CN109536479B - 一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，提供一种交联固定化双酶‑表面活性剂复合物，通过表面活性剂对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的双酶体系进行修饰，再经沉淀、交联等反应过程合成得到。经过表面活性剂修饰的双酶体系，大大增加了交联聚集体在反应介质中的分散性，保证其不易出现团聚现象，并具有良好的热稳定性。此外，本发明提供的交联固定化双酶‑表面活性剂复合物无需低温操作，室温下即可合成，大大降低了实验成本，使用后通过简单的离心分离可回收再利用，经过多次重复利用后酶活仍能保持较高的活力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物及其制备方法。
背景技术
相比于传统的化学催化剂，酶具有立体选择性好、催化速率高、反应条件温和等特点，因此在化学品制造、医药中间体合成、生物检测及食品加工等领域有着广泛的应用。但是在工业化生产中，作为催化剂的酶价格昂贵、稳定性差，无法满足重复利用的需求，已经严重限制了其发展和应用。因此，固定化技术已经成为工业化生产中的一项核心关键性技术，通过对酶进行固定化，以得到稳定性、催化性能、重复使用性能均能够达到要求的固定化酶制剂。
酶固定化方法一般分为四种：物理吸附、共价键和、包埋以及交联。常规的酶固定化手段中多涉及载体的选择，但是利用惰性的载体对酶进行固定化时，酶的负载率通常只有0.1％-10％，降低了酶催化剂的生产能力，并且也会增加酶固定化的成本。而酶的无载体交联可以在不引入惰性载体的条件下，利用双功能交联剂对酶蛋白进行直接交联，达到酶固定化的效果，其能够提高酶活保留率和催化剂中酶蛋白浓度，降低固定化成本。
专利文件CN103667219A公开了一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体的制备方法，该方法在低温条件下，先将沉降剂加入到β-葡萄糖苷酶溶液中，然后加入戊二醛溶液，最后向混合液中加入还原剂，震荡后离心收集沉淀获得β-葡萄糖苷酶交联聚集体。
专利文件CN106047848A公开了一种交联卤醇脱卤酶聚集体的制备方法，该方法在冰浴条件下，将卤醇脱卤酶的粗酶液中加入牛血清白蛋白形成混合液，然后加入饱和硫酸铵溶液进行沉淀分离，并加入戊二醛进行交联，通过离心处理得到卤醇脱卤酶聚集体。
上述专利利用戊二醛交联酶蛋白制备酶聚集体，都是在低温条件下先沉淀酶蛋白，增加了酶固定化的成本。固定化后得到的酶聚集体颗粒由于疏水作用容易在反应介质中发生聚集，使得交联聚集体内部的一些酶难以与底物相接触进行催化反应。而且在环境较高的反应温度中进行催化反应时，酶的催化构象会被破坏造成大量酶活的损失。
专利申请CN107988201A公开了一种乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共交联酶聚集体的制备方法，包括以下步骤：获得含乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的粗酶液，加入沉淀剂混合，沉淀得到含有乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的混合物；然后加入交联剂戊二醛水溶液，最后加入吐温80，交联反应的温度是0-40℃。在该专利申请中先将酶液进行沉淀反应后进行交联反应，最后才加入表面活性剂，该方法虽然可以在0-40℃温度范围内进行共交联酶聚集体，并能在一定程度上提高共交联酶聚集体的酶活回收率(至80％)，但是对于共交联酶聚集体的热稳定性和分散性改善有限。
葡萄糖氧化酶可以将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，制备的葡萄糖酸以及葡萄糖酸衍生物可以广泛应用于食品、医药、饲料以及纺织工业中。但是在葡萄糖被氧化成葡萄糖酸的过程中，会产生大量的过氧化氢，而大量的过氧化氢会严重抑制葡萄糖氧化酶的活性，抑制反应的进程。为此，可通过添加过氧化氢酶将过氧化氢降解为水和氧气，从而避免其对葡萄糖氧化酶的抑制作用，保障生产葡萄糖酸的连续顺利进行。但是通过何种制备方法制备得到一种工艺简单，活性高、分散性和稳定性好的葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的共交联聚集体，克服上述现有技术的缺陷，是本发明所要解决的技术问题之一。
发明内容
基于上述现有技术的缺陷，本发明通过先用表面活性剂对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行修饰后再沉淀，最后进行交联反应，得到一种合成成本低、热稳定性好、分散性好的交联固定化双酶-表面活性剂复合物，该复合物可以批量快速便捷制备，在生物医药、生物检测、食品、精细化学品等领域有着广泛的应用前景。
本发明提供一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物，由葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶先经表面活性剂修饰后，再交联聚集得到。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶经表面活性剂修饰后，经沉淀剂沉淀，再经交联剂、赖氨酸交联聚集得到。
更进一步地，上述反应在20-30℃下进行反应。
进一步地，所述表面活性剂选自 吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司盘-20、司盘-60、司盘-80、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂醇硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、月桂酰胺丙基甜菜碱中的一种或多种。
更进一步地，所述表面活性剂优选为或聚乙烯吡咯烷酮。
进一步地，所述葡萄糖氧化酶的蛋白浓度为1-80mg/mL，过氧化氢酶的蛋白浓度为1-80mg/mL，表面活性剂的含量为1-800mg/mL。
更进一步地，所述葡萄糖氧化酶的蛋白浓度为30-40mg/mL，过氧化氢酶的蛋白浓度为20-30mg/mL，表面活性剂的含量为20-30mg/mL。
进一步地，所述沉淀剂选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠中的一种或多种。
更进一步地，所述沉淀剂优选为硫酸铵。
进一步地，所述沉淀剂的添加量为0.1-0.7g/mL。
进一步地，所述交联剂为戊二醛。
进一步地，所述交联剂的浓度为30-65％(V/V)，添加量为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶溶液体积的1/40-1/10倍。
更进一步地，所述交联剂的浓度为45-55％(V/V)，添加量为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶溶液体积的1/20-1/12.5倍。
进一步地，所述赖氨酸的浓度为0.5-1.5mol/L，添加量为修饰后的双酶溶液体积的1/40-1/25倍。
更进一步地，所述赖氨酸的浓度为1.0mol/L，添加量为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶溶液体积的1/33-1/25倍。
本发明进一步提供上述交联固定化双酶-表面活性剂复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)修饰双酶体系：葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶中加入表面活性剂进行修饰；
(2)交联反应：向修饰后的双酶体系中加沉淀剂沉淀，然后加入交联剂进行交联，最后加入赖氨酸，备用；
(3)离心、洗涤、干燥，即得。
进一步地，所述步骤(1)将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入水或缓冲液中溶解。
更进一步地，所述缓冲液为磷酸缓冲液，pH值为6.0-9.0，浓度为10-200mM。
进一步地，所述步骤(2)中在修饰后的双酶溶液里加入沉淀剂，搅拌10min-4h后加入沉淀剂，搅拌30min-24h后，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30min-24h。
进一步地，所述步骤(2)在修饰后的双酶溶液里加入沉淀剂，搅拌10-20min后加入沉淀剂，搅拌1-3h后，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30-60min。
进一步地，所述步骤(3)中离心转速为4000-15000rpm,离心时间为3-30min。
更进一步地，所述步骤(3)中干燥方式选自冷冻干燥、真空干燥、自然风干中的一种。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的交联固化双酶-表面活性剂复合物通过表面活性剂先对双酶体系进行修饰，大大提高了复合物的分散性和热稳定性。
(2)本发明提供的交联固化双酶-表面活性剂复合物在制备过程中不需要低温操作，全部在常温下即可合成，减少了实验合成的能耗；另一方面，本发明未采用固定化载体，更利于酶蛋白与底物相结合，进一步降低了固定化的成本。
(3)本发明所述的双酶-表面活性剂交联聚集体可以通过简单的离心分离进行回收再利用，且能够多次重复使用后酶活没有较为明显的下降。
(4)本发明所述的双酶-表面活性剂交联聚集体可以批量快速便捷制备，在生物医药、生物检测、食品、精细化学品等领域有着广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1双酶-交联聚集体及其制备
(1)将1mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)与1mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)加入锥形瓶中，加入40mg的室温搅拌10min；
(2)缓慢加入1g固体硫酸铵，继续搅拌10min，加入160μL 50％的戊二醛溶液，搅拌反应1h后，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将步骤(2)的溶液于10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
实施例2双酶-交联聚集体及其制备
(1)将0.33mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、0.33mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)与1.34mL的蒸馏水加入锥形瓶中，加入40mg的室温搅拌10min；
(2)缓慢加入1g固体硫酸铵。继续搅拌10min，加入160μL 50％的戊二醛溶液。搅拌反应1h后，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
实施例3双酶-聚乙烯吡咯烷酮交联聚集体及其制备
(1)将1mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度30mg/mL)与1mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度30mg/mL)加入锥形瓶中，加入50mg的聚乙烯吡咯烷酮，室温搅拌15min；
(2)缓慢加入1g固体硫酸铵。继续搅拌10min，加入120μL 50％的戊二醛溶液。搅拌反应1h后，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥10h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-聚乙烯吡咯烷酮交联聚集体。
实施例4双酶-交联聚集体批量制备
(1)将50mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、50mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)加入500mL烧瓶中，加入3g的室温搅拌20min；
(2)缓慢加入饱和硫酸铵溶液。继续搅拌15min，加入10mL 50％的戊二醛溶液。搅拌反应3h后，加入4mL1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌1h；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤5次，将沉淀放置于真空干燥机，真空干燥72h，将干燥得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
实施例5双酶-十二烷基硫酸钠交联聚集体及其制备
(1)将1mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度1mg/mL)与1mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度1mg/mL)加入锥形瓶中，加入2mg的十二烷基硫酸钠，室温搅拌10min；
(2)缓慢加入0.2g氯化钠，继续搅拌4h，加入200μL 45％的戊二醛溶液，搅拌反应24h后，加入80μL0.5mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌24h；
(3)将步骤(2)的溶液于4000rpm离心分离30min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
其中，步骤(1)中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为磷酸缓冲液溶解的溶液，所述磷酸缓冲液pH值为6.0，浓度为200mM。
经上述步骤制备得到双酶-十二烷基硫酸钠交联聚集体。
实施例6双酶-司盘-80交联聚集体及其制备
(1)将1mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度80mg/mL)与1mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度80mg/mL)加入锥形瓶中，加入1.6g的司盘-80，室温搅拌10min；
(2)缓慢加入1.4g硫酸钠，继续搅拌20min，加入130μL 55％的戊二醛溶液，搅拌反应30min后，加入50μL1.5mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌60min；
(3)将步骤(2)的溶液于15000rpm离心分离3min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
其中，步骤(1)中，葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为磷酸缓冲液溶解的溶液，所述磷酸缓冲液pH值为9.0，浓度为10mM。
经上述步骤制备得到双酶-司盘-80交联聚集体。
对比例1不添加表面活性剂的双酶交联聚集体及其制备
不添加表面活性剂，其余同实施例2，具体为：
(1)将0.33mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、0.33mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)与1.34mL的蒸馏水加入锥形瓶中，室温搅拌10min；
(2)缓慢加入1g固体硫酸铵。继续搅拌10min，加入160μL 50％的戊二醛溶液。搅拌反应1h后，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶交联聚集体。
对比例2先沉淀再加表面活性剂的双酶-表面活性剂交联聚集体及其制备
(1)将0.33mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、0.33mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)与1.34mL的蒸馏水加入锥形瓶中，缓慢加入1g固体硫酸铵，室温搅拌10min；
(2)加入40mg的继续搅拌10min，加入160μL 50％的戊二醛溶液。搅拌反应1h后，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
对比例3先沉淀再交联，最后加表面活性剂的双酶-表面活性剂交联聚集体及其制备
(1)将0.33mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、0.33mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)与1.34mL的蒸馏水加入锥形瓶中，缓慢加入1g固体硫酸铵，室温搅拌10min；
(2)加入160μL50％的戊二醛溶液，搅拌反应1h后，加入40mg的室温搅拌10min，加入60μL 1mol/L的赖氨酸溶液，室温继续搅拌30min；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
对比例4不加赖氨酸的双酶-表面活性剂交联聚集体及其制备
(1)将0.33mL的葡萄糖氧化酶(酶蛋白浓度40mg/mL)、0.33mL的过氧化氢酶(酶蛋白浓度20mg/mL)与1.34mL的蒸馏水加入锥形瓶中，加入40mg的室温搅拌10min；
(2)缓慢加入1g固体硫酸铵。继续搅拌10min，加入160μL 50％的戊二醛溶液，搅拌反应1h后；
(3)将固定化后的溶液10000rpm离心分离5min，洗涤3次，将沉淀放置于冷冻干燥机，冷冻干燥12h，将冻干得到的粉末进行密封低温保存。
经上述步骤制备得到双酶-交联聚集体。
实施例7不同双酶-表面活性剂交联聚集体的酶活测定
在50mL的锥形瓶中加入288mg葡萄糖、5.48mg ABTS与40mL的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)，配置成底物溶液。称取一定量的制备得到聚集交联体均匀分散于蒸馏水中，并稀释一定的倍数得到双酶-表面活性剂交联体溶液。在比色皿中加入950μL的底物溶液与50μL的辣根过氧化物酶(酶蛋白浓度为1mg/mL)，然后加入5μL的交联聚集体溶液，测定反应液的吸光度值的变化。
酶活力单位1U定义为在环境温度为25℃时，每分钟使底物吸光度值上升1所需要的酶量。
表1不同双酶-表面活性剂交联聚集体的酶活测定
表1数据表明，通过添加表面活性剂大大提高了双酶-表面活性剂聚集体的酶活活性，而先采用表面活性剂对双酶进行修饰，也能在一定程度上提高聚集体的酶活活性。
实施例8不同双酶-表面活性剂的热稳定性研究
在50mL烧杯中，加入80mg实施例1-6、对比例1-4制备的双酶-表面活性剂交联聚集体与25mL蒸馏水，于60℃的水浴锅中加热搅拌。每2h取样，按照实施例7中的酶活测定方法测定出其相对酶活。同时，选择游离酶作为对照进行实验。相对酶活的计算公式如下：
相对酶活＝A/A0
其中，A代表热处理一段时间后样品的酶活；A0代表没有经过热处理的样品的酶活。
表2不同酶在60℃热处理条件下相对酶活性
由表2数据可知，本发明实施例提供的双酶-表面活性剂具有良好的热稳定性，10h热处理，酶活性仍能够保持80％以上，而游离酶的活性在60℃环境下迅速下降，对比例1-4采用不同制备方法制备得到的双酶-表面活性剂聚集体的酶活性也随热处理时间的推移而逐渐降低。
实施例9不同双酶-表面活性剂的分散性研究
在50mL烧杯中，加入80mg实施例1-6、对比例1-4制备的双酶-表面活性剂交联聚集体与25mL蒸馏水，搅拌均匀后取1mL的双酶-表面活性剂交联体溶液稀释5倍，用激光粒度仪测定双酶-表面活性剂交联体的平均粒径。
表3不同双酶-表面活性剂聚集体在水溶液中的粒径
| 组别 | 平均粒径(μm) |
| 实施例1 | 2.1 |
| 实施例2 | 1.6 |
| 实施例3 | 2.5 |
| 实施例4 | 1.8 |
| 实施例5 | 3.6 |
| 实施例6 | 3.1 |
| 对比例1 | 31.3 |
| 对比例2 | 17.2 |
| 对比例3 | 19.1 |
| 对比例4 | 28.3 |
由表3数据可知，本发明实施例提供的双酶-表面活性剂聚集体在水溶液中的平均粒径小于4μm，在水溶液中具有良好的分散性能，对比例1-4采用不同制备方法制备得到的双酶-表面活性剂聚集体在水溶液容易发生聚集的现象，其平均粒径均大于17μm。
实施例10双酶-交联聚集体重复使用
在200mL圆底烧瓶中，加入80mg实施例1-6、对比例1-4的双酶-5g葡萄糖与50mL蒸馏水，于45℃的水浴锅中加热搅拌，并向反应液中通入空气。通过pH反馈调控装置，向反应液中添加2mol/L的氢氧化钠溶液，使溶液的pH保持在6.5-7.2之间。每隔1h取样，通过与硫酸铜溶液发生反应产生的吸光度值变化来测定反应液中葡萄糖酸钠的浓度，计算出葡萄糖的转化率。
反应12h后，将反应液离心分离(10000rpm,5min)，洗涤2次得到双酶-表面活性剂聚集体，重新与5g葡萄糖与50mL蒸馏水加入圆底烧瓶中，重复第一次反应过程，每隔1h取样测定葡萄糖转化率。经过20次重复使用后，计算出每一次的葡萄糖转化率并作出对比测定出其相对酶活(即每一次使用后的葡萄糖转化率除以第1次使用时的葡萄糖转化率)。葡萄糖转化率计算公式如下：
其中c1为葡萄糖酸钠的摩尔浓度，单位为mol/L；V1为反应体系的体积，单位为L；m0为葡萄糖的质量(5g)；M0为葡萄糖的摩尔质量(180g/mol)。
表4不同双酶-表面活性剂聚集体的重复使用率
由表4数据可知，本发明实施例提供的双酶-表面活性剂具有良好的重复使用率，经过20次重复使用后，酶活性仍能够保持84％以上，而对比例1-4采用不同制备方法制备得到的双酶-表面活性剂聚集体的酶活性会随着重复使用次数的增加呈现不断降低的趋势。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种交联固定化双酶-表面活性剂复合物，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶经表面活性剂修饰后，经沉淀剂沉淀，再经交联剂、赖氨酸交联聚集得到，上述反应在20-30℃下进行，所述表面活性剂为 或聚乙烯吡咯烷酮。
2.根据权利要求1所述的交联固定化双酶-表面活性剂复合物，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶的蛋白浓度为1-80mg/mL，过氧化氢酶的蛋白浓度为1-80mg/mL，表面活性剂的含量为1-800mg/mL。
3.根据权利要求1所述的交联固定化双酶-表面活性剂复合物，其特征在于，所述沉淀剂选自硫酸铵、硫酸钠、氯化钠中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的交联固定化双酶-表面活性剂复合物，其特征在于，所述交联剂为戊二醛，浓度为30-65％(V/V)，添加量为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶溶液体积的1/40-1/10倍。
5.根据权利要求1所述的交联固定化双酶-表面活性剂复合物，其特征在于，所述赖氨酸的浓度为0.5-1.5mol/L，添加量为修饰后的双酶溶液体积的1/40-1/25倍。
6.一种权利要求1-5任一项所述交联固定化双酶-表面活性剂复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)修饰双酶体系：葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶中加入表面活性剂进行修饰；
(2)交联反应：向修饰后的双酶体系中加沉淀剂沉淀，然后加入交联剂进行交联，最后加入赖氨酸，备用；
(3)离心、洗涤、干燥，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中在修饰后的双酶溶液里加入沉淀剂，搅拌10min-4h后加入沉淀剂，搅拌30min-24h后，加入赖氨酸溶液，继续搅拌30min-24h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的离心转速为4000-15000rpm，离心时间为3-30min；所述干燥方式选自冷冻干燥、真空干燥、自然风干中的一种。
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