WO2021010268A1 - Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法 - Google Patents

Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法 Download PDF

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WO2021010268A1
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amide compound
acrylamide
substituted
reaction
reaction solution
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美知子 高橋
章裕 島元
隆文 山口
卓理 秋山
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三菱ケミカル株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56—Acrylamide; Methacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a copolymer of acrylamide (amide compound) and N-substituted acrylamide (N-substituted amide compound) (hereinafter, referred to as "N-substituted amide compound / amide compound copolymer"). More specifically, the present invention relates to a method for producing N-substituted acrylamide from acrylamide and amine by a biocatalytic reaction, and obtaining an acrylamide / N-substituted acrylamide copolymer by a polymerization reaction between the produced N-substituted acrylamide and unreacted acrylamide.
  • Copolymers of acrylamide / N-substituted acrylamide are used for paper chemicals such as paints, adhesives, adhesives, coating agents, and paper strength enhancers, polymer flocculants used for treating industrial wastewater and domestic wastewater, and polymer modification. It is a functional polymer used in an extremely diverse field such as pledges, dispersants, thickeners, raw materials for contact lenses and biogels, and reactive diluents for UV curable resins.
  • the conventional method for producing a copolymer of acrylamide / N-substituted acrylamide requires a multi-step process including a step under high temperature conditions for the synthesis of N-substituted acrylamide, and is not an inexpensive method.
  • an amide exchange reaction between (meth) acrylamide and an amine and a Michael addition reaction are carried out at 100 to 250 ° C. using an acrylate of amine as a catalyst, and further liquid phase heat is performed at 160 to 350 ° C.
  • a method of removing an amine by decomposition to obtain N-substituted (meth) acrylamide is disclosed.
  • a main object of the present invention is to provide a method for producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer using a biocatalyst.
  • the present invention provides the following [1]-[7].
  • [1] A step of reacting an amide compound with an amine in the presence of an enzyme that catalyzes an amide exchange reaction.
  • (B) A step of subjecting the obtained reactant to polymerization conditions and polymerizing the N-substituted amide compound and the amide compound to obtain a copolymer.
  • a method for producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer which comprises. [2] The method for producing [1], wherein the enzyme is amidase. [3] The method for producing [1] or [2], wherein the amide compound is acrylamide or methacrylamide.
  • the amine is selected from the group consisting of N, N-dimethyl-1,3-propanediamine, isopropylamine, 2-hydroxyethylamine, tert-butylamine, dimethylamine and 4-amino-4-methyl-2-pentanone.
  • the production method according to any one of [1] to [3], which is one or more of the above.
  • N-substituted acrylamide consists of N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide, isopropylacrylamide, N- [2-hydroxyethyl] acrylamide, tert-butylacrylamide, NN-dimethylacrylamide and diacetoneacrylamide.
  • the present invention also provides the following [1]-[10].
  • [1] A method for producing a copolymer of acrylamide and N-substituted acrylamide. (1) A step of providing a first reaction solution containing acrylamide, amine and amidase, and (2) N-substituted acrylamide is generated in the first reaction solution by an amide exchange reaction between acrylamide and amine catalyzed by amidase to obtain a second reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide. Process and (3) A step of subjecting the second reaction solution to polymerization conditions and polymerizing acrylamide and N-substituted acrylamide to obtain the copolymer. Manufacturing method, including.
  • N-substituted acrylamide is selected from N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide, isopropylacrylamide, N- [2-hydroxyethyl] acrylamide, tert-butylacrylamide, NN-dimethylacrylamide and diacetoneacrylamide.
  • the production method of [1] or [2] which is one or more.
  • Process and (3) A step of subjecting the second reaction solution to polymerization conditions and polymerizing acrylamide and N-substituted acrylamide to obtain the copolymer.
  • a method for producing a reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide (1) A step of providing a first reaction solution containing acrylamide, amine and amidase, and (2) N-substituted acrylamide is generated in the first reaction solution by an amide exchange reaction between acrylamide and amine catalyzed by amidase to obtain a second reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide. Process and Manufacturing method, including.
  • [8] (1) A step of providing a first reaction solution containing acrylamide, an amine and an amidase, and (2) N-substituted acrylamide is generated in the first reaction solution by an amide exchange reaction between acrylamide and amine catalyzed by amidase to obtain a second reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide. Process and A reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide, which is obtained by a production method containing. [9] The reaction solution of [8] for polymerizing acrylamide and N-substituted acrylamide to obtain a copolymer of acrylamide and N-substituted acrylamide. [10] The reaction solution of [8] or [9] containing a recombinant bacterium expressing amidase.
  • the present invention provides a method for producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer using a biocatalyst.
  • the method for producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer according to the present invention includes the following steps (1), (2) and (3), and optionally includes steps (2a) and / or (2b). ..
  • Step (1) A step of providing a first reaction solution containing acrylamide, amine and amidase.
  • Step (2) N-substituted acrylamide is produced in the first reaction solution by an amide exchange reaction between acrylamide and amine catalyzed by amidase, and a second reaction solution containing acrylamide and N-substituted acrylamide is produced. The process of obtaining.
  • Step (2a) A step of removing ammonia produced by the amide transesterification reaction of acrylamide and amine from the second reaction solution.
  • Step (2b) A step of removing the recombinant bacterium from the second reaction solution when the amidase is provided by the recombinant bacterium.
  • Step (3) A step of subjecting the second reaction solution to polymerization conditions and polymerizing acrylamide and N-substituted acrylamide to obtain an acrylamide / N-substituted acrylamide copolymer.
  • the step (2) corresponds to the step (A) of reacting the amide compound with the amine in the presence of an enzyme that catalyzes the amide exchange reaction.
  • step (3) corresponds to the step (B) in which the reaction product obtained in the step (A) is subjected to polymerization conditions and the N-substituted amide compound and the amide compound are polymerized to obtain a copolymer. ..
  • the amide compound is acrylamide or methacrylamide.
  • the amine is not particularly limited as long as it is a compound capable of an amide exchange reaction with an amide compound.
  • Preferred compounds as amines are selected from N, N-dimethyl-1,3-propanediamine, isopropylamine, 2-hydroxyethylamine, tert-butylamine, dimethylamine and 4-amino-4-methyl-2-pentanone. Or more than one, more preferably N, N-dimethyl-1,3-propanediamine.
  • the enzyme that catalyzes the amide exchange reaction is not limited in type and origin as long as it can catalyze the amide exchange reaction. Further, as the enzyme, a wild type can be used, or a mutant type in which the catalytic ability of the amide exchange reaction is imparted by modifying the amino acid sequence can also be used. As the enzyme, a microorganism expressing the enzyme can be used, or one extracted from the microorganism can be used.
  • the enzyme that catalyzes the amide exchange reaction is preferably amidase.
  • an enzyme classified other than amidase can be used as long as it is an enzyme to which amidase activity (catalytic ability of amide exchange reaction) is imparted by modifying the amino acid sequence.
  • the amidase a commercially available product can be obtained and used.
  • an amino acid sequence or a nucleic acid sequence obtained from a database available to the public and synthesized as a recombinant enzyme may be used.
  • the amidase for example, one derived from bacteria can be used.
  • the bacterium is preferably a bacterium belonging to the genus Rhodococcus, Gordonia, Earthlobactor, or Pseudonocardia, and more preferably a bacterium belonging to the genus Rhodococcus.
  • the amidase an amidase derived from the Rhodococcus erythropolis TA37 strain (amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 and nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11) is preferably used.
  • amidase a recombinant enzyme synthesized from the amino acid sequence (or nucleic acid sequence) obtained from the database by sequence identity search with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (or the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 11) can also be used.
  • an amidase a polypeptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 10 (nucleic acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 12 to 20) can be preferably used.
  • the amidase for example, a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted and / or added in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10 can be used.
  • the protein maintains the amidase activity that catalyzes the amide exchange reaction with amines.
  • the "several pieces” are, for example, 1 to 40 pieces, 1 to 20 pieces, preferably 1 to 20 pieces, 1 to 10 pieces, more preferably 1 to 5 pieces, 1 to 4 pieces, and particularly preferably 3. One, two or less.
  • a mutation introduction kit using a site-specific mutagenesis method by a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, for example, QuikChange TM System-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) , GeneTaylor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TakaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .), etc .: Takara.
  • the entire gene having a sequence containing a deletion or the like may be artificially synthesized.
  • the amidase contains, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 99.5% or more, and particularly preferably 99.9% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-10. It is also possible to use a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of% or more. Here, the polypeptide maintains an amidase activity that catalyzes an amide exchange reaction with an amine.
  • sequence identity means that both sequences are aligned so that the residues of two amino acid sequences to be compared match as much as possible, and the number of matched residues is divided by the total number of residues. It is expressed as a percentage.
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared.
  • sequence alignment can be performed using well-known programs such as BLAST, FASTA, and CLUSTALW.
  • the total number of residues is the number of residues counted with one gap as one residue. If the total number of residues counted in this way differs between the two sequences to be compared, the identity (%) is calculated by dividing the total number of residues in the longer sequence by the number of matching residues. ..
  • amidase for example, a protein consisting of an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes to the complementary strand of the base sequence of SEQ ID NO: 11-20 under stringent conditions can also be used.
  • the protein maintains the amidase activity that catalyzes the amide exchange reaction with amines.
  • stringent conditions for example, a nylon film on which DNA is immobilized is 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 8.76 g of sodium chloride and 4.41 g of sodium citrate dissolved in 1 liter of water), 1%.
  • Conditions for hybridization in a solution containing SDS, 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, and 0.1% ficol at 65 ° C. for 20 hours with a probe It can be mentioned, but it is not limited to this. Those skilled in the art will set the hybridization conditions in consideration of other conditions such as the probe concentration, the probe length, and the reaction time in addition to the conditions such as the salt concentration and temperature of the buffer. Can be done.
  • the washing conditions after hybridization include, for example, "2 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, "1 x SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and the more stringent conditions include, for example, Conditions such as “1 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” and "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.” can be mentioned.
  • Conditions such as “1 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” and "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.” can be mentioned.
  • For detailed procedures of hybridization method please refer to Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997)) and the like can be referred to.
  • the synthesis of enzymes such as amidase can be performed using general-purpose molecular biological techniques such as PCR.
  • the enzyme is used as a purified enzyme or a crude enzyme.
  • the recombinant bacterium expressing the enzyme may be used as it is, or the bacterium may be frozen, dried, pulverized or the like.
  • the culture solution obtained by culturing the recombinant bacteria can be used as it is, or the cells obtained from the culture solution by a bacterial collection operation such as centrifugation or a processed product thereof can be used.
  • the cell-treated product include cells treated with acetone, toluene and the like, freeze-dried cells, crushed cells, cell extracts and the like.
  • an enzyme-immobilized enzyme can also be used in the reaction.
  • the method of immobilization is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of enzyme, reaction conditions, and the like.
  • a method of immobilization a carrier binding method in which an enzyme is bound to and immobilized on various insoluble carriers such as cellulose, dextrin, resin beads, activated charcoal, silica gel, magnetic particles and polymer film; functional groups in proteins and the functional groups thereof.
  • a cross-linking method that utilizes a chemical bond with a compound that reacts; a comprehensive method that immobilizes the enzyme in the gel without directly chemically modifying the enzyme by incorporating the enzyme into the polymer gel can be mentioned.
  • microorganisms expressing the enzyme can be immobilized and used in the reaction.
  • the method of immobilization is not particularly limited, and a known method can be used.
  • microorganisms immobilized on a polyacrylamide gel can be used as a catalyst.
  • the enzyme is not particularly limited, but can be purified by, for example, the following method.
  • a method for removing low molecular weight substances by (1) fractionation by precipitation, (2) various chromatography, (3) dialysis, ultrafiltration, etc. in a crude enzyme solution obtained by crushing recombinant bacteria and suspending them in a buffer solution. Etc. are applied alone or in combination as appropriate.
  • Recombinant bacteria are prepared by transforming a host microorganism with an expression vector incorporating a gene encoding an enzyme such as amidase.
  • host microorganisms include Escherichia coli, Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, and Streptomyces in bacteria, and Saccharomyces, Candida, Schizosaccharomyces, and Pichia in yeast.
  • Aspergillus genus is mentioned as a filamentous fungus.
  • recombinant bacteria not only the above-mentioned recombinant bacteria, but also a cell-treated product such as a frozen product, a dried product or a crushed product of the recombinant bacteria may be collectively referred to as "recombinant bacteria”.
  • the concentration of the amide compound in the first reaction solution is preferably 0.1% by mass or more. Further, the amide compound concentration is preferably 50% by mass or less, more preferably 30% by mass or less, and more preferably 15% by mass or less in order to suppress the inactivation of the enzyme by a high concentration substrate. More preferred. The amide compound concentration may be, for example, 2 to 11% by mass.
  • the amine concentration of the first reaction solution is preferably 0.1% by mass or more. Further, the amine concentration is preferably 30% by mass or less, more preferably 20% by mass or less, in order to suppress the inactivation of the enzyme by a high concentration substrate. The amine concentration may be, for example, 2 to 7% by mass.
  • the amidase activity of the enzyme in the first reaction solution is preferably 100 U / L to 100,000 U / L.
  • the solvent of the first reaction solution is preferably an aqueous solvent, and a buffer can be added to the aqueous solvent if necessary.
  • the pH of the first reaction solution can be preferably 8 to 12, more preferably 9 to 11.
  • the buffer is not particularly limited as long as the pH can be maintained, and for example, sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate can be used.
  • At least a part of the amide compound is converted to an N-substituted amide compound by amide exchange with an amine. Further, since the conversion efficiency of the amide compound by amidase to the N-substituted amide compound is usually not 100%, the amide compound that has not been subjected to the amide exchange with the amine remains in the reaction solution. As a result, a reaction solution containing an amide compound and an N-substituted amide compound is obtained as the second reaction solution.
  • the second reaction solution may contain an enzyme such as amidase or a recombinant bacterium in addition to the amide compound and the N-substituted amide compound.
  • the N-substituted amide compound produced depends on the selection of the amide compound and amine to be used.
  • the N-substituted amide compounds produced are specifically N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide, isopropylacrylamide, N- [2-hydroxyethyl] acrylamide, tert-butylacrylamide, NN-dimethylacrylamide and One or more selected from diacetone acrylamide.
  • the N-substituted amide compound is preferably N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide.
  • the amide compound is acrylamide and the amine is N, N-dimethyl-1,3-propanediamine.
  • reaction temperature is preferably 4 to 90 ° C, more preferably 10 to 40 ° C, and even more preferably 15 to 30 ° C in order to suppress the inactivation of the enzyme due to heat.
  • the reaction time is a time sufficient for producing the N-substituted amide compound at the desired concentration, and is not particularly limited, but is, for example, 7 to 96 hours.
  • the second reaction solution obtained in step (2) is (I) Any of the group selected from the group consisting of a Michael addition reaction product of an amide compound and an amine, a hydrolyzate of an amide compound, ammonia or a salt thereof, a component derived from a microbial cell, and a medium component for culturing the microorganism.
  • a Michael addition reaction product of an amide compound and an amine a hydrolyzate of an amide compound, ammonia or a salt thereof, a component derived from a microbial cell, and a medium component for culturing the microorganism.
  • Amide compound and May include.
  • reaction solution in addition to the (iii) N-substituted amide compound and the (iii) amide compound, ammonia or a salt thereof produced by an amide exchange reaction between the amide compound and the amine; the amide compound and the amine are contained.
  • a Michael addition reaction product produced by a Michael addition reaction separate from the amide exchange reaction; any one or more components selected from a hydrolyzate of an amide compound, a component derived from a microbial cell, and a medium component for culturing the microorganism.
  • This second reaction solution is used for producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer in the subsequent step (3), and has the following features.
  • the start of polymerization may be delayed, but when the second reaction solution obtained in the present invention is subjected to a polymerization reaction, there is no such drawback. It can be used for polymerization as it is without purification.
  • the second reaction solution obtained in the present invention is directly subjected to a polymerization reaction, the molecular weight of the obtained polymer is appropriately adjusted, so that the obtained polymer is less likely to be insolubilized (gelled).
  • the molecular weight can be increased by changing the polymerization conditions, but there is a feature that it is difficult to insolubilize because there are few cross-linking components.
  • the component (i) above does not affect the polymerization and is considered to have a buffering ability, even if the second reaction solution obtained in the present invention is directly subjected to the polymerization reaction, it is possible to carry out the polymerization at the time of polymerization.
  • the change in pH can be controlled to be small, and the reaction is stable.
  • the amide compound concentration of the second reaction solution obtained in the step (2) is preferably 0.1% by mass or more and 50% by mass or less.
  • the concentration of the N-substituted amide compound in the second reaction solution obtained in the step (2) is preferably 0.1% by mass or more and 30% by mass or less.
  • the solvent of the second reaction solution obtained in the step (2) is the same as that of the first reaction solution.
  • step (2) at least a part of the amide compound is converted to an N-substituted amide compound by amide exchange with an amine, but the residue remains unreacted in the reaction solution.
  • an N-substituted amide compound / amide compound copolymer is produced by a polymerization reaction of the unreacted amide compound and the N-substituted amide compound.
  • the amide compound and the N-substituted amide compound in the second reaction solution may be subjected to a polymerization reaction without purification and separation. Further, if necessary, the amide compound can be added to the reaction solution.
  • the polymerization method is not particularly limited as long as it is a method of polymerizing in an aqueous solvent, and an aqueous solution polymerization method, an adiabatic polymerization method, a continuous polymerization method and the like can be adopted. Furthermore, a suspension polymerization method or an emulsion polymerization method using a non-aqueous solvent can also be adopted.
  • the polymerization is started by adding a polymerization initiator to the second reaction solution and generating free radicals by heat, light, a redox reaction or the like. It is common to add a solution of the polymerization initiator to the second reaction solution, but the second reaction solution may be added dropwise to the solution of the polymerization initiator.
  • a solution of the polymerization initiator may be added to a suspension prepared by suspending or emulsifying the second reaction solution in a non-aqueous solvent, and the non-aqueous solvent or non-aqueous solvent may be added.
  • the polymerization initiator solution and the second reaction solution may be added to the aqueous solvent and the suspension or emulsion of water.
  • the concentration of the amide compound in the second reaction solution in the step (3) is preferably 5% by mass or more.
  • the amide compound concentration is preferably 50% by mass or less, more preferably 30% by mass or less, and further preferably 20% by mass or less from the viewpoint of suppressing the heat of polymerization.
  • the amide compound concentration may be, for example, about 10% by mass.
  • the concentration of the N-substituted amide compound in the second reaction solution in the step (3) is preferably 0.1% by mass or more. Further, the concentration of the N-substituted amide compound is preferably 30% by mass or less, more preferably 20% by mass or less, and further preferably 15% by mass or less from the viewpoint of suppressing the heat of polymerization.
  • the second reaction solution in the step (3) may contain other monomers, if necessary.
  • examples of other monomers include acrylic acid for amphoterizing the polymer, a polyfunctional monomer for branching or cross-linking the polymer, and a dimethylacrylamide monomer for modifying the polymer.
  • the concentration of the other monomer varies depending on the purpose and type thereof, but is preferably 0 to 30% by mass.
  • Any solvent may be used as the solvent for the second reaction solution, but an aqueous solvent is preferable. In the case of an aqueous solvent, the preferable pH of the second reaction solution is 2 to 10.
  • Conventionally general-purpose polymerization initiators can be used, for example, peroxides such as potassium persulfate, ammonium persulfate, benzoyl peroxide, hydrogen peroxide, and t-butyl hydroperoxide; azobisisobutyro. Azo compounds such as nitriles; photo-decomposition-type polymerization initiators such as benzoin ethyl ale; and sodium hydrogen peroxide, sodium sulfite, hydrosulfite sodium, triethanolamine, sulfate that form initiators by redox reaction with the above peroxides.
  • a reducing agent such as ferrous iron; can be used.
  • One of these polymerization initiators can be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the polymerization initiator varies depending on the type and temperature, but is preferably 10 to 50,000 ppm, more preferably 20 to 40,000 ppm.
  • the temperature of the polymerization reaction more accurately than the decomposition temperature of the catalyst, varies depending on the half-life of 10 hours, but is preferably 0 ° C. to 90 ° C.
  • the time of the polymerization reaction is, for example, 30 minutes to 10 hours.
  • the copolymer composition obtained in the step (3) is (I) Any of the group selected from the group consisting of a Michael addition reaction product of an amide compound and an amine, a hydrolyzate of an amide compound, ammonia or a salt thereof, a component derived from a microbial cell, and a medium component for culturing the microorganism.
  • the copolymer composition obtained in the present invention contains the component (i) above, but since these components do not post-crosslink the polymer, the obtained polymer is insolubilized (gelled) even during storage. It is difficult to do and the copolymerization is stable. Further, since the component (i) exerts a buffering effect, it has an effect that the copolymer can be stably stored even against changes in the external environment such as pH.
  • the conversion rate of the amide compound to the N-substituted amide compound / amide compound copolymer by the polymerization reaction is, for example, 98% or more.
  • the conversion rate of the N-substituted amide compound to the copolymer by the polymerization reaction is, for example, 99.8% or more.
  • an N-substituted amide compound is produced from an amide compound and an amine by a biocatalytic reaction (step (2)), and the produced N-substituted amide compound is polymerized with an unreacted amide compound.
  • the production process can be simplified by a continuous process of producing an N-substituted amide compound / amide compound copolymer by the reaction (step (3)).
  • the production method according to the present invention does not require a multi-step step requiring high temperature conditions for the synthesis of the N-substituted amide compound, which can contribute to cost reduction.
  • the production method according to the present invention is an enzymatic reaction at a low temperature (for example, 100 ° C.
  • the impurities required for purification are extremely limited, and even if these impurities are present, polymerization delay, cross-linking, gelation, etc. are not caused.
  • the currently used method by reaction at high temperature is extremely likely to generate other functional monomers that cause cross-linking due to condensation of raw materials, chain transfers, condensates that lead to polymerization delay, and aromatic compounds. It was expensive and a purification process was essential. Therefore, the second reaction solution of the present invention, which does not cause polymerization delay and is extremely unlikely to cause reactions such as cross-linking and gelation, can omit the purification step. Therefore, in the present invention, the N-substituted amide compound / The amide compound copolymer can be produced very efficiently.
  • the step (2) and the step (3) can be a continuous process as described above, but if necessary, a second reaction is performed between the step (2) and the step (3). It may include a step of adding an amide compound and / or other monomer to the liquid. Further, in the step (2), an amide compound and / or another monomer may be added to the second reaction solution.
  • the manufacturing method according to the present invention may include the following steps (2a) and / or steps (2b) between the steps (2) and the steps (3), if necessary.
  • Step (2a) ammonia produced by the amide transesterification reaction between the amide compound and the amine is removed from the second reaction solution.
  • this step is not essential, it is preferably performed to obtain an N-substituted amide compound / amide compound copolymer that does not contain ammonia as a contaminant.
  • Ammonia may be removed by means such as aeration, or if there is no practical problem in the presence of the ammonia salt, it may be neutralized with an acid such as hydrochloric acid.
  • Step (2b) In this step, recombinant bacteria expressing an enzyme such as amidase are removed from the second reaction solution. Although this step is not essential, it is preferably performed to obtain an N-substituted amide compound / amide compound copolymer that does not contain recombinant bacteria as a contaminant. Conventional general-purpose methods such as centrifugation, membrane filtration, cake filtration, agglomeration separation, and activated carbon treatment can be applied alone or in combination for removing recombinant bacteria.
  • a recombinant bacterium expressing amidase was prepared by transforming a host microorganism with the expression vector of 2 above.
  • DN1 strain see Patent Document 4
  • DN1 strain competent cell solution was ice-cooled for 30 minutes. The mixed solution was placed in a cuvette and subjected to electric pulse treatment at 20 kV / cm and 200 OHMS by a gene transfer device (Gene Pulser, BIO RAD).
  • the mixed solution was allowed to stand for 10 minutes under ice-cooling, and heat-shocked at 37 ° C. for 10 minutes.
  • MYK medium 0.5% polypeptone, 0.3% bactoyeast extract, 0.3% bactomolt extract, 0.2% K 2 HPO 4 , 0.2% KH 2 PO 4
  • 10 ⁇ g / ml was applied to MYK agar medium containing canamycin and cultured at 30 ° C. for 3 days. Colonies with confirmed plasmid introduction were isolated as amidase-expressing recombinant bacteria.
  • amidase activity of the recombinant bacteria in 3 above was measured by the following method.
  • a culture solution containing a recombinant was added to a reaction solution (100 mM acrylamide, 50 mM N, N-dimethyl-1,3-propanediamine, 50 mM sodium hydrogen carbonate buffer (pH 9)) and reacted at 37 ° C. overnight. ..
  • the reaction solution obtained by filtering the cells using a 0.45 ⁇ m filter was subjected to gas chromatography analysis, and N- [3- [3-] produced by an amide exchange reaction between acrylamide and N, N-dimethyl-1,3-propanediamine.
  • the concentration of (dimethylamino) propyl] acrylamide was measured.
  • Analytical conditions Analytical equipment: Gas chromatograph GC-2014S (manufactured by Shimadzu Corporation) Detector: FID (detected at 250 ° C) Column: Rtx-5Amine (30 mm x 0.25 mm I.D. x 1.0 ⁇ m df Restek) Column temperature: 50 °C, 2min ⁇ (20 °C / min) ⁇ 160 °C, 0min ⁇ (30 °C / min) ⁇ 240 °C, 5min
  • Table 3 shows the amidase activity of the recombinant bacteria by the amount of N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide produced (relative value with the amount produced in the recombinant bacteria by the expression vector pSJTA37 as 1). The production of N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide was confirmed in all recombinant bacteria.
  • Example 1 Production of acrylamide / N-substituted acrylamide copolymer
  • 1. Process (1) Prepared in Example 1 with 3.2% (v / v) of 50% acrylamide aqueous solution (Mitsubishi Chemical Corporation) and 2.3% of N, N-dimethyl-1,3-propanediamine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). A first reaction solution containing the recombinant bacteria (1%) and water was prepared in a reaction vessel. A jacketed stirring tank having an internal volume of 500 mL was used as the reaction tank. The reaction solution was adjusted to pH 10 by adding a 6M HCl solution. The amidase activity in the first reaction solution was 1000 U / L.
  • Steps (2) and (2b) The temperature of the reaction solution was controlled to 20 ° C., and the amide exchange reaction was carried out for 7 hours with stirring so that the recombinant bacteria were uniformly dispersed to obtain a second reaction solution.
  • the obtained second reaction solution was membrane-filtered with a filter having a pore size of 0.45 ⁇ m to remove recombinant bacteria.
  • the second reaction solution from which the recombinant bacteria had been removed was subjected to the same gas chromatography analysis as in Example 1 (4), and was produced by an amide exchange reaction between acrylamide and N, N-dimethyl-1,3-propanediamine.
  • the concentration of N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide was measured.
  • the acrylamide concentration was 0.1% and the N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide concentration was 1.1%.
  • the temperature of the jacket was raised to 70 ° C., 15,000 ppm of 2,2'-azobis (2-methylpropioamidine) dihydrochloride was added as a pair of monomers under a nitrogen seal, and the mixture was stirred for 3 hours to carry out a polymerization reaction.
  • a part of the reaction solution after the polymerization reaction was taken, and the residual monomer was measured by liquid chromatography (column: ODP2 HP4E 250 mm ⁇ 4.6 mm UV 207 nm detection).
  • the polymerization conversion rate of the monomer was 98% (see Table 4).
  • the polymerization conversion rate of the monomer was calculated by the following formula (the same applies to the following Examples and Comparative Examples).
  • Polymerization conversion of monomer (%) ⁇ [(concentration of amide compound before the start of polymerization reaction) + (concentration of N-substituted amide compound before start of polymerization reaction)]-[(concentration of amide compound after completion of polymerization reaction) ) + (Concentration of N-substituted amide compound after completion of polymerization reaction)] ⁇ / [(Concentration of amide compound before initiation of polymerization reaction) + (Concentration of N-substituted amide compound before initiation of polymerization reaction)] Moreover, the solution temperature at the time of polymerization was measured with a digital thermometer (the same applies to the following Examples and Comparative Examples). The maximum temperature reached of the solution during polymerization was 75.4 ° C (see FIG. 1).
  • Example 1 As a result, the conversion rate of the monomer was 98% (see Table 4), and the maximum temperature reached by the solution during polymerization was 78.6 ° C. (see FIG. 1). From these results, in Example 1, impurities (Michael addition reaction product of amide compound and amine, hydrolyzate of amide compound, ammonia or salt thereof) were added to the second reaction solution obtained by the enzymatic reaction of the present invention. , Recombinant cell-derived components, medium components, etc.), but it can be confirmed that the conversion rate equivalent to that of Comparative Example 1 in which the reaction solution containing no of these impurities was subjected to the polymerization reaction was achieved. It was. Further, it was found that Example 1 had a lower maximum temperature reached during the polymerization reaction than Comparative Example 1, and the polymerization reaction could be safely carried out.
  • Example 2 Production of acrylamide / N-substituted acrylamide copolymer
  • An amide exchange reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except that the reaction time was 24 hours and the pH of the reaction solution was 9, except that the concentration of the recombinant bacteria was 3.7%, the reaction time was 24 hours, and a second reaction solution was obtained. It was.
  • the amidase activity in the first reaction solution was 16000 U / L.
  • the acrylamide concentration of the second reaction solution from which the recombinant bacteria had been removed was 4.3%, and the N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide concentration was 6.5%.
  • Example 2 the polymerization reaction was carried out in the same manner as in the step (3) of Example 2, and the polymerization conversion rate of the monomer and the solution temperature at the time of polymerization were measured.
  • the conversion rate of the monomer was 99% (see Table 4), and the maximum temperature reached by the solution during polymerization was 89.8 ° C. (see FIG. 2).
  • impurities Moichael addition reaction product of amide compound and amine, hydrolyzate of amide compound, ammonia or its like
  • Example 3 Production of acrylamide / N-substituted acrylamide copolymer
  • the second reaction solution was subjected to the amide exchange reaction in the same manner as in Example 1 except that the reaction time was 24 hours and the pH of the reaction solution was 9, except that the concentration of the recombinant bacteria was 7.7% and the concentration of the recombinant bacteria was 5.0%.
  • the amidase activity in the first reaction solution was 12000 U / L.
  • the acrylamide concentration of the second reaction solution from which the recombinant bacteria had been removed was 1.3%, and the N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide concentration was 8.6%.
  • Example 3 As a result, the conversion rate of the monomer was 99% (see Table 4), and the maximum temperature reached by the solution during polymerization was 77.3 ° C. (see FIG. 3). From these results, also in Example 3, impurities (Michael addition reaction product of amide compound and amine, hydrolyzate of amide compound, ammonia or its like) are contained in the second reaction solution obtained by the enzymatic reaction of the present invention. It was confirmed that even in the presence of salts, recombinant bacterial cell-derived components, medium components, etc.), the same conversion rate as in Comparative Example 3 in which the reaction solution containing no of these impurities was subjected to the polymerization reaction was achieved. did it. Further, it was found that the maximum temperature reached during the polymerization reaction of Example 3 was lower than that of Comparative Example 3, and the polymerization reaction could be safely carried out.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of amidase of Rhodococcus erythropolis strain TA37
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of amidase of Rhodococcus erythropolis SK121
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid sequence of amidase of Rhodococcus erythropolis PR4
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of amidase of Rhodococcus qingshengii CW25 No. 5: Gordonia alkanivorans NBRC 16433 amidase amino acid sequence No. 6: Arthrobacter sp. MWB30 amidase amino acid sequence No. 7: Pseudonocardia sp.

Abstract

生体触媒を用いたＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法として、（Ａ）アミド交換反応を触媒する酵素の存在下に、アミド化合物とアミンとを反応させる工程と、（Ｂ）得られた反応物を重合条件に付し、Ｎ－置換アミド化合物とアミド化合物とを重合させて共重合体を得る工程と、を含む製造方法を提供する。

Description

Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法
　本発明は、アクリルアミド（アミド化合物）とＮ－置換アクリルアミド（Ｎ－置換アミド化合物）との共重合体（以下、「Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体」と称する）の製造方法に関する。より詳しくは、アクリルアミドとアミンから生体触媒反応によりＮ－置換アクリルアミドを生成させ、生成したＮ－置換アクリルアミドと未反応のアクリルアミドとの重合反応によりアクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体を得る方法に関する。
　アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミドの共重合体は、塗料、粘着剤、接着剤、コーティング剤、紙力増強剤などの製紙用薬剤、産業排水や生活排水の処理に用いる高分子凝集剤、高分子改質剤、分散剤、増粘剤、コンタクトレンズや生体用ゲルなどの原料、ＵＶ硬化樹脂用反応性希釈剤など、極めて多様な分野で用いられている機能性ポリマーである。
　従来のアクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミドの共重合体の製造方法は、Ｎ－置換アクリルアミドの合成のために高温条件の工程を含む多段階の工程を必要とし、安価な方法ではない。例えば、特許文献１には、触媒としてアミンのアクリル酸塩を用いて１００～２５０℃で（メタ）アクリルアミドとアミンとのアミド交換反応とマイケル付加反応を行い、さらに１６０～３５０℃で液相熱分解によりアミンを除去し、Ｎ－置換（メタ）アクリルアミドを取得する方法が開示されている。
特開昭５８－１８３４６号公報 ロシア登録特許２５３９０３３号公報 特開平１０－３３７１８５号公報 特開平２０１１－２００１３２公報
　本発明は、生体触媒を用いたＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法を提供することを主な目的とする。
　上記課題解決のため、本発明は、以下の〔１〕－〔７〕を提供する。
〔１〕　（Ａ）アミド交換反応を触媒する酵素の存在下に、アミド化合物とアミンとを反応させる工程と、
　（Ｂ）得られた反応物を重合条件に付し、Ｎ－置換アミド化合物とアミド化合物とを重合させて共重合体を得る工程と、
を含む、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法。
〔２〕　前記酵素がアミダーゼである、〔１〕の製造方法。
〔３〕　アミド化合物が、アクリルアミド又はメタクリルアミドである、〔１〕又は〔２〕の製造方法。
〔４〕　アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、イソプロピルアミン、２－ヒドロキシエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ジメチルアミン及び４－アミノ－４－メチル－２－ペンタノンからなる群から選択されるいずれか一以上である、〔１〕－〔３〕のいずれかの製造方法。
〔５〕　Ｎ－置換アクリルアミドが、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］アクリルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド及びダイアセトンアクリルアミドからなる群から選択されるいずれか一以上である、〔１〕－〔４〕のいずれかの製造方法。
〔６〕　（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
　（ｉｉ）Ｎ－置換アミド化合物と、
　（ｉｉｉ）アミド化合物と、
を含む、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体製造用組成物。
〔７〕　（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
　（ｉｖ）構成単位としてＮ－置換アミド化合物及びアミド化合物を含む共重合体と、
を含む、共重合体組成物。
　また、本発明は、以下の［１］－［１０］をも提供する。
［１］　アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとの共重合体の製造方法であって、
（１）アクリルアミドとアミンとアミダーゼとを含む第一の反応液を提供する工程と、
（２）アミダーゼによって触媒されるアクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって前記第一の反応液中にＮ－置換アクリルアミドを生成させて、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む第二の反応液を得る工程と、
（３）前記第二の反応液を重合条件に付し、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを重合させて前記共重合体を得る工程と、
を含む、製造方法。
［２］　Ｎ－置換アクリルアミドが、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］アクリルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド及びダイアセトンアクリルアミドから選択されるいずれか一以上である、［１］の製造方法。
［３］　アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、イソプロピルアミン、２－ヒドロキシエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ジメチルアミン及び４－アミノ－４－メチル－２－ペンタノンから選択されるいずれか一以上である、［１］又は［２］の製造方法。
［４］　工程（１）及び（２）において、アミダーゼを発現する組換菌を用いる、［１］－［３］のいずれかの製造方法。
［５］　工程（２）と工程（３）との間に、前記組換菌を前記第二の反応液から除去する工程をさらに含む、［１］－［４］のいずれかの製造方法。
［６］　（１）アクリルアミドとアミンとアミダーゼとを含む第一の反応液を提供する工程と、
（２）アミダーゼによって触媒されるアクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって前記第一の反応液中にＮ－置換アクリルアミドを生成させて、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む第二の反応液を得る工程と、
（３）前記第二の反応液を重合条件に付し、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを重合させて前記共重合体を得る工程と、
を含む製造方法により得られる、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとの共重合体。
［７］　アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む反応液の製造方法であって、
（１）アクリルアミドとアミンとアミダーゼとを含む第一の反応液を提供する工程と、
（２）アミダーゼによって触媒されるアクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって前記第一の反応液中にＮ－置換アクリルアミドを生成させて、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む第二の反応液を得る工程と、
を含む、製造方法。
［８］　（１）アクリルアミドとアミンとアミダーゼとを含む第一の反応液を提供する工程と、
（２）アミダーゼによって触媒されるアクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって前記第一の反応液中にＮ－置換アクリルアミドを生成させて、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む第二の反応液を得る工程と、
を含む製造方法によって得られる、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む反応液。
［９］　アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを重合させてアクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとの共重合体を得るための、［８］の反応液。
［１０］　アミダーゼを発現する組換菌を含む、［８］又は［９］の反応液。
　本発明により、生体触媒を用いたＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法が提供される。
重合時の溶液温度をデジタル温度計で測定した結果を示すグラフである（実施例１及び比較例１）。 重合時の溶液温度をデジタル温度計で測定した結果を示すグラフである（実施例２及び比較例２）。 重合時の溶液温度をデジタル温度計で測定した結果を示すグラフである（実施例３及び比較例３）。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　本発明に係るＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法は、以下の工程（１）（２）及び（３）を含み、任意に工程（２ａ）及び／又は（２ｂ）を含む。
　工程（１）：アクリルアミドとアミンとアミダーゼとを含む第一の反応液を提供する工程。
　工程（２）：アミダーゼによって触媒されるアクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって第一の反応液中にＮ－置換アクリルアミドを生成させて、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを含む第二の反応液を得る工程。
　工程（２ａ）：アクリルアミドとアミンとのアミド交換反応によって生成したアンモニアを第二の反応液から除去する工程。
　工程（２ｂ）：アミダーゼが組換菌によって提供される場合において、組換菌を第二の反応液から除去する工程。
　工程（３）：第二の反応液を重合条件に付し、アクリルアミドとＮ－置換アクリルアミドとを重合させてアクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体を得る工程。
　ここで、工程（２）は、アミド交換反応を触媒する酵素の存在下に、アミド化合物とアミンとを反応させる工程（Ａ）に相当する。また、工程（３）は、工程（Ａ）で得られた反応物を重合条件に付し、Ｎ－置換アミド化合物とアミド化合物とを重合させて共重合体を得る工程（Ｂ）に相当する。
１．工程（１）
　本工程では、アミド化合物とアミンとアミド交換反応を触媒する酵素とを含む第一の反応液が提供される。
［アミド化合物］
　アミド化合物は、アクリルアミド又はメタクリルアミドとされる。
［アミン］
　アミンは、アミド化合物とアミド交換反応が可能な化合物であれば特には限定されない。アミンとして好ましい化合物は、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、イソプロピルアミン、２－ヒドロキシエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ジメチルアミン及び４－アミノ－４－メチル－２－ペンタノンから選択されるいずれか一以上であり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミンである。
［アミド交換反応を触媒する酵素］
　アミド交換反応を触媒する酵素は、アミド交換反応を触媒できれば、種類や由来生物種は限定されない。
　また、酵素は、野生型を使用することもできるし、アミノ酸配列の改変によりアミド交換反応の触媒能を付与した変異型を使用することもできる。
　酵素は、当該酵素を発現する微生物を使用することもできるし、微生物から抽出したものを使用することもできる。
　アミド交換反応を触媒する酵素は、アミダーゼが好ましい。ただし、上述のとおり、アミダーゼ以外に分類される酵素であっても、アミノ酸配列の改変によりアミダーゼ活性（アミド交換反応の触媒能）が付与された酵素であれば使用できる。
　アミダーゼは、市販のものを入手して用いることができる。
　また、アミダーゼは、公衆に利用可能なデータベースからアミノ酸配列あるいは核酸配列を入手して組換酵素として合成したものを用いてもよい。
　アミダーゼとしては、例えば、細菌に由来するものを使用できる。酵素活性の観点から、細菌は、ロドコッカス属、ゴルドニア属、アースロバクター属、又はシュードノカルディア属に属する細菌が好ましく、ロドコッカス属に属する細菌がより好ましい。アミダーゼには、ロドコッカス・エリスロポリス　ＴＡ３７株由来のアミダーゼ（アミノ酸配列を配列番号１に、核酸配列を配列番号１１に示す）が好適に用いられる。
　また、アミダーゼとして、配列番号１のアミノ酸配列（又は配列番号１１の核酸配列）との配列同一性検索によりデータベースから取得したアミノ酸配列（又は核酸配列）から合成した組換酵素も利用できる。このようなアミダーゼとしては、配列番号２～１０のアミノ酸配列（核酸配列を配列番号１２～２０に示す）からなるポリペプチドを好適に利用できる。
　アミダーゼには、例えば、配列番号１～１０のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。ここで、同タンパク質は、アミンとのアミド交換反応を触媒するアミダーゼ活性を維持しているものである。
　ここで、「数個」とは、例えば１～４０個、１～２０個、好ましくは１～２０個、１～１０個、より好ましくは１～５個、１～４個、特に好ましくは３個、２個以下をいう。アミノ酸配列に欠失等を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ－Ｋ、Ｍｕｔａｎ－Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。あるいは、欠失等を含む配列を有する遺伝子全体を人工合成してもよい。
　また、アミダーゼには、例えば配列番号１－１０のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、特に好ましくは９９．９％以上の同一性の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることもできる。ここで、同ポリペプチドは、アミンとのアミド交換反応を触媒するアミダーゼ活性を維持しているものである。
　ここで、「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列の残基ができるだけ多く一致するように両配列を整列させ、一致した残基数を、全残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全残基数は、１つのギャップを１つの残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全残基数が比較する２つの配列間で異なる場合には、長い方の配列の全残基数で一致した残基数を除して同一性（％）を算出する。
　さらに、アミダーゼには、例えば配列番号１１－２０の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いることもできる。ここで、同タンパク質は、アミンとのアミド交換反応を触媒するアミダーゼ活性を維持しているものである。
　ストリンジェントな条件としては、例えば、ＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）））、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７））等を参照することができる。
　アミダーゼ等の酵素の合成は、ＰＣＲ等の汎用の分子生物学的手法を用いて行うことができる。
　酵素は、精製（purified）酵素あるいは粗精製（crude）酵素として用いられる。
　また、酵素を発現する組換菌を菌体そのまま、あるいは、菌体を凍結、乾燥又は粉砕等して用いてもよい。具体的には、組換菌を培養して得られる培養液をそのまま用いるか、又は、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体又はその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン及びトルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物及び細胞抽出物等が挙げられる。
　更に、酵素を固定化したもの（固定化酵素）を反応に用いることもできる。固定化の方法としては特には限定されず、酵素の種類や反応条件等に応じて適宜選択することができる。
　固定化の方法としては、酵素を、セルロース、デキストリン、樹脂ビーズ、活性炭、シリカゲル、磁性粒子及び高分子膜等の各種の不溶性担体に結合させ固定化する担体結合法；タンパク質中の官能基とそれに反応する化合物との化学結合を利用する架橋法；高分子ゲルの中に酵素を取り込ませることにより、酵素を直接化学修飾することなくゲルの中に固定化する包括法等を挙げることができる。
　更に、酵素を発現する微生物を固定化して反応に用いることもできる。固定化の方法は特には限定されず、公知の方法を使用することができる。例えば、微生物をポリアクリルアミドゲル中に固定化したものを触媒として使用することができる。
　酵素は、特に制限されないが、例えば以下の方法により精製され得る。組換菌を破砕し緩衝液に懸濁して得られる粗酵素液に、（１）沈澱による分画、（２）各種クロマトグラフィー、（３）透析、限外濾過等による低分子物質の除去方法などを単独で又は適宜組み合わせて適用する。
　組換菌の作成は、アミダーゼ等の酵素をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより宿主微生物を形質転換することにより行う。宿主微生物としては、細菌では大腸菌、ロドコッカス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、バチルス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属などが挙げられ、酵母ではサッカロマイセス属、カンジダ属、シゾサッカロマイセス属、ピキア属、糸状菌ではアスペルギルス属などが挙げられる。
　本発明では、上記の組換菌だけでなく、当該組換菌の凍結物、乾燥物又は粉砕物等の菌体処理物も併せて「組換菌」と称することがある。
［反応液組成］
　第一の反応液のアミド化合物濃度は、０．１質量％以上であることが好ましい。また、アミド化合物濃度は、高濃度の基質による酵素の失活を抑制するため、５０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがより好ましく、１５質量％以下であることがさらに好ましい。アミド化合物濃度は、例えば２～１１質量％であってよい。
　第一の反応液のアミン濃度は、０．１質量％以上であることが好ましい。また、アミン濃度は、高濃度の基質による酵素の失活を抑制するため、３０質量％以下であることが好ましく、２０質量％以下であることがより好ましい。アミン濃度は、例えば２～７質量％であってよい。
　第一の反応液中の酵素のアミダーゼ活性は１００Ｕ／Ｌ～１０００００Ｕ／Ｌが好ましい。
　第一の反応液の溶媒は、水溶媒であることが好ましく、必要に応じて水溶媒に緩衝剤を添加して使用することができる。第一の反応液のｐＨは好ましくは８～１２、より好ましくは９～１１とすることができる。緩衝剤は、上記ｐＨを維持可能であれば特に限定されず、例えば炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムを使用できる。
２．工程（２）
　本工程では、アミド交換反応を触媒する酵素の存在下に、アミド化合物とアミンとを反応させる。本工程では、アミダーゼ等の酵素によって触媒されるアミド化合物とアミンとのアミド交換反応によって第一の反応液中にＮ－置換アミド化合物を生成させて、アミド化合物とＮ－置換アミド化合物とを含む第二の反応液を得る。
　アミド化合物の少なくとも一部がアミンとのアミド交換によって、Ｎ－置換アミド化合物に変換される。また、アミダーゼによるアミド化合物のＮ－置換アミド化合物への転換効率は通常１００％ではないので、アミンとのアミド交換に供されなかったアミド化合物は反応液中に残存する。その結果、第二の反応液として、アミド化合物とＮ－置換アミド化合物とを含む反応液が得られる。第二の反応液は、アミド化合物とＮ－置換アミド化合物とに加えて、アミダーゼ等の酵素あるいは組換菌を含み得る。
　生成するＮ－置換アミド化合物は、用いるアミド化合物とアミンの選択による。生成するＮ－置換アミド化合物は、具体的には、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］アクリルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド及びジアセトンアクリルアミドから選択されるいずれか一以上である。
　Ｎ－置換アミド化合物は、好ましくは、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドである。この場合、アミド化合物はアクリルアミドであり、アミンはＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミンである。
［反応条件］
　反応温度は、好ましくは４～９０℃、熱による酵素の失活を抑制するためにより好ましくは１０～４０℃、さらに好ましくは１５～３０℃とされる。
　反応時間は、目的とする濃度のＮ－置換アミド化合物が生成するのに十分な時間とされ、特に限定されないが、例えば７～９６時間である。
［反応生成組成物］
　工程（２）で得られる第二反応液は、
（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
（ｉｉ）Ｎ－置換アミド化合物と、
（ｉｉｉ）アミド化合物と、
を含み得る。
　当該反応液中には、（ｉｉ）Ｎ－置換アミド化合物及び（ｉｉｉ）アミド化合物以外にも、アミド化合物とアミンとがアミド交換反応することによって生成するアンモニア若しくはその塩；アミド化合物とアミンとがアミド交換反応とは別にマイケル付加反応して生じるマイケル付加反応物；アミド化合物の加水分解物、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分から選択されるいずれか一以上の成分を含み得る。
　この第二反応液は、続く工程（３）でのＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造に供されるものであり、以下の特長を有する。
　通常、連鎖移動剤等により重合体の分子量を調節する場合、重合開始の遅延を生じることがあるが、本発明で得られる第二反応液を重合反応に供する場合はそのような欠点はなく、精製せずにそのまま重合に用いることができる。
　本発明で得られる第二反応液をそのまま重合反応に供する場合は、得られる重合体の分子量が適度に調節されるため、得られる重合体が不溶化（ゲル化）しにくいという利点がある。また、高分子量の重合体を製造したい場合、重合条件を変更することにより高分子量化することができるが、架橋成分が少ないため不溶化しにくいという特徴がある。
　さらに、上記（ｉ）の成分が重合に影響を与えず、且つ、緩衝能を有していると考えられるため、本発明で得られる第二反応液をそのまま重合反応に供しても重合時のｐＨの変化を小さく制御でき、反応が安定する。
　工程（２）で得られる第二反応液のアミド化合物濃度は０．１質量％以上、５０質量％以下であることが好ましい。
　工程（２）で得られる第二反応液のＮ－置換アミド化合物濃度は、０．１質量％以上、３０質量％以下であることが好ましい。
　工程（２）で得られる第二の反応液の溶媒は、第一の反応液と同じである。
３．工程（３）
　本工程では、第二の反応液を重合条件に付し、アミド化合物とＮ－置換アミド化合物とを重合させてＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を得る。
　工程（２）において、アミド化合物の少なくとも一部は、アミンとのアミド交換によってＮ－置換アミド化合物に変換されるが、残余は、未反応のまま反応液中に存在している。
　本工程では、この未反応のアミド化合物とＮ－置換アミド化合物との重合反応により、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を生成する。第二の反応液中のアミド化合物とＮ－置換アミド化合物は、精製・分離することなく、重合反応に供されてよい。また、必要に応じて、アミド化合物を反応液中に添加することもできる。
　重合方法は、水溶媒中で重合する方法であれば特に制限されることはなく、水溶液重合法、断熱重合法及び連続重合法等を採用できる。さらには、非水溶媒を用いた懸濁重合法や乳化重合法も採用できる。
　重合は、第二の反応液に重合開始剤を添加し、熱、光又はレドックス反応等によりフリーラジカルを発生させることにより開始される。第二の反応液に重合開始剤の溶液を添加することが一般的であるが、重合開始剤の溶液に第二の反応液を滴下してもよい。懸濁重合や乳化重合の場合は、第二の反応液を非水溶媒に懸濁もしくは乳化して作成した懸濁液に、重合開始剤の溶液を添加してもよく、非水溶媒もしくは非水溶媒と水の懸濁もしくは乳化液に、重合開始剤溶液及び第二の反応液を添加して行ってもよい。
［反応液組成］
　工程（３）での第二の反応液のアミド化合物濃度は５質量％以上であることが好ましい。また、アミド化合物濃度は、重合熱抑制の観点から、５０質量％以下であることが好ましく、３０質量％以下であることがより好ましく、２０質量％以下であることがさらに好ましい。アミド化合物濃度は、例えば約１０質量％であってよい。
　工程（３）での第二の反応液のＮ－置換アミド化合物濃度は、０．１質量％以上であることが好ましい。また、Ｎ－置換アミド化合物濃度は、重合熱抑制の観点から、３０質量％以下であることが好ましく、２０質量％以下であることがより好ましく、１５質量％以下であることがさらに好ましい。例えば１～７質量％であってよい。
　また、工程（３）での第二の反応液は、必要に応じて他のモノマーを含んでいても良い。他のモノマーとしては、例えば、ポリマーを両性化するためのアクリル酸、ポリマーを分岐又は架橋させるための多官能性モノマー、ポリマーの改質のためのジメチルアクリルアミドモノマー等が挙げられる。他のモノマーの濃度は、その目的や種類によって異なるが、０～３０質量％であることが好ましい。
　第二の反応液の溶媒は、いずれの溶媒を使用しても良いが、水溶媒であることが好ましい。水溶媒中の場合、第二の反応液の好ましいｐＨは２～１０である。
　重合開始剤には、従来汎用のものが使用可能であり、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過酸化ベンゾイル、過酸化水素、t-ブチルハイドロパーオキサイド等の過酸化物；アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物；ベンゾインエチルエール等の光分解型の重合開始剤；及び上記過酸化物とレドックス反応により開始剤を形成する亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ハイドロスルファイトナトリウム、トリエタノールアミン、硫酸第１鉄等の還元剤；を使用できる。これらの重合開始剤は１種類を単独であるいは２種類以上を組み合わせて使用できる。
　重合開始剤の濃度は、種類と温度によって異なるが、１０～５００００ｐｐｍであることが好ましく、２０～４００００ｐｐｍであることがより好ましい。
　重合反応の温度は、その触媒の分解温度より正確には１０時間半減期によって異なるが、０℃～９０℃であることが好ましい。
　重合反応の時間は、例えば３０分～１０時間である。
［反応生成組成物］
　工程（３）で得られる共重合組成物は、
（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
（ｉｖ）構成単位としてＮ－置換アミド化合物及びアミド化合物を含む共重合体と、
を含み得る。
　本発明で得られる共重合体組成物は上記（ｉ）の成分を含むが、これらの成分は重合体を後架橋させることがないため、得られた重合体が保存中も不溶化（ゲル化）しにくく、共重合は安定である。
　さらに上記（ｉ）の成分が緩衝効果を奏することにより、ｐＨ等の外部環境の変化に対しても安定的に共重合体を保存できるという効果を有する。
　重合反応によるアミド化合物のＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体への転化率は、例えば９８％以上である。また、重合反応によるＮ－置換アミド化合物の共重合体への転化率は、例えば９９．８％以上である。
　本発明に係る製造方法によれば、アミド化合物とアミンから生体触媒反応によりＮ－置換アミド化合物を生成させ（工程（２））、生成したＮ－置換アミド化合物と未反応のアミド化合物との重合反応によりＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を生成させる（工程（３））という連続的プロセスにより、製造工程を簡略化できる。加えて、本発明に係る製造方法は、Ｎ－置換アミド化合物の合成のために高温条件を要する多段階の工程を必要としないため、コストの低減に寄与し得る。
　また、本発明に係る製造方法は、低温（例えば１００℃以下、好ましくは室温付近）で且つかつ特異性の高い酵素反応である。そのため、精製を要する不純物が極めて限定されており、たとえこれらの不純物が存在しても重合遅延、架橋、ゲル化等を引き起こさない。　それに対し、現在使用されている高温での反応による方法では、原料などの縮合により架橋等を引き起こす他官能性モノマーや連鎖移動、重合遅延につながる縮合物、芳香族系化合物を生じる可能性が極めて高く、精製工程が必須であった。したがって、重合遅延を引き起こさず、且つ、架橋、ゲル化等の反応を引き起こす可能性が極めて少ない本発明の第二反応液は、精製工程を省略できるため、本発明において、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を非常に効率良く製造することができる。
　本発明に係る製造方法において、工程（２）及び工程（３）は上記とおり連続的プロセスとできるが、必要に応じて、工程（２）と工程（３）との間に、第二の反応液にアミド化合物及び／又は他のモノマーを添加する工程を含んでいてもよい。
　また、工程（２）において、第二の反応液にアミド化合物及び／又は他のモノマーが添加されてもよい。
　さらに、本発明に係る製造方法は、必要に応じて、工程（２）と工程（３）との間に以下の工程（２ａ）及び／又は工程（２ｂ）を含んでいてもよい。
４．工程（２ａ）
　本工程では、アミド化合物とアミンとのアミド交換反応によって生成したアンモニアを第二の反応液から除去する。本工程は、必須とはならないが、アンモニアを夾雑物として含まないＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を得るために行うことが好ましい。
　アンモニアの除去は、曝気等の手段で行ってもよく、アンモニア塩存在が実用上問題ない場合は塩酸等の酸による中和によって行ってもよい。
５．工程（２ｂ）
　本工程では、アミダーゼ等の酵素を発現する組換菌を前記第二の反応液から除去する。本工程は、必須とはならないが、組換菌を夾雑物として含まないＮ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体を得るために行うことが好ましい。
　組換菌の除去には、遠心分離、膜ろ過、ケークろ過、凝集分離及び活性炭処理等の従来汎用の手法を単独で又は組み合わせて適用できる。
　以下、本発明の実施例を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の「％」は質量％を示す。
［試験例１：アミダーゼを発現する組換菌の作製］
１．アミダーゼ遺伝子
　アミダーゼとしては、ロドコッカス・エリスロポリス　ＴＡ３７株アミダーゼ（GenBank:JX894244、特許文献２参照）を用いた。
　また、ロドコッカス・エリスロポリス　ＴＡ３７株アミダーゼのアミノ酸配列と高い配列同一性を示すアミダーゼを、パブリックデータベースの検索（Ｂｌａｓｔ検索）によって取得して用いた。
　使用したアミダーゼの由来株、GenBankアクセションナンバー、ロドコッカス・エリスロポリス　ＴＡ37株アミダーゼに対するアミノ酸配列同一性、アミノ酸配列及び核酸配列の配列番号を「表１」に示す。各アミダーゼの遺伝子配列DNAを合成し、それぞれプラスミドpET-26b（Stratagene社）に挿入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．アミダーゼ遺伝子を組み込んだ発現ベクターの作製
　上記１のプラスミドを鋳型としたＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素で切断し、それぞれ発現ベクターpSJ034のマルチクローニングサイトに導入した。各アミダーゼの発現ベクターを「表２」のとおり命名した。なお、発現ベクターpSJ034は、形質転換体pSJ023から特許文献３に記載される方法に従って作製した。形質転換体pSJ023（R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に1997年3月4日付で国際寄託されている（受託番号FERM BP-6232）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．アミダーゼを発現する組換菌の作製
　上記２の発現ベクターで宿主微生物を形質転換することで、アミダーゼを発現する組換菌を作製した。
　宿主微生物には、ロドコッカス・ドロクロウスJ1株のニトリルヒドラターゼ欠損株であるDN1株（特許文献４参照）を用いた。
　発現ベクターの溶液1 μlとDN1株コンピテントセル溶液10 μlの混合液を30分間氷冷した。混合液をキュベットに入れ、遺伝子導入装置（Gene Pulser、BIO RAD)により20 kV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。その後、混合液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショクを行った。混合液をMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4）500 μlを加えて30℃、24時間静置した後、10 μg/mlカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養した。プラスミドの導入が確認されたコロニーを、アミダーゼを発現する組換菌として分離した。
４．アミダーゼ活性の確認
　上記３の組換菌のアミダーゼ活性を以下の方法で測定した。
　反応液（１００ｍＭ　アクリルアミド、５０ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、５０ｍＭ　炭酸水素ナトリウムバッファー（pH 9））に、組換体を含む培養液を添加し、37℃で一晩反応させた。０．４５μｍフィルターを用いて菌体を濾別した反応液をガスクロマトグラフィー分析に供し、アクリルアミドとＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミンとのアミド交換反応によって生成したＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドの濃度を測定した。
分析条件
　分析機器：ガスクロマトグラフGC-２０１４Ｓ(島津製作所製)
　検出器：FID（250℃にて検出)
　カラム：Rtx-5Amine（30mm×0.25mmI.D.×1.0μm  d.f.  Restek社）
　カラム温度：50℃、2min→（20℃/min）→160℃、0min→（30℃/min）→240℃、5min
　表３に、組換菌のアミダーゼ活性を、生成したＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド量（発現ベクターpSJTA37による組換菌における生成量を１とした相対値）により示す。全ての組換菌でＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドの生成が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例１：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
１．工程（１）
　５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）を３．２％（ｖ/ｖ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（東京化成工業株式会社）を２．３％、実施例１で作製した組換菌（１％）及び水を含有する第一の反応液を反応槽内に調製した。反応槽には、内容積５００ｍＬのジャケット付き攪拌槽を使用した。反応液は、６Ｍ　ＨＣＬ溶液を添加することでｐＨ１０に調整した。第一の反応液中のアミダーゼ活性は１０００Ｕ／Ｌとした。
２．工程（２）・（２ｂ）
　反応液の温度を２０℃に制御し、組換菌が均一に分散するよう撹拌しながら７時間アミド交換反応を行い、第二の反応液を得た。得られた第二の反応液を孔径０．４５μｍのフィルターで膜ろ過して組換菌を除去した。
　組換菌を除去した第二の反応液を、実施例１（４）と同様のガスクロマトグラフィー分析に供し、アクリルアミドとＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミンとのアミド交換反応によって生成したＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミドの濃度を測定した。アクリルアミド濃度は０．１％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度は１．１％であった。
３．工程（３）
　第二の反応液に５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）を添加し、アクリルアミド濃度が９．８％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度が１．０％となるように調整した。その後、攪拌機を装備したジャケット付きセパラブルフラスコに第二の反応液を移し、次亜リン酸ナトリウム２０００ｐｐｍを添加してｐＨを９とした。窒素ガスを流通して酸素を除去した。ジャケットを７０℃に昇温し、窒素シール下で２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオアミジン）ジヒドロクロリドを対モノマーで１５０００ｐｐｍ添加し、３時間撹拌して重合反応を行った。
　重合反応後の反応液の一部を取り、液体クロマトグラフィー（カラム：ＯＤＰ２　ＨＰ４Ｅ　２５０ｍｍ×４．６ｍｍ　ＵＶ２０７ｎｍ検出）にて残存モノマーを測定した。その結果、モノマーの重合転化率は９８％であった（表４参照）。
　なお、モノマーの重合転化率は、以下の式で求めた（以下の実施例及び比較例も同様）。
　モノマーの重合転化率（％）＝｛〔（重合反応開始前のアミド化合物の濃度）＋（重合反応開始前のＮ－置換アミド化合物の濃度）〕－〔（重合反応終了後のアミド化合物の濃度）＋（重合反応終了後のＮ－置換アミド化合物の濃度）〕｝／〔（重合反応開始前のアミド化合物の濃度）＋（重合反応開始前のＮ－置換アミド化合物の濃度）〕
　また、重合時の溶液温度をデジタル温度計で測定した（以下の実施例及び比較例も同様）。重合時の溶液の最高到達温度は７５．４℃であった（図１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［比較例１：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
　５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）と市販のＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（東京化成工業株式会社、Cas. No.3845-76-9）を混合し、アクリルアミド濃度が９．８％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度が１．０％となるように調整した。その後、実施例１の工程（３）と同様にして重合反応を行って、モノマーの重合転化率と重合時の溶液温度を測定した。
　結果、モノマーの転化率は、９８％であり（表４参照）、重合時の溶液の最高到達温度は７８．６℃であった（図１参照）。
　これらの結果から、実施例１において、本発明の酵素反応により得られた第二の反応液中に不純物（アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、組換菌体由来成分及び培地成分等）が存在していても、これらの不純物が含まれない反応液を重合反応に供した比較例１と同等の転化率が達成されることを確認できた。
　また、実施例１は比較例１と比較して重合反応時の最高到達温度が低く、安全に重合反応を行うことが可能であることが分かった。
［実施例２：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
１．工程（１）・（２）・（２ｂ）
　第一の反応液における５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）の濃度を２１％（ｖ/ｖ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（東京化成工業株式会社）の濃度を７．４％、組換菌の濃度を３．７％とし、反応時間を２４時間、反応液のｐＨを９とした以外は実施例１と同様にアミド交換反応を行って第二の反応液を得た。第一の反応液中のアミダーゼ活性は１６０００Ｕ／Ｌとした。
　組換菌を除去した第二の反応液のアクリルアミド濃度は４．３％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度は６．５％であった。
２．工程（３）
　第二の反応液にアクリルアミド粉末（関東化学株式会社）を添加し、アクリルアミド濃度が１０％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度が６．５％となるように調整した。その後、実施例１と同様に重合反応を行った。その結果、モノマーの重合転化率が９７％であることを確認した（表４参照）。また、重合時の溶液の最高到達温度は７２℃であった（図２参照）。
［比較例２：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
　５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）と市販のＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（東京化成工業株式会社、 Cas. No.3845-76-9）を混合し、アクリルアミド濃度が１０．０％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度が６．５％となるように調整した。その後、実施例２の工程（３）と同様にして重合反応を行って、モノマーの重合転化率と重合時の溶液温度を測定した。
　結果、モノマーの転化率は９９％であり（表４参照）、重合時の溶液の最高到達温度は８９．８℃であった（図２参照）。
　これらの結果から、実施例２においても、本発明の酵素反応により得られた第二の反応液中に不純物（アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、組換菌体由来成分及び培地成分等）が存在していても、これらの不純物が含まれない反応液を重合反応に供した比較例２と同等の転化率が達成されることを確認できた。
　また、実施例２は比較例２と比較して重合反応時の最高到達温度が低く、安全に重合反応を行うことが可能であることが分かった。
［実施例３：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
１．工程（１）・（２）・（２ｂ）
　第一の反応液における５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）の濃度を１０．６％（ｖ/ｖ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン（東京化成工業株式会社）の濃度を７．７％、組換菌の濃度を５．０％とし、反応時間を２４時間、反応液のｐＨを９とした以外は実施例１と同様にアミド交換反応を行って第二の反応液を得た。第一の反応液中のアミダーゼ活性は１２０００Ｕ／Ｌとした。
　組換菌を除去した第二の反応液のアクリルアミド濃度は１．３％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度は８．６％であった。
２．工程（３）
　第二の反応液にアクリルアミド粉末（関東化学株式会社）を添加し、アクリルアミド濃度が６．０％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度が４．１％となるように調整した。その後、実施例１と同様に重合反応を行った。その結果、モノマーの重合転化率が９９％であることを確認した（表４参照）。また、重合時の溶液の最高到達温度は７３．６℃であった（図３参照）。
［比較例３：アクリルアミド／Ｎ－置換アクリルアミド共重合体の製造］
　５０％アクリルアミド水溶液（三菱ケミカル社）と市販のＮ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（東京化成工業株式会社、 Cas. No.3845-76-9）を混合し、アクリルアミド濃度を６．０％、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド濃度４．１％の溶液を調整した。その後、実施例３の工程（３）と同様にして重合反応を行って、モノマーの重合転化率と重合時の溶液温度を測定した。
　結果、モノマーの転化率は９９％であり（表４参照）、重合時の溶液の最高到達温度は７７．３℃であった（図３参照）。
　これらの結果から、実施例３においても、本発明の酵素反応により得られた第二の反応液中に不純物（アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、組換菌体由来成分及び培地成分等）が存在していても、これらの不純物が含まれない反応液を重合反応に供した比較例３と同等の転化率が達成されることを確認できた。
　また、実施例３は比較例３と比較して重合反応時の最高到達温度が低く、安全に重合反応を行うことが可能であることが分かった。
配列番号１：Rhodococcus erythropolis strain TA37のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号２：Rhodococcus erythropolis SK121のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号３：Rhodococcus erythropolis PR4のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号４：Rhodococcus qingshengii CW25のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号５：Gordonia alkanivorans NBRC 16433のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号６：Arthrobacter sp. MWB30のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号７：Pseudonocardia sp. AL041005-10のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号８：Pseudonocardia spinosispora DSM 44797のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号９：Rhodococcus rhodochrous KG-21のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号１０：Arthrobacter sp. Leaf145のアミダーゼのアミノ酸配列
配列番号１１：erythropolis strain TA37のアミダーゼの核酸配列
配列番号１２：Rhodococcus erythropolis SK121のアミダーゼの核酸配列
配列番号１３：Rhodococcus erythropolis PR4のアミダーゼの核酸配列
配列番号１４：Rhodococcus qingshengii CW25のアミダーゼの核酸配列
配列番号１５：Gordonia alkanivorans NBRC 16433のアミダーゼの核酸配列
配列番号１６：Arthrobacter sp. MWB30のアミダーゼの核酸配列
配列番号１７：Pseudonocardia sp. AL041005-10のアミダーゼの核酸配列
配列番号１８：Pseudonocardia spinosispora DSM 44797のアミダーゼの核酸配列
配列番号１９：Rhodococcus rhodochrous KG-21のアミダーゼの核酸配列
配列番号２０：Arthrobacter sp. Leaf145のアミダーゼの核酸配列

Claims (7)

  1. 　（Ａ）アミド交換反応を触媒する酵素の存在下に、アミド化合物とアミンとを反応させる工程と、
    　（Ｂ）得られた反応物を重合条件に付し、Ｎ－置換アミド化合物とアミド化合物とを重合させて共重合体を得る工程と、
    を含む、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体の製造方法。
  2. 　前記酵素がアミダーゼである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　アミド化合物が、アクリルアミド又はメタクリルアミドである、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　アミンが、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン、イソプロピルアミン、２－ヒドロキシエチルアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、ジメチルアミン及び４－アミノ－４－メチル－２－ペンタノンからなる群から選択されるいずれか一以上である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　Ｎ－置換アクリルアミドが、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］アクリルアミド、ｔｅｒｔ－ブチルアクリルアミド、ＮＮ－ジメチルアクリルアミド及びダイアセトンアクリルアミドからなる群から選択されるいずれか一以上である、請求項１記載の製造方法。
  6. 　（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
    　（ｉｉ）Ｎ－置換アミド化合物と、
    　（ｉｉｉ）アミド化合物と、
    を含む、Ｎ－置換アミド化合物／アミド化合物共重合体製造用組成物。
  7. 　（ｉ）アミド化合物とアミンとのマイケル付加反応物、アミド化合物の加水分解物、アンモニア若しくはその塩、微生物菌体由来成分及び当該微生物を培養するための培地成分からなる群から選択されるいずれか一以上と、
    　（ｉｖ）構成単位としてＮ－置換アミド化合物及びアミド化合物を含む共重合体と、
    を含む、共重合体組成物。
     
    　
     

     
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