CN113151225B - 聚合物改性β-葡萄糖苷酶及其制备与在木质纤维素酶解中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了聚合物改性β‑葡萄糖苷酶及其制备与在木质纤维素酶解中的应用。本发明在β‑葡萄糖苷酶表面接枝含丙烯酰胺和丙烯酸及可阳离子化和/或疏水化单体的嵌段聚合物,再与纤维素酶制剂复合,加入以木质纤维素为底物的酶解体系中,使聚合物改性酶优先吸附于木质素上,减少内外切酶在木质素上的“无效吸附”,实现木质纤维素的酶解强化,同时利用丙烯酸嵌段调节聚合物改性酶间的静电吸附。酶解结束后,体系温度降至0~45℃时,具有温度响应的聚合物改性β‑葡萄糖苷酶沉淀析出,通过固液分离回收改性β‑葡萄糖苷酶。
Description
技术领域
本发明属于木质纤维素酶解技术领域,具体涉及一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶及其制备与在强化木质纤维素酶解和酶回收中的应用。
背景技术
目前能源危机和环境问题突出,为了解决这一系列问题,利用可再生的木质纤维素资源生产纤维素乙醇的相关技术发展备受关注。在纤维素乙醇的生产过程中,木质纤维素的酶解具有安全、清洁及反应专一性强等优点,被认为是极具发展潜力的降解纤维素的方法。然而由于木质纤维素中的木质素包附于纤维素表面,使得纤维素的可及性较低,限制了酶解效率的提高。且纤维素酶容易通过较强的静电、疏水作用力在木质素上形成“无效吸附”,难以高效酶解纤维素,同时增加了回收利用难度,限制了其工业化发展。
纤维素酶是多组分酶,由于酶各组分的结构和酶解底物的差异,木质素的吸附对不同酶组分催化活性的影响不同,其中,木质素的吸附会显著抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的催化活性(Bioresource Technology,2018.267:110-116.)。而对于β-葡萄糖苷酶,由于其结构上不存在结合域,且其酶解底物纤维二糖是水溶性的,因此木质素的吸附对β-葡萄糖苷酶的催化活性和传质阻力影响较小。目前普遍认为纤维素酶和木质素间主要存在疏水作用、静电作用和氢键作用。因此可以考虑对β-葡萄糖苷酶进行理性改造,使β-葡萄糖苷酶优先吸附在木质素上以提高纤维素酶的整体酶解效率。
为了让纤维素酶高效利用且方便回收,具有环境响应(如温度、pH)的智能高分子成为研究热点。一些非离子聚合物如聚异丙基丙烯酰胺具有灵敏的温度响应性质,将纤维素酶与这些非离子聚合物采用共价键结合在一起,可以使改性后的酶具有高温析出和低温溶解的性质。通过甲基丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺或N-异丙基甲基丙烯酰胺的共聚合成了两类具有最低临界溶解温度(LCST)的共聚物,其LCST在20.9~60.5℃范围内,将内切葡聚糖酶通过5-磷酸吡哆醛转氨以产生含酮蛋白质,然后将转氨后的酶与含有酰胺键的聚合物共聚合成生物缀合物,在两次再循环后内切葡聚糖酶保持了60%以上的活性,并且与单独且未修饰的酶相比可以产生更多的可溶性糖(Journal of the American ChemicalSociety,2013,135:293-300.)。通过N-异丙基甲基丙烯酰胺与丙烯酸甲酯和N-(羟甲基)丙烯酰胺聚合而成的热响应聚合物与纤维素酶形成生物缀合物。调节聚合物(PNMN)的LCST为51.6℃,此时回收率为98.5%,通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺将PNMN接枝到纤维素酶表面,聚合物-纤维素酶在重复5次水解反应循环后依然保持了其初始活性的85.2%(Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2016,128:39-45.)。但高温回收酶容易使纤维素酶失活,且能耗较高,不利于成本的降低。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处,本发明的首要目的在于提供一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶。
本发明的再一目的在于提供上述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶在木质纤维素酶解中的应用。
本发明通过化学改性在β-葡萄糖苷酶末端引入含丙烯酰胺-丙烯酸及疏水性单体(如聚苯乙烯等)和/或阳离子型单体(聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯等)的聚合物。利用疏水性或阳离子型聚合物嵌段作为β-葡萄糖苷酶与木质素结合的吸附域,使β-葡萄糖苷酶优先吸附在木质素上,通过竞争吸附减少内切酶和外切酶在木质素上的无效吸附,从而提高木质纤维素的酶解效率。由于疏水性和阳离子型聚合物对酶的催化活性影响较大,故引入不带电的丙烯酰胺嵌段,使酶与疏水性或阳离子聚合物嵌段在空间上形成一定的区域分隔。同时引入丙烯酸嵌段,便于调节聚合物与木质素间的静电吸脱附。所述嵌段聚合物具有一定的温度响应性能,反应结束后可利用聚合物的温度响应降温分离实现纤维素酶的回收。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,包括以下步骤:
先将链转移剂、引发剂和丙烯酰胺进行预聚合,再加入丙烯酸和功能单体进行聚合,结束反应,纯化得到聚合物,再将聚合物与交联剂和β-葡萄糖苷酶反应得到聚合物改性β-葡萄糖苷酶;
或者,先将链转移剂、引发剂、交联剂与β-葡萄糖苷酶反应得到中间体,再加入丙烯酰胺进行预聚合,然后加入丙烯酸和功能单体进行聚合,得到聚合物改性β-葡萄糖苷酶;
所述功能单体为疏水性烃类和/或阳离子型聚合单体。
优选地,所述丙烯酰胺、丙烯酸与功能单体的摩尔比为(20~200):(10~30):(1~200);所述β-葡萄糖苷酶与聚合物的摩尔比为1:1~1:6,其中聚合物为丙烯酰胺、丙烯酸与功能单体聚合所得的聚合物。
优选地,所述链转移剂、引发剂、交联剂与丙烯酰胺的摩尔比为(1~3):(1~5):(1~5):(20~200)。
优选地,所述疏水性烃类单体为苯乙烯、苯丙烯酰胺、丙烯腈、N,N-二乙基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯、N-乙烯基己内酰胺和6-(丙烯酰氧基甲基)尿嘧啶中的至少一种,所述可阳离子化聚合单体为甲基丙烯酸二甲氨乙酯、N,N’-二甲基丙烯酰胺和N,N’-二乙基丙烯酰胺中的至少一种。
优选地,所述引发剂为过硫酸铵和偶氮二异丁腈中的至少一种;交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的至少一种;链转移剂为双(羧甲基)三硫代碳酸盐、巯基丙酸和2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸中的至少一种。
优选地,所述丙烯酰胺预聚合的温度为40~80℃,时间为6~24h;所述丙烯酸以及功能单体聚合的温度为40~80℃,时间为5~20h;所述聚合物与交联剂和β-葡萄糖苷酶反应的温度为0~50℃,时间为1~5h。
优选地,所述β-葡萄糖苷酶与交联剂、链转移剂、引发剂反应的温度为0~50℃,时间为1~5h。
优选地,所述预聚合和聚合反应的溶剂均为乙醇、水和二氯甲烷中的至少一种,丙烯酰胺的浓度为10~500mg/ml;β-葡萄糖苷酶反应的溶剂为磷酸缓冲液,β-葡萄糖苷酶的浓度为1~100mg/ml。
上述方法制得一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶。
所得聚合物改性β-葡萄糖苷酶于pH=4.0、4℃条件下冷藏保存;所得聚合物改性β-葡萄糖苷酶的临界溶解温度(UCST)为0~45℃。
上述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶在木质纤维素酶解中的应用,具体方法为:
将含聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂加入到木质纤维素为底物的酶解体系中,于45~60℃下反应24~96h得到木质纤维素的糖化水解液,调节体系pH至5.5~7.0,使聚合物改性β-葡萄糖苷酶于木质素表面脱附,固液分离得到酶解液体,随后将酶解液pH调节至2.0~4.0并降温至0~45℃使聚合物与纤维素酶共同沉淀分离,进行回收利用。
优选地,所述含聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂中,聚合物改性β-葡萄糖苷酶与内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的质量比为1:(0.1~10):(0.1~10),酶解过程中的复合酶制剂蛋白质用量为0.1~10mg/mL。
优选地,每克木质纤维素加入5~25FPU含聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂。
优选地,所述木质纤维素来源于松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。
优选地,调节pH所用的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、马来酸和氢氧化钠中的至少一种。
优选地,所述聚合物改性β-葡萄糖苷酶沉淀分离的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法和离心法中的至少一种。
优选地,所述聚合物改性β-葡萄糖苷酶沉淀分离后,可通过超滤、低温、离子交换层析、亲和层析、吸附分离、区带电泳、等电点聚焦中的至少一种方法进行纯化回收。
优选地,所述酶解体系为木质纤维素为底物、pH4.5~6.0、50mmol/L缓冲液酶解体系。
本发明的机理为:木质素的吸附会显著抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的催化活性,但对β-葡萄糖苷酶的催化活性影响较小。故通过化学修饰法在β-糖苷酶分子表面接枝不同的具有疏水性和/或可阳离子化的聚合物单体,增强其与木质素之间的静电作用力、疏水作用力,可使β-葡萄糖苷酶优先吸附在木质素上,通过竞争吸附减少其他酶组分在木质素上的无效吸附,使更多的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶作用在纤维素上,从而提高整体纤维素酶的催化效率。酶解结束后,调节pH值至5.5~7.0,利用嵌段中的丙烯酸与木质素间的静电排斥,使嵌段聚合物从木质素表面脱离,固液分离后,将pH值调节至聚合物的等电点(pH 2.0~4.0)附近,同时利用聚合物本身的温度响应性,降温至其临界溶解温度,将聚合物和酶共同沉淀析出。本发明的聚合物需要具备适当的临界溶解温度,使其在酶解温度(45~60℃)完全溶解在缓冲液中,酶解结束后,可以通过降温方法从酶解液中沉淀出来。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
1、本发明的改性方法对β-葡萄糖苷酶的活力影响较小,改性酶的酶活保留率高于80%,且可有效改变酶分子的表面性能,增加酶分子与木质素间的亲和力,可使木质纤维素的酶解糖化得率提高14.5~30.6%。
2、本发明可使β-葡萄糖苷酶的酶活回收率达到40~80%,解决目前酶回收体系中β-葡萄糖苷酶组分回收性能差的问题,为高效酶制剂的构建提供指导。
附图说明
图1为实施例1-4改性β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE分析。
图2为实施例2改性β-葡萄糖苷酶的QCM-D分析。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的微晶纤维素型号为PHI01(购自Sigma-Aldrich公司),β-葡萄糖苷酶购自夏盛实业有限公司,纤维素酶是从诺维信(中国)有限公司购买的1.5L Celluclast,木质纤维素底物选用由济南圣泉集团股份有限公司提供的玉米芯残渣;水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(SBA-40E,山东省生物科学研究院)测定的。
对比例1
(1)改性β-葡萄糖苷酶bgl-mPEG-b-P(AM-co-AN)的合成方法:
将0.1g 4-二甲氨基吡啶和1g N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于20ml二氯甲烷中,冷却至0℃。将4g聚乙二醇单甲醚(mPEGx)、1.89g链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸与100ml二氯甲烷混合,搅拌均匀,然后加入溶有4-二甲氨基吡啶和N,N,-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液,室温反应48h,过滤,滤液浓缩,加入过量冷乙醚沉淀、过滤,重复将粗产物溶于二氯甲烷中,加入过量冷乙醚沉淀、过滤的操作,最后干燥,得到浅黄色粉末。将2g丙烯酰胺(AM)、0.5g丙烯腈(AN)、0.12g上述浅黄色粉末、0.02g偶氮二异丁腈和25ml N,N’-二甲基甲酰胺在搅拌条件下通入氮气,80℃反应48h,反应结束后冷却,接着加入过量甲醇,过滤,沉淀用去离子水透析,冷冻干燥,得到mPEG-b-P(AM-co-AN),取5g溶解于水中,加入0.45g戊二醛,搅拌反应、低温离心、去离子水洗涤,取45mg固体溶于10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸盐缓冲液,搅拌反应、低温离心、磷酸盐缓冲液洗涤,产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活和相变温度UCST。
(2)bgl-PEG-b-P(AM-co-AN)的酶解及回收:
将40CBU的上述bgl-PEG-b-P(AM-co-AN)和10FPU 1.5L Celluclast复配后与30mlpH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1g玉米芯残渣。密封后于55℃下酶解72h后趁热离心得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率,结果如表1所示。待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
对比例2
(1)甜菜碱改性β-葡萄糖苷酶bgl-B的合成方法:
取45mg甜菜碱逐滴加入10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸缓冲液中,调节pH至8.0,依次加入0.45g EDC和0.3g NHS,50℃磁力搅拌反应2h。产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活。
(2)bgl-B的酶解:
将40CBU的bgl-B和10FPU1.5L Celluclast复配后与30ml pH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1.2g玉米芯残渣。密封后于50℃下酶解72h后趁热离心得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率。调节酶解液的pH至4.0,待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
实施例1
(1)聚合物改性β-葡萄糖苷酶bgl-P(AM-b-AA-b-AN)的合成方法:
将5g丙烯酰胺(AM)和0.04g偶氮二异丁腈用30ml乙醇溶解,转移至三口烧瓶中,氮气除氧,加入0.15g链转移剂双(羧甲基)三硫代碳酸盐,80℃搅拌反应8h,滴加1.28g丙烯酸(AA)和1g丙烯腈(AN)继续反应6h。冷却离心,取沉淀加甲醇升温重悬,重复三次,真空干燥得到胶状产物。取45mg上述产物加入20ml 10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸缓冲液中,调节pH至8.0,依次加入0.45g EDC和0.3g NHS,50℃磁力搅拌反应2h。产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活和相变温度UCST。
(2)bgl-P(AM-b-AA-b-AN)的酶解及回收:
将40CBU的bgl-P(AM-b-AA-b-AN)和10FPU 1.5L Celluclast复配后与30ml pH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1.2g玉米芯残渣,密封后于55℃下酶解72h。酶解结束后趁热调节pH至6.0并离心分离得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率。调节酶解液的pH至3.2,待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
实施例2
(1)改性β-葡萄糖苷酶bgl-P(AM-b-AA-b-DMAEMA)的合成方法:
将4.95g丙烯酰胺和0.022g过硫酸铵用30ml纯水溶解,转移至三口烧瓶中,氮气除氧,加入0.08g链转移剂巯基丙酸,80℃搅拌反应8h,滴加1.28g丙烯酸(AA)和7.8g甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)继续反应5h。冷却离心,取沉淀加纯水升温重悬,重复三次,真空干燥得到胶状产物。取30mg上述产物加入10ml 10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸缓冲液中,调节pH至8.0,依次0.45gEDC和0.3g NHS,40℃磁力搅拌反应2h。产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活和相变温度UCST。
(2)bgl-P(AM-b-AA-b-DMAEMA)的酶解及回收:
将40CBU的bgl-P(AM-b-AA-b-DMAEMA)和10FPU 1.5L Celluclast复配后与30mlpH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1.2g玉米芯残渣,密封后于55℃下酶解72h。酶解结束后趁热调节pH至6.0并离心分离得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率。调节酶解液的pH至3.5,待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
实施例3
(1)聚合物改性β-葡萄糖苷酶bgl-P(AM-b-AA-b-st)的合成方法:
将4.95g丙烯酰胺(AM)和0.02g偶氮二异丁腈用10ml二甲基亚砜溶解,转移至三口烧瓶中,氮气除氧,加入0.15g链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸,70℃搅拌反应8h,滴加1.28g丙烯酸和1.05g苯乙烯(st)继续反应20h。冷却离心,取沉淀加甲醇升温重悬,重复三次,真空干燥得到胶状产物。取45mg上述产物加入10ml 10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸缓冲液中,调节pH至8.0,依次加入0.45g EDC和0.3g NHS,50℃磁力搅拌反应2h。产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活和相变温度UCST。
(2)bgl-P(AM-b-AA-b-st)的酶解及回收:
将40CBU的bgl-P(AM-b-AA-b-st)和10FPU 1.5L Celluclast复配后与30ml pH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1.2g玉米芯残渣,密封后于55℃下酶解72h。酶解结束后趁热调节pH至6.0并离心分离得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率。调节酶解液的pH至2.5,待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
实施例4
(1)聚合物改性β-葡萄糖苷酶bgl-P(AM-b-AA-b-CAM)的合成方法:
将5g丙烯酰胺(AM)和0.04g偶氮二异丁腈用30ml乙醇溶解,转移至三口烧瓶中,氮气除氧,加入0.02g链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸,80℃搅拌反应8h,滴加2.18g丙烯酸和1g苯丙烯酰胺(CAM)继续反应6h。冷却离心,取沉淀加甲醇升温重悬,重复三次,真空干燥得到胶状产物。取45mg上述产物加入10ml 10mg/mlβ-葡萄糖苷酶的磷酸缓冲液中,调节pH至8.0,依次加入0.45g EDC和0.3g NHS,50℃磁力搅拌反应2h。产物于100kDa膜超滤提纯浓缩,调节pH至4.0,4℃冷藏保存,测试其酶活和相变温度UCST。
(2)bgl-P(AM-b-AA-b-CAM)的酶解及回收:
将40CBU的bgl-P(AM-b-AA-b-CAM)和10FPU 1.5L Celluclast复配后与30ml pH为4.8、离子强度为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液混合,再往体系中添加1.2g玉米芯残渣,密封后于55℃下酶解72h。酶解结束后趁热调节pH至6.0并离心分离得酶解液,取样测试酶解液的葡萄糖含量,计算酶解糖化收率。调节酶解液的pH至2.5,待温度降至25℃后离心,固体即为回收酶,计算酶活回收率,结果如表1所示。
实施例效果说明:
实验测定了上述实施例制备的聚合物改性β-葡萄糖苷酶的化学改性后酶活保留率、响应温度和72h酶解糖化性能以及空白组(空白组为添加未改性β-葡萄糖苷酶并按照实施1例步骤2进行)和对比例相应的性能,结果见表1。
表1聚合物改性β-葡萄糖苷酶的结构与性能
由表1可知,聚合物改性β-葡萄糖苷酶可有效提高木质纤维素的酶解效率,另外通过降温回收能够在酶解体系中回收较高酶活性的β-葡萄糖苷酶。
图1是实施例1-4产品改性前后的分子量变化(泳道1和10为标准蛋白Marker,泳道2~5为改性前酶分子量,泳道6~9依次为实施例1~4改性酶产品分子量),与天然的β-葡萄糖苷酶相比,改性后的酶分子均增大至110kDa左右,说明聚合分子成功接枝至β-葡萄糖苷酶表面。
由对比例1和实施例1可知,对比例1中聚乙二醇的存在使得酶的临界溶解温度可调,但聚乙二醇同时削弱了聚合物的疏水性,使得改性酶的酶解强化性能较差,仅提高了5%,在本实验中,通过引入丙烯酸即可使聚合物改性酶的临界溶解温度控制在0~50℃内。
由对比例2与实施例2可知,在相同的阳离子化程度下,丙烯酰胺的引入提高了酶活保留率,说明丙烯酰胺对于阳离子嵌段和酶在水溶液中有一定的空间阻隔作用,削弱了阳离子嵌段对酶三维结构的破坏作用。
图2是实施例2中酶改性产品bgl-P(AM-b-AA-b-DMAEMA)对1.5LCelluclast在木质素上无效吸附的QCM-D测试结果,结果表明接枝聚合物后,酶在木质素上的吸附量明显增加,且可以一定程度地减少其他纤维素酶组分(1.5L Celluclast)在木质素上的无效吸附,验证了本发明的设计思路。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
先将链转移剂、引发剂和丙烯酰胺进行预聚合,再加入丙烯酸和功能单体进行聚合,结束反应,纯化得到聚合物,再将聚合物与交联剂和β-葡萄糖苷酶反应得到聚合物改性β-葡萄糖苷酶;
所述功能单体为疏水性烃类和/或阳离子型聚合单体;
所述丙烯酰胺、丙烯酸与功能单体的摩尔比为(20~200):(10~30):(1~200);所述β-葡萄糖苷酶与聚合物的摩尔比为1:1~1:6,其中聚合物为丙烯酰胺、丙烯酸与功能单体聚合所得的聚合物;
所述链转移剂、引发剂、交联剂与丙烯酰胺的摩尔比为(1~3):(1~5):(1~5):(20~200)。
2.权利要求1所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,其特征在于,所述疏水性烃类单体为苯乙烯、苯丙烯酰胺、丙烯腈、N,N’-二乙基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯、N-乙烯基己内酰胺和6-(丙烯酰氧基甲基)尿嘧啶中的至少一种,所述阳离子型聚合单体为甲基丙烯酸二甲氨乙酯、N,N’-二甲基丙烯酰胺和N,N’-二乙基丙烯酰胺中的至少一种。
3.权利要求1所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,其特征在于,所述引发剂为过硫酸铵和偶氮二异丁腈中的至少一种;所述交联剂为环氧氯丙烷、戊二醛、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种;所述链转移剂为双(羧甲基)三硫代碳酸盐、巯基丙酸和2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸中的至少一种。
4.权利要求1所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,其特征在于,所述β-葡萄糖苷酶与交联剂、链转移剂、引发剂反应的温度为0~50℃,时间为1~5h;
所述丙烯酰胺预聚合的温度为40~80℃,时间为6~24h;所述丙烯酸以及功能单体聚合的温度为40~80℃,时间为5~20h;所述合物与交联剂和β-葡萄糖苷酶反应的温度为0~50℃,时间为1~5h。
5.权利要求1所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶的制备方法,其特征在于,所述预聚合和聚合反应的溶剂均乙醇、水和二氯甲烷中的至少一种,丙烯酰胺的浓度为10~500 mg/ml;β-葡萄糖苷酶反应的溶剂为磷酸缓冲液,β-葡萄糖苷酶的浓度为1~100 mg/ml。
6.权利要求1~5任一项所述方法制得的聚合物改性β-葡萄糖苷酶。
7.权利要求6所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶在木质纤维素酶解中的应用,其特征在于,具体方法为:
将含权利要求书6所述聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂加入到木质纤维素为底物的酶解体系中,于45~60℃下反应24~96h得到木质纤维素的糖化水解液,调节体系pH至5.5~7.0,使聚合物改性β-葡萄糖苷酶于木质素表面脱附,固液分离得到酶解液体,将酶解液pH调节至2.0~4.0并降温至0~45℃使聚合物与纤维素酶共同沉淀分离,进行回收利用。
8.根据权利要求7所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶在木质纤维素酶解中的应用,其特征在于,所述含聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂中,聚合物改性β-葡萄糖苷酶与内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的质量比为1:(0.1~10):(0.1~10),酶解过程中的复合酶制剂蛋白质用量为0.1~10 mg/mL;每克木质纤维素加入5~25 FPU含聚合物改性β-葡萄糖苷酶的复合酶制剂。
9.根据权利要求7所述一种聚合物改性β-葡萄糖苷酶在木质纤维素酶解体系中的应用,其特征在于,所述酶解体系为木质纤维素为底物、pH4.0~6.0、50mmol/L缓冲液酶解体系;调节pH所用的pH调节剂为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、甲酸、马来酸和氢氧化钠中的至少一种;所述木质纤维素来源于松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、柏树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种;所述聚合物改性β-葡萄糖苷酶沉淀分离的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法和离心法中的至少一种;所述聚合物改性β-葡萄糖苷酶沉淀分离后,可通过超滤、低温、离子交换层析、亲和层析、吸附分离、区带电泳、等电点聚焦中的至少一种方法进行纯化回收。
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