CN114392760B - 一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法。所述纳米酶的制备通过一锅高温煅烧法合成。以硅球为模板，多孔碳载体、葡萄糖、九水硝酸铁和双氰胺为原料合成了具有中空结构的铁/氮碳纳米酶。该方法制备得到的铁/氮碳纳米酶可催化过氧化氢高效氧化底物3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐，显示出优异的过氧化物酶催化活性。该纳米酶比活力接近市场所售的天然过氧化物酶，远超目前报道的其它纳米酶活性。本发明具有成本低廉、稳定性高和易储存等优点。
Description
本发明属于无机纳米材料及其模拟酶技术领域，涉及纳米酶的制备，尤其涉及一种具有超高过氧化物酶活性纳米酶的制备方法。所述纳米酶显示出超高的过氧化物酶活性，比活力接近市场所售天然过氧化物酶，大大超过目前报道的其它纳米酶活性，该纳米酶超高的酶学活性和低廉的成本优势，使其在医学分析检测和环境污染物去除等方面具有巨大的应用价值。
背景技术
酶是一类生物分子，广泛参与各种细胞活动，有效地控制着机体的代谢、营养和能量转换过程。天然酶在生物体内起着重要的作用，在生物医学领域有着广泛的应用，能有效催化各种特定的生化反应。然而，天然酶的成本高、制备困难、不稳定性等问题严重制约了天然酶的实际应用（E. N. Mirts, I. D. Petrik, P. Hosseinzadeh, M. J. Nilges andY. Lu, Science, 2018, 361, 1098–1101；X. Zhang, G. Li, D. Wu, X. Li, N. Hu, J.Chen, G. Chen and Y. Wu, Biosens. Bioelectron., 2019, 137, 178）。
纳米酶是一种具有酶活性的纳米纳米酶，是一种新型的人工模拟酶。纳米酶作为天然酶的潜在替代品在催化领域引起了广泛关注（J. Wu, X. Wang, Q. Wang, Z. Lou,S. Li, Y. Zhu, L. Qin and H. Wei, Chem. Soc. Rev., 2019, 48, 1004；Y. Chen, Y.Xianyu, M. Dong, J. Zhang, W. Zheng, Z. Qian and X. Jiang, Anal. Chem., 2018,90, 6906）。与天然酶相比，纳米酶具有稳定性好、成本低、易于规模化生产等优点。目前已经研究出一系列具有过氧化物酶、氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶性质的纳米酶，它们已被广泛应用于各个领域。尽管纳米酶已经取得了显著的进展，但其发展仍受到活性较低和特异性较差等问题的阻碍，因此新型高效纳米酶的设计和开发仍然是探索人工模拟酶的主要挑战（Y. Hu, X. J. Gao, Y. Zhu, F. Muhammad, S. Tan, W. Cao, S. Lin, Z.Jin, X.Gao, H. Wei, Chem. Mater., 2018, 30, 6431–6439）。
金属/碳纳米酶是将金属分散在碳载体上，可应用于多种催化反应，是近年来催化领域的研究热点。碳载体上负载的金属存在形式包含纳米点、金属簇或金属单原子，金属可作为催化反应的活性部位。通过提高金属的负载量以及改善分散性，可以调控金属/碳纳米酶的催化性能（L. Jiao, W. Q. Xu, H. Y. Yan, Y. Wu, C. R. Liu, D. Du, Y. H.Lin, C. Z. Zhu, Anal. Chem., 2018, 30, 6431–6439）。
综上所述，我们通过制备出中空的碳球负载金属铁，使其内外表面均可负载金属铁，进而大大改善了金属铁的分散性；并在良好分散性基础上通过多孔碳载体和葡萄糖与铁配位，提高了金属铁的负载量。综合利用以上两策略最终得到一种可比拟天然过氧化物酶的铁/氮碳纳米酶。
发明内容
本发明目的在于解决目前面临的纳米酶活性较低的问题，提供一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法。
为达到上述目的，本发明实现目的所采用的技术方案是：
一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）将多孔碳载体、九水硝酸铁、葡萄糖、双氰胺和硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；所述多孔碳载体的合成方法如下：4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体；所述多孔碳载体为6 mg，所述九水硝酸铁为0.0121~0.0605 g，所述葡萄糖为0.1207 g，所述双氰胺为1.2492~1.6848 g，所述硅球与双氰胺的质量比为0.1:1~1:1；
（2）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为2~5 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（3）将所得粉末浸泡于热碱液中去除硅球模板，随后使用离心机离心分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到中空结构的铁/氮碳纳米酶；所述浸泡温度为20~50 ℃，所述碱液为质量分数为10~30 wt%的NaOH溶液，所述浸泡时间为2~8 h，所述离心机转速为8500~14000 rpm，所述离心时间为3~10min。
本发明所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于步骤（1）所述硅球的合成方法如下：6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
本发明所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于，所述九水硝酸铁为0.0363g ，所述双氰胺为1.2492g ，所述硅球与双氰胺的质量比为1:1。
本发明所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于，所述升温速率为3.5 ℃/mi。
本发明所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于，所述温度为50 ℃，所述NaOH热溶液质量分数为20wt%，所述时间为8 h，所述离心机转速为10000 rpm，所述离心时间为10 min。
本发明进一步公开了采用所述方法制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶在用于提高铁的负载量以及改善分散性方面的应用；所述的提高铁的负载量以及改善分散性的应用指的是：催化过氧化氢高效氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，提高过氧化物酶催化活性。实验结果显示：成功制备出了具有中空结构的铁氮碳材料，铁元素均匀分散。其过氧化物酶活性大大增加，比活力已接近天然过氧化物酶，远超目前报道的其它纳米酶。
本发明更加详细的描述如下：
一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）将多孔碳载体、九水硝酸铁、葡萄糖、双氰胺和硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（2）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，冷却至室温，取出所得粉末；
（3）将所得粉末浸泡于热碱液中去除硅球模板，随后使用离心机离心分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到中空结构的铁/氮碳纳米酶。
进一步，步骤（1）所述多孔碳载体的合成方法如下：4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体。
进一步，步骤（1）所述硅球的合成方法如下：6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
进一步，步骤（1）所述多孔碳载体为6 mg，所述九水硝酸铁为0.0121~0.0605 g，所述葡萄糖为0.1207g，所述双氰胺为1.2492~1.6848g，所述硅球与双氰胺的质量比为0.1:1~1:1。
进一步，步骤（1）所述九水硝酸铁优选0.0363 g，双氰胺优选1.2492 g，硅球与双氰胺的质量比优选1:1。
进一步，步骤（2）所述升温速率为2~5 ℃/min，优选3.5 ℃/min。
进一步，步骤（3）所述浸泡温度为20~50 ℃，所述碱液为质量分数为10~30 wt%的NaOH溶液，所述浸泡时间为2~8 h，所述离心机转速为8500~14000 rpm，所述离心时间为3~10min。
进一步，步骤（3）所述温度优选50 ℃，NaOH热溶液质量分数优选20wt%，所述时间优选8 h，所述离心机转速优选10000 rpm，离心时间优选10 min。
本发明主要解决了目前纳米酶活性较低的问题，重点考察了硝酸铁、双氰胺以及硅球与双氰胺质量比对材料性能的影响，主要的难点在于制备一种具有中空结构以实现铁的高负载和良好分散性，进而提高其酶学活性。
本发明公开的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
1.本发明提供的铁/氮碳纳米酶的制备方法，合成路线简单，条件温和，重复性好，稳定性高。
2.相对于天然酶，铁/氮碳纳米酶在高温以及不同pH条件下稳定性更高，可重复使用，并且能保证较高的催化活性。
3.制备的铁/氮碳纳米酶具有中空结构，具有更大的比表面积，可提高铁的负载量以及改善分散性，进而提供更多的催化活性位点，并有利于有效的传质，使催化活性大幅度提高（36.6 U/mg）。催化比活力接近天然辣根过氧化物酶（例如Sigma-Aldrich品牌，50 U/mg），大大超过目前报道的其它纳米酶活性（例如Fe3O4 0.17 U/mg，Fe SAEs 6.75 U/mg）（C.Zhao, C. Xiong, X. Liu, M. Qiao, Z. Li, T. Yuan, J. Wang, Y. Qu, X. Wang, F.Zhou, Q. Xu, S. Wang, M. Chen, W. Wang, Y. Li, T. Yao, Y. Wu and Y. Li, Chem. Commun., 2019, 55, 2285-2288）。
4.铁/氮碳纳米酶作为一种新型的模拟过氧化物酶，可代替天然酶，应用于医学分析检测和污染物去除等领域。和天然酶相比(例如Sigma-Aldrich品牌，588元100 mg)，材料成本可降低约150倍，大大降低了应用成本。
附图说明
图1为制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的TEM图；
图2为制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的元素分布图；其中a为C元素分布，b为N元素分布，c为O元素分布，d为Fe元素分布；
图3为制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的XRD图；
图4为制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的BET图；
图5为具有中空结构的铁/氮碳纳米酶模拟过氧化物酶活性测试的UV-Vis图；
图6为不同铁含量对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶活性大小的影响；
图7为反应温度对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶催化活性的影响；
图8为pH对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶催化活性的影响；
图9为最佳具有中空结构的铁/氮碳纳米酶比活力测试图；
图10为具有中空结构的铁/氮碳纳米酶对TMB底物的反应动力学米氏曲线；
图11为具有中空结构的铁/氮碳纳米酶对H2O2底物的反应动力学米氏曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3',5,5'-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。本发明所用反应物、试剂均为市售。
实施例1
本发明的一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体。
（2）6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
（3）将6 mg多孔碳载体、0.0363 g九水硝酸铁、0.1207 g葡萄糖、1.2492 g 双氰胺、1.2492 g硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（4）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为3.5 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（5）将所得粉末在50 ℃下浸泡于20wt% NaOH热溶液8 h去除硅球模板，随后使用离心机以10000 rpm的转速离心10 分钟分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到铁/氮碳纳米酶。
获得的产物经TEM表征呈空心球状结构（图1）；元素分布测试图表明铁元素均匀分布（图2）；XRD测试图只有一个归属于无定形碳的宽衍射峰，并没有铁或氧化物的衍射峰，进一步说明铁分散良好（图3）；经N2吸附脱附等温线确认铁/氮碳纳米酶具有较大的BET比表面积（图4）。
实施例2
本发明的一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80℃干燥后，获得多孔碳载体。
（2）6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
（3）将6 mg多孔碳载体、0.0121 g九水硝酸铁、0.1207 g葡萄糖、1.2492 g双氰胺、0.1249 g硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（4）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为2 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（5）将所得粉末在20 ℃下浸泡于10wt% NaOH溶液2 h去除硅球模板，随后使用离心机以8500 rpm的转速离心3分钟分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到铁/氮碳纳米酶。
实施例3
本发明的一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体。
（2）6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
（3）将6 mg多孔碳载体、0.0242 g九水硝酸铁、0.1207 g葡萄糖、1.3581 g双氰胺、0.6246 g硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（4）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为3 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（5）将所得粉末在30 ℃下浸泡于20wt% NaOH热溶液4 h去除硅球模板，随后使用离心机以9000 rpm的转速离心5分钟分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到铁/氮碳纳米酶。
实施例4
本发明的一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体。
（2）6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
（3）将6 mg多孔碳载体、0.0484 g九水硝酸铁、0.1207 g葡萄糖、1.3581 g双氰胺、0.6246 g硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（4）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为3 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（5）将所得粉末在30℃下浸泡于20wt% NaOH热溶液4 h去除硅球模板，随后使用离心机以9000 rpm的转速离心5分钟分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到铁/氮碳纳米酶。
实施例5
本发明的一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用H2SO4溶液(0.5 mol/L)和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体。
（2）6 mL原硅酸四乙酯在搅拌下加入到210 mL乙醇中，然后将7.2 mL 25wt％氨水和42 mL水逐滴加入上述溶液中，将混合物在室温搅拌下保持24 h，形成白色悬浮液，然后离心烘干得到硅球。
（3）将6 mg多孔碳载体、0.0605 g九水硝酸铁、0.1207 g葡萄糖、1.3581 g双氰胺、0.6246 g硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；
（4）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2h，升温速率为3 ℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（5）将所得粉末在30 ℃下浸泡于20wt% NaOH热溶液4h去除硅球模板，随后使用离心机以9000 rpm的转速离心5分钟分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到铁/氮碳纳米酶。
实施例6
具有中空结构的铁/氮碳纳米酶模拟过氧化物酶性能测试实验，步骤是：
（1）取2907 µL pH 5缓冲溶液、30 µL 1 M H2O2溶液、60 µL 25 mmol/L TMB溶液和3 μL 1 mg/mL的铁/氮碳纳米酶溶液于离心管中混匀。
（2）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的催化动力学曲线。或者反应5 min后，用紫外可见光谱仪光谱模式测定反应溶液的紫外可见光谱。根据一定时间段内的吸光度差值确定催化能力的大小。
图5记录了制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶在不同体系中催化过氧化氢氧化TMB反应的UV-Vis图。由图所示，当过氧化氢、TMB和铁/氮碳纳米酶中的任何一种缺失时，未有颜色反应发生；当过氧化氢、TMB和铁/氮碳纳米酶均存在时，发生颜色反应。此颜色变化是由TMB和过氧化氢在铁/氮碳纳米酶的催化下发生氧化还原反应导致的，证明制备的铁/氮碳纳米酶具有过氧化物酶活性。
实施例7
不同铁含量对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶催化活性大小的影响，步骤是：
（1）取2907 µL pH 5缓冲溶液、30 µL 1 mol/L H2O2溶液、60 µL 25 mmol/LTMB溶液和3 μL 1 mg/mL的不同铁含量的铁/氮碳纳米酶溶液于离心管中混匀，时间控制在0.5min之内。
（2）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的催化动力学曲线。
结果如图6所示，铁/氮碳纳米酶的催化活性随着铁含量的增加先增加后减小，且真实铁含量在5.85%时催化活性最高（对应九水硝酸铁为0.0363g）。
实施例8
不同温度对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶催化活性的影响，步骤是：
（1）将 pH 5的缓冲溶液分别放在20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中保持恒温。
（2）取2907 µL pH 5的缓冲溶液、30 µL 1 mol/L H2O2溶液、60 µL 25 mmol/L TMB溶液和3 μL 1 mg/mL的铁/氮碳纳米酶溶液（铁含量为5.85%）于离心管中混匀，时间控制在0.5 min之内。
（3）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的5 min内的催化动力学曲线。
结果如图7所示，随着温度的升高，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在40 ℃时达到峰值。因此可知，把温度控制在40 ℃时，铁/氮碳纳米酶的催化活性最好。
实施例9
不同pH值对具有中空结构的铁/氮碳纳米酶催化活性的影响，步骤是：
（1）配制pH值分别为3、4、5、6、7、8的缓冲溶液。
（2）取2907 µL不同pH值的缓冲溶液、30 µL 1 mol/L H2O2溶液、60 µL 25 mmol/LTMB溶液和3 μL 1 mg/mL的铁/氮碳纳米酶溶液（铁含量为5.85%）于离心管中混匀。
（3）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的5 min内的催化动力学曲线。
结果如图8所示，随着pH值的升高，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在pH为5时达到峰值。因此可知，把pH控制在5时，铁/氮碳纳米酶的催化活性最好。
实施例10
最佳铁/氮碳纳米酶比活力的测定，步骤是：
（1）将2 mL含不同量（0.3- 1.8 µg）纳米酶的溶液置于0.2 mol/L NaAc-HAc缓冲溶液中，pH值为4。
（2）向离心管中加入100 µL TMB溶液并混合。
（3）将反应混合物放入恒温水浴中，在37 ℃恒温水浴中孵育1分钟。水浴连接紫外/可见光谱仪。
（4）向反应混合物中加入H2O2，最终浓度为1 mol/L，总体积为3 mL。
（5）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的催化动力学曲线。
结果如图9所示，铁/氮碳纳米酶的酶比活力大小为36.6 U/mg，已接近市场销售的天然辣根过氧化物酶活性（50 U/mg），大大超过目前报道的其它纳米酶活性，显示出优异的催化性能。
实施例11
最佳铁/氮碳纳米酶对TMB底物的反应动力学测试，步骤是：
（1）取2907 µL pH 5的缓冲溶液、30 µL 1 mol/L H2O2溶液、3 μL 1 mg/mL的纳米酶溶液以及终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1和2 mmol/L的TMB溶液于离心管中混匀。
（2）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的5 min内的催化动力学曲线。
结果如图10所示，随着TMB浓度的增加，初始反应速率增加。当TMB浓度增加到一定浓度时，初始反应速率趋于最大值，符合典型的Michaelis−Menten方程。
实施例12
最佳铁/氮碳纳米酶对H2O2底物的反应动力学测试，步骤是：
（1）取2907 µL pH 5的缓冲溶液、60 µL 25 mmol/LTMB溶液、3 μL 1 mg/mL的纳米酶溶液以及终浓度分别为2、3、5、10、20、30、40、50和60 mmol/L的H2O2溶液于离心管中混匀。
（2）用紫外可见光谱仪的时间驱动模式检测652 nm下的5 min内的催化动力学曲线。
结果如图11所示，随着H2O2浓度的增加，初始反应速率增加。当H2O2浓度增加到一定浓度时，初始反应速率趋于最大值，符合典型的Michaelis−Menten方程。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式。当然，本发明还可有其它多种实施
例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，任何熟悉本技术领域的技术人员，当可根据本发明作出各种相应的等效改变和变形，都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）将多孔碳载体、九水硝酸铁、葡萄糖、双氰胺和硅球在搅拌下共溶于超纯水中，水浴加热蒸干，然后放入真空烘箱烘干；所述多孔碳载体的合成方法如下：4 mmol 柠檬酸钾在管式炉中800 ℃下煅烧1 h，所得黑色固体产物用0.5 mol/L H2SO4溶液和水洗涤以除去无机杂质，在80 ℃干燥后，获得多孔碳载体；所述多孔碳载体为6 mg，所述九水硝酸铁为0.0121~0.0605 g，所述葡萄糖为0.1207g，所述双氰胺为1.2492~1.6848g，所述硅球与双氰胺的质量比为0.1:1~1:1；
（2）将所得样品放入管式炉中，氮气氛中进行碳化，在800 ℃保持2 h，升温速率为2~5℃/min，冷却至室温，取出所得粉末；
（3）将所得粉末浸泡于热碱液中去除硅球模板，随后使用离心机离心分离固体沉淀物并用水洗涤3次，最后，在真空烘箱中烘干得到中空结构的铁/氮碳纳米酶；所述浸泡温度为20~50 ℃，所述碱液为质量分数为10~30 wt%的NaOH溶液，所述浸泡时间为2~8 h，所述离心机转速为8500~14000 rpm，所述离心时间为3~10min。
2.权利要求1所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于，所述九水硝酸铁为0.0363 g ，所述双氰胺为1.2492 g ，所述硅球与双氰胺的质量比为1:1。
3.权利要求1所述具有中空结构的铁/氮碳纳米酶的制备方法，其特征在于，所述升温速率为3.5 ℃/min。
4.采用权利要求1所述方法制备的具有中空结构的铁/氮碳纳米酶在用于提高铁的负载量以及改善分散性方面的应用；所述的提高铁的负载量以及改善分散性的应用指的是：催化过氧化氢高效氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐，提高过氧化物酶催化活性。
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