CN116536234A - 一种高产l-高丝氨酸的工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产L‑高丝氨酸的工程菌及其应用，以重组大肠杆菌HS为底盘菌株，在基因组上插入1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr、替换1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr，并引入强表达质粒pTrc99A‑thrAfbr，然后用强启动子Ptrc分别替换基因pntAB和基因fpr的原位启动子，最后引入基因esaI、基因esaR和基因thrB；本发明采用群体感应系统(esaI/esaR)动态调控苏氨酸合成途径，解除发酵过程中必需氨基酸苏氨酸的添加，降低发酵过程中调控的复杂性及发酵成本，摇瓶发酵L‑高丝氨酸产量从11.4g/L提高到19.7g/L，为L‑高丝氨酸发酵法生产奠定了一定的研究基础。

Description

一种高产L-高丝氨酸的工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明属于合成生物学领域，具体涉及一种高产L-高丝氨酸的工程菌及其应用。
(二)背景技术
L-高丝氨酸(L-homeserine,L-HS)是一种非蛋白质氨基酸，又名2-氨基-4-羟基丁酸，广泛应用于γ-丁内酯、L-高丝氨酸内酯、1,4-丁二醇等化合物的合成，并可以作为合成农药草铵膦的原料。L-高丝氨酸作为一种非必需氨基酸，存在于细菌的肽聚糖中，也是微生物细胞内多种必需氨基酸，如L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸等生物合成的中间代谢产物。正是由于高丝氨酸丰富的生物、化学活性，使得L-高丝氨酸被广泛应用于食品、医药、农业、化妆品以及饲料添加等行业。
传统的L-高丝氨酸生产方法主要是化学合成法，但该方法存在反应步骤长、反应条件苛刻、安全性低等问题，将逐渐被取代。由于对气候变化和环境问题的日益关注，用于化学品绿色生产的生物合成技术越来越受到关注，特别是近年来合成生物学的发展，更为高丝氨酸的生物合成提供了有效的代谢工程改造策略。通过代谢途径的理性设计、代谢改造，已实现了多种氨基酸的发酵法生产，如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸等。与化学合成法相比，微生物发酵合成氨基酸具有工艺环保、成本低、生产效率高等优点，逐渐成为氨基酸生产的主流方式。
生物法合成L-高丝氨酸最早是通过谷氨酸棒杆菌发酵生产L-苏氨酸和L-赖氨酸的过程中获得的，该菌株在含80g/L玉米浆和150g/L蔗糖的培养基中发酵72h，最终得到14.5g/L的L-高丝氨酸。Li等使用基因编辑技术构建得到了一株高丝氨酸高产的大肠杆菌HM4(pBRmetL–pNrhtA)，其在500mL摇瓶中发酵得到2.12g/L的产量。在敲除工程菌株的外转运蛋白基因tdcC后得到菌株HM5(pBRmetL–pNrhtA)，经过补料发酵得到了39.9g/L的高丝氨酸。于波课题组设计从葡萄糖发酵L-高丝氨酸的氧化还原平衡途径，这种途径降低了细胞生长压力，微调了从延胡索酸到L-天冬氨酸的流量，敲除了竞争和降解途径，增强L-高丝氨酸的流出，最终发酵得到84.1g/L的L-高丝氨酸。谢新开等通过敲除thrB基因，阻断高丝氨酸向苏氨酸降解途径，并在大肠杆菌基因组上多拷贝高丝氨酸合成途径中的关键基因，使得高丝氨酸产量达88g/L。
但如上所述的L-高丝氨酸发酵菌株改造过程中，为提高L-高丝氨酸的发酵产量，其副产物合成途径，如L-赖氨酸、L-苏氨酸途径均被敲除，这导致在后续发酵过程中需外源添加这些必需氨基酸以维持大肠杆菌的生长；并且目前L-高丝氨酸整体发酵水平较低，导致其较难进行工业化生产。
为此，本发明主要围绕提高L-高丝氨酸发酵水平进行菌株改造，并且在改造过程中引入群体感应系统，动态调控副产物氨基酸(如L-赖氨酸、L-苏氨酸)合成途径，避免由于营养缺陷型菌株导致的后续发酵需外源添加必需氨基酸等问题，降低发酵操作的复杂性及发酵成本，提高L-高丝氨酸发酵水平，为后续发酵法工业化生产奠定一定的研究基础。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高产L-高丝氨酸的工程菌及应用，主要围绕提高L-高丝氨酸发酵水平进行菌株改造，并且在改造过程中引入群体感应系统，动态调控副产物必需氨基酸的合成途径，消除发酵过程中必需氨基酸的添加，降低发酵操作的复杂性及发酵成本，提高L-高丝氨酸发酵水平，有效提高工业上发酵生产L-高丝氨酸的效率，为大规模工业化生产奠定基础。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种高产L-高丝氨酸的工程菌，所述工程菌以重组大肠杆菌HS为底盘菌株，在基因组上插入1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr，替换1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr，并引入强表达质粒pTrc99A-thrAfbr以过表达抗反馈抑制基因thrAfbr，然后用强启动子Ptrc分别替换编码吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB和编码铁氧还原蛋白/黄素还原蛋白的NADP+还原酶编码基因fpr的原位启动子，以达到下游基因过表达的效果，最后引入基因esaI、基因esaR和基因thrB(即引入esaI/esaR群体感应系统来动态调控副产物氨基酸L-苏氨酸合成的关键基因thrB)；所述基因thrB采用PesaS启动子调控；所述重组大肠杆菌HS为E.coli W3110
ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclRΔptsGΔgalRΔlacI::Ptrc-rhtA Ptrc-rhtA Ptrc-eamA Ptrc-metL Ptrc-thrA Ptrc-glk Ptrc-gltB。所述抗反馈抑制基因是抗天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ反馈抑制的基因。
进一步，所述抗反馈抑制基因thrAfbr插入底盘菌的yjiT基因位点，并在ompT基因位点进行替换；所述抗反馈抑制基因thrAfbr(NCBI基因编号：ECK0002)的核苷酸序列如SEQID NO.1的553-3015bp序列，yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，ompT基因(NCBI基因编号：ECK0557)核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；更优选，抗反馈抑制基因thrAfbr插入yjiT基因的1518bp后、在ompT基因的1-954bp处进行替换。
进一步，所述基因pntAB(NCBI基因编号：ECK1598-ECK1597)的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述基因fpr(NCBI基因编号：ECK3916)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述强启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的501-552bp核苷酸序列；所述PesaS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的500-710bp核苷酸序列。
进一步，引入esaI/esaR群体感应系统动态调控thrB基因。所述基因esaI(NCBI基因编号：L32183.1)核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的567-1196bp核苷酸序列，插入位点为基因yjiT的1269-1292bp处；基因esaR(NCBI基因编号：L32184.1)核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的566-1312bp核苷酸序列，插入位点为基因yjiT的4-27bp处；所述基因thrB(NCBI基因编号：ECK0003)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的711-1643bp核苷酸序列，插入位点为基因ygaY的8-31bp处；thrB基因的原始启动子替换为PesaS启动子，核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示的500-710bp核苷酸序列。
进一步，优选所述工程菌以重组大肠杆菌HS为底盘菌株按如下步骤构建：(1)大肠杆菌基因组上，在yjiT位点插入一个拷贝数的编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的基因thrAfbr，记为菌株HS1；(2)菌株HS1在基因组ompT位点上替换一个拷贝数编码抗反馈抑制的天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的基因thrAfbr，记为菌株HS2；(3)在菌株HS2上导入强表达质粒pTrc99A过表达抗反馈抑制的thrAfbr基因，记为菌株HS3；(4)在菌株HS3基因组上用强启动子Ptrc调控编码吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB来进行过表达，记为菌株HS4；(5)在菌株HS4基因组上用强启动子Ptrc调控NADP+还原酶编码基因fpr，记为菌株HS5；(6)在菌株HS4中引入基因esaI、基因esaR和基因thrB(引入esaI/esaR群体感应系统，来动态调控苏氨酸合成基因thrB)，记为HS6。
本发明菌株HS6的构建方法包括如下步骤：
(1)HS1的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别扩增yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)的上、下游同源臂片段UyjiT、DyjiT，和thrA基因的上、下游同源臂片段UthrA和DthrA，通过融合PCR获得重叠片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因yjiT的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，构建pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg突变载体；
将片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT和pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg进行一步克隆，获得pTarget-thrAfbr(yjiT)载体，电转化至含有pCas9的HS菌株中，经筛选获得插入一个拷贝thrAfbr的菌株HS1。
(2)HS2的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别扩增ompT基因(NCBI基因编号：ECK0557)的上、下游同源臂片段UompT、DompT，并且以pTarget-thrAfbr(yjiT)载体为模板扩增出thrAfbr基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的553-3015bp序列)，通过融合PCR获得重叠片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因ompT的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，构建pTarget-thrAfbr(ompT)-sg突变载体；
将片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT和pTarget-thrAfbr(ompT)-sg进行一步克隆，获得pTarget-thrAfbr(ompT)载体，电转化至含有pCas9的HS1菌株中，经筛选获得替换一个拷贝thrAfbr的菌株HS2。
(3)HS3的构建
以pTarget-thrAfbr(yjiT)载体为模板扩增出thrAfbr基因片段(核苷酸序列如SEQID NO.1所示的553-3015bp序列)和载体pTrc99A进行一步克隆，获得pTrc99A-thrAfbr载体，转化至HS2菌株中，获得菌株HS3。
(4)HS4的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别扩增pntAB基因(NCBI基因编号：ECK1598-ECK1597)的上、下游同源臂片段UpntAB、DpntAB，通过融合PCR获得重叠片段UpntAB-Ptrc-DpntAB；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因pntAB的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)，构建pTarget-pntAB-sg突变载体；
将片段UpntAB-Ptrc-DpntAB和pTarget-pntAB-sg进行一步克隆，获得pTarget-pntAB载体，电转化至含有pCas9但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS3菌株中，经筛选获得的菌株再导入pTrc99A-thrAfbr载体获得菌株HS4。
(5)HS5的构建
以大肠杆菌E.coli W3110基因组为模板，分别扩增fpr基因(NCBI基因编号：ECK3916)的上、下游同源臂片段Ufpr、Dfpr，通过融合PCR获得重叠片段Ufpr-Ptrc-Dfpr；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因fpr的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，构建pTarget-fpr-sg突变载体；
将片段Ufpr-Ptrc-Dfpr和pTarget-fpr-sg进行一步克隆，获得pTarget-fpr载体，电转化至含有pCas9但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS4菌株中，经筛选获得的菌株再导入pTrc99A-thrAfbr载体获得菌株HS5。
(6)HS6的构建
以菌株HS5基因组为模板，分别扩增yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)的上、下游同源臂片段UyjiT1、DyjiT1，委托北京擎科生物科技有限公司合成esaR基因，并且以该基因为模板扩增出esaR基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的566-1312bp核苷酸序列)，通过融合PCR获得重叠片段UyjiT1-esaR-DyjiT1；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因yjiT的sgRNA的pTarget-esaR(yjiT)-sg突变载体，其中sgRNA序列为SEQ ID NO.2所示基因yjiT的5-24bp核苷酸序列；
将片段UyjiT1-esaR-D yjiT1和pTarget-esaR(yjiT)-sg进行一步克隆，获得pTarget-esaR(yjiT)载体，电转化至含有pCas9的HS4菌株中，经筛选获得插入一个拷贝esaR基因的菌株HS4-1。
以菌株HS4-1基因组为模板，分别扩增yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)的上、下游同源臂片段UyjiT2、D yjiT2，委托北京擎科生物科技有限公司合成esaI基因，并且以该基因为模板扩增出esaI基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的567-1196bp核苷酸序列)，通过融合PCR获得重叠片段UyjiT2-esaI-DyjiT2；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因yjiT的sgRNA的pTarget-esaI(yjiT)-sg突变载体，其中sgRNA序列为SEQ ID NO.2所示基因yjiT的1270-1289bp核苷酸序列；
将片段UyjiT2-esaI-D yjiT2和pTarget-esaI(yjiT)-sg进行一步克隆，获得pTarget-esaI(yjiT)载体，电转化至含有pCas9的HS4-1菌株中，经筛选获得插入一个拷贝esaI基因的菌株HS4-2。
以菌株HS4-2基因组为模板，分别扩增ygaY基因(NCBI基因编号：ECK2675)的上、下游同源臂片段UygaY、DygaY，委托北京擎科生物科技有限公司合成PesaS启动子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的500-710bp核苷酸序列)，并且以大肠杆菌W3110为模板扩增出thrB基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的711-1643bp核苷酸序列)，通过融合PCR获得重叠片段UygaY-PesaS-thrB-DygaY；
以pTargetF载体为模板，扩增出能够表达靶定目的基因ygaY的sgRNA的pTarget-thrB(ygaY)-sg突变载体，其中sgRNA对应SEQ ID NO.9所示基因ygaY的9-28bp核苷酸序列；
将片段UygaY-PesaS-thrB-DygaY和pTarget-thrB(ygaY)-sg进行一步克隆，获得pTarget-thrB(ygaY)载体，电转化至含有pCas9的HS4-2菌株中，经筛选获得插入thrB基因的菌株HS6。
本发明还提供一种所述高产L-高丝氨酸的工程菌在生产L-高丝氨酸中的应用，所述应用的方法为：
(1)种子培养：将高产L-高丝氨酸的工程菌划线于LB固体平板上，37℃培养12h；挑取平板上的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养12h，培养物按体积浓度0.5％的量接种于新的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养8～10h，获得种子液；
(2)摇瓶发酵培养：将种子液以体积浓度5％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在30～32℃、150～180rpm条件下发酵培养48h，获得含L-高丝氨酸的发酵液，分离提取，获得L-高丝氨酸；所述发酵培养基组成：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 16g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO41g/L、MgSO4 1g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·7H2O 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L、CaCO325g/L、L-苏氨酸0-0.2g/L、L-蛋氨酸0.05g/L、L-赖氨酸0.025g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8。根据菌株有无pTrc99A-thrAfbr载体，选择性添加终浓度为50mg/L的卡那霉素。
优选的，所述菌株为HS6时，L-苏氨酸的含量为0。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明以菌株HS为底盘菌，通过在基因组的yjiT基因和ompT基因位点分别插入或替换一个拷贝的基因thrAfbr，再引入pTrc99A-thrAfbr载体，之后将基因pntAB和基因fpr的原位启动子替换成强启动子Ptrc，同时，引入基因esaI、基因esaR和PesaS启动子调控的基因thrB，调整碳流分配和辅酶平衡，最终构建出一株高产L-高丝氨酸菌株。本发明采用群体感应系统(esaI/esaR)动态调控苏氨酸合成途径，解除发酵过程中必需氨基酸苏氨酸的添加，降低发酵过程中调控的复杂性及发酵成本，摇瓶发酵L-高丝氨酸产量从11.4g/L提高到19.7g/L，为L-高丝氨酸发酵法生产奠定了一定的研究基础。
(四)附图说明
图1、实施例1步骤(2)重叠片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT的PCR产物的凝胶电泳图。1、2：片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT；3：DNA marker。
图2、实施例1步骤(4)菌落PCR的凝胶电泳图。1：DNA marker；2、3：菌落PCR阳性克隆。
图3、实施例2步骤(2)重叠片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT的PCR产物的凝胶电泳图。1、2：片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT；3：DNA marker。
图4、实施例2步骤(4)菌落PCR的凝胶电泳图。1、2：菌落PCR阳性克隆；3：DNAmarker。
图5、实施例3菌落PCR的凝胶电泳图。1：DNA marker；2、3：菌落PCR阳性克隆。
图6、实施例4步骤(2)融合片段UpntAB-Ptrc-DpntAB的PCR产物电泳图。1：片段UpntAB-Ptrc-DpntAB；2：DNA marker。
图7、实施例4步骤(4)菌落PCR电泳图。1、2：菌落PCR阳性克隆；3：DNA marker。
图8、实施例5步骤(4)菌落PCR电泳图。1：DNA marker；2、3：菌落PCR阳性克隆。
图9、实施例6步骤(4)菌落PCR电泳图。1：DNA marker；2、3：菌落PCR阳性克隆。
图10、实施例7步骤(4)菌落PCR电泳图。1、2：菌落PCR阳性克隆；3：DNA marker。
图11、实施例8步骤(4)菌落PCR电泳图。1：菌落PCR阳性克隆；2：DNA marker。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。固体培养基需要加终浓度20g/L琼脂。
本发明底盘菌HS为重组大肠杆菌E.coli W3110
ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclRΔptsGΔgalRΔlacI::Ptrc-rhtA Ptrc-rhtA Ptrc-eamA Ptrc-metL Ptrc-thrA Ptrc-glk Ptrc-gltB，参照Liu P,Zhang B,Yao Z H,et al.Multiplex design of metabolic network for production of L-homoserine in Escherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology,2020,86(20).其中ΔlacI::Ptrc-rhtA是将基因组中lacI基因替换为Ptrc-rhtA，并且对原始rhtA基因进行原位启动子替换为强启动子Ptrc。
本发明实施例中基因片段委托北京擎科生物科技有限公司合成。
SEQ ID NO.10:aaaacagcat tacagccagc；SEQ ID NO.11:ttttatgcgggcgaaacttc.
SEQ ID NO.12:tcgtacatga gcagcttgtg；SEQ ID NO.13:gggactggaatttttttgtt.
SEQ ID NO.14:cgtacatgag cagcttgtgt ggctcctgac acaggcaaac catcatcaataaaaccgatg gaagggaata tc.
实施例1、菌株HS1的构建(第一个拷贝thrAfbr基因的插入)
为了提高L-天冬氨酸到L-高丝氨酸的碳通量，通过引入一个拷贝的thrA基因来解决问题，但又因thrA基因受L-苏氨酸和L-异亮氨酸的反馈抑制，故通过定点突变来增加一个拷贝数抗反馈抑制的thrAfbr基因(NCBI基因编号：ECK0002，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的553-3015bp序列)，抗反馈抑制的thrAfbr基因信息参见Chassagnole C,B,QuentinE,et al.An integrated study of threonine-pathway enzyme kinetics inEscherichia coli.Biochem J,2001,356(2):415-23.
通过CRISPR-Cas9系统在底盘菌HS基因组中插入1个拷贝编码抗反馈抑制天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的thrAfbr基因，具体操作如下：
(1)pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用表1中引物1和引物2，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因yjiT(NCBI基因编号：ECK4333，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，获得pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h，随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg载体。
(2)重叠片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT
以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别使用引物3/引物4和引物9/引物10，通过PCR扩增，得到yjiT基因上、下游同源片段(UyjiT、DyjiT)。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物5和引物6扩增得到UthrA基因片段(SEQ IDNO.1所示UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT片段的553-1586bp核苷酸序列)，同样模板同样方法使用引物7和引物8扩增得到DthrA片段(SEQ ID NO.1所示UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT片段的1587-3015bp核苷酸序列)。
将回收的四个DNA片段UyjiT、DyjiT、UthrA、DthrA基因，使用引物3和引物10进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(结果如图1所示)，获得重叠片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(3)pTarget-thrAfbr(yjiT)载体
将步骤(1)pTarget-thrAfbr(yjiT)-sg载体和步骤(2)的重叠片段UyjiT-Ptrc-UthrA-DthrA-DyjiT进行一步克隆，反应程序：37℃30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-thrAfbr(yjiT)载体。
(4)菌株HS1
将pTarget-thrAfbr(yjiT)载体电转化至含有pCas9载体的HS菌株中，按如下步骤操作：
为了电穿孔，将转化有pCas9载体的HS菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中，在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物11和引物12进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在3500bp的DNA条带，确认thrAfbr基因的插入(结果如图2所示)。将通过此确认的菌株接种在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中，在30℃下培养过夜以去除pTarget-thrAfbr(yjiT)载体。然后将已经去除pTarget-thrAfbr(yjiT)载体的菌株接种在LB培养基中，在42℃下培养过夜以去除pCas9载体。如此构建的菌株，记为菌株HS1。
表1引物序列
引物1 TAATACTAGTAAAACAGCATTACAGCCAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物2 GCTCTAAAACGCTGGCTGTAATGCTGTTTTACTAGTATTATACCTAGGAC
引物3 CGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAAAAGCGAAGTGAGATTTGGC
引物4 TGTGACCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATCAGCACGTGTAACGCGTTA
引物5 CATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACAAAGGAGATATACATGCGAGTGTTGAAGTTCGG
引物6 CAGCACCACGAAAATACGGG
引物7 CCCGTATTTTCGTGGTGCTG
引物8 ATCGATCCAACGCAGTACTTTCAGACTCCTAACTTCCATG
引物9 CATGGAAGTTAGGAGTCTGAAAGTACTGCGTTGGATCGAT
引物10 TAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACACGGCGCGTCTGACGGTCGA
引物11 GCCAATTCTATTGGTCAGAAAAGCA
引物12 TTGCCTTCATCACTGGTAAAGTCC
实施例2、菌株HS2(第二个拷贝thrAfbr基因的插入)
为了进一步提高L-天冬氨酸到L-高丝氨酸的碳通量，通过在基因组中再次引入一个拷贝的thrAfbr基因来解决。通过CRISPR-Cas9系统编辑底盘菌HS基因组中编码抗反馈抑制天冬氨酸激酶Ⅰ和高丝氨酸脱氢酶Ⅰ的thrAfbr基因，具体操作如下：
(1)pTarget-thrAfbr(ompT)-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用表2中引物13和引物14，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因ompT(NCBI基因编号：ECK0557，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)，获得pTarget-thrAfbr(ompT)-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-thrAfbr(ompT)-sg载体。
(2)重叠片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT
以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别使用引物15、引物16和引物19、引物20，通过PCR扩增得到ompT基因上、下游同源片段(UompT、DompT)。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法以实施例1中pTarget-thrAfbr(yjiT)载体为模板使用引物17和引物18扩增得到thrAfbr基因片段。将回收的三个DNA片段使用引物15和引物20进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段(结果如图3所示)，获得重叠片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT。
(3)pTarget-thrAfbr(ompT)载体
将步骤(1)pTarget-thrAfbr(ompT)-sg载体和步骤(2)的叠片段UompT-Ptrc-thrAfbr-DompT进行一步克隆，反应程序：37℃30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-thrAfbr(ompT)载体。
(4)菌株HS2
将pTarget-thrAfbr(ompT)载体电转化至含有pCas9载体的HS1菌株中。为了电穿孔，转化有pCas9载体的HS1菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中，在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物21和引物22进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在3500bp的DNA条带(结果如图4所示)，确认thrAfbr基因的插入。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中，在30℃下培养过夜以去除pTarget-thrAfbr(ompT)载体。然后将已经去除pTarget-thrAfbr(ompT)载体的菌株在LB培养基中，在42℃下培养过夜以去除pCas9载体。如此构建的菌株记为菌株HS2。
表2引物序列
引物13 TAATACTAGTTTTTATGCGGGCGAAACTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物14 GCTCTAAAACGAAGTTTCGCCCGCATAAAAACTAGTATTATACCTAGGAC
引物15 CGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAAACGGATAAGACGGGCATAA
引物16 GCCGGATGATTAATTGTCAAAAAAGTTCTCCATTCAATCG
引物17 CGATTGAATGGAGAACTTTTTTGACAATTAATCATCCGGC
引物18 GGAAATTTTAGTTGGCGTTCTCAGACTCCTAACTTCCATG
引物19 CATGGAAGTTAGGAGTCTGAGAACGCCAACTAAAATTTCC
引物20 GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACGTTTAATAAAAAAAAGATTA
引物21 CCAGCTATAGCCAGATTGTCACA
引物22 CAGACTCACACTCCCTTTGG
实施例3、菌株HS3(过表达具有抗反馈抑制的thrAfbr基因的质粒构建)
以实施例1中pTarget-thrAfbr(yjiT)载体作为模板，使用引物23和引物24进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃2.5min共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化thrAfbr基因片段。将该片段与质粒pTrc99A进行一步克隆，反应程序：37℃30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。挑取单菌落作为模板，以引物25和引物26进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在2500bp的DNA条带(结果如图5所示)，确认thrAfbr基因的插入。挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTrc99A-thrAfbr质粒。将pTrc99A-thrAfbr质粒转化至HS2菌株中，构建菌株记为菌株HS3。
表3引物序列
引物23 AAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGC
引物24 CTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTCAGACTCCTAACTTCCATG
引物25 CGCCGACATCATAACGGTT
引物26 AGACCGCTTCTGCGTTCTG
实施例4、菌株HS4(pntAB基因表达的增强)
pntAB基因编码吡啶核苷酸转氢酶，将NADP+转化为NADPH，为了进一步提高NADPH在胞内的含量，将用Ptrc启动子替换pntAB基因中的原始启动子序列PpntAB以达到增强pntAB基因表达的目的。通过CRISPR-Cas9系统编辑HS3菌株基因组中编码吡啶核苷酸转氢酶的pntAB基因的启动子序列。
(1)pTarget-ΔPpntAB::Ptrc-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用引物27和引物28通过PCR扩增能够表达靶定目的基因pntAB(核苷酸序列如SEQ ID NO.4)启动子序列PpntAB(PpntAB核苷酸序列如SEQ IDNO.14)的sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.12)，获得pTarget-ΔPpntAB::Ptrc-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上。37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-ΔPpntAB::Ptrc-sg载体。
(2)重叠片段UpntAB-Ptrc-DpntAB
以大肠杆菌E.coli W3110菌株的基因组为模板，使用引物29和引物30，通过PCR扩增得到pntAB基因启动子序列上游同源片段(UpntAB)，pntAB基因(NCBI基因编号：ECK1598-ECK1597)的启动子序列信息是基于EcocycE.coli Database数据库中获得的。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物31和引物32扩增得到pntAB基因启动子序列下游同源片段(DpntAB)。将回收的两个DNA片段使用引物29和引物32进行融合PCR，获得重叠片段UpntAB-Ptrc-DpntAB。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min重复30个循环，72℃继续延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测(结果如图6所示)并切胶回收纯化该片段，该基因条带中已将Ptrc启动子序列插入至两同源片段之间。
(3)pTarget-ΔPpntAB::Ptrc载体
将步骤(1)pTarget-ΔPpntAB::Ptrc-sg载体和步骤(2)的重叠片段UpntAB-Ptrc-DpntAB进行一步克隆，反应程序：37℃，30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔPpntAB::Ptrc载体。
(4)菌株HS4
将pTarget-ΔPpntAB::Ptrc载体电转化至有pCas9载体的HS2菌株。为了电穿孔，转化有pCas9载体的HS2菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中，在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物33和引物34进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在1500bp的DNA条带(结果如图7所示)，将PCR产物测序，根据测序结果确认Ptrc启动子是否替换成功。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔPpntAB::Ptrc载体。然后将已经去除pTarget-ΔPpntAB::Ptrc载体的菌株在LB培养基中在42℃下培养过夜以去除pCas9载体，再将pTrc99A-thrAfbr载体转化至该菌株中，如此构建的菌株记为菌株HS4。
表4引物序列
引物27 TAATACTAGTTCGTACATGAGCAGCTTGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物28 GCTCTAAAACCACAAGCTGCTCATGTACGAACTAGTATTATACCTAGGAC
引物29 CGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGACCATAGCAGAAAGCAGTGCC
引物30 TGTGACCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAGCTAAATGTTACTCCGTTA
引物31 CATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACAAAGGAGATATACATGCGAATTGGCATACCAAG
引物32 TAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACTTTGCCGGTGGCACTTTCCC
引物33 CACGCCAGTTACCGCTGTTA
引物34 GAACGCGTCCGACATCAC
实施例5、菌株HS5(fpr基因表达的增强)
fpr基因编码铁氧还原蛋白/黄素还原蛋白——NADP+还原酶，将NADP+转化为NADPH，为了进一步提高NADPH在胞内的含量，将用Ptrc启动子替换fpr基因中的原始启动子Pfpr序列以达到增强fpr基因表达的目的。通过CRISPR-Cas9系统编辑HS4菌株基因组中编码铁氧还原蛋白/黄素还原蛋白——NADP+还原酶的fpr基因的启动子序列。
(1)pTarget-ΔPfpr::Ptrc-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用引物35和引物36，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因fpr(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)启动子序列的sgRNA(核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示)，获得pTarget-ΔPfpr::Ptrc-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上。37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-ΔPfpr::Ptrc-sg载体。
(2)重叠片段Ufpr-Ptrc-Dfpr
通过PCR使用引物37和引物38，以大肠杆菌W3110菌株的基因组为模板扩增得到fpr基因启动子序列上游同源片段(Ufpr)，fpr基因(NCBI基因编号：ECK3916)的启动子序列信息是基于EcocycE.coliDatabase数据库中获得的。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下:95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法使用引物39和引物40扩增得到fpr基因启动子序列下游同源片段(Dfpr)。将回收的两个DNA片段使用引物37和引物40进行融合PCR，PCR反应条件如下:95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min重复30个循环，72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，该基因条带中已将Ptrc启动子序列插入至两同源片段之间，获得重叠片段Ufpr-Ptrc-Dfpr。
(3)pTarget-ΔPfpr::Ptrc载体
将步骤(1)pTarget-ΔPfpr::Ptrc-sg载体和步骤(2)的重叠片段Ufpr-Ptrc-Dfpr进行一步克隆，反应程序：37℃，30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-ΔPfpr::Ptrc载体。
(4)菌株HS5
将pTarget-ΔPfpr::Ptrc载体电转化至有pCas9载体但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS4菌株。为了电穿孔，转化有pCas9载体但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS4菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物41和引物42进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在700bp的DNA条带来确认Ptrc启动子是否替换成功，结果如图8所示。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-ΔPfpr::Ptrc载体。然后将已经去除pTarget-ΔPfpr::Ptrc载体的菌株在LB培养基中42℃下培养过夜以去除pCas9载体，将pTrc99A-thrAfbr载体转化至该菌株中，如此构建的菌株记为菌株HS5。
表5引物序列
引物35 TAATACTAGTGGGACTGGAATTTTTTTGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物36 GCTCTAAAACAACAAAAAAATTCCAGTCCCACTAGTATTATACCTAGGAC
引物37 CGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGATTTGCTATTCCGGACGGCGA
引物38 TGTGACCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGAAGGACTGGAAGGCTCAAT
引物39 CATCCGGCTCGTATAATGTGTGGTCACAAAGGAGATATACATGGCTGATTGGGTAACAGG
引物40 TAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACCGCAGTTTTCCTTCGTAGCG
引物41 GACAATTAATCATCCGGCTCGT
引物42 GTTTCGTCATCTGCCGGG
实施例6、菌株HS4-1(esaR基因的导入)
esaR基因编码转录调控因子，作用于PesaS启动子，以达到PesaS启动子下游基因的正常表达，与esaI基因连用，可以起到对PesaS启动子下游基因表达的动态衰减作用。通过CRISPR-Cas9系统将esaR基因导入到HS4基因组中。
(1)pTarget-esaR(yjiT)-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用引物43和引物44，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因yjiT(esaR)的sgRNA，获得pTarget-esaR(yjiT)-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上。37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-esaR(yjiT)-sg载体。
(2)UyjiT1-esaR-DyjiT1片段
通过PCR使用引物45和引物46，以HS5菌株的基因组为模板扩增得到yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)序列上游同源片段(UyjiT1)。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下:95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法和模板使用引物49和引物50扩增得到yjiT基因序列下游同源片段(DyjiT1)。按同样的方法，以合成基因esaR为模板使用引物47和引物48扩增得到esaR基因序列。将回收的三个DNA片段使用引物45和引物50进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min重复30个循环，72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，获得重叠片段UyjiT1-esaR-DyjiT1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
(3)pTarget-esaR(yjiT)载体
将步骤(1)pTarget-esaR(yjiT)-sg载体和步骤(2)的重叠片段UyjiT1-esaR-DyjiT1进行一步克隆，反应程序：37℃，30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-esaR(yjiT)载体。
(4)菌株HS4-1
将pTarget-esaR(yjiT)载体电转化至有pCas9载体但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS4菌株。为了电穿孔，转化有pCas9载体但不含pTrc99A-thrAfbr载体的HS4菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物51和引物52进行PCR，PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶中存在2200bp的DNA条带来确认esaR基因是否导入成功，结果如图9所示。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-esaR(yjiT)载体。然后将已经去除pTarget-esaR(yjiT)载体的菌株在LB培养基中42℃下培养过夜以去除pCas9载体，如此构建的菌株记为菌株HS4-1。
表6引物序列
引物43 TAATACTAGTGTCAATCAGAATACATTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物44 GCTCTAAAACTGAAATGTATTCTGATTGACACTAGTATTATACCTAGGAC
引物45 CGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGAGGGGATATAGATTTATATAT
引物46 TTAATGAATTGATGGCTGTAAGTATCCTATAGGTTAGACTTTATGTCGACCAAAGCAAGCTCCTTAGAG
引物47 CCTATAGGATACTTACAGCCATCAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGATCCATGTTCAGCTTTTTCCTGGA
引物48 AGCCAGGAAGTACATTTTACACGTGCTGCGCTTGCTGCCG
引物49 CGGCAGCAAGCGCAGCACGTGTAAAATGTACTTCCTGGCT
引物50 GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACGAAAGGGCAGAAAAACCTGA
引物51 GGTGGATGATGAAGCCTCTG
引物52 GCGTTCCTGTTTCATCATCTAACG
实施例7、菌株HS4-2(esaI基因的导入)
esaI基因编码酰基高丝氨酸内酯合酶，生成高丝氨酸内酯(AHL)，AHL浓度会随着细胞密度的增加而增大。当AHL浓度达到一定量时，AHL会作用于PesaS启动子，阻止EsaR与该启动子结合，进而抑制PesaS启动子下游基因的表达，从而起到动态衰减作用。通过CRISPR-Cas9系统将esaI基因导入到HS4-1基因组中。
(1)pTarget-esaI(yjiT)-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用引物53和引物54，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因yjiT(esaI)的sgRNA，获得pTarget-esaI(yjiT)-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上。37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-esaI(yjiT)-sg载体。
(2)UyjiT2-esaI-DyjiT2片段
通过PCR使用引物55和引物56，以HS4-1菌株的基因组为模板扩增得到yjiT基因(NCBI基因编号：ECK4333)序列上游同源片段(UyjiT2)。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下:95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法和模板使用引物59和引物60扩增得到yjiT基因序列下游同源片段(DyjiT2)。按同样的方法，以合成基因esaI为模板使用引物57和引物58扩增得到esaI基因序列。将回收的三个DNA片段使用引物55和引物60进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min重复30个循环，72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，获得重叠片段UyjiT2-esaI-DyjiT2，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
(3)pTarget-esaI(yjiT)载体
将步骤(1)pTarget-esaI(yjiT)-sg载体和步骤(2)的重叠片段UyjiT2-esaI-DyjiT2进行一步克隆，反应程序：37℃，30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-esaI(yjiT)载体。
(4)菌株HS4-2
将pTarget-esaI(yjiT)载体电转化至有pCas9载体的HS4-1菌株。为了电穿孔，转化有pCas9载体的HS4-1菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物61和引物62进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在2100bp的DNA条带来确认esaI基因是否导入成功，结果如图10所示。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-esaI(yjiT)载体。然后将已经去除pTarget-esaI(yjiT)载体的菌株在LB培养基中42℃下培养过夜以去除pCas9载体，如此构建的菌株记为菌株HS4-2。
表7引物序列
引物53 TAATACTAGTTCGAGGGCAGTAAACGTATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物54 GCTCTAAAACAATACGTTTACTGCCCTCGAACTAGTATTATACCTAGGAC
引物55 CGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGACCTCTGTAGAGGCTAAGCCT
引物56 AAAATTTATTATATCACATGCTACAGAGGGTGTCAATCTACGGCGCGCCTTGGCCATCAAAACCAGCAA
引物57 CACCCTCTGTAGCATGTGATATAATAAATTTTATATTCTACCCAAGCTTATGCTGGAACTGTTCGACGT
引物58 TCACAGGTAGTGCTTTTAGTAACAGGCAGTGTCAGCGGCC
引物59 GGCCGCTGACACTGCCTGTTACTAAAAGCACTACCTGTGA
引物60 GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACAAGTTCGGCAAAAATACGTTCGGCATCGCT
引物61 GCGCTGCCAACTGTTTTTAG
引物62 TGACCGCGCGCTTCTAAT
实施例8、菌株HS6(PesaS-thrB基因的导入)
PesaS启动子在esaI/esaR群体感应系统中，作为引导下游基因动态衰减的启动子元件，通过在基因组中插入PesaS-thrB基因，以达到既能回补苏氨酸合成基因，又能控制苏氨酸生成量的作用。通过CRISPR-Cas9系统将PesaS-thrB基因导入到HS4-2基因组中。
(1)pTarget-PesaS-thrB(ygaY)-sg载体
以pTargetF载体作为模板，使用引物63和引物64，通过PCR扩增能够表达靶定目的基因ygaY的sgRNA，获得pTarget-PesaS-thrB(ygaY)-sg突变载体。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，灭活后转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上。37℃培养12h随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-PesaS-thrB(ygaY)-sg载体。
(2)UygaY-PesaS-thrB-DygaY片段
通过PCR使用引物65和引物66，以HS4-2菌株的基因组为模板扩增得到ygaY基因(NCBI基因编号：ECK2675，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)序列上游同源片段(UygaY)。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化片段。PCR反应条件如下:95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。按同样的方法和模板使用引物71和引物72扩增得到ygaY基因序列下游同源片段(DygaY)。按同样的方法，以合成PesaS启动子为模板使用引物67和引物68扩增得到PesaS启动子序列。按同样的方法，以大肠杆菌E.coliW3110基因组为模板使用引物69和引物70扩增得到thrB基因序列。将回收的四个DNA片段使用引物65和引物72进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1.5min重复30个循环，72℃继续延伸10min，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，获得重叠片段UygaY-PesaS-thrB-DygaY，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
(3)pTarget-PesaS-thrB(ygaY)载体
将步骤(1)pTarget-PesaS-thrB(ygaY)-sg载体和步骤(2)的重叠片段UygaY-PesaS-thrB-DygaY进行一步克隆，反应程序：37℃，30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-PesaS-thrB(ygaY)载体。
(4)菌株HS6
将pTarget-PesaS-thrB(ygaY)载体电转化至有pCas9载体的HS4-2菌株。为了电穿孔，转化有pCas9载体的HS4-2菌株在含有50mg/L卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中在30℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用无菌蒸馏水洗涤两次，然后使用10％的甘油洗涤一次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。
将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物73和引物74进行PCR，并且通过观察到在1.0％琼脂糖凝胶中存在2600bp的DNA条带来确认PesaS-thrB基因是否导入成功，结果如图11所示。将通过此确认的菌株在含有50mg/L卡那霉素和5mM的IPTG的LB培养基中在30℃下培养过夜以去除pTarget-PesaS-thrB(ygaY)载体。然后将已经去除pTarget-PesaS-thrB(ygaY)载体的菌株在LB培养基中42℃下培养过夜以去除pCas9载体，将pTrc99A-thrAfbr载体转化至该菌株中，如此构建的菌株记为菌株HS6。
表8引物序列
引物63 TAATACTAGTACCTAATCATGAGCTTAGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
引物64 GCTCTAAAACGGCTAAGCTCATGATTAGGTACTAGTATTATACCTAGGAC
引物65 CGAGTCGGTGCTTTTTTTGAATTCTCTAGATCCGCACTGCCGGGCGATAA
引物66 ACGCTTACACTGTTGTGAGCTTAGTCATTATTTTTGTTCA
引物67 TGAACAAAAATAATGACTAAGCTCACAACAGTGTAAGCGT
引物68 GGGGCATAAACTTTAACCATGGATCCTTTCTCCTCTTTAA
引物69 TTAAAGAGGAGAAAGGATCCATGGTTAAAGTTTATGCCCC
引物70 AGACATCAGCACGATCAGCGTTAGTTTTCCAGTACTCGTG
引物71 CACGAGTACTGGAAAACTAACGCTGATCGTGCTGATGTCT
引物72 GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACCCAGCGCCATCAGTGCCATT
引物73 GGTGCGATCAACCACCAG
引物74 CAGCTCCCGCAAGTCCA
实施例9、摇瓶发酵实验
1、菌株的摇瓶发酵
对底盘菌HS及上述实施例1到实施例7构建的菌株(HS1、HS2、HS3、HS4、HS5)在摇瓶中进行发酵实验测试，以比较各基因型菌株之间生产L-高丝氨酸的能力。摇瓶发酵实验按如下方案进行：将每个菌株划线接种在的LB平板上(若含有pTrc99A-thrAfbr载体，则在LB平板中添加50mg/L卡那霉素，否则不添加)，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至10mL的LB培养基中，并目以180～200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液。
在500mL的摇瓶中添加20mL的发酵培养基，并将1mL每种菌株的种子液接种至摇瓶的培养基中，若含有pTrc99A-thrAfbr载体，则添加终浓度为50mg/L的卡那霉素，否则不添加。然后摇瓶以150～180rpm的转速在30℃的培养箱中培养48h，从摇瓶中取1mL液体，12000rpm离心1min取上清，用超纯水稀释一定倍数，通过衍生化、过滤膜(孔径0.22μm)后，使用HPLC分析发酵液中L-高丝氨酸的含量，最终比较每种菌株获得L-高丝氨酸的量，结果如表9所示。
发酵培养基：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 16g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO41g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·7H2O 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L、CaCO3 25g/L、L-苏氨酸0.2g/L、L-蛋氨酸0.05g/L、L-赖氨酸0.025g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8。
衍生化反应为：100μL样品稀释液+300μL CNBF(4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯，0.27gCNBF/10mL乙腈)+500μL硼酸钠缓冲液(0.2mol/L硼酸+0.05mol/L硼砂，pH为9.0)，60℃、600rpm避光反应1h。
使用赛默飞HPLC高效液相色谱仪检测：色谱柱为C18柱(4.6×250mm，5μm)，设置参数为检测波长260nm，进样量10μL，柱温30℃，流速0.8mL/min。流动相A：纯乙腈；流动相B：缓冲液(828mL蒸馏水+170mL乙腈+2mL三乙胺，乙酸调节pH为4.9)。
表9代谢改造菌株摇瓶发酵实验
菌株 OD600 L-高丝氨酸(g/L) 菌株 OD600 L-高丝氨酸(g/L)
HS 11.1±0.55 11.4±0.52 HS3 11.3±0.52 16.9±0.85
HS1 12.1±0.61 12.4±0.59 HS4 12.01±0.48 18.2±0.89
HS2 12.5±0.58 13.3±0.66 HS5 11.1±0.53 19.6±0.88
根据表9可知，5株经过代谢改造的HS菌株都具有生产L-高丝氨酸的能力，而且对基因组改造和载体添加的部分未对菌株的生长造成明显的影响。
2、去除发酵培养基成分中L-苏氨酸添加
将步骤1发酵培养基中L-苏氨酸去除，其他操作相同，结果发现菌株几乎不生长，且L-高丝氨酸生成极少。
由于改造后菌株均是营养缺陷型，因此通过在发酵培养基中额外添加L-苏氨酸，可以恢复菌体生长，从而发酵生产L-高丝氨酸。
3、菌株HS6的发酵
将步骤1发酵培养基中L-苏氨酸去除，菌株改为HS6，其他相同，结果表明在改造的菌株中，引入群体感应esaI/esaR系统(HS6)菌株的效果较好，且不需要外源添加L-苏氨酸，菌株发酵生产L-高丝氨酸的水平相比于HS菌株从11.4g/L提高到19.7±0.86g/L，糖酸转化率从28.5％提高到49.25％，且菌体量并没有因为基因改造而降低，菌株构建完全符合工厂生产要求，为后续代谢改造奠定了一定的基础。

Claims (9)

1.一种高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌以重组大肠杆菌HS为底盘菌株，在基因组上插入1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr、替换1个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr，并引入强表达质粒pTrc99A-thrAfbr以过表达抗反馈抑制基因thrAfbr，然后用强启动子Ptrc分别替换编码吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB和编码NADP+还原酶编码基因fpr的原位启动子，最后引入基因esaI、基因esaR和基因thrB；所述基因thrB采用PesaS启动子调控；所述重组大肠杆菌HS为E.coli W3110
ΔmetIΔmetJΔmetBΔthrBΔmetAΔlysAΔiclRΔptsGΔgalRΔlacI::Ptrc-rhtAPtrc-rhtA Ptrc-eamA Ptrc-metL Ptrc-thrA Ptrc-glk Ptrc-gltB。
2.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述两个拷贝抗反馈抑制基因thrAfbr插入底盘菌的yjiT基因位点，并在ompT基因位点进行替换；所述抗反馈抑制基因thrAfbr的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的553-3015bp所示，yjiT基因核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，ompT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，抗反馈抑制基因thrAfbr插入yjiT基因的1518bp后、在ompT基因的1-954bp处进行替换。
4.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述基因pntAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述基因fpr的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述强启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的501-552bp所示；所述PesaS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8的500-710bp所示。
6.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述基因esaI核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的567-1196bp所示，插入位点为基因yjiT的1269-1292bp处；基因esaR核苷酸序列如SEQ ID NO.7的566-1312bp所示，插入位点为基因yjiT的4-27bp处；所述基因thrB核苷酸序列如SEQ ID NO.8的711-1643bp所示，插入位点为基因ygaY的8-31bp处。
7.如权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌以重组大肠杆菌HS为底盘菌株按如下步骤构建：(1)大肠杆菌基因组上，在yjiT位点插入一个拷贝数的编码抗反馈抑制基因thrAfbr，记为菌株HS1；(2)菌株HS1在基因组ompT位点上替换一个拷贝数编码抗反馈抑制基因thrAfbr，记为菌株HS2；(3)在菌株HS2上导入强表达质粒pTrc99A过表达抗反馈抑制的thrAfbr基因，记为菌株HS3；(4)在菌株HS3基因组上用强启动子Ptrc调控编码吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB来进行过表达，记为菌株HS4；(5)在菌株HS4基因组上用强启动子Ptrc调控NADP+还原酶编码基因fpr，记为菌株HS5；(6)在菌株HS4中引入基因esaI、基因esaR和基因thrB，记为HS6。
8.一种权利要求1所述高产L-高丝氨酸的工程菌在生产L-高丝氨酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
(1)种子培养：将高产L-高丝氨酸的工程菌划线于LB固体平板上，37℃培养12h；挑取平板上的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养12h，培养物按体积浓度0.5％的量接种于新的LB液体培养基中，37℃、180～200rpm培养8～10h，获得种子液；
(2)摇瓶发酵培养：将种子液以体积浓度5％接种量接种至含50mg/L卡那霉素的发酵培养基，在30～32℃、150～180rpm条件下发酵培养48h，获得含L-高丝氨酸的发酵液，分离提取，获得L-高丝氨酸；所述发酵培养基组成：葡萄糖40g/L、(NH4)2SO4 16g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4 1g/L、FeSO4·7H2O 0.005g/L、MnSO4·7H2O 0.005g/L、ZnSO4 0.005g/L、CaCO3 25g/L、L-蛋氨酸0.05g/L、L-赖氨酸0.025g/L，溶剂为去离子水，pH值6.8。
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