TWI686205B - 芋螺毒素（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）肽，其醫藥組合物及用途 - Google Patents

芋螺毒素（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）肽，其醫藥組合物及用途 Download PDF

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Abstract

本發明描述α-芋螺毒素(conotoxin)肽RgIA之芋螺毒素肽類似物。此等芋螺毒素肽類似物阻斷菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型且可用於治療疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症。

Description

芋螺毒素(CONOTOXIN)肽，其醫藥組合物及用途 [相關申請案之交叉引用]
本申請案主張2013年5月31日申請之美國臨時專利申請案第61/829,633號及2013年7月5日申請之美國臨時專利申請案第61/843,135號的優先權，該等申請案之全部內容皆以引用之方式併入本文中。
政府支持之引用
本發明在由國立衛生研究所(National Institutes of Health),Bethesda,Maryland頒發的授權號為MH53631、GM48677及NS048158的政府支持下產生。美國政府享有本發明中之特定權利。
芋螺屬之食肉性海蝸牛的毒液富含神經藥理學活性肽(Armishaw等人，2005；Wang等人，2004；Livett等人，2004；Lewis,2004；Terlau等人，2004)。芋螺屬中有約500個物種，且在目前已檢驗之彼等物種中，不變之特徵為其毒液中存在α-芋螺毒素(α-conotoxin)肽。α-芋螺毒素肽為具有C1-C3二硫鍵及C2-C4二硫鍵的高度二硫交聯之肽。
由於α-芋螺毒素之非半胱胺酸殘基的高序列變異性，α-芋螺毒素極其多樣且每個芋螺物種具有獨特的α-芋螺毒素肽補體。α-芋螺毒素肽以大型前驅物形式合成，且成熟毒素藉由對前驅物之C-末端進行蛋白酶裂解而產生。與成熟毒素的半胱胺酸間可變序列相反，前驅物及 其編碼基因在既定芋螺物種中的α-芋螺毒素肽之間及物種與物種之間皆相當保守。
α-芋螺毒素肽通常顯示為菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)拮抗劑(Mcintosh等人，1999；Janes,2005；Dutton等人，2001；Arias等人，2000)。nAChR為乙醯膽鹼閘控離子通道之群組，該等乙醯膽鹼閘控離子通道為配體閘控離子通道超家族之部分(Karlin，2002；Gotti等人，2004)。其為環繞中心離子傳導通道之跨膜子單元的五聚物。已識別出多種不同子單元，且大多數屬於兩個主要超家族(α子單元及β子單元)。子單元在受體五聚物中可以多種組合締合，導致受體亞型之不同家族。大多數亞型包含來自α子單元家族及β子單元家族之子單元，例如，人類成體肌肉亞型包含兩個α子單元及一個β子單元(除δ子單元及ε子單元之外)且α3β2亞型由α3子單元及β2子單元構成。僅由α子單元構成之nAChR為α7亞型及α9亞型(均五聚物)以及α9α10亞型(全α雜五聚物)。系統發生分析顯示，α7子單元、α9子單元及α10子單元彼此間的關係相較於與其他nAChR子單元的關係更緊密(Le Novere等人，2002；Sgard等人，2002)。
α9 nAChR子單元及α10 nAChR子單元在不同組織中表現。在內耳中，α9α10 nAChR介導傳出橄欖耳蝸纖維與耳蝸毛細胞之間的突觸傳輸(Sgard等人，2002；Elgoyhen等人，1994；Elgoyhen等人，2001)。α9子單元及α10子單元亦發現於背根神經節神經元(Harberger等人，2004；Lips等人，2002)、淋巴細胞(Peng等人，2004)、皮膚角質細胞(Arredondo等人，2002；Nguyen等人，2000；Kurzen等人，2004)及垂體結節部(Sgard等人，2002；Elgoyhen等人，1994；Elgoyhen等人，2001)。此外，α9 nAChR子單元在乳癌中活躍(Lee等人，2010a；Lee等人，2010b；Linnoila,2010)。α-芋螺毒素肽RgIA(RgIA；GCCSDPRCRYRCR；SEQ ID NO：1)已顯示阻斷α9α10 nAChR(Ellison 等人，2006)。RgIA之某些類似物亦已顯示阻斷α9α10 nAChR(US 2009/0203616、US 2012/0220539及WO 2008/011006)。
本發明係關於α-芋螺毒素肽RgIA之類似物(本文之芋螺毒素肽類似物)。此等芋螺毒素肽類似物阻斷菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型，且可用於治療疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症。
圖1A及圖1B展示蘇胺酸(Thr或T)56/異白胺酸(Ile或I)造成大鼠對比人類之RgIA抑制效能差異。大鼠α9子單元中Thr56突變為Ile，導致對大鼠受體的RgIA效能降低至人類受體發現之水準(圖1A)。將人類α9受體中之Ile56置換為Thr導致對人類受體的RgIA效能增加至大鼠內所發現之水準(圖1B)。各值為由至少三個卵母細胞之平均值±平均值標準誤差(standard error of the mean；SEM)，該等卵母細胞中注射有比率為1：1的來自α9子單元基因之cRNA及α10子單元基因之cRNA。
圖2展示類似物2(表1；SEQ ID NO：4)選擇性阻斷α9α10 nAChR對於α7 nAChR。類似物2施用於表現人類α9α10 nAChR或人類α7 nAChR之爪蟾(Xenopus)卵母細胞。10nM之類似物2阻斷α9α10 nAChR之Ach-誘發反應的75±2.8%。高一千倍之濃度(10μM肽)未能阻斷α7nAChR。(n=5)。展示個別卵母細胞之代表性跡線。
圖3展示神經損傷後的物質P表現。其為熱損傷24小時及一週後，脊髓背角中提高之物質P表現的顯微照片。
圖4A至圖4J展示芋螺毒素肽在化學療法誘發之神經痛中的功效。每天投與RgIA在第14天及第21天產生顯著鎮痛效果(圖4A、圖4B、圖4E、圖4F及圖4I)。圖4C、圖4D、圖4G、圖4H及圖4J展示表明此預防性治療範例中CSP-4之鎮痛效果的資料。(圖4A：CINP模型：RgIA(30分鐘)對機械性痛覺過敏之作用。圖4B：CINP模型：RgIA(24小時)對機械性痛覺過敏之作用。圖4C：CINP模型：CSP-4(30分鐘)對機械性痛覺過敏之作用。圖4D：CINP模型：CSP-4(24小時)對機械性痛覺過敏之作用。圖4E：CINP模型：RgIA(30分鐘)對機械性異常疼痛之作用。圖4F：CINP模型：RgIA(24小時)對機械性異常疼痛之作用。圖4G：CINP模型：CSP-4(30分鐘)對機械性異常疼痛 之作用。圖4H：CINP模型：CSP-4(24小時)對機械性異常疼痛之作用。圖4I：CINP模型：RgIA(30分鐘)對熱異常疼痛之作用。圖4J：CINP模型：CSP-4(24小時)對熱異常疼痛之作用。)
圖5A及圖5B展示RgIA(圖5A)及CSP-7(圖5B)顯著降低燒傷引發之熱痛覺過敏，如藉由Hargraves方法以全部三個測試劑量(4mcg/Kg、20mcg/Kg及100mcg/Kg)量測。(圖5A：燒傷模型：RgIA對熱痛覺過敏之作用。圖5B：燒傷模型：CSP-7對熱痛覺過敏之作用。)
本發明係關於芋螺毒素肽，該等芋螺毒素肽為α-芋螺毒素肽RgIA之類似物(本文中之芋螺毒素肽類似物)，以及其變異體、d取代類似物、修飾物及衍生物(本文中統稱「芋螺毒素肽」)。此等芋螺毒素肽阻斷菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型，且可用於治療疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症。芋螺毒素肽亦可用於本文所述之進一步藥物開發。
I. α-芋螺毒素肽RgIA之類似物
來自無急性或慢性毒性存在之動物疼痛模型之資料表明α-芋螺毒素肽為藥物開發提供有前景之引導。支持此結論的是，來自維多利亞芋螺(Conus victoriae)之相關肽(Vc1.1)已進行至第2期臨床試驗才發現其對於人類α9α10 nAChR之效用顯著低於對大鼠α9α10 nAChR(Livett等人，2006)。同樣地，對RgIA之研究已證實此肽對人類受體之效用比對大鼠受體之效用小約170倍(Azam等人，2012)。藉由使用定點突變誘發，已識別出α9子單元中之單一殘基(Thr/Ile 56)為導致大鼠α9α10及人類α9α10與RgIA之間大部分相互作用差異的原因(圖1A)。將人類α9從Ile56改變為大鼠體內發現之Thr導致對人類受體之RgIA效能增大2之對數(圖1B)。
使用受體-配體動力學以及RgIA之核磁共振(nuclear magnetic resonance；NMR)結構的知識，設計出對人類受體及對大鼠受體大致等效的RgIA之結構類似物。識別出RgIA中提高人類α9α10結合的四個突變。精胺酸(Arg或R)9至瓜胺酸或ω-硝基-Arg的單一取代，及酪胺酸(Tyr或Y)10至單碘-Tyr(後者為SEQ ID NO：21)的單一取代各對大鼠受體導致小效能提高，但對人類受體導致4倍至8倍之效能提高。絲胺 酸(Ser或S)4改變為Thr，或Arg11改變為麩醯胺酸(Gln或Q)各自亦導致對人類受體之3倍至4倍效能提高。在單個肽(類似物2；SEQ ID NO：19)中組合此等四個改變導致IC50約為8nM時對人類受體之效能提高>100倍(表2)。
類似物2之進一步最佳化顯示可藉由進一步向肽末端添加兩個Arg殘基(類似物4；SEQ ID NO：4)及/或藉由將Arg13修飾為Tyr(類似物3；SEQ ID NO：3)實現對人類受體的效能提高。除此等取代之外，半胱胺酸(Cys或C)殘基(Cys2及Cys3)中之兩者亦修飾為硒代半胱胺酸以提高肽之穩定性及再摺疊效率(SEQ ID NO：20)。雙重硒代半胱胺酸突變體對人類受體之效能相對於未修飾之RgIA顯示出10倍提高。RgIA之上述改變單獨或組合用於構造對人類通道具有提高效能之類似物，解決先前臨床候選物Vc1.1的關鍵開發問題。
在多個實施例中，本文所揭示之芋螺毒素肽類似物具有式GX6X7X3DPRX8X1X2X4X9X5(SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：37)，其中X1為Arg、瓜胺酸或ω-硝基-Arg；X2為Tyr或單碘-Tyr；X3為Ser或Thr；X4為Arg、Gln或Glu；X5為Arg、Tyr、苯丙胺酸(Phe或F)、色胺酸(Trp或W)、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg-Tyr或Tyr-Arg-Arg；X6為Cys或硒代半胱胺酸；X7為Cys或硒代半胱胺酸；X8為Cys或硒代半胱胺酸；且X9為Cys或硒代半胱胺酸。在一個實施例中，X1為Arg。在一個實施例中，X1為瓜胺酸。在一個實施例中，X1為ω-硝基-Arg。在一個實施例中，X3為Ser。在一個實施例中，X3為Thr。在一個實施例中，X4為Arg。在一個實施例中，X4為Gln。在一個實施例中，X4為Glu。在一個實施例中，X5為Arg。在一個實施例中，X5為Tyr。在一個實施例中，X5為Phe。在一個實施例中，X5為Trp。在一個實施例中，X5為Tyr-Tyr。在一個實施例中，X5為Tyr-Arg。在一個實施例中，X5為Arg-Arg-Arg。在一個實 施例中，X5為Arg-Arg-Tyr。在一個實施例中，X5為Tyr-Arg-Arg。在一個實施例中，X6為Cys。在一個實施例中，X6為硒代半胱胺酸。在一個實施例中，X7為Cys。在一個實施例中，X7為硒代半胱胺酸。在一個實施例中，X8為Cys。在一個實施例中，X8為硒代半胱胺酸。在一個實施例中，X9為Cys。在一個實施例中，X9為硒代半胱胺酸。
在多個實施例中，本文所揭示之芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCX3(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23至SEQ ID NO：29)，其中X1為Arg或瓜胺酸；X2為單碘-Tyr；且X3為Tyr、Phe、Trp、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg-Tyr或Tyr-Arg-Arg。在一個實施例中，X1為Arg。在另一實施例中，X1為瓜胺酸。在一個實施例中，X3為Tyr。在另一實施例中，X3為Phe。在另一實施例中，X3為Trp。在另一實施例中，X3為Tyr-Tyr。在另一實施例中，X3為Tyr-Arg。在另一實施例中，X3為Arg-Arg-Arg。在另一實施例中，X3為Arg-Arg-Tyr。在另一實施例中，X3為Tyr-Arg-Arg。
在一個實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCY(SEQ ID NO：3；本文中亦稱為類似物3)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在另一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRR(SEQ ID NO：4；本文中亦稱為類似物4)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在額外實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYRR(SEQ ID NO：5；本文中亦稱為類似物5)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在又一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCRRY(SEQ ID NO：6；本文中亦稱為類似物6)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在另一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCF(SEQ ID NO：7；本文中亦稱為類似物7)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在額外實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCW(SEQ ID NO：8；本文中亦稱為類似物8)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在又一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYY(SEQ ID NO：9；本文中亦稱為類似物9)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。在又一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCX1X2QCYR(SEQ ID NO：10；本文中亦稱為類似物10)，其中X1為瓜胺酸且X2為單碘-Tyr。
在一個實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCY(SEQ ID NO：11；本文中亦稱為類似物11)，其中X2為單碘-Tyr。在另一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCRRR(SEQ ID NO：12；本文中亦稱為類似物12)，其中X2為單碘-Tyr。在額外實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCYRR(SEQ ID NO：13；本文中亦稱為類似物13)，其中X2為單碘-Tyr。在又一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCRRY(SEQ ID NO：14；本文中亦稱為類似物14)，其中X2為單碘-Tyr。在另一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCF(SEQ ID NO：15；本文中亦稱為類似物15)，其中X2為單碘-Tyr。在額外實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCW(SEQ ID NO：16；本文中亦稱為類似物16)，其中X2為單碘-Tyr。在又一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCYY(SEQ ID NO：17；本文中亦稱為類似物17)，其中X2為單碘-Tyr。在另一實施例中，芋螺毒素肽類似物具有式GCCTDPRCRX2QCYR(SEQ ID NO：18；本文中亦稱為類似物18)，其中X2為單碘-Tyr。
本文所揭示之芋螺毒素肽類似物的「變異體」包括相較於本文所揭示之芋螺毒素肽類似物具有一或多個胺基酸添加、胺基酸缺失、胺基酸終止位置或胺基酸取代的肽。
胺基酸取代可為保守取代或非保守取代。本文所揭示之芋螺毒 素肽類似物之變異體可包括具有一或多個保守胺基酸取代之彼等變異體。如本文所使用，「保守取代」涉及以下保守取代群組中之一者中出現之取代：第1組：丙胺酸(Ala或A)、甘胺酸(Gly或G)、Ser、Thr；第2組：天冬胺酸(Asp或D)、Glu；第3組：天冬醯胺酸(Asn或N)、麩醯胺酸(Gln或Q)；第4組：Arg、離胺酸(Lys或K)、組胺酸(His或H)；第5組：Ile、白胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、纈胺酸(Val或V)；及第6組：Phe、Tyr、Trp。
此外，胺基酸可按相似之功能、化學結構或組成(例如酸性、鹼性、脂族、芳族、含硫)分組成保守取代組。舉例而言，脂族組可包括(出於取代目的)Gly、Ala、Val、Leu及Ile。彼此視為保守取代的含有胺基酸之其他群組包括：含硫：Met及Cys；酸性：Asp、Glu、Asn及Gln；小分子脂族非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；極性帶負電殘基及其醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；極性帶正電殘基：His、Arg及Lys；大分子脂族非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及大分子芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。額外資訊發現於Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company中。
本文所揭示或所提及之芋螺毒素肽類似物序列之變異體亦包括相對於本文所揭示或所提及之肽序列具有至少70%之序列一致性、至少80%之序列一致性、至少85%之序列、至少90%之序列一致性、至少95%之序列一致性、至少96%之序列一致性、至少97%之序列一致性、至少98%之序列一致性或至少99%之序列一致性的序列。更特定而言，本文所揭示之芋螺毒素肽類似物之變異體包括以下肽，該等肽具有：與SEQ ID NO：1-37中之任一者的70%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的80%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的81%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的82%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的83%之序列一 致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的84%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的85%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的86%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的87%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的88%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的89%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的90%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的91%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的92%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的93%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的94%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的95%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的96%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的97%之序列一致性；與SEQ ID NO：1-37中之任一者的98%之序列一致性；或與SEQ ID NO：1-37中之任一者的99%之序列一致性。
「序列一致性百分比」係指藉由比較序列判斷之兩個或兩個以上序列之間的關係。此項技術中，「一致性」亦意指藉由該等序列串之間的匹配判斷的肽序列之間的序列相關程度。「一致性」(通常稱為「相似性」)容易藉由已知方法計算出，該等方法包括描述於以下文獻之彼等方法：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編，)Oxford University Press,NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編，)Academic Press,NY(1994)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，)Humana Press,NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(Von Heijne,G.編，)Academic Press(1987)；及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.及Devereux,J.編，)Oxford University Press,NY(1992)。判斷序列一致性之較佳方法經設計以提供測試序列之間的最佳匹配。判斷序列一致性及相似性之方法被整理至公開可得 之電腦程式中。序列比對及一致性百分比計算可使用LASERGENE生物資訊計算套件(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)之Megalign程式進行。序列之多重比對亦可使用Clustal比對方法(Higgins及Sharp CABIOS，5，151-153(1989))及預設參數(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)進行。相關程式亦包括GCG程式套件(Wisconsin Package 9.0版，Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wisconsin)；BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))；DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,Wisconsin)；及併入Smith-Waterman演算法之FASTA程式(Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994)，會議日期1992,111-20，編輯：Suhai,Sandor，出版商：Plenum,New York,N.Y.)。在本發明之上下文中，應瞭解，在將序列分析軟體用於分析時，分析結果為基於所引用程式之「預設值」。本文所使用之「預設值」將意指任意值或參數組，該等值或參數在首次初始化時用軟體加載。
「D-取代之類似物」包括本文所揭示之芋螺毒素肽類似物，該芋螺毒素肽類似物中又一個L-胺基酸取代為D-胺基酸。D-胺基酸可與在類似物序列中發現之胺基酸為相同胺基酸類型，或可為不同之胺基酸。相應地，D-類似物亦為變異體。
「修飾物」包括本文所揭示之芋螺毒素肽類似物，其中一或多個胺基酸已置換為非胺基酸組份，或其中胺基酸已與官能基結合，或官能基以其他方式與胺基酸關聯。經修飾之胺基酸可為例如糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸、法呢基化(farnesylated)胺基酸、乙醯基化胺基酸、生物素標記胺基酸、與脂質部分結合之胺基酸或與有機衍生劑結合之胺基酸。以下各者中存在經修飾胺基酸之可有利：例如，(a)延長多肽血清半衰期及/或活體內功能性半衰期，(b)降低多肽抗原 性，(c)提高多肽儲存穩定性，(d)提高肽溶解度，(e)延長循環時間及/或(f)提高生物可用性，例如增大曲線下面積(AUCsc)。胺基酸可例如在重組製造期間經共轉譯修飾或轉譯後修飾(例如在哺乳動物細胞中表現期間在N-X-S/T基元處經N連接糖基化)，或藉由合成方式改質。經修飾之胺基酸可在序列內，或在序列末端。修飾物可包括本文其他部分所述之衍生物。
針對芋螺毒素肽之每一者，C-末端可為羧酸基或醯胺基，較佳為羧酸基。本發明亦係關於藉由以下進一步修飾之芋螺毒素肽類似物：(i)對C-末端進行添加，諸如Tyr、碘-Tyr、螢光標籤，或(ii)對N-末端進行添加，諸如Tyr、碘-Tyr、焦麩胺酸鹽或螢光標籤。
此外，熟習此項技術者已知用於改良穩定性的殘基或殘基之群組可添加至C-末端及/或N-末端。同樣，熟習此項技術者已知的用於改良口服可用性的殘基或殘基之群組可添加至C-末端及/或N-末端。
本發明進一步係針對所揭示之芋螺毒素肽類似物之衍生物。衍生物包括具有非環狀排列之芋螺毒素肽類似物，其中環狀排列保留天然芋螺毒素肽的天然橋接模式(Craik等人(2001)，例如環化芋螺毒素肽具有醯胺環化主鏈，使得芋螺毒素肽不具有游離N-末端或C-末端，其中芋螺毒素肽包括天然二硫鍵(美國專利第7,312,195號))。在一個實施例中，環化芋螺毒素肽包括線性芋螺毒素肽及肽連接子，其中線性芋螺毒素肽之N-末端及C-末端經由肽連接子連接以形成醯胺環化肽主鏈。在一些實施例中，肽連接子包括選自Gly、Ala及其組合之胺基酸。
各種環化方法可應用於本文所述之芋螺毒素肽類似物。使用丙胺酸橋容易環化本文所述之芋螺毒素肽類似物(Clark等人，2013；Clark等人，2012)。環化芋螺毒素肽類似物可改良其口服生物可用性且減少對蛋白水解之易感性，而不影響芋螺毒素肽類似物對其特定目 標之親和力。
本文所揭示之實施例包括本文所述之芋螺毒素肽類似物，以及本文所述之芋螺毒素肽類似物之變異體、D-取代之類似物、修飾物及衍生物。在一些實施例中，變異體、D-取代之類似物、修飾物及衍生物具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個序列添加、序列缺失、序列終止位置、取代、置換、結合、關聯或排列。在額外實施例中，Xaa位置可包括於芋螺毒素肽類似物之任何位置中，其中Xaa代表添加、缺失、終止位置、取代、置換、結合、關聯或排列。
本文所揭示之各芋螺毒素肽亦可包括任何位置處的添加、缺失、終止位置、取代、置換、結合、關聯或排列，該位置包括本文所揭示之芋螺毒素肽類似物序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。相應地，在特定實施例中，各芋螺毒素肽類似物中之各胺基酸位置可為Xaa位置，其中Xaa表示在特定位置處的胺基酸之添加、缺失、終止位置、取代、置換、結合、關聯或排列。在特定實施例中，各芋螺毒素肽類似物在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中之一或多者處具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個Xaa位置。
類似物可具有一個以上改變(添加、缺失、終止位置、取代、置換、結合、關聯或排列)且成為變異體、D-取代之類似物、修飾物及/或衍生物中之一或多者。亦即，包括一種類別的類似物、變異體、D-取代之類似物、修飾物及/或衍生物不排除包括其他類別，且在本文中全部統稱為「芋螺毒素肽」。
如所述，本文所揭示之芋螺毒素肽阻斷nAChR之α9α10亞型。阻 斷可藉由任何有效手段量測。在一個實施例中，阻斷經量測為由本文所揭示之芋螺毒素肽置換來自nAChR之α9α10亞型的經標記RgIA。在一個實施例中，阻斷可為由本文所揭示之芋螺毒素20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%置換來自nAChR之α9α10亞型的經標記RgIA。在第二實施例中，可藉由對本文所揭示之芋螺毒素肽進行生物分析來判定與RgIA之生物分析所得結果相比本文所揭示之芋螺毒素肽的治療活性，從而量測阻斷。在一個實施例中，如藉由生物分析所量測，本文所揭示之芋螺毒素肽的治療活性相較於RgIA高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一第三實施例中，可量測本文所揭示之芋螺毒素肽對nAChR之α9α10亞型的結合親和力，且與RgIA對nAChR之α9α10亞型的結合親和力相比較。在一個實施例中，阻斷可為本文所揭示之芋螺毒素肽的結合親和力較RgIA高20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一第四實施例中，藉由量測功能性分析(諸如電生理學分析、鈣成像分析及其類似分析)中的作用來分析本文所揭示之芋螺毒素肽對nAChR之α9α10亞型之功能的作用。在一個實施例中，阻斷包括藉由功能性分析所量測nAChR之α9α10亞型之功能相較於RgIA降低20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
芋螺毒素肽可使用重組DNA技術製備。芋螺毒素肽亦可使用 Merrifield固相合成製備，但亦可使用此項技術中已知的其他等效化學合成法。藉由將經保護之α-胺基酸偶合至適合樹脂而從芋螺毒素肽之C-末端開始固相合成。可藉由用酯鍵聯將α-胺基保護之胺基酸連接至氯甲基化樹脂或羥甲基樹脂，或用醯胺鍵將α-胺基保護之胺基酸連接至二苯甲胺(BHA)樹脂或對甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂來製備該起始物質。羥甲基樹脂之製備由Bodansky等人(1966)描述。氯甲基化樹脂可自Bio Rad Laboratories(Richmond,Calif.)及自Lab.Systems,Inc.處購得。該樹脂之製備由Stewart及Young(1969)描述。BHA樹脂及MBHA樹脂支撐物市場有售，且通常當正在合成之所需芋螺毒素肽在C-末端具有未經取代之醯胺時使用。因此，固體樹脂支撐物可為此項技術中已知的彼等固體樹脂支撐物中之任一者，諸如具有化學式-O-CH2-樹脂支撐物、-NH BHA樹脂支撐物或-NH-MBHA樹脂支撐物者。當需要未經取代之醯胺時，BHA樹脂或MBHA樹脂之使用可為有利的，因為裂解直接獲得醯胺。在需要N-甲基醯胺的情況下，N-甲基醯胺可由N-甲基BHA樹脂產生。若需要其他經取代之醯胺，則可使用美國專利第4,569,967號之教示；或若C-末端處需要除游離酸外的其他基團，則較佳可使用如Houben-Weyl text(1974)中所闡述之經典方法合成芋螺毒素肽。
當合成在C-末端具有游離酸之芋螺毒素肽時，適當時，可根據Horiki等人(1978)所述之程序，在約60℃下在攪拌下使用含KF之二甲基甲醯胺(DMF)持續24小時，首先將由Boc或Fmoc及側鏈保護基保護之C-端胺基酸偶合至氯甲基化樹脂。在BOC保護之胺基酸偶合至樹脂支撐物後，可藉由使用含三氟乙酸(TFA)之二氯甲烷或單獨之TFA移除α-胺基保護基。可在0℃至室溫之溫度下脫除保護基。如Schroder & Lubke(1965)所描述，可使用用於移除特定α-胺基保護基之其他標準裂解劑(諸如含HCl之二噁烷)及條件。
移除α-胺基保護基之後，剩餘α-胺基保護及側鏈保護之胺基酸可按所需順序逐步偶合以獲得中間化合物，或者在合成中各別地添加各胺基酸，其中一些胺基酸可在添加至固相反應器之前彼此偶合。適當偶合劑之選擇在此項技術之技術範圍內。例示性偶合劑包括N,N'-二環己基碳化二亞胺(存在HoBt或HoAt之情況下的DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU)。
用於肽(包括芋螺毒素肽)之固相合成中的活化劑為此項技術中所熟知的。適合活化劑之實例包括碳化二亞胺，諸如N,N'-二異丙基碳化二亞胺及N-乙基-N'-(3-二甲胺丙基)碳化二亞胺。其他活化劑及其在肽偶合中之用途由Schroder & Lubke(1965)及Kapoor(1970)描述。
各經保護之胺基酸或胺基酸序列可雙倍或雙倍以上過量引入固相反應器中，且偶合可在DMF：CH2Cl2(1：1)之介質中或在單獨DMF或CH2Cl2中進行。在發生中間偶合之情況下，在下一胺基酸偶合之前，可重複偶合程序隨後移除α-胺基保護基。如Kaiser等人(1970)所述，若手動進行，則可藉由寧海準反應(ninhydrin reaction)監測合成之各階段中偶合反應之成功。藉由使用諸如Rivier等人(1978)所報導之程式，可在如Beckman 990自動合成儀中自動進行偶合反應。
所需胺基酸序列完成後，可藉由使用諸如液態氟化氫或TFA(若使用Fmoc化學)之試劑處理自樹脂支撐物移除中間肽，該試劑不僅使肽自樹脂裂解，而且亦裂解所有剩餘之側鏈保護基，且若中間肽先前未經移除以獲得游離酸形式之肽，則在N-末端處裂解α-胺基保護基。若序列中存在Met，則在使用HF將肽從樹脂裂解以消除潛在S-烷基化作用之前，可首先使用TFA/乙二硫醇移除Boc保護基。在使用氟化氫或TFA進行裂解時，反應容器中可包括一或多種清除劑，諸如苯甲醚、甲酚、甲硫醚及甲基乙基硫醚。
與環化作為肽-樹脂之一部分的芋螺毒素肽相對，線性芋螺毒素 肽之環化可受影響，以在Cys殘基之間形成鍵。如此項技術中所熟知，為實現該二硫化物環化鍵聯，可藉由胺解作用自羥甲基化樹脂或氯甲基化樹脂支撐物裂解經充分保護之芋螺毒素肽，以產生經充分保護之醯胺中間物，其隨後經適當環化且脫除保護基。或者，可在0℃下用氫氟酸(HF)或TFA脫除保護基以及自上述樹脂或二苯甲胺(BHA)樹脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)裂解芋螺毒素肽，隨後如上文所述氧化。
芋螺毒素肽亦可使用自動合成儀合成。在此等實施例中，可從C-末端開始，使用Advanced Chemtech 357肽自動合成儀將胺基酸依序偶合至MBHA Rink樹脂(通常為100mg之樹脂)。使用含1,3-二異丙基碳化二亞胺之N-甲基吡咯啶酮(NMP)或藉由六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基
Figure 103119136-A0305-02-0018-59
(HBTU)及二乙基異丙基乙基胺(DIEA)進行偶合。可藉由使用哌啶於二甲基甲醯胺(DMF)中之20%溶液處理移除Fmoc保護基。隨後，使用DMF(兩次)，接著用甲醇及NMP洗滌樹脂。
II.使用方法 A.治療方法
本發明之芋螺毒素肽適用於治療與個體中菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10受體亞型相關的病況之方法中。該等方法包括向有此需要之個體投與治療有效量之所揭示之芋螺毒素肽或其醫藥學上可接受之鹽，其中該揭示之芋螺毒素肽阻斷nAChR之α9α10亞型。
已在本文中使用表現nAChR之不同亞型的卵母細胞的研究(Ellison等人，2006；Vincler等人，2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616；US 2012/0220539)中顯示某些α-芋螺毒素(包括RgIA及其類似物)阻斷nAChR之α9α10亞型的活性。α-芋螺毒素(包括RgIA)作為鎮痛劑及止痛劑的活性已展示於慢性壓迫性損傷的研究中(Vincler 等人，2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616)。α-芋螺毒素(包括RgIA)關於抑制免疫細胞之遷移的活性已展示於慢性壓迫性損傷的研究中(Vincler等人，2006；WO 2008/011006；US 2009/0203616)。
阻斷nAChR之α9α10亞型的芋螺毒素肽適用於治療疼痛、治療發炎及/或發炎病況以及適用於治療癌症。在某些實施例中，芋螺毒素肽之有效性係基於其抑制免疫細胞遷移之能力。在其他實施例中，化合物之有效性係基於其減緩脫髓鞘作用及/或增加完整神經纖維之數目的能力。
可治療之例示性疼痛類型包括一般疼痛、慢性疼痛、神經痛、傷害性疼痛及炎性疼痛。此外，此等疼痛類型可與以下原因相關及/或由以下原因引發，該等原因包括：周邊神經或疼痛感受器損傷、發炎病症、代謝失調、病毒感染、癌症、化學治療劑引發之疼痛、外科手術後引發之疼痛以及由燒傷或其他身體組織損傷引發之疼痛。
可治療之例示性發炎病況包括發炎、慢性發炎、風濕性發炎(包括關節炎、狼瘡、僵直性脊椎炎、纖維肌痛、肌腱炎、滑囊炎、硬皮病及痛風)、敗血症、纖維肌痛、發炎性腸病(包括潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease))、類肉瘤病、子宮內膜異位、子宮肌瘤、發炎性皮膚病(包括牛皮癬及傷口癒合不良)、肺發炎病況(包括哮喘及慢性阻塞性肺病)、與神經系統之發炎相關的疾病(包括帕金森氏病(Parkinson's Disease)及阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease))、牙周病及心血管疾病。
可治療之例示性癌症包括乳癌。α9-nAChR在人類乳房腫瘤組織中過度表現(Lee等人，2010(a))且siRNA或其他機制所致的受體抑制在活體外及活體內乳癌細胞致癌特性中減少，包括癌細胞增殖之抑制(Chen等人，2011)。在某些實施例中，RgIA類似物以治療量使用，以便藉由抑制α9-nAChR來抑制腫瘤生長。
本文所揭示之方法包括使用本文所揭示之芋螺毒素肽(包括其醫藥學上可接受之鹽及前藥)治療個體(人類、獸醫動物(犬、貓、爬行動物、鳥等)、家畜(馬、牛、山羊、豬、雞等)及研究用動物(猴子、大鼠、小鼠、魚等))。治療個體包括傳遞治療有效量的所揭示之芋螺毒素肽。治療有效量包括提供有效量、預防性治療及/或治療性治療的量。
「有效量」為導致個體內所需生理學變化所必需的芋螺毒素肽之量。有效量通常出於研究目的投與。在預期研究芋螺毒素肽於疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之治療中的有效性的研究分析中，本文所揭示之有效量導致所需之生理學變化。
「預防性治療」包括對未顯示疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之跡象或症狀，或僅顯示疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之早期跡象或症狀的個體投與的治療，使得投與治療以減弱、防止或減少疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症進一步發展之風險。因此，預防性治療起到對疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之預防性治療的作用。
「治療性治療」包括對顯示疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之症狀或跡象的個體投與的處理，且向個體投與該處理以減弱或消除疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之彼等跡象或症狀。治療性治療可減輕、控制或消除疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之存在或活性，及/或減輕、控制或消除疼痛、發炎病況、發炎及/或癌症之副作用。
治療化學療法引發之神經痛(CINP)的治療有效量可包括減少機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、熱(熱引發之)痛覺過敏、熱(冷引發之)異常疼痛、遷移免疫細胞之數目、發炎介體之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度的量。
治療燒傷引發之神經痛的治療有效量可包括減少機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、熱(熱引發之)痛覺過敏、熱(冷引發之)異常疼 痛、遷移免疫細胞之數目、發炎介體之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度的量。
治療術後神經痛的治療有效量可包括減少機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、熱(熱引發之)痛覺過敏、熱(冷引發之)異常疼痛、遷移免疫細胞之數目、發炎介體之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度的量。
治療發炎病症之治療有效量可包括減少發炎標記於基因表現之程度或蛋白質含量，及/或減少遷移免疫細胞之數目的量。此外，可藉由治療有效量治療與發炎病症相關之疼痛，此導致機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛、熱(熱引發之)痛覺過敏、熱(冷引發之)異常疼痛及/或個體報導之主觀疼痛程度減少。
治療諸如乳癌之癌症的治療有效量可包括減少腫瘤細胞之數目、減少轉移之數目、減少腫瘤體積、增加預期壽命、誘發癌細胞之細胞凋亡、誘發癌細胞死亡、誘發癌細胞之化療敏感性或輻射敏感性、抑制癌細胞附近之血管生成、抑制癌細胞增殖細胞、抑制腫瘤生長細胞、防止轉移、延長個體壽命、減輕癌症相關之疼痛及/或減少治療後個體之癌症復發或再次發生的量。
對於投與，治療有效量(本文中亦稱為劑量)最初可基於活體外分析及/或動物模型研究之結果估算。舉例而言，可在動物模型中調配劑量以實現包括IC50之循環濃度範圍，如在針對特定目標之細胞培養物中所判斷。該資訊可用於更精確判斷對相關個體的適用劑量。
向特定個體投與之作為治療有效量的實際量可由醫師、獸醫或研究人員考慮諸如以下之參數而判斷：身體因素及生理學因素，包括目標、體重、病況嚴重程度、疼痛類型、發炎病況類型或癌症類型、前期或同步治療性干預、個體之特發症以及投與途徑。
可適當調整劑量以達成所需之局部或全身芋螺毒素肽含量。典 型地，本發明之芋螺毒素肽在0.001mg/kg至250mg/kg芋螺毒素肽，較佳地在0.01mg/kg至100mg/kg芋螺毒素肽，更佳地在0.05mg/kg至75mg/kg芋螺毒素肽劑量範圍內顯示其作用。適合劑量可以每天多個子劑量投與。通常，劑量或子劑量可在每單位劑型中含有0.1mg至500mg芋螺毒素肽。更佳之劑量將含有每單位劑型中0.5mg至100mg芋螺毒素肽。
額外適用劑量通常可在0.1μg/kg至5μg/kg或0.5μg/kg至1μg/kg之範圍內。在其他實例中，劑量可包括1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg、35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg、50μg/kg、55μg/kg、60μg/kg、65μg/kg、70μg/kg、75μg/kg、80μg/kg、85μg/kg、90μg/kg、95μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、350μg/kg、400μg/kg、450μg/kg、500μg/kg、550μg/kg、600μg/kg、650μg/kg、700μg/kg、750μg/kg、800μg/kg、850μg/kg、900μg/kg、950μg/kg、1000μg/kg、0.1mg/kg至5mg/kg或0.5mg/kg至1mg/kg。在其他實例中，劑量可包括1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg或1000mg/kg以上。
在特定實施例中，劑量可以較低程度起始且增加直至達到所需效果。在個體在該等劑量下之反應不足的情況下，可在個體耐受性允許之程序內使用甚至較高之劑量(或藉由不同且更局部之傳度途徑的較高有效劑量)。預期例如24小時連續給藥或每天多次給藥達到芋螺 毒素肽的適當全身含量。
可藉由在治療方案之過程期間(例如每天、每兩天、每3天、每4天、每5天、每6天、每週、每兩週、每3週、每月、每2個月、每3個月、每4個月、每5個月、每6個月、每7個月、每8個月、每9個月、每10個月、每11個月或每年)投與單個或多個劑量達到治療有效量。
可使用多種投與途徑。所選特定模式可視所傳遞之特定芋螺毒素肽，所治療之疼痛、發炎病況或癌症的嚴重程度，以及提供治療有效量所要的劑量而定。可使用醫學上可接受之任何投與模式，意謂根據可靠之醫學判斷，提供治療有效量之芋螺毒素肽且不引起臨床上不可接受之副作用超過投與益處的任何方式。例示性投與途徑包括靜脈內投與、皮內投與、動脈內投與、腸內投與、鼻內投與、結節內投與、淋巴內投與、腹膜內投與、病灶內投與、前列腺內投與、陰道內投與、直腸內投與、局部投與、鞘內投與、瘤內投與、肌肉內投與、囊泡內投與、口服投與、皮下投與及/或舌下投與，且更特定地藉由靜脈內注射、皮內注射、動脈內注射、腸內注射、鼻內注射、結節內注射、淋巴內注射、腹膜內注射、病灶內注射、前列腺內注射、陰道內注射、直腸內注射、局部注射、鞘內注射、瘤內注射、肌肉內注射、囊泡內注射、口服注入、皮下注射及/或舌下注射。
在一個實施例中，芋螺毒素肽直接傳遞至中樞神經系統(CNS)，較佳傳遞至腦室、腦實質、鞘內空間或其他適合CNS位置。
或者，目標療法可用於藉由使用靶向系統(諸如抗體或細胞特異性配體)將芋螺毒素肽更特異性地傳遞至特定類型之細胞。
芋螺毒素肽亦可經在基於細胞之傳遞系統中投與，其中編碼芋螺毒素肽之DNA序列引入至經設計以植入個體體內的細胞中。在特定實施例中，此傳遞方法可用於脊髓區域。適合傳遞系統描述於美國專利第5,550,050號及公開之PCT申請案第WO 92/19195號、第WO 94/25503號、第WO 95/01203號、第WO 95/05452號、第WO 96/02286號、第WO 96/02646號、第WO 96/40871號、第WO 96/40959號及第WO 97/12635號中。
各芋螺毒素肽的適合DNA序列可基於所揭示之序列及已知遺傳編碼以合成方式製備。簡言之，術語「基因」係指編碼芋螺毒素肽之核酸序列。此定義包括多種序列多形現象、突變及/或序列變異體，其中該等改變不影響所編碼之芋螺毒素肽的功能。術語「基因」不僅可包括編碼序列，而且亦包括調節區(諸如啟動子、增強子)及終止區。該術語進一步可包括所有內含子及自mRNA轉錄剪接之其他DNA序列，以及因替代剪接位點所導致之變異體。編碼芋螺毒素肽之核酸序列可為引導芋螺毒素肽之表現的DNA或RNA。此等核酸序列可為經轉錄至RNA中之DNA股序列或轉譯成蛋白質之RNA序列。核酸序列同時包括全長核酸序列以及源自全長蛋白質之非全長序列。序列亦可包括可引入以在特定細胞類型中提供密碼子偏好的天然序列之簡併密碼子。本文所揭示之編碼芋螺毒素肽之基因序列可在可公開獲得之資料庫及出版物中獲得。
在一些實施例中，聚核苷酸包括質體、cDNA或mRNA，其可包括例如表現芋螺毒素肽之序列(例如基因)。適合質體包括可用於將基因轉移至細胞的標準質體載劑及微環質體。聚核苷酸(例如微環質體)可進一步包括任何額外序列資訊以促進遺傳物質(例如編碼芋螺毒素肽之序列)向細胞之轉移。舉例而言，聚核苷酸可包括啟動子，諸如一般啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子及/或對核或細胞質特異之啟動子。啟動子及質體(例如微環質體)通常為此項技術中所熟知的，且可使用習知技術製備。如本文進一步描述，聚核苷酸可用於轉染細胞。除非另作規定，否則術語轉染(transfect、transfected或transfecting)可用於指示細胞中外源聚核苷酸或由其表現之多肽的 存在。如此項技術中所已知，已知許多載劑能夠介導基因向細胞之轉移。
B.識別候選藥物之方法
本文所揭示之芋螺毒素肽亦適用於識別用以治療與nAChR之α9α10亞型相關之病況的候選藥物的方法中。此等方法包括根據候選藥物阻斷nAChR之α9α10亞型活性的能力篩選候選藥物。
「候選藥物」係指可阻斷或干擾目標(亦即α9α10亞型)之活性的任何肽、蛋白質(包括抗體或抗體片段)或化合物(小分子或其他)。小分子可屬於懷疑與蛋白質複合物相互作用且預期為醫藥學上可接受的任何化學類別。候選藥物可發現於自然界，由組合化學方法合成及/或經合理藥物設計形成。
可如本文其他處所述量測阻斷，但候選藥物可與本文所揭示之芋螺毒素肽而非RgIA對比或除RgIA之外與本文所揭示之芋螺毒素肽對比。芋螺毒素肽適用於識別模擬芋螺毒素肽之治療活性的候選藥物之方法中。該等方法包括以下步驟：(a)對候選藥物進行生物分析以判定其治療活性；及(b)將自候選藥物之生物分析所得結果與自本文所揭示之芋螺毒素肽的生物分析所得結果對比。
候選藥物亦可藉由與聚核苷酸(例如DNA及/或RNA)及/或酶相互作用來干擾α9α10亞型之活性。該等候選藥物可為已知或潛在DNA修飾劑，包括DNA損傷劑(例如干擾核酸結構之嵌入劑)、DNA彎曲劑、錯配結合蛋白及/或烷基化劑。
合理藥物設計的一個目標為識別候選藥物，該等候選藥物例如為芋螺毒素肽的更具活性或更穩定之形式，或例如提高或干擾活體內肽功能。用於合理藥物設計的若干方法包括三維結構分析、丙胺酸掃描、分子建模及抗id抗體之使用。該等技術可包括提供界定由芋螺毒素肽及nAChR之α9α10亞型形成之蛋白質複合物之三維結構的原子配 位，以及基於該等原子配位設計或選擇能夠干擾芋螺毒素肽與nAChR之α9α10亞型之間的相互作用的候選藥物。
模擬或改良芋螺毒素肽之作用的候選藥物設計為基於「前導」芋螺毒素肽開發藥物的已知方法。在特定芋螺毒素肽之合成為困難或昂貴的情況下，或在不適於特定投與方法(例如將純肽用作為口服組合物之活性劑可能具有挑戰性，因為純肽容易被消化道中之蛋白酶快速降解)的情況下，此方法可為合意的。模擬設計、合成及測試亦用於避免針對目標特性隨機篩選大量分子。
一旦選擇候選藥物用於進一步研究或開發，則可使用來自一定範圍來源之資料(例如光譜技術、X-射線繞射資料及NMR)，根據候選藥物之物理特性(例如立體化學、結合、大小及/或電荷)對候選藥物之結構建模。計算分析、相似度映射(其模擬候選藥物之電荷及/或體積，而非原子間的鍵結)及其他技術可用於此建模過程。
當選擇候選藥物時，可評估其他化學基團之連接。可選擇化學基團，以使候選藥物容易合成、可能藥理學上可接受且不在活體內降解，在一些實施例中，保留或提高前導芋螺毒素肽之生物活性。或者，在候選藥物基於肽之情況下，可藉由將肽環化實現較高穩定性，增加肽之剛性。連接有化學基團之候選藥物可經進一步篩選以確保候選藥物保留目標特性。隨後可進行進一步最佳化或修飾，以得到一或多個最終候選藥物用於活體內或臨床測試。
候選藥物之選擇及最佳化之後，所選擇及最佳化之候選藥物可製造及/或用於醫藥組合物中以向個體投與。
III.醫藥組合物
芋螺毒素肽可調配於醫藥組合物中。「醫藥組合物」意謂適用於醫學投與的物理離散相干單元。「單位劑型之醫藥組合物」意謂適用於醫學投與的物理離散相干單元，各單元含有治療有效量，或治療有 效量之倍數(高達四倍)或分數(低至四十分之一)的芋螺毒素肽與醫藥學上可接受之載劑。醫藥組合物是否含有每日劑量、或例如每日劑量之一半、三分之一或四分之一，將視該醫藥組合物分別是每天一次、例如兩次、三次或四次投與而定。
醫藥組合物中芋螺毒素肽之量及濃度以及醫藥組合物之量可基於臨床相關因素、醫藥組合物中芋螺毒素肽之溶解度、芋螺毒素肽之效能及活性以及醫藥組合物之投與方式而選擇。僅需使芋螺毒素肽構成治療有效量，亦即使得適合有效劑量將與單個或多個單位劑量所使用之劑型一致。
醫藥組合物通常將含有以全部組合物之重量計0.0001-99重量%，較佳為0.001-50重量%，更佳為0.01-10重量%芋螺毒素肽。除芋螺毒素肽之外，醫藥組合物亦可含有其他藥物或試劑。其他藥物或試劑之實例包括臨床醫學之所有主要領域中的鎮痛劑、細胞激素及治療劑。當與其他藥物或試劑一同使用時，芋螺毒素肽可以藥物混合劑之形式傳遞。混合劑為芋螺毒素肽中之任一者與另一藥物或試劑的混合物。在此實施例中，常見投與媒劑(例如丸劑、錠劑、植入物、泵、可注射溶液等)將含有芋螺毒素肽與其他藥物或試劑之組合。混合劑之個別組分可各自以治療有效量投與，或其投與的組合可產生治療有效量。
醫藥組合物包括醫藥學上可接受之載劑，該等載劑包括，對研究性治療、預防性治療及/或治療性治療不產生超過投與之益處的顯著負面反應、過敏性反應或其他不良反應的載劑。例示性醫藥學上可接受之載劑及配方揭示於Remington,2005中。此外，醫藥組合物可經製備以滿足具有生物標準的美國食品藥物管理(FDA)局(U.S.Food and Drug Administration(FDA)Office of Biological Standards)及/或其他相關外國管制機關所要求之無菌、發熱性及/或通用安全及純度標準。
通常，芋螺毒素肽將與一或多種針對所選投與模式選擇的醫藥學上可接受之載劑混合。傳遞方法之實例參見美國專利第5,844,077號。
通常使用之例示性醫藥學上可接受之載劑包括任何及所有膨化劑、填充劑、溶劑、共溶劑、分散介質、包衣、界面活化劑、抗氧化劑、防腐劑、等張劑、釋放劑、吸收延遲劑、鹽、穩定劑、緩衝劑、螯合劑、凝膠、黏合劑、崩解劑、濕潤劑、乳化劑、潤滑劑、著色劑、調味劑、甜味劑及芳香劑。
例示性緩衝劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑、酒石酸鹽緩衝劑、反丁烯二酸鹽緩衝劑、葡糖酸鹽緩衝劑、草酸鹽緩衝劑、乳酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑及三甲胺鹽。
例示性防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯化十八烷基二甲基苄基銨、苯紮鹵銨、氯化六甲銨、對羥基苯甲酸烷基酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。
例示性等張劑包括多羥糖醇、三羥基糖醇或較高級糖醇，諸如丙三醇、丁四醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
例示性穩定劑包括有機糖、多羥糖醇、聚乙二醇、含硫還原劑、胺基酸、低分子量多肽、蛋白質、免疫球蛋白、親水性聚合物及多醣。
例示性抗氧化劑包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、半胱胺酸鹽酸鹽、亞硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、油溶性抗氧化劑、棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基甲氧苯(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚、金屬螯合劑、檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸及磷酸。
例示性潤滑劑包括月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂。
例示性醫藥學上可接受之鹽包括用無機或有機酸及/或鹼形成的酸性及/或鹼性鹽，較佳為鹼性鹽。儘管醫藥學上可接受之鹽尤其在將芋螺毒素肽用作藥劑時為較佳的，但例如其他鹽在處理此等芋螺毒素肽時或在預期非藥劑類型用途的情況下具有效用。此等芋螺毒素肽之鹽可藉由此項技術中所公認之技術製備。
例示性醫藥學上可接受之鹽包括無機及有機加成鹽、諸如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、羥乙基磺酸鹽(isothionate)、茶鹼乙酸鹽及水楊酸鹽。亦可使用較低碳數烷基四級銨鹽。
對於口服投與，芋螺毒素肽可調配成固體或液體製劑，諸如膠囊、丸劑、錠劑、口含錠、熔融物(melt)、散劑、懸浮液或乳液。將組合物製備成口服劑型時，可採用一般醫藥學上可接受之載劑中的任一者，在口服固體製劑(諸如散劑、膠囊及錠劑)之情況下，諸如澱粉、糖、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、黏合劑、崩散劑及其類似物；或在口服液體製劑(諸如懸浮液、酏劑或溶液)之情況下，諸如水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑及其類似物的載劑。由於錠劑及膠囊容易投與，因此其可代表有利之口服單位劑型，該情況下，顯然採用固體醫藥載劑。若需要，則錠劑可藉由標準技術經糖衣包覆或經腸溶衣包覆。芋螺毒素肽可經囊封，以使其穩定地通過胃腸道，且同時，在某些實施例中，允許通過血腦屏障。參見例如WO 96/11698。
對於非經腸投與，芋螺毒素肽可溶解於醫藥學上可接受之載劑中且以溶液或懸浮液形式投與。例示性醫藥學上可接受之載劑包括水、鹽水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇或動物油、植物油或合成來 源之油。載劑亦可含有其他成分，例如防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩衝劑及其類似物。
芋螺毒素可為散劑形式，用於在傳遞時在適當醫藥學上可接受之載劑中復原。在另一實施例中，芋螺毒素之單位劑型在無菌、氣密封之安瓿或無菌注射器中可為芋螺毒素肽或其醫藥學上可接受之鹽在適合稀釋劑中之溶液。
芋螺毒素肽亦可調配為藥物儲槽製劑。藥物儲槽製劑可使用適合聚合材料或疏水性材料(例如作為可接受之油中的乳液)或離子交換樹脂調配而成，或調配為微溶衍生物(例如調配為微溶鹽)。
此外，芋螺毒素肽可利用含有至少一種化合物之固體聚合物的半透性基質調配成持續釋放系統。多種持續釋放材料已由一般技術者形成且為其所熟知。持續釋放系統可視其化學性質而定在投與後釋放芋螺毒素肽達數週至超過100天。
芋螺毒素肽之投與亦可使用泵(參見例如Luer等人，(1993)；Zimm等人，(1984)及Ettinger等人，(1978))、微膠囊化(參見例如美國專利第4,352,883號、第4,353,888號及第5,084,350號)、連續釋放聚合物植入物(參見例如美國專利第4,883,666號)及大型膠囊化(參見例如美國專利第5,284,761號、第5,158,881號、第4,976,859號及第4,968,733號，以及公開之PCT專利申請案WO92/19195、WO 95/05452)實現。
當芋螺毒素肽經鞘內投與時，其亦可溶解於腦脊髓液中。亦可使用移植至CNS的裸露或未未囊封細胞。參見例如美國專利第5,082,670號及第5,618,531號。
例示性實施例
1.一種芋螺毒素肽，其包括式SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37。
2.如實施例1之芋螺毒素肽，其包括式SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29。
3.如實施例1或2之芋螺毒素肽，其包括以下式：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21。
4.如實施例1至3中任一項之芋螺毒素肽，其中該芋螺毒素肽之C-末端為羧酸基。
5.如4之芋螺毒素肽，其中Tyr、碘-Tyr或螢光標籤添加至羧酸基。
6.如實施例1至5中任一項之芋螺毒素肽，其具有添加至芋螺毒素肽之N-末端的Tyr、碘-Tyr、焦麩胺酸鹽或螢光標籤。
7.如實施例1至6中任一項之芋螺毒素肽，其中該芋螺毒素肽包括醯胺環化主鏈。
8.一種醫藥組合物，其包括如實施例1至7中任一項的芋螺毒素肽或其鹽以及醫藥學上可接受之載劑。
9.一種為有需要之個體治療與菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型相關的至少一種病況的方法，該方法包括向個體投與治療有效量的如實施例1至7之芋螺毒素肽或如實施例8之醫藥組合物，從而治療該病況。
10.如實施例9之方法，其中該至少一種病況為疼痛。
11.如實施例10之方法，其中該疼痛為一般疼痛、慢性疼痛、神經痛、傷害性疼痛、炎性疼痛、與周邊神經或疼痛感受器損傷相關及 /或由其誘發之疼痛、與發炎病症相關及/或由其誘發之疼痛、與代謝失調相關及/由其誘發之疼痛、與病毒感染相關及/或由其誘發之疼痛、與癌症相關及/或由其誘發之疼痛、與化學治療劑相關及/或由其誘發之疼痛、與外科手術相關及/或其後誘發之疼痛及/或與燒傷及/或其他身體組織損傷相關及/或由其誘發之疼痛。
12.如實施例10中任一項之方法，其中該疼痛為化學療法誘發之神經痛。
13.如實施例10中任一項之方法，其中該疼痛為與燒傷或其他組織熱損傷相關之慢性疼痛及/或神經病變。
14.如實施例10之方法，其中該疼痛為手術或其他身體組織損傷後所誘發之疼痛及/或神經病變。
15.如實施例9之方法，其中至少一種病況為發炎病況。
16.如實施例15之方法，其中該發炎病況為發炎、慢性發炎、風濕性疾病、敗血症、纖維肌痛、發炎性腸病、類肉瘤病、子宮內膜異位、子宮肌瘤、發炎性皮膚病、肺發炎病況、與神經系統發炎相關之疾病、牙周病及/或心血管疾病。
17.如實施例16之方法，其中該風濕性疾病為以下中之一或多者：關節炎、狼瘡、僵直性脊椎炎、纖維肌痛、肌腱炎、滑囊炎、硬皮病或痛風。
18.如實施例16之方法，其中該發炎性腸病為潰瘍性結腸炎或克羅恩氏病。
19.如實施例16之方法，其中該發炎性皮膚病為牛皮癬或傷口癒合不良。
20.如實施例16之方法，其中該肺發炎病況為哮喘或慢性阻塞性肺病。
21.如實施例16之方法，其中該神經系統之發炎為帕金森氏病或 阿茲海默氏病。
22.如實施例9之方法，其中該至少一種病況為疼痛及發炎。
23.如實施例9及15至21中任一者之方法，其中該至少一種病況為發炎及神經病變。
24.如實施例15至20中任一者之方法，其中該發炎由免疫細胞介導。
25.如實施例9及15至21中任一者之方法，其中該至少一種病況為損傷後之長期發炎及周邊神經病變。
26.如實施例9之方法，其中該至少一種病況為癌症相關之慢性疼痛及神經病變。
27.如實施例9之方法，其中該至少一種病況為癌症。
28.如實施例27之方法，其中該癌症為乳癌。
29.如實施例10或11之方法，其中該疼痛為化學療法相關之慢性疼痛及/或化學療法相關之神經病變。
包括以下實例以示範特定實施例。一般技術者根據本發明應認識到可在不悖離本發明之精神及範疇的情況下對本文所揭示之特定實施例做出許多改變，且仍獲得相同或相似之結果。
實例
實例1. RgIA之臨床前最佳化。在活體外表徵研究及動物疼痛模型中評估前導芋螺毒素肽類似物，以選擇用於臨床前研發的前導芋螺毒素肽。
Figure 103119136-A0305-02-0033-1
Figure 103119136-A0305-02-0034-2
X2=瓜胺酸
X3=單碘-酪胺酸
X4=硒代半胱胺酸
Figure 103119136-A0305-02-0034-3
Sel=硒代半胱胺酸
IC50 hα9α10：對爪蟾卵母細胞中所表現之人類α9α10 nAChR的IC50(以nM為單位)。
表2中之IC50值使用具有C-末端COOH之類似物X-Y計算。
親本肽RgIA對於人類α9α10 nAChR之IC50為494nM(Azam等人，2012)。因此，此等芋螺毒素肽類似物對於人類α9α10 nAChR之效力 比親本肽高80-1100倍。
實例2. nAChR亞型特異性及效能分析. 測試芋螺毒素肽類似物對於非洲爪蟾卵母細胞中異源表現之選殖nAChR的功能活性。常規採用完成此舉之方法(McIntosh等人，2005)。卵母細胞系統具有之優勢為提供關於拮抗劑活性對於促效劑活性的即時資訊，且可藉由異位機制檢測芋螺毒素肽類似物之作用。對α9α10受體具有活性之化合物將針對α7及α1β1δε nAChR經反向篩選，該兩種亞型與α9α10最密切相關。經選擇以用於進一步研發之芋螺毒素肽類似物將展示出：對於α9α10受體之IC50
Figure 103119136-A0305-02-0035-60
100nM且Imax
Figure 103119136-A0305-02-0035-62
80%，且對於α9α10之選擇性相較於α7或α1β1δε
Figure 103119136-A0305-02-0035-63
200倍。不符合此等準則之芋螺毒素肽類似物將被丟棄，不作進一步評估，其餘類似物則將針對nAChR子單元之所有可表現之逐對及同源組合進行詳細測試，以判定其亞型特異性。將取得各亞型組合的劑量-反應曲線及動力學常數(包括締合及解離常數)。由於使用卵母細胞代表功能性分析，因此亦可分析芋螺毒素肽類似物之其他更細微特徵，諸如其對反轉電位之影響及電壓與其阻斷之相關性。
類似物2(SEQ ID NO：4)已證實可接受之效能及選擇性。此芋螺毒素肽類似物對α9α10 nAChR具有強力之拮抗劑活性(約8nM IC50，圖2)，而其對所有其他亞型之IC50均大於10μM(n=3-5)。因此，類似物2(SEQ ID NO：4)對α9α10 nAChR之IC50與對其他主要亞型之IC50相差1000倍，該等其他主要亞型包括肌肉nAChR(α1β1γδ)及神經元nAChR(α2β2、α2β4、α3β2、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β2、α6β4及α7)。
對其他受體亞型測試前導芋螺毒素肽類似物，該等受體亞型包括結構相關之5-HT3及GABAA受體。亦檢驗更通用之止痛相關目標，包括類鴉片、GABAB、蕈毒鹼及去甲腎上腺素運輸蛋白及受體。
實例3. 穩定表現α9α10n AChR之細胞株的產生. 先前已形成穩定 表現nAChR之各種亞型的細胞株。然而，尚未研發出穩定表現最近識別之α9α10亞型的細胞株。且不會天然表現nAChR的人類胎腎(HEK)細胞已成功用於表現許多nAChR亞型(Capelli等人，2011；Abdrakhmanova等人，2010；Xiao等人，2009；Kracun等人，2008；Xiao等人，1998)。此等細胞之優勢在於不會天然表現nAChR。使用HEK293細胞構建表現α9α10 nAChR之穩定純系。主要表現構築體含有由腦心肌炎病毒內部核糖體進入序列(IRES)分隔之α9及α10之編碼序列。觀測到RNA(紫苜蓿嵌紋病毒之RNA4之5'UTR(未轉譯區)-α9編碼序列-α9之部分3'UTR序列)及RNA(紫苜蓿嵌紋病毒之RNA4之5'UTR-α10編碼序列-α10之部分3'UTR序列)之混合物導致爪蟾卵母細胞在過渡性轉染後高度表現α9α10受體。此等兩個表現卡匣選殖至細胞巨大病毒啟動子下游之pIRES載體中，且可選擇標記置換為(綠色螢光蛋白(GFP)：勻黴素(zeocin)基因(Bennett等人，1998)，以允許藉由基於GFP螢光及基於勻黴素之選擇的純系識別。
使用諸如FuGENE® HD轉染試劑(Roche Applied Science)之試劑，用DNA自表現載劑轉染HEK293細胞。使用螢光活化細胞分選(FACS)識別GFP表現純系，且使用基於螢光顯微術之胞內鈣分析識別表現功能性α9α10受體之純系(Capelli等人，2011；Kracun等人，2008；Teichert等人，2012)。轉染四十八小時後，藉由FACS分離GFP表現細胞且將其接種至完全培養基中。接種二十四小時後，一部分細胞(約50,000個)重新接種至聚離胺酸塗覆之24孔板上，用於鈣成像研究。藉由將細胞暴露於鈣敏感之螢光染料螢光-4-乙醯氧基甲酯(Fura-2-AM，Invitrogen)進行鈣成像。Fura-2-AM進入細胞，且與鈣結合後激發光譜發生改變(Barreto-Chang及Dolmetsch，2009)。由於胞內鈣含量與α9α10受體表現成正比升高，因此此分析可識別高度表現之殖株。將使用用於Fura-2-AM的標準比例成像視訊顯微術。將監測促效劑及 拮抗劑對螢光發射之作用。未經轉染之細胞將用作陰性對照，且形成之α3β4 nAChR細胞株將用作陽性對照。穩定表現受體之純系將於選擇下生長且根據標準方法冷藏。最終細胞株將使用膜片箝制電生理技術進行分析，以確認所表現受體的藥理學及功能。
用於產生充分表現α9α10亞型之細胞株的替代系統包括：(1)將內源5'-UTR及內源3'-UTR從α9基因及α10基因選殖至雙向載劑pBi(Clontech)，以獲得：(5'α9UTR-α9編碼序列-3'α9UTR)-雙向啟動子-(5'α10UTR-α10編碼序列-3'α10UTR)，及如前所述將可選擇標記置換為GFP：勻黴素；及(2)將cDNA編碼α9α10與其內源UTR一起插入pTRE3G-hyg載體(四環素誘導雙向載體)，及將選擇標記置換為GFP：勻黴素，以產生用於表現之四環素誘導系統。對於替代性系統#2，HEK293 Tet-On®細胞(Clontech)經轉染，且基因表現將藉由向培養基添加多西環素(doxycycline)開始。
實例4.用於評定芋螺毒素肽效能的活體內疼痛模型。全皮層熱損傷模型：熱損傷之前使用含4%異氟醚之氧氣將史泊格多利大白鼠(Sprague Dawley rat)麻醉。使用配備有斜置烙鐵頭(RX-80HRT-5.4D)(Goot,Hiroshima,Japan)的溫控超焊台引發損傷。此程序導致全皮層熱損傷。使用蘇木素(hematoxylin)及曙紅(eosin)之皮膚組織學確認此損傷之深度及重複性。為防止感染，每天一次向後爪上受傷部位或未受傷部位施用磺胺嘧啶銀(1%)軟膏，直至受傷動物形成疤痕組織(損傷後7天)。為檢驗芋螺毒素肽對熱損傷誘發之疼痛的功效及效能，損傷後分析機械性異常疼痛及熱痛覺過敏持續高達21天。
脊髓神經結紮模型(SNL)：SNL涉及經由L5脊髓神經之結紮的部分傳入神經阻滯，使其他鄰近神經保持完整且允許對大鼠後爪進行行為測試。在受影響之神經退化期間，鄰近之未受損神經暴露於化學發炎介體之環境中，該環境與臨床中創傷性損傷中所見相似。SNL模型 為實驗性神經痛的廣泛接受模型，其在結紮之1至2天內可靠地產生熱痛覺過敏及機械性異常疼痛，具有低變異性且不存在運動協調缺陷(Kim等人，1992)。
使用含4%異氟醚之氧氣對史泊格多利大白鼠實施麻醉，且隨後使用經鼻錐傳遞的約2-2.5%之異氟烷進行維持。將大鼠毛髮剪除，且使用2%聚維酮碘及70%乙醇水溶液交互處理消毒手術部位。手術在解剖顯微鏡幫助下進行。在自動物之中線向外側0.8cm處製造約2cm之縱向切口。切口暴露脊椎旁肌肉，該脊椎旁肌肉與相鄰之結締組織一起自L5脊椎突之位準移至薦骨。L6橫突移動至極靠近脊椎，允許接入L4及L5脊神經。將6-0絲線置放於L5神經下方，且將該神經緊紮。對於假手術組動物，將線置放於L5神經下方，但移除且不結紮。無可見出血存在之情況下，傷口逐層閉合。使用3-0絲線縫合筋膜，且使用金屬創緣夾使皮膚閉合。中斷麻醉，且將動物送回其籠。給予兩劑0.05mg/kg丁基原啡因皮下注射；一劑緊隨手術之後，且一劑在術後8小時。此止痛法因手術之侵襲力而為必需的，且不影響隨後對芋螺毒素肽之鎮痛活性的量測。對術後具有明顯運動缺陷之動物實施安樂死且從行為研究中排除。
機械性異常疼痛測試：藉由使用電子von Frey觸覺量測儀(Pitcher等人，1999)識別產生機械性異常疼痛(其為正常情況下不導致疼痛之刺激所導致的疼痛)之受傷大鼠。該程序開始之前使大鼠適應測試室環境20分鐘。裝置向後爪之足底中部區域傳遞壓力持續15秒(增量為2g/s)。測試之上限臨限值為30公克。比較受傷大鼠自刺激移開爪子時的壓力(縮足臨限值)與受傷前大鼠移開爪子時的壓力(基線臨限值)。隨後評估芋螺毒素肽處理對於縮足臨限值之作用。經假手術操作且用媒劑處理之動物充當對照組。各時間點對每隻動物進行三次重複量測。
熱痛覺過敏測試：熱痛覺過敏為對痛性熱或冷的誇大反應，該誇大反應有時由損傷導致。測試動物對熱之反應以判斷使用芋螺毒素肽之處理是否緩解此痛覺過敏。如機械性異常疼痛測試一樣，動物在受傷前經測試形成基線反應。為判定熱縮足臨限值，使用足底測試(哈格里夫法(Hargreaves method))(Hargreaves等人，1988)。將動物置放在位於架高溫控玻璃板上的丙烯酸封閉區中。輻射熱源(可見光)聚焦在後爪之足底表面上，且當爪從熱源撤回時識別出熱臨限值。
免疫組織化學研究：對自每個測試組中之個體獲得之組織進行免疫組織化學分析以判定測試芋螺毒素肽是否影響痛感之分子介體的活化及/或表現。所獲得之組織包括脊髓之背角以及其他神經系統組分。針對p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、OX-42、c-Fos、抑鈣素基因相關肽(CGRP)、物質P、μ-型類鴉片受體、神經元核抗原及其他分子產生之抗體按需要用於此等分析。為獲得組織，使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠且隨後藉由使用4%三聚甲醛之放血-灌注使其安樂死。組織在4%三聚甲醛中後固定24小時且隨後儲存在30%蔗糖中直至切片。在低溫控制器上將組織以30μm直接冷凍切片至經處理載玻片上。使用PBS清洗載玻片且使用特定一級抗體培育，以標記相關分子。經螢光標記或生物素結合之二級抗體用作偵測試劑，且所得載玻片藉由螢光顯微鏡或亮視野顯微鏡目測。
嚙齒動物疼痛模型中藥物功效之類似物篩選：在初步篩選實驗中，使用每天33μg/kg之皮下劑量在SNL及FTB疼痛模型中評估類似物。此劑量與先前RgIA實驗之最大劑量的大約一半相一致，且預期產生最大血清濃度約為各類似物對α9α10受體之IC50。芋螺毒素肽或媒劑對照處理自損傷之日開始且持續21天。在第7天，第14天及第21天對動物進行評定。測試在即將劑量投與之前(最後一次劑量後24小時)及測試當天之劑量投與後30分鐘時進行。研究終點包括機械性縮 足臨限值及熱縮足臨限值、每日臨床觀測及每週之體重。此初始研究可用於選擇用於劑量-反應研究的兩種最有效類似物。
芋螺毒素肽對自脊髓釋放之促避害肽的作用：熱損傷及脊髓神經結紮引起脊髓之感覺背角中促發炎肽釋放增強，該促發炎肽包括CGRP及物質P(圖3)。若芋螺毒素肽對於熱損傷後之疼痛為有效止痛劑，則如減少之疼痛信號傳導所量測，在脊髓中應觀測到CGRP及物質P之表現相應減少。為測試此假設，大鼠經受右後爪之熱損傷，且其後24小時開始每天皮下投與芋螺毒素肽或媒劑。各組動物(n=5/組)於24小時、1週及2週時處死，且其組織藉由灌注固定而固定。將采出之組織冷凍且切片至載玻片上。在緩衝劑中沖洗載玻片，使用針對CGRP之一級抗體(1：10,000；Immunostar)或針對物質P之一級抗體(1：50,000；Immunostar)培育24小時，且使用適當二級抗體及鎳增強之二胺基聯苯胺顯色。
亦使用與此研究相同之大鼠評估RgIA處理對燒傷病理學及對傷口癒合的作用。收集固定之後爪且切片以用於H&E染色及螢光免疫組織化學，以便對比經RgIA處理之大鼠及經媒劑處理之大鼠。螢光免疫組織化學用以偵測神經纖維神經支配之變化、各種發炎介體之表現、瘢痕形成之分子決定因素、細胞增殖標記及基質重塑所涉及之蛋白質。
實例5.化學療法誘發之神經痛中的功效.
使用化學療法誘發之神經痛(CINP)之已建立活體內模型評估RgIA投與對於奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)(常用之鉑鹽化學治療劑)引起之周邊疼痛的作用。嚙齒動物中之OXA CINP為神經痛(NPP)之高度相關且廣泛使用的模型(Authier等人，2009)。長期使用OXA處理之大鼠產生周邊NPP，包括機械性痛覺過敏、機械性異常疼痛及熱異常疼痛(圖4A至圖4J)。在此模型中，RgIA之每日投與在第14天及第21天 具有顯著鎮痛作用(圖4A、圖4B、圖4E、圖4F及圖4I)。此等資料用作RgIA可預防化學療法誘發之周邊NPP之概念的證據。使用相同模型評估芋螺毒素肽之活體內鎮痛潛力。圖4C、圖4D、圖4G、圖4H及圖4J展示表明類似物3(亦稱為CSP-4；SEQ ID NO：3)在此預防性處理範例中的鎮痛作用之資料。
RgIA及芋螺毒素肽可在OXA CINP模型之預防性處理範例及治療性處理範例中測試。在兩種範例中，將經由劑量反應研究判斷最小有效劑量，研究中最少五分之三處理劑量經試驗。在額外研究中，芋螺毒素肽經測試且其功效與按低效劑量投與時的功效相比較。
在OXA誘發之CINP模型中，用2.4mg/kg之OXA處理雄性史泊格多利大白鼠(約250g)，每週連續腹膜內(i.p.)投與5天，持續3週(15次注射)。OXA溶解於5%葡萄糖水溶液中。自既定實驗之指定日期開始，每天將RgIA及芋螺毒素肽、陽性對照藥物或陰性對照媒劑肌肉內(i.m.)投與或皮下(s.c.)投與(Bennet,2003)。陽性對照藥物之實例包括加巴噴丁(gabapentin)/普瑞巴林(pregabalin)及嗎啡(morphine)。對於預防模式之處理，大鼠自OXA注射之前一天開始接收RgIA或芋螺毒素肽持續21天。對於治療性處理，藥物投與自NPP開始後開始，此對OXA CINP而言通常為14天。
機械性痛覺過敏藉由Randall-Selitto測試量測(Di Cesare,2012)。可使用von Frey測試及由如Chaplan等人，1994所述之上/下方法產生之機械性異常疼痛。冷異常疼痛使用如下所述之冷板測試量測。所有測試之量測在第0天(基線)、第7天、第14天及第21天進行，自治療後30分鐘及/或治療後24小時開始。
此外，在此等研究中自處理之動物採集血漿、背根節(DRG)及脊髓，以分析發炎介體之表現的變化。藉由RT-qPCR且在DRG及脊髓組織中藉由免疫組織化學法量測該等標記之基因表現程度。
用2.4mg/kg溶解於5%葡萄糖水溶液中之OXA(Sequoia Research Products,Pangbourne,UK)處理雄性史泊格多利大白鼠，每週連續腹膜內投與5天，持續3週(15次腹膜內注射)。在OXA投與之第一天開始，按三個劑量水準(0.89nmol/kg、2.67nmol/kg及8.0nmol/kg)將RgIA或CSP-4替代性地肌肉內注射入右側及左側外股肌。如圖4所指示，自處理後30分鐘及/或處理後24小時開始，在第0天、第7天、第14天及第21天進行量測。藉由Randall-Selitto測試量測機械性痛覺過敏。如本文所述使用von Frey測試量測機械性異常疼痛。使用冷板測試量測冷異常疼痛，其中冷板保持在4℃下且直至量測到第一個疼痛相關行為(包括舉起及/或舔舐與冷板接觸之爪子)的跡象。
機械性痛覺過敏. RgIA及CSP-4在所測試之三個劑量(0.89nmol kg-1、2.67nmol kg-1及8.0nmol kg-1)下顯著預防OXA誘發之痛覺過敏(圖4A至圖4D)。注射30分鐘後量測時，RgIA及CSP-4使疼痛臨限值急劇增大。24小時後療效仍顯著。普瑞巴林展示與0.89nmol kg-1(所測試之最低劑量)給藥之芋螺毒素肽相似之特徵曲線。
機械性異常疼痛. 機械性異常疼痛之Von Frey測試量測值報導且展示於圖4E至圖4H中。在第7天，OXA處理誘發之疼痛臨限值減少在2.67nmol kg-1及8.0nmol kg-1之RgIA及CSP-4投與30分鐘後恢復；24小時後未觀測到鎮痛作用。普瑞巴林展示相似作用。在第14天及第21天，RgIA及CSP-4(所有劑量)及普瑞巴林在注射30分鐘及24小時後均具活性，表明RgIA及CSP-4的長期鎮痛作用。
熱異常疼痛. 藉由冷板測試評估熱異常疼痛，且結果展示於圖4I及圖4J中。RgIA及CSP-4之重複投與(第7天為2.67nmol kg-1及8.0nmol kg-1，且第14天及第21天之所有劑量)能夠預防OXA誘發之冷異常疼痛。
實例6. 全皮層損傷(燒傷)疼痛模型中之功效.
燒傷涉及神經性組分及發炎性組分。大鼠中燒傷之活體內模型，諸如實例4中所述之模型(全皮層熱損傷模型；FTTI)已展示燒傷誘發之機械性異常疼痛及熱痛覺過敏。
已顯示，使用RgIA之急性處理有效減輕FTTI模型中之熱痛覺過敏及機械性異常疼痛。芋螺毒素肽相較於RgIA對人類α9α10 nAChR通道展示較高效能，評估芋螺毒素肽減輕燒傷誘發之疼痛的能力，如藉由以下一或多者之減輕來量測：機械性異常疼痛、熱痛覺過敏及/或發炎性標記之表現。
具有單側後爪FTTI之大鼠每天接收單次芋螺毒素肽注射，持續14天，或接受等劑量陰性對照鹽水注射。為研究劑量依賴性作用，測試至少3個劑量之芋螺毒素肽。藥物之注射可藉由包括皮下或肌肉內之途徑投與。
在第1天、第4天、第7天及第14天之損傷後/處理後時間段內量測類似物之鎮痛作用。如上文所述，機械性異常疼痛藉由von Frey方法量測，且熱痛覺過敏藉由Hargreaves方法量測。此外，在源自相同動物之血漿、爪組織、DRG及脊髓樣品中量測發炎性標記之含量。藉由qPCR量測之發炎介體包括物質P、CGRP、TGF-β、TNF-α、IL-6及IL-1β。DRG及脊髓中之選擇性標記藉由免疫組織化學法使用巨噬細胞標記特異性抗體及T細胞標記特異性抗體分析。
源自一個所進行之該研究的資料展示於圖5A及圖5B中。RgIA(圖5A)及類似物11(亦稱為CSP-7；SEQ ID NO：11)(圖5B)顯著減輕燒傷誘發之熱痛覺過敏，如藉由Hargraves方法以全部三個測試劑量(4mcg/Kg、20mcg/Kg及100mcg/Kg)所量測。
統計分析. 結果以平均值±S.E.M.之方式表示，且藉由ANOVA進行方差分析。將Dunnet之顯著差異程序用作事後比較(post-hoc comparison)。小於0.05或0.01之P值將視為顯著。
實例7. 術後神經痛模型中之功效.
手術後疼痛之爪子切口模型經設計以模擬手術後所經歷之疼痛。該模型涉及在一隻爪子的足底表面製造1cm之切口，以產生與患者所報導相似之疼痛及敏感性。如下所述，採取對機械敏感性及機械性痛覺過敏之手術前量測，以便為芋螺毒素肽對減輕機械性異常疼痛及痛覺過敏之功效的評估提供基線值。
大鼠每天接受單次芋螺毒素肽注射，持續7天，或等劑量之陰性對照鹽水注射或陽性對照嗎啡注射。芋螺毒素肽之劑量相關作用可藉由按多個劑量水準給藥而測試。注射可藉由包括皮下或肌肉內的途徑投與。
機械性異常疼痛藉由von Frey方法量測。量測在手術前(第3天及第0天)，術後約2小時(第0天)及術後第1、2、4、7天芋螺毒素肽給藥後約30分鐘進行。使用電子von Frey裝置(eVF,IITC Life Sciences©；Woodland Hills,CA)量測機械敏感性之值。動物置放在個別丙烯酸室中的金屬篩網表面上，且在測試前允許動物用最少15分鐘適應環境。刺激以與爪子之足底表面垂直的方式存在，且逐漸施加壓力。當注意到正面回應(爪子驟然縮回)或爪子舉離篩網表面時記錄爪子縮足臨限值。每個時間點每隻後爪量測三個eVF臨限值。取3個值之平均值作為彼時間點之爪子縮足臨限值。刺激經設計以量測反應臨限值，其為可免除的，且不對動物造成傷害。
機械性痛覺過敏藉由數位Randall-Selitto爪子壓力測試量測。量測於手術前(第3天)進行及術後第1、2、4及7天給藥後約2小時進行。測試前，允許動物用最少15分鐘適應測試室。動物置於將動物懸起的約束吊帶上，保持後肢可用於測試。藉由錐形尖端向後爪之足底表面施加刺激，且在約10秒內逐漸施加壓力。第一次觀測到疼痛反應行為(嘶叫、掙扎或縮足)時記錄爪子壓迫臨限值。每隻爪採取一次讀數， 且使用300公克之最大刺激截斷值，以防止傷害動物。刺激源經設計以量測反應臨限值，刺激源可經免除，且不對動物造成傷害。
除非另作指示，否則本發明之實踐採用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉基因生物學的習知技術，該等技術在此項技術範圍內。參見例如Maniatis等人，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1982)；Sambrook等人，Molecular Cloning，第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)；Sambrook及Russell,Molecular Cloning，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons，更新至2005)；Glover,DNA Cloning(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie及Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Harlow及Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1998)；Jakoby及Pastan,1979；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames及S.J.Higgins編1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames及S.J.Higgins編1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I卷-第IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell編，1986)；Riott,Essential Immunology，第6版(Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988)；Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)；Westerfield,M.,The zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)，第4版(Univ.of Oregon Press,Eugene,Oregon,2000)。
一般技術者應瞭解，本文所揭示之各實施例可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：該實施例的特定闡述元件、步驟、成分或組分。因此，術語「包括(include、including)」應理解成以下敍述：「包含、由...組成、或基本上由...組成」。如本文所使用，過渡術語「包含(comprise、comprises)」意謂包括但不限於，且允許包括以下各者：未指定之元件、步驟、成分或組分，即使大量時亦如此。過渡用語「由...組成」排除任何未指定之元件、步驟、成分或組分。過渡用語「基本上由...組成」將實施例之範圍限制為指定元件、步驟、成分或組分，以及不會顯著影響實施例者。如本文所使用，材料作用將導致文所揭示之芋螺毒素肽阻斷nAChR之α9/α10亞型的能力相較於RgIA統計學上顯著降低。
除非另有指示，否則說明書及申請專利範圍中所用之全部數字均理解為在所有情況下由術語「約」修飾。因此，除非指出為相反，否則在本說明書及隨附申請專利範圍中所闡述的數值參數為可視本發明設法獲得之所要特性而改變之近似值。至少且不試圖限制將等同原則應用於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效位的數值且藉由應用一般捨入技術解釋。當需要進一步明確時，術語「約」在與所述數值或範圍結合使用時具有由熟習此項技術者合理歸於其的含義，亦即指示比所述值或範圍略多或略少，在所述值的 ±20%；所述值的±19%；所述值的±18%；所述值的±17%；所述值的±16%；所述值的±15%；所述值的±14%；所述值的±13%；所述值的±12%；所述值的±11%；所述值的±10%；所述值的±9%；所述值的±8%；所述值的±7%；所述值的±6%；所述值的±5%；所述值的±4%；所述值的±3%；所述值的±2%；或所述值的±1%的範圍內。
儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但已儘可能精確地報導特定實例中所述之數值。然而，任何數值固有地含有由其各別測試量測中所發現之標準差必然產生的某些誤差。
除非本文中另外指示或上下文明顯矛盾，否則描述本發明之上下文中(尤其在隨附申請專利範圍之上下文中)所使用的術語「一」、「該」及類似指示物將解釋為涵蓋單數及複數。本文中值之範圍之敘述僅意欲作為個別提及屬於該範圍之每一各別值之速記法。除非本文中另作指示，否則每個個別值併入說明書中，如同該值在本文中個別陳述一樣。除非本文中另作指示或與上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法均可以任何適合次序執行。使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)僅意欲較佳地闡明本發明，且不對另外主張之本發明之範疇作出限制。本說明書中之任何語言均不應解釋為表示實施本發明所必需之任何非主張要素。
本文所揭示之本發明的替代性元件或實施例之分組不應解釋為限制。各群組成員可個別地或與群組之其他成員或其中發現之其他元素之任何組合形式提及且主張。預期一或多個群組成員可出於便利性及/或專利性原因而包括於群組中或自群組中刪除。當任何該包含或刪除發生時，認為說明書含有所修正之群組，因而實現隨附申請專利範圍中所使用的所有馬庫西群組(Markush group)之書面描述。
本文描述本發明之某些實施例，其包括發明者已知用於進行本發明之最佳方式。當然，閱讀前述描述後，此等所述之實施例之變化 對熟習此項技術者而言將顯而易知。發明者期望熟習此項技術者在適當時使用該等變化，且發明者預期不按本文所具體描述之方式實施本發明。因此，若適用法律允許，則本發明包括隨附於本文之申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修正及等效物。此外，除非本文另外指出或另外與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。
此外，本說明書全文大量引用公開案、專利及/或專利申請案(統稱為「參考文獻」)。引用之參考文獻中之每一者藉由對其特定敍述之教示的引用而個別併入本文中。
最後，應瞭解，本文所揭示之本發明的實施例對本發明之原理為說明性的。可使用之其他修正屬於本發明之範疇內。因此，例如但不限制，可根據本文中之教示使用本發明之替代組態。因此，本發明不限於展示及描述之確切內容。
本文所展示之細節為舉例方式，且僅出於說明性論述本發明之較佳實施例的目的，且為了提供咸信本發明之各種實施例之原理及概念態樣的最有用以及容易理解的描述而呈現。就此而言，不試圖展示比基本理解本發明所必須之細節更詳細的本發明之結構細節，結合圖式及/或實例所作之描述使熟習此項技術者顯而易知可如何具體實施本發明之若干形式。
除非實例中明確且毫無疑問地修正或當該含義之應用使任何構造無意義或實質上無意義時，本發明中所使用之定義及解釋意欲且預期控制任何未來構造。在術語之構造將導致其無意義或基本上無意義的情況下，定義應取自於Webster's Dictionary，第3版或熟習此項技術者已知之的字典，諸如Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(Anthony Smith編，Oxford University Press,Oxford,2004)。
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<223> 芋螺毒素肽類似物
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Tyr
<400> 28
Figure 103119136-A0305-02-0072-48
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg或瓜胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Arg
<400> 29
Figure 103119136-A0305-02-0073-50
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Tyr
<400> 30
Figure 103119136-A0305-02-0074-51
Figure 103119136-A0305-02-0075-4
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Phe
<400> 31
Figure 103119136-A0305-02-0076-52
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Trp
<400> 32
Figure 103119136-A0305-02-0078-53
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Tyr
<400> 33
Figure 103119136-A0305-02-0079-54
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Arg
<400> 34
Figure 103119136-A0305-02-0081-55
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Arg
<400> 35
Figure 103119136-A0305-02-0083-56
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Tyr
<400> 36
Figure 103119136-A0305-02-0085-57
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 芋螺毒素肽類似物
<220>
<221> VARIANT
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (3)..(3)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)..(4)
<223> Xaa為Ser或Thr
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Arg、瓜胺酸或[ω]-硝基-Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Tyr或單碘-Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa為Arg、Gln或Glu
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Cys或硒代半胱胺酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa為Tyr
<220>
<221> VARIANT
<222> (14)..(14)
<223> Xaa為Arg
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Arg
<400> 37
Figure 103119136-A0305-02-0087-58

Claims (19)

  1. 一種芋螺毒素肽，其包含式SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：37。
  2. 如請求項1之芋螺毒素肽，其包含式：SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：11。
  3. 如請求項1或2之芋螺毒素肽，其中該芋螺毒素肽之C-末端為羧酸基。
  4. 如請求項1或2之芋螺毒素肽，其中在該羧酸基上添加Tyr、碘-Tyr或螢光標記。
  5. 如請求項1或2之芋螺毒素肽，其具有添加至該芋螺毒素肽之該N-末端的Tyr、碘-Tyr、焦麩胺酸鹽或螢光標籤。
  6. 如請求項1或2之芋螺毒素肽，其包含醯胺環化主鏈。
  7. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之芋螺毒素肽或其鹽，及醫藥學上可接受之載劑。
  8. 一種如請求項1至6之芋螺毒素肽或如請求項7之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療與菸鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型相關之至少一種病況的藥物。
  9. 如請求項8之用途，其中該至少一種病況為疼痛。
  10. 如請求項9之用途，其中該疼痛為一般疼痛、慢性疼痛、神經痛、傷害性疼痛、炎性疼痛、周邊神經損傷誘發之疼痛、發炎 病症誘發之疼痛、代謝失調誘發之疼痛、癌症誘發之疼痛、化學療法誘發之疼痛、外科手術誘發之疼痛及/或燒傷誘發之疼痛。
  11. 如請求項9之用途，其中該疼痛為化學療法相關之慢性疼痛及/或化學療法相關之神經病變。
  12. 如請求項8之用途，其中該至少一種病況為發炎病況。
  13. 如請求項12之用途，其中該發炎病況為發炎、慢性發炎、風濕性疾病、敗血症、纖維肌痛、發炎性腸病、類肉瘤病、子宮內膜異位、子宮肌瘤、發炎性皮膚病、肺發炎病況及/或與神經系統發炎相關之疾病或牙周病或心血管疾病。
  14. 如請求項8之用途，其中該至少一種病況為疼痛及發炎。
  15. 如請求項8之用途，其中該至少一種病況為發炎及神經病變。
  16. 如請求項12、14或15中任一項之用途，其中該發炎病況及/或發炎係由免疫細胞介導。
  17. 如請求項16之用途，其中該發炎病況及/或發炎為損傷後之長期發炎及周邊神經病變。
  18. 如請求項8之用途，其中該至少一種病況為癌症。
  19. 如請求項18之用途，其中該癌症為乳癌。
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