 및 250rpm에서 약 16 시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 상기 배양액 중 1ml을 수득하여 15 ug/ml의 카나마이신을 포함하고 있는 100ml LB 배지에 접종하여 본 배양을 16시간 이상 진행하였다.

Beadbeater를 이용하여 배양한 세포를 용해(lysis)시킨 후 상등액만 취득하여 샘플버퍼와 1 : 1로 혼합 후 100 ℃에서 5분간 가열한다. 준비한 샘플은 12% SDS-PAGE gel (조성 : running gel - 3.3 ml H₂O, 4.0 ml 30% acrylamide, 2.5 ml 1.5M Tris buffer(pH 8.8), 100 ㎕ 10% SDS, 100 ㎕, 10% APS, 4 ㎕ TEMED / stacking gel - 1.4 ml H₂O, 0.33 ml 30% acrylamide, 0.25 ml 1.0M Tris buffer(pH 6.8), 20 ㎕ 10% SDS, 20 ㎕ 10% APS, 2 ㎕ TEMED)에 180V로 약 50 분 동안 전기영동하여 단백질 발현을 확인하였다. CDPE의 발현을 SDS-PAGE gel상에서 확인 후 정확한 발현량의 측정을 위해 Ni-NTA resin을 이용한 His-tag정제 진행하여, 계산식(발현율(%) = (Purified protein(mg) / Total soluble protein(mg)) * 100)을 이용하여 발현율 계산하였다. 상기 제조된 형질전환 코리네박테리움 글루타리쿰은 전체 수용성 단백질을 16.62mg 및 정제된 효소 단백질 1.74 mg을 생산하였다.

실시예 1-3: 유화제를 이용한 사이코스 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한 유화제 용액을, 실시예1-2에서 준비한 세포를 유화제 용액으로 현탁(resuspension)하여 40 ℃에서 30분 동안 반응하였다. 이후 원심분리(centrifugation)하여 세포에서 유화제를 제거하고 세포를 완충액에 현탁한 후 세포 반응을 진행하였다.

50mM PIPES 버퍼(pH 6.5 내지 7.0)하에서 과당 농도 50(w/v)%, 1mM Mn² ⁺, 0.5 내지 1mg/ml로 첨가하고, 60 ℃에서 30분 반응 후 100 ℃에서 5분간 끓여서 반응 중지하였다. 상기 얻어진 생산물을 확인하고자, 액체 크로마토그래피 (LC) 분석을 통해 기질(과당)과 생산물질(사이코스)의 피크 확인 및 피크의 에어리어(area)를 통한 정량분석 진행하였다. 그 결과 다양한 유화제 용액에 대한 세포의 사이코스 생산에 관한 초기반응속도 (Unit/g-DCW)를 하기 표 3에 나타냈다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 ℃, 유속은 0.6ml/min로 하였다.

전환율과 생산량의 계산을 위해서 과당 농도별 샘플(10, 20, 50, 100, 120, 150mM)과 사이코스의 농도별 샘플(1, 2, 5, 10, 20, 50mM)을 준비하여 R 곱값이 0.99 이상이 되도록 표준곡선(standard curve)를 각각 그렸고 그에 따른 수식을 도출하여 피크 면적에 따른 과당 및 사이코스의 농도를 계산하였다. 계산에 사용한 수식은 각각 다음과 같다. 과당의 농도(mM) = (과당 피크의 면적값 + 4688.7) / 19538, 사이코스 농도(mM) = (사이코스 피크의 면적값 - 74.568) / 18840

최종 결과값은 초기반응속도로 나타내어 서로 비교하였으며, 이때 초기반응속도란 일직선속도구간의 반응지점에서의 생산물질의 생산량을 반응에 사용한 세포의 양과 반응 시간으로 나누어준 값을 말한다. 즉, 초기반응속도의 값이 클수록 같은 세포당, 시간당 생산되는 사이코스의 양이 많다는 것을 의미한다.

실험	유화제 종류	초기반응속도 (Unit/g-DCW)
비교예 1	불포함	203
비교예 2	O-120V (폴리옥시에틸렌 솔비탄모노라우레이트)	221
비교예 2	L-120V (폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트)	399
실시예 1	M-1695 (자당미리스틴산에스테르)	1173
실시예 1	L-1695 (자당라우린산에스테르)	1164
실시예 1	S1170 (자당스테아린산에스테르)	862
실시예 1	P1670 (자당팔미틴산에스테르)	1182

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 유화제를 처리하지 않은 비교예 1의 초기반응속도가 203 U/g-DCW인 것에 비해 유화제 처리를 진행한 샘플들은 초기반응속도가 향상된 것을 확인할 수 있었다. 자당 지방산 에스테르를 사용하여 세포를 처리한 경우, 비교예 1의 초기반응속도에 비해서 4배에서 최대 5배 정도까지 세포 초기반응속도가 향상된 것을 확인할 수 있었고, 그 외에 폴리옥시에틸렌지방산에스테르를 사용한 경우에는 세포초기반응속도가 약간은 향상됨을 보였으나 그 효과가 크지 않았다.

비교예 1: 유화제 미처리 세포를 이용한 사이코스 생산

실시예 1에 기재된 균주와 동일한 균주를 사용하여 과당으로부터 사이코스를생산하였다. 다만, 유화제 전처리 과정을 진행하지 않았을 때 코리네박테리움(corynebacterium) 균주가 어느 정도의 활성인지 확인하는 실험을 진행하였다. 상기 사이코스 생산량에 관한 실험결과를 표 3에 나타냈다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 유화제 전처리를 하지 않은 코리네박테리움 세포를 이용하여 사이코스 전환반응을 진행한 결과 기준이 되는 비교수치인 세포 초기반응속도 계산값은 예상했던 바와 같이 두꺼운 세포 외벽의 영향으로 인해 203 Unit/g-DCW로 낮은 값으로 측정되었다.

비교예 2: 폴리솔베이트계 유화제를 이용한 사이코스 생산

폴리솔베이트(polysorbate)계 유화제로서 폴리솔베이트 20 (폴리옥시에틸렌 솔비탄모노라우레이트, O-120V) 및 폴리솔베이트 80 (폴리옥시에틸렌 솔비탄모노올레이트, L-120V)을 물에 용해하여 0.1 중량/부피(wt/vol)%의 농도로 각각의 유화제 용액을 준비하여 실험에 사용하였다.

상기 준비된 유화제 용액으로 실시예 1-2 및 1-3과 실질적으로 동일한 방법으로 사이코스 전환반응을 수행하고, 얻어진 생산물을 분석하였다. 그 실험결과를 표 3에 나타냈다.

비교예 1의 결과값인 203 U/g-DCW와 비교하였을 때, 폴리옥시에틸렌계 유화제를 통해서도 약간의 효과를 얻을 수는 있으나 그 효과의 정도가 미미함을 확인하였다.

비교예 3: 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르 유화제를 이용한 사이코스 생산

실시예 1에 기재된 균주와 동일한 균주를 사용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하였다. 다만, 비이온성 계면활성제의 일종인 폴리옥시에틸 옥틸페닐 에테르인 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 0.1 중량/부피(wt/vol)%로 준비하여 세포 현탁액에 처리하고 상온에서 5분간 반응시킨 후, 원신분리하여 세포를 침전하고 유화제를 제거하였다. 이후 세포를 다시 완충액에 현탁한 후 50mM PIPES 버퍼(pH 6.5~7.0)하에서 과당 농도 50%, 1mM Mn² ⁺, 현탁한 세포는 2mg/ml로 첨가하고, 60?에서 30분 반응 후 100?에서 5분간 끓여서 반응을 중지하였다. 이 후 분석과정은 실시예 1-3과 동일하다. 분석 결과는 표 4에 나타내었다.

실험	유화제	초기반응속도 (Unit/g-DCW)
비교예 3	트리톤 X-100	3966
실시예 1	P1670 (자당팔미틴산에스테르)	1182

상기 결과에서 알 수 있듯이 트리톤 X-100은 세포 초기반응속도 3966 U/g-DCW이며 자당 지방산 에스테르는 1110U/g-DCW로 트리톤 X-100이 약 3.5배 더 좋은 효과를 보였다. 그러나 전처리 후 유화제를 제거하기 위해 원심분리를 통해 세포를 분리(cell- down)했을 때 세포의 형태가 거의 남아있지 않고 모두 분해된 형태를 보였다. 이는 트리톤 X-100의 세포 투과화 효능이 코리네박테리움에는 너무 크게 작용하여 세포의 외벽이 모두 분해된 것으로 사료된다. 이후 공정인 비드 제작을 위해서는 어느 정도 형태가 남아있는 세포가 필요하기 때문에 트리톤 X-100의 세포 투과화 효능은 뛰어나나 트리톤 X-100으로 처리된 세포는 이후 공정에 사용하기에 적합하지 않다. 또한, 비드에 고정화를 하지 않더라도 세포 현탁액 반응에서 트리톤 X-100이 반응액내에 잔류하는데, 세척을 하더라도 트리톤 X-100는 분리가 어려워서 식용으로 사용이 적합하지 않고, 세척을 수행하면 세포 외벽이 분해되어 효소가 노출된 상태이기 때문에 효소 자체가 유실될 위험이 있어 세포 현탁액 전환 반응에도 적당하지 않다.

실시예 2: 유화제 농도에 따른 사이코스 생산

자당미리스틴산에스테르(M-1695) 및 자당라우린산에스테르(L-1695) 유화제를 물에 용해하여 다양한 농도로 각각의 유화제 용액을 준비하여 실험에 사용하였다. 구체적 유화제 농도는 0.025, 0.05, 0.1, 1.0 및 2.0 (w/v)%의 유화제 용액을 제조하였다.

상기 준비된 유화제 용액으로 실시예 1-2 및 1-3과 실질적으로 동일한 방법으로 사이코스 전환반응을 수행하고, 얻어진 생산물을 분석하였다. 그 실험결과를 초기반응속도 (Unit/g-DCW)로서 표 5에 나타냈다.

실험	유화제 종류	0.025(w/v)%	0.050(w/v)%	0.1(w/v)%	1.0(w/v)%	2.0(w/v)%
비교예 4	O-120V	233	269	221	-	-
비교예 5	L-120V	383	403	399	-	-
실시예 2	M-1695	1198	1166	1173	885	779
실시예 2	L-1695	1172	1175	1164	757	436

폴리옥시에틸렌계 유화제로서 폴리옥시에틸렌 솔비탄모노라우레이트(O-120V) 및 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노올레이트(L-120V)를 사용한 비교예 4 및 5의 결과와 비교하여, 자당 지방산 에스테르 유화제를 사용한 실시예 2의 결과가 세포 초기반응속도값이 약 4 배 내지 5배 정도 높았다. 또한 유화제 농도별로 값을 비교하였을 때 값의 차이가 크지는 않았으나 유화제의 농도를 1% 이상 높은 농도로 사용한 경우에 오히려 세포 초기반응속도가 감소하는 경향을 보이므로, 지나치게 높은 농도의 유화제는 사이코스 전환반응을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 2를 통해서 0.025 w/v% 내지 0.15 w/v% 범위이 유화제 농도가 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.

비교예 4 및 5 : 유화제 농도에 따른 사이코스 생산

실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로, 폴리솔베이트계인 O-120V 및 L-120V를 물에 용해하여 0.025, 0.05, 및 0.1 (w/v)%의 농도로 각각의 유화제 용액을 준비하여 실험에 사용하였다.

실시예 3: 유기용매와 유화제를 이용한 사이코스 제조

자당스테아린산에스테르(S-1170) 및 자당팔미틴산에스테르(P-1670)의 각각 유화제에 대해서, 아세톤, 에탄올 및 iso-프로판올 각각 1 mL을 사용하여 용해한 후에 증류수 9 mL를 첨가하여 최종농도 유화제 0.1 (wt/vol)% 및 유기용매 10 (wt/vol)%가 되도록 유화제 용액을 제조하였다.

대조군으로서, 유화제 S-1170 및 P-1670을 첨가하지 않은 각각의 용매와, 상기 유화제를 각각 첨가하되 물 10mL만을 첨가한 용액에 대해 동일한 실험을 수행하였다.

상기 준비된 유화제 용액와 용매 단독에 대해서, 실시예 1-2 및 1-3과 실질적으로 동일한 방법으로 사이코스 전환반응을 수행하고, 얻어진 생산물을 분석하였다. 그 실험결과를 초기반응속도 (Unit/g-DCW)로서 표 6에 나타냈다.

구분	S1170	P1670	유화제 불포함
물	862	1182	-
Acetone	1176	1254	184
Ethanol	1106	1129	113
iso-propanol	1160	1032	144

본 발명에 따른 유기용매를 첨가한 유화제 용액으로 전처리 과정을 진행하였을 때 물만 사용한 경우보다 세포 초기반응속도도 향상된 결과를 얻을 수 있었다. 특히 S1170의 경우 물에 녹인 샘플에 비해 아세톤을 첨가한 샘플은 70%정도 향상된 결과값을 얻을 수 있었다.

실시예 4: 유화제 용액을 이용한 사이코스 제조

고정화 세포를 이용한 사이코스 생산을 하고자, 실시예 1에서와 같이 수행하여 코리네박테리움 세포를 제조하고, 원리분리로 세포를 회수하였다. 상기 회수된 세포에 물을 혼합하여 최종 균체 농도 50~80g/L 농도 범위 이내로 조절한 세포 현탁액을 제조하였다.

그런 후에 상기 세포 현탁액에 최종 부피에 유화제(M-1695)를 0.05% (w/v) 처리하여 35℃(±5℃)에서 60 분간 처리하였다. 반응이 완료된 균체는 다시 원심분리기를 이용하여 유화제가 포함된 상등액은 제거한 뒤 균체를 회수하였다.

고정화 비드 제조를 위하여, 상기 회수된 균체는 D.W.와 혼합하여 최종 균체 농도 5% (w/v)로 맞추고, 물에 용해된 4% (w/v) 알긴산과 회수된 균체 5%(w/v)를 1:1로 혼합하고, 혼합시 생성된 기포를 제거하기 위해 4℃ 냉장 보관하였다. 상기 냉장 보관된 혼합액은 Neddle (내경 0.20~0.30mm)을 통해 혼합액이 사출되어 방울 형태로 형성되며 무게에 의해 낙하하게 되며, 낙하된 혼합액은 미리 제조된 100mM 염화칼슘 (CaCl₂) 용액으로 떨어뜨려 경화시켜 구형 또는 타원형의 비드를(지름 2.0~2.2mm) 형성하였다. 상기 형성된 비드들은 100mM 염화칼슘 용액에 담그어 교반기에 의해 골고루 섞어지면서 더욱 경화되도록 하였다.

상기 혼합액이 모두 사출된 후에, 4~6시간 냉장 보관하면서 비드를 더욱 경화시킨 뒤에 새로운 100mM 염화칼슘 용액과 교체하여 냉장 상태에서 약 6시간 정도 경화를 시켰다. 경화가 완료된 비드는 걷어내 물기를 완전히 제거한 후, 비드 부피 대비 3배 부피의 물을 투입한 후 10분간 교반하고, 이러한 과정을 3회 처리하여 염화칼슘 용액을 제거하였다. 세척된 비드들은 망간 소킹을 위하여 물기를 완전 제거한 후, 10mM 망간이 포함된 40brix (%) 반응 기질을 비드 부피 대비 3 배 부피로 투입한 후 10분간 교반하고, 이러한 처리를 3회 이상 처리하여 10mM 망간이 포함된 반응 기질로 교체 하였다.

반응 기질은 pH 6.8~7.2로 3N NaOH에 의해 조절되며, 생산물의 종류에 따라 액상 과당 또는 결정 과당이 반응 기질이 될 수 있다. 10mM 망간이 포함된 반응 기질로 교체된 비드들은 반응조로 옮겨진 뒤, 반응 온도 50℃에서 약 30~60분간 반응 하여 망간 및 과당으로 비드의 소킹 작업을 완료하였다. 소킹이 완료된 비드는 지름이 약 1.6~1.8mm로 줄어들며 강도 또한 증가하게 된다.

소킹이 완료된 비드들의 기질을 제거 후, 망간이 포함되지 않은 반응 기질로 1회 세척한 뒤 고정화 반응 컬럼에 충진 후 사이코스 시럽 생산에 이용하였다.

<고정화 컬럼 반응조건>

반응 온도: 컬럼 자켓 내부 온도 50℃

기질 유속: 0.5 SV (space velocity L. h-1)

반응 기질: 결정 과당 40brix, pH 6.8~7.2, Mn² ⁺ 무첨가

비드 제조: 2.5%(w/w) 균체, 2%(w/w) 알긴산 혼합 및 10mM Mn² ⁺ soaking

상기 반응결과에 따라, 반응시간에 따른 사이코스 생산량을 도 8에 나타냈다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 유화제 처리 과정을 통해 반응성을 향상시킨 세포를 이용하여 고정화 반응을 진행하였을 때 0.5 SV에서 전환율 28% 내지 29%정도가 나오는 것을 확인하였고, 전환율이 30일 이상 계속적으로 유지되는 것을 볼 수 있었다. 위의 반응을 통해 사이코스를 생산한 결과 컬럼 부피 단위당 사이코스 함유 시럽 생산성은 128kg/L-column vol으로 계산된다.

실시예 5: 유화제 처리조건에 따른 효과실험

실시예 2와 실시예 3의 실험결과를 토대로 M1695 0.025(w/v)%, L1695 0.05(w/v)%, S1170 0.1(w/v)% in acetone 10%, P1670 0.1(w/v)% in acetone 10%의 전처리 용액을 선정하였고, 실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 세포를 처리하고 사이코스를 생산하였다. 다만, 세포 처리의 온도조건에 대한 실험으로써 실온 25℃를 기준으로 5℃ 간격으로 20℃부터 최대 60℃까지 온도에서 30분 동안 반응한 후 원심분리하여 유화제를 제거하고 세포를 완충액에 현탁한 후 세포 반응을 진행하여 실시예 1-3에서의 방법과 같이 사이코스 제조반응을 진행하였다.

실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 세포를 준비하고 사이코스를 생산하였다. 다만, 세포에 유화제를 처리하는 시간을 10, 30, 60, 90분 동안 수행하였다. 사이이코스 전환반응을 실시한 후 세포 초기반응속도 결과값을 확인하였다.

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Method for producing psicose using the corynebacterium <130> DPP20145301KR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 295 <212> PRT <213> Clostridiun scidens <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Ala Ala 1 5 10 15 Asp Tyr Lys Arg Tyr Val Glu Lys Ala Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Gly Ala Ala Pro Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Gln Glu Val 35 40 45 Lys Glu Leu Lys Lys Cys Ala Asp Asp Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Tyr Gly Pro Ala Phe Asn His Asn Met Gly Ser Ser Asp Pro Lys 65 70 75 80 Ile Arg Glu Glu Ala Leu Gln Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Glu Val Met 85 90 95 Ala Gly Leu Asp Ile His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Val Asp Phe Ala Thr Ala Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys His Ser 115 120 125 Val Glu Gly Met Gln Ile Leu Ala Pro Ile Ala Ser Gln Tyr Gly Ile 130 135 140 Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Phe Val Thr Glu Val Gly Met Asp Asn 165 170 175 Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Ser Ser 180 185 190 Ile Gly Asp Ala Ile Arg His Ala Gly Lys Leu Leu Gly His Phe His 195 200 205 Thr Gly Glu Cys Asn Arg Met Val Pro Gly Lys Gly Arg Thr Pro Trp 210 215 220 Arg Glu Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Ile Glu Tyr Asp Gly Thr Val 225 230 235 240 Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Gln Val Gly Ser Asp Ile 245 250 255 Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Lys Gly Ala Gly Glu Asp Arg Leu Asp 260 265 270 Glu Asp Ala Arg Arg Ala Val Glu Phe Gln Arg Tyr Met Leu Glu Trp 275 280 285 Lys Leu Glu His His His His 290 295 <210> 2 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence for psicose epimerase <400> 2 atgaaacacg gtatctacta cgcgtactgg gaacaggaat gggcggcgga ctacaaacgt 60 tacgttgaaa aagcggcgaa actgggtttc gacatcctgg aagttggtgc ggcgccgctg 120 ccggactact ctgcgcagga agttaaagaa ctgaaaaaat gcgcggacga caacggtatc 180 cagctgaccg cgggttacgg tccggcgttc aaccacaaca tgggttcttc tgacccgaaa 240 atccgtgaag aagcgctgca gtggtacaaa cgtctgttcg aagttatggc gggtctggac 300 atccacctga tcggtggtgc gctgtactct tactggccgg ttgacttcgc gaccgcgaac 360 aaagaagaag actggaaaca ctctgttgaa ggtatgcaga tcctggcgcc gatcgcgtct 420 cagtacggta tcaacctggg tatggaagtt ctgaaccgtt tcgaatctca catcctgaac 480 acctctgaag aaggtgttaa attcgttacc gaagttggta tggacaacgt taaagttatg 540 ctggacacct tccacatgaa catcgaagaa tcttctatcg gtgacgcgat ccgtcacgcg 600 ggtaaactgc tgggtcactt ccacaccggt gaatgcaacc gtatggttcc gggtaaaggt 660 cgtaccccgt ggcgtgaaat cggtgacgcg ctgcgtgaaa tcgaatacga cggtaccgtt 720 gttatggaac cgttcgttcg tatgggtggt caggttggtt ctgacatcaa agtttggcgt 780 gacatctcta aaggtgcggg tgaagaccgt ctggacgaag acgcgcgtcg tgcggttgaa 840 ttccagcgtt acatgctgga atggaaactc gagcaccacc accactaa 888 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression casette including a promoter sequence <400> 3 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300

Claims

사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포에, 탄소수 10 내지 18을 갖는 지방산을 함유하는 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움속 균주 세포를 이용하여 사이코스를 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 코리네박테리움속 균주 세포와 과당-함유 원료를 접촉하는 단계 전 또는 접촉하는 단계와 함께 수행되는 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 코리네박테리움속 균주 세포와 과당-함유 원료를 접촉하는 단계 전에 수행되고, 상기 과당-함유 원료를 접촉하는 단계 전에 상기 자당 지방상 에스테르를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 코리네박테리움속 균주 세포를 포함하는 세포 현탁액에 자당 지방산 에스테르를 첨가하여 수행되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 담체에 고정화된 코리네박테리움속 균주 세포에 자당 지방산 에스테르를 처리하여 수행되는 것인 방법.
제 1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 자당 스테아린산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 미리스틴산 에스테르 및 자당 라우린산 에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 자당 지방산 에스테르의 모노에스테르, 디에스테르, 트리에스테르 및 폴리에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는, 자당 지방산 에스테르 전체 100중량%를 기준으로 결합된 지방산이 60 내지 99 중량%인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 용매와 0.02 (w/v)% 내지 0.15 (w/v)%의 자당 지방상 에스테르를 포함하는 용액인 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 용매는 물, 아세톤, C1-C4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 포함하는 것인 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 용매는 물, 아세톤 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 자당 지방산 에스테르; 물; 및 아세톤, C1-C4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 포함하는 용액이며,
전체 용액 100 w/v% 기준으로, 상기 자당 지방산 에스테르는 0.02(w/v)% 내지 0.15(w/v) % 범위, 유기용매는 5 (v/v)% 내지 50(v/v)% 농도 범위 및 잔량의 물을 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르를 처리하는 단계는 처리온도 20℃ 내지 50℃ 범위 및 처리시간 10분 내지 180분으로 수행되는 것인 방법.
탄소수 10 내지 18을 갖는 지방산을 함유하는 자당 지방산 에스테르를 0.02 (w/v)% 내지 0.15 (w/v)%로 포함하는, 사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움속 균주 세포의 처리용 조성물로서,
상기 자당 지방산 에스테르에 의해 과당-함유 원료로부터 사이코스의 생산량을 증가시키는 것인, 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 자당 스테아린산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 팔미틴산 에스테르, 자당 미리스틴산 에스테르 및 자당 라우린산 에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는 자당 지방산 에스테르의 모노에스테르, 디에스테르, 트리에스테르 및 폴리에스테르로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 자당 지방산 에스테르는, 자당 지방산 에스테르 100 중량%을 기준으로 결합된 지방산이 60 내지 99 중량%인 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 조성물은 자당 지방산 에스테르; 및
물, 아세톤, C1-C4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 포함하는 것인 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 용매는 물, 아세톤 및 에탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 자당 지방산 에스테르; 물; 및 아세톤, C1-4 저급 알코올, 톨루엔, 벤젠, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 포함하며,
상기 조성물 100 (w/v)% 기준으로 자당 지방산 에스테르는 0.02(w/v)% 내지 0.15(w/v) % 범위, 유기용매는 5 (v/v)% 내지 50(v/v)% 농도 범위 및 잔량의 물을 포함하는 것인 조성물.