DE19813011A1 - Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln durch Zerstäuben einer wäßrigen Lösung 1, die 0,1 bis 5 Gew.-% mindestens eines wasserlösliches Polyanions enthält, zu Flüssigkeitströpfchen, wobei die so erhaltenen Flüssigkeitströpfchen auf einen fließenden Film einer wäßrigen Lösung 2 auftreffen, enthaltend: DOLLAR A È 0,1 bis 5 Gew.-% Calciumkationen; und DOLLAR A È 0,001 bis 0,4 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht größer 40000 g/Mol; und/oder DOLLAR A È 0,1 bis 5 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht zwischen 500 und 40000 g/Mol.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln.

Mikrokapseln werden hergestellt durch Einkapselung fein disperser flüssiger Phasen durch Umhüllung mit filmbildenden Polymeren. Mikrokapseln finden vor allem auf dem Gebiet von Depotpräparaten Anwendung, demzufolge der in den Mikrokapseln enthaltene Wirkstoff durch die Hülle der Mikrokapsel geschützt ist und nicht sofort, sondern erst mit einem verzögerten Release, freigesetzt wird.

Es ist bekannt, Mikrokapseln durch Zerstäuben einer Polymer-Lösung und Wirkstoff mittels Ultraschall herzustellen, wobei die auf diese Weise hergestellten Flüssigkeits­ tröpfchen in ein Fällbad eingesprüht werden.

So beschreibt die US-A-4 352 883 einen 2-Stufen-Prozeß zur Herstellung von Mikro­ kapseln, in denen lebende Zellen, wie z. B. Langerhans'sche Inselzellen, verkapselt werden. Hierzu werden die lebenden Zellen in Natriumalginat suspendiert und diese Suspension in ein Fällbad gesprüht, das mehrwertige Kationen (beispielsweise Ca²⁺) enthält. Hierbei kommt es an der Grenzfläche zur physikalischen Vernetzung des Alginats durch das mehrwertige Kation. Im zweiten Schritt werden die so hergestell­ ten Kapseln mit einem kationischen Polymer gemischt, was eine weitere physikali­ sche Vernetzung bewirkt. Als Polykationen werden in dieser Druckschrift Polyethy­ lenimin und Polylysin genannt.

Die US-A-5 389 379 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln, bei dem die mittels einer Ultraschalldüse hergestellten Flüssigkeitströpfchen zuerst in eine Flüssigkeit eingebracht werden, in der die Flüssigkeitströpfchen nicht löslich sind (beispielsweise in Ethanol). Anschließend wird diese Flüssigkeit durch Wasser ersetzt. Dieses aufwendige 2-Stufen-Verfahren wird deshalb gewählt, weil ein direk­ tes Einbringen der Flüssigkeitströpfchen in nicht möglich ist, da sich anderenfalls anstelle der Mikrokapseln ein dünner Polymerfilm auf der Wasseroberfläche bildet. Die Größe der auf diese Weise gebildeten Mikrokapseln wird mit 10 bis 1000 µm angegeben.

In der US-A-5 472 648 ist ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln angege­ ben, wobei kleine Flüssigkeitströpfchen mittels Ultraschall aus einer Alginatlösung hergestellt werden und in ein Gefäß mit einer CaCl₂-Lösung eingedüst werden. Nachdem die Flüssigkeitströpfchen in dieser CaCl₂-Lösung (Fällbad) ausgehärtet sind, werden die auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln mit Hilfe einer Fördervor­ richtung (Bandsieb) aus der CaCl₂-Lösung gebracht. Um möglichst gleichmäßige Mikrokapseln herzustellen, wird in dieser Druckschrift vorgeschlagen, zu der CaCl₂-Lö­ sung zusätzlich ein oberflächenaktives Mittel zuzugeben, um die Oberflächen­ spannung zu erniedrigen, oder die CaCl₂-Lösung aufzuschäumen, um die mechani­ sche Belastung der Flüssigkeitströpfchen beim Auftreffen auf die CaCl₂-Lösung zu verringern. Die Größe der auf diese Weise erhältlichen Mikrokapseln wird mit 100 bis 4000 µm angegeben.

Die US-A-5 484 721 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismen enthaltenden Mikrokapseln. Hierzu wird die das Polyanion enthaltende wäßrige Lö­ sung mittels Luftdruck und einer Sprühdüse zerstäubt und die so erhaltenen Flüs­ sigkeitströpfchen in einen Flüssigkeitsfilm eingebracht, der als Vernetzer Calcium- oder Kaliumionen enthält. Die Größe der gemäß dieser Druckschrift hergestellten Mikrokapseln wird zwischen 10 µm und 4 mm angegeben. Diese Mikrokapseln eig­ nen sich aber nicht zur Verkapselung von Wirkstoffen, die verzögert freigegeben werden sollen.

Die US-A-5 589 370 betrifft die Herstellung von Mikropartikeln durch Aussalzen von Polymeren. Die auf diese Weise hergestellten Mikropartikel lösen sich aber sofort auf, sobald sie in Wasser gegeben werden. Insofern eignen sie sich nicht zur Her­ stellung von Depot-Präparaten.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfah­ rens zur Herstellung von Mikrokapseln, die sich für die Herstellung von Depot-Präpa­ raten mit verzögertem Release eignen, und die in einer solchen Größe hergestellt werden können, daß sie auch zur parenteralen Verabreichung von Depot-Präparaten verwendet werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln durch Zerstäuben einer wäßrigen Lösung 1, die 0,1 bis 5 Gew.-% mindestens eines wasserlösliches Polyanions enthält, zu Flüssigkeitströpfchen, wobei die so erhalte­ nen Flüssigkeitströpfchen auf einen fließenden Film einer wäßrigen Lösung 2 auf­ treffen, enthaltend:

• - 0,1 bis 5 Gew.-% Calciumkationen; und
• - 0,001 bis 0,4 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht größer 40 000 g/mol; und/oder
• - 0,1 bis 5 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht zwi­ schen 500 und 40 000 g/mol.

Die entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mikrokapseln weisen eine besonders stabile Vernetzung der äußeren Hülle auf, die vor allem auf die gleichzeitige Verwendung von Calciumkationen und Polykationen als Vernet­ zungsmittel zurückzuführen ist. Aufgrund dieser Eigenschaft eignen sich diese Mikro­ kapseln besonders für die Einkapselung von Wirksubstanzen zur Herstellung von Depot-Präparaten.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat des weiteren den Vorteil, daß keine Agglome­ ration oder Verklumpung der Mikrokapseln eintritt, wie es beispielsweise der Fall ist, wenn man die mittels Ultraschall zerstäubte Lösung 1 in ein gerührtes Fällbad aus der Lösung 2 einsprüht.

Der Film kann entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren über ein festste­ hendes Substrat fließt, wobei das Substrat vorzugsweise nicht horizontal angeordnet ist. Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausführungsform bildet das Substrat eine schiefe oder eine vertikale Ebene.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das wasserlösliche Polyanion ein Alginat ist, insbesondere ein Alginat mit hohem Guluronsäuregehalt.

Das wasserlösliche Polyanion kann aber auch ausgewählt sein aus der Gruppe von Carrageenan, sulfatierten Polysacchariden, Gelatine und Agar-Agar.

Entsprechend einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er­ findung enthält die Lösung 1 zusätzlich mindestens eine Polysäure oder deren Alka­ lisalz, ausgewählt aus der Gruppe von Polyaminosäuren, Polyphosphaten und Poly­ sulfaten von Polysacchariden.

Bevorzugte Beispiele für ein Polyphosphat sind Natriumpolyphosphat und ein Poly­ phosphat eines Polysaccharids.

Das Polysaccharid kann ausgewählt sein aus der Gruppe von Stärkehydrolysaten, Inulin, Hydroxyethylstärke, Xylan und Dextranen.

Als Polyaminosäure ist bevorzugt Polyasparaginsäure oder Polyglutaminsäure zu verwenden.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung enthält die Lö­ sung 2 zusätzlich ein Polykation, ausgewählt aus der Gruppe von Polylysin, Poly­ vinylamin, Poly-α,β-(2-2dimethylaminoethyl)-D,L-aspartamid, aminierten Polysaccha­ riden, wie z. B. aminierten Dextranen, Cyclodextrinen, Celluloseethern, Stärken, Pek­ tinen, sowie deren hydrophob substituierten Derivaten.

Der Release kann darüber hinaus reduziert werden, indem man nach der Partikel­ herstellung die Mikrokapseln in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mit einem Ver­ netzer umsetzt, ausgewählt aus der Gruppe von Glyoxal, Glutardialdehyd, Bern­ steinsäuredialdehyd, oder Dicarbonsäuren, wie beispielsweise Oxalsäure, Bern­ steinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, 2,3-O-Isopropylidenweinsäure, Disäurechloriden, wie beispielsweise Bernsteinsäurechlorid, Fumarsäurechlorid, Glutarsäurechlorid, Adipinsäurechlorid, oder Tricarbonsäuren, wie beispielsweise Citronensäure, 1,2,3-Propantricarbonsäure, Hemimellithsäure, Trimellithsäure, Trimesinsäure.

Das Zerstäuben kann mit allen geeigneten Vorrichtungen erfolgen, besonders bevor­ zugt ist eine Zerstäubung mittels einer Ultraschalldüse oder eines Aerosolgenera­ tors.

Die Größe der erfindungsgemäß hergestellten Mikrokapseln liegt zwischen 50 nm und 500 µm, insbesondere zwischen 100 nm und 150 µm.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung der Lösung 1

9 mg Natrium Alginat von der Firma Sigma (Katalog-Nr.: A-7128) zusammen mit 6 mg BSA-FITC (von der Firma Sigma, Katalog-Nr.: A-9771) werden in 3 ml 0,9% NaCl-Lösung gelöst.

Herstellung der Lösung 2

In einem 4 l Zweihalskolben, ausgestattet mit einem Kühler, werden 1500 ml 1,0 M Salzsäure auf 90°C erwärmt. Anschließend werden 60 g Chitosan (erhältlich unter der Bezeichnung Chitosan von der Firma Fluka, Katalog-Nr.: 22 743) langsam unter Rühren zugegeben. Nach erfolgter Zugabe wird die Reaktionsmischung 4 Stunden lang bei 90°C gerührt und anschließend durch eine G2-Fritte filtriert. Das erhaltene Filtrat wird über Nacht in einem Kühlschrank bei 2-8°C stehengelassen. Der auf die­ se Weise erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugation (Lobofuge GL von Heraeus; bei 4500 U/Min, 25 Min) isoliert. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und mit Hilfe einer Gefriertrocknungs-Vorrichtung (LDC-1m der Firma Christ) gefrierge­ trocknet.

600 mg des so hergestellten Chitosan wird zusammen mit 900 mg CaCl₂ (von der Firma Riedel deHaen, Katalog-Nr.: 12 018) in 30 ml Wasser gelöst.

Herstellung der Mikrokapseln

3 ml der Lösung 1 werden mit einem Ultraschallzerstäuber US2 der Firma Lechler GmbH & Co. KG mit einer Arbeitsfrequenz von 58 kHz zerstäubt. Mit Hilfe von Trä­ gerluft wird der erhaltene Sprühstrahl zu einem Sprühkegel von ca. 30° stabilisiert, um zu verhindern, daß der Sprühstrahl durch Umgebungsatmosphäre beeinflußt werden kann. Auf diese Weise kann wirksam gewährleistet werden, daß die Tropfen größere Entfernungen überbrücken können. Die Größe der auf diese Weise erhal­ tene Flüssigkeitströpfchen liegt bei 30 µm.

Dieser Sprühkegel wird, mit einem Abstand der Düse von 3 cm, auf eine Glasplatte mit den Abmessungen von 5 cm × 10 cm gerichtet, die horizontal um 30° geneigt ist. Über diese Glasplatte wird mit Hilfe einer Schlauchpumpe (der Firma Cole-Parmer Instrument Co., Modell: Masterflex L/S™, Schlauch L/S™ 16, Geschwindigkeitsstufe 7) die Lösung 2 in einer Menge von 30 l/h gegeben. Die Lösung 2 wird hierbei be­ ständig umgepumpt.

Der die Mikrokapseln enthaltende Flüssigkeitsfilm wird in einem Becherglas aufge­ sammelt. Nach Beendigung des Zerstäubungsvorgangs werden die Mikrokapseln aus der Lösung 2 durch dekantieren abgetrennt, mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewa­ schen und in dieser Lösung gelagert. Die häufigste Mikropartikelgröße liegt bei 90 µm.

Bestimmung der Wirkstofffreisetzung

Zur Bestimmung der Release Eigenschaften der hergestellten Kapseln wird als Mo­ dell-Protein BSA-FITC der Firma Sigma (Katalog-Nr.: A-9771) verwendet. Weitere Materialien sind: Natrium-Alginat von Sigma (A-7128), Chitosan von Fluka (22 743), CaCl₂ von Riedel deHaen (12 018), NaCl von Merck (6404).

Die Releasemessungen werden in PBS Puffer (Sigma, P4417), mit zusätzlich 0,005% Timerosol (der Firma Fluka, Katalog-Nr.: 71 230), durchgeführt. Die PEC-Kapseln werden nach der Herstellung in 10 ml PBS-Pufferlösung, in 15 ml Rollrandgläschen, überführt und die Mikrokapseln werden bei 37°C inkubiert.

Die Messung der BSA-FITC Konzentration erfolgten mittels eines UV/VIS Spektro­ photomer der Firma Beckmann (DU 70). Zuerst wird der Anteil an eingeschlossenem BSA-FITC bestimmt, indem in den vereinigten Überständen die BSA-FITC-Konzen­ tration bestimmt wird. Die Konzentrationsbestimmung erfolgt durch Messung der Ab­ sorption bei 494 nm unter Benutzung einer Eichkurve. Eine Verfälschung der Mes­ sung durch die Eigenfärbung des Chitosans wird umgangen, indem die Absorption des Chitosans abgezogen wird. Aus der eingesetzten Menge an BSA-FITC kann berechnet werden, wieviel von dem BSA-FITC eingeschlossen wurde.

Die Releasemessung erfolgt, indem 3 ml aus der Inkubationslösung entnommen wird und an diesem Überstand die BSA-FITC Konzentration bestimmt wird. Nach Beendi­ gung der Messung wird die Probenlösung wieder mit der Releaseprobe vereint. Die auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln zeigten, daß nach 30 Tagen nur 44% des eingekapselten Wirkstoffes freigesetzt wurden.

Beispiel 2 (Chitosan hochmolekular)

Die Durchführung erfolgt analog zu Beispiel 1, jedoch wird die Lösung 2 wie folgt hergestellt: 90 mg hochmolekulares Chitosan (der Firma Fluka, Katalog-Nr.: 22 743) wird zusammen mit 900 mg CaCl₂ (von der Firma Riedel deHaen, Katalog-Nr.: 12 018) und etwa 100 µl Essigsäure ( Riedel deHaen), in 30 ml Wasser gelöst. Die häufigste Größe der auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln liegt bei 90 µm; die Wirkstofffreisetzung nach 30 Tagen beträgt nur 38% des eingekapselten Wirk­ stoffes.

Beispiel 3 (Vernetzung mit Glyoxal)

Die Durchführung erfolgt analog zu Beispiel 1. Nach der Mikropartikelherstellung werden die Partikel mit Glyoxal vernetzt. Hierzu werden die Mikropartikel für 30 Mi­ nuten in 10 ml einer 2 Gew.-% Lösung eingebracht und stehen gelassen. Anschließend werden sie mit 0,9% NaCl Lösung gewaschen.

Die häufigste Größe der auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln liegt bei 90 µm.

Beispiel 4 (Nachbehandlung mit Pentosanpolysulfat)

Die Durchführung erfolgt analog Beispiel 1. Nach der Mikropartikelherstellung wer­ den die Partikel mit einer Polyanionlösung versetzt. Die Partikel werden für 30 Mi­ nuten in 20 ml einer 2 Gew.-% Pentosanpolysulfat-Lösung (Pentosanpolysulfat von der Firma Sigma, Katalog-Nr.: P8275) eingebracht und stehen gelassen. Anschlie­ ßend werden sie mit 0,9% NaCl Lösung gewaschen.

Die häufigste Größe der auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln liegt bei 90 µm; die Wirkstofffreisetzung nach 30 Tagen beträgt nur 20% des eingekapselten Wirk­ stoffes.

Beispiel 5 (Nanopartikel)

Die Durchführung erfolgt analog zu Beispiel 1, jedoch wird die Lösung 1 durch einen Aerosolerzeuger "Pari Inhalierboy" der Firma Pari GmbH zerstäubt. Die Größe der auf diese Weise erhaltenen Flüssigkeitströpfchen beträgt weniger als 5 µm. Die häu­ figste Mikropartikelgröße der hergestellten Mikrokapseln liegt bei 300 nm.

Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)

Die Durchführung erfolgt analog zu Beispiel 1, jedoch werden 30 ml der Lösung 2 in einem 250 ml Becherglas vorgelegt. 3 ml der Lösung 1 werden mit einem Ultraschall­ zerstäuber US2 der Firma Lechler GmbH & Co. KG mit einer Arbeitsfrequenz von 58 kHz zerstäubt. Mit Hilfe von Trägerluft wird der erhaltene Sprühstrahl zu einem Sprühkegel von ca. 30° stabilisiert und in das Becherglas gelenkt. Hierbei wurde auf der Oberfläche von Lösung 2 eine Verklumpung beobachtet, die auf eine unkontrol­ lierte Vernetzung zwischen Alginat und Chitosan zurückzuführen ist. Es konnten kei­ ne Mikrokapseln erhalten werden.

Die folgenden Diagramme zeigen eine Bestimmung der Partikelgrößenverteilung der Mikrokapseln, hergestellt nach Beispiel 1 (Ultraschallgenerator) und Beispiel 5 (Aerosolgenerator). Im Falle von Beispiel 1 wurde die Partikelgröße durch Frauen­ hoferbeugung (Cilas Granulometer, Cilas 920), im Fall von Beispiel 5 durch dynami­ sche Lichtstreuung (Malvern Instruments, Mastersizer Microplus) bestimmt.

Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln durch Zerstäuben einer wäßrigen Lösung 1, die 0,1 bis 5 Gew.-% mindestens eines wasserlösliches Polyanions enthält, zu Flüssigkeitströpfchen, wobei die so erhaltenen Flüssigkeitströpfchen auf einen fließenden Film einer wäßrigen Lösung 2 auftreffen, enthaltend:

• - 0,1 bis 5 Gew.-% Calciumkationen; und
• - 0,001 bis 0,4 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekularge­ wicht größer 40 000 g/mol; und/oder
• - 0,1 bis 5 Gew.-% Chitosan mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht zwischen 500 und 40 000 g/mol.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Film über ein feststehendes Substrat fließt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat nicht horizontal angeordnet ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine schiefe Ebene bildet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine vertikale Ebene bildet.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polyanion ein Alginat, insbesondere ein Alginat mit hohem Guluronsäuregehalt.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polyanion ausgewählt ist aus der Gruppe von Carra­ geenan, sulfatierten Polysacchariden, Gelatine und Agar-Agar.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung 1 zusätzlich mindestens eine Polysäure oder deren Alkalisalz enthält, ausgewählt aus der Gruppe von Polyaminosäuren, Polyphosphaten und Polysulfaten von Polysacchariden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyphosphat Natriumpolyphosphat oder ein Polyphosphat eines Polysaccharids ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysac­ charid ausgewählt ist aus der Gruppe von Stärkehydrolysaten, Inulin, Hydroxy­ ethylstärke, Xylan und Dextranen.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyaminosäure Polyasparaginsäure oder Polyglutaminsäure ist.

12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung 2 zusätzlich ein Polykation enthält, ausgewählt aus der Gruppe von Polylysin, Polyvinylamin, Poly-α,β-(2-2dimethylaminoethyl)-D,L-aspartamid, aminierten Polysacchariden, wie z. B. aminierten Dextranen, Cyclodextrinen, Celluloseethern, Stärken, Pektinen, sowie deren hydrophob substituierten Deri­ vaten.

13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln in einem zusätzlichen Verfahrensschritt mit einem Ver­ netzer umgesetzt werden, ausgewählt aus der Gruppe von Glyoxal, Glutardial­ dehyd, Bernsteinsäuredialdehyd, oder Dicarbonsäuren, wie beispielsweise Ox­ alsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, 2,3-O-Isopropylidenweinsäure, Disäurechloriden, wie beispiels­ weise Bernsteinsäurechlorid, Fumarsäurechlorid, Glutarsäurechlorid, Adipin­ säurechlorid, oder Tricarbonsäuren, wie beispielsweise Citronensäure, 1,2,3-Propantricarbonsäure, Hemimellithsäure, Trimellithsäure, Trimesinsäure.

14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet₁ daß das Zerstäuben mittels einer Ultraschalldüse oder eines Aerosolgenerators erfolgt.

15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe der Mikrokapseln zwischen 50 nm und 500 µm, insbesondere zwischen 100 nm und 150 µm, liegt.