KR20160019469A - 코노톡신 펩티드, 제약 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 α-코노톡신 펩티드 RgIA의 유사체 코노톡신 펩티드를 기재하고 있다. 이러한 유사체 코노톡신 펩티드는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형을 차단하고, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

코노톡신 펩티드, 제약 조성물 및 그의 용도 {CONOTOXIN PEPTIDES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2013년 5월 31일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/829,633 및 2013년 7월 5일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/843,135를 우선권 청구하며, 이들 둘 다의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

정부 지원에 대한 참고문헌

본 발명은 미국 국립 보건원 (메릴랜드주 베데스다)에 의해 수여된 계약 MH53631, GM48677 및 NS048158 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

코누스(Conus) 속 중 포식성 바다 달팽이는 신경약리학적으로 활성인 펩티드가 풍부한 독을 갖는다 (Armishaw et al., 2005; Wang et al., 2004; Livett, et al., 2004; Lewis, 2004; Terlau et al., 2004). 코누스에는 대략 500종이 있고, 현재까지 검사된 것들 중에서, 보존된 특징은 이들의 독 중에 α-코노톡신 펩티드가 존재한다는 것이다. α-코노톡신 펩티드는 C1-C3 및 C2-C4 디술피드 결합을 갖는 고도의 디술피드 가교 펩티드이다.

이들의 비-시스테인 잔기의 높은 서열 변동성 때문에, α-코노톡신은 매우 다양하고, 각각의 코누스 종은 α-코노톡신 펩티드의 독특한 보체를 갖는다. α-코노톡신 펩티드는 대형 전구체로서 합성되고, 성숙한 독소는 전구체의 C-말단을 향한 단백질분해적 절단에 의해 생성된다. 성숙한 독소의 가변적 시스테인-간 서열과 달리, 전구체 및 이를 코딩하는 유전자는 주어진 코누스 종에서의 α-코노톡신 펩티드 중에서 및 종마다 둘 다 상당히 보존되어 있다.

α-코노톡신 펩티드는 일반적으로 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR) 길항제인 것으로 나타났다 (Mcintosh, et al., 1999; Janes, 2005; Dutton et al., 2001; Arias et al., 2000). nAChR은 리간드 게이팅 이온 채널 슈퍼패밀리의 일부인 일군의 아세틸콜린 게이팅 이온 채널이다 (Karlin, 2002; Gotti et al., 2004). 이들은 중심 이온 전도성 채널을 둘러싸는 막횡단 서브유닛의 오량체이다. 다수의 다양한 서브유닛이 확인되었고, 대부분 2가지 주요 서브패밀리 (α 서브유닛 및 β 서브유닛)에 속한다. 서브유닛은 수용체 오량체로 다양한 조합으로 회합될 수 있으며, 이는 다양한 패밀리의 수용체 하위유형을 유도할 수 있다. 대부분의 하위유형은 α 및 β 서브유닛 패밀리 둘 다로부터의 서브유닛을 함유하고, 예를 들어, 인간 성인 근육 하위유형은 (δ 및 ε 서브유닛 이외에도) 2개의 α 서브유닛 및 β 서브유닛을 함유하고, α3β2 하위유형은 α3 및 β2 서브유닛으로 구성된다. 단지 α 서브유닛만으로 구성된 nAChR은 α7 및 α9 하위유형 (동종오량체) 및 α9α10 하위유형 (모두 α 이종오량체)이다. 계통발생학적 분석은 α7, α9 및 α10 서브유닛이 그들이 다른 nAChR 서브유닛에 대해서보다 서로 더욱 밀접하게 관련된다는 것을 보여준다 (Le Novere, et al., 2002; Sgard, et al., 2002).

α9 및 α10 nAChR 서브유닛은 다양한 조직에서 발현된다. 내이에서 α9α10 nAChR은 원심성 올리브와우 신경 및 와우 유모 세포 사이의 시냅스 전달을 매개한다 (Sgard, et al., 2002; Elgoyhen, et al., 1994; Elgoyhen, et al., 2001). α9 및 α10 서브유닛은 또한 후근 신경절 뉴런 (Harberger, et al., 2004; Lips, et al., 2002), 림프구 (Peng, et al., 2004), 피부 각질세포 (Arredondo, et al., 2002; Nguyen, et al., 2000; Kurzen, et al., 2004) 및 뇌하수체의 융기부 (Sgard, et al., 2002; Elgoyhen, et al., 1994; Elgoyhen, et al., 2001)에서 발견된다. 또한, α9 nAChR 서브유닛은 유방암에서 활성이다 (Lee, et al., 2010a; Lee, et al. 2010b; Linnoila, 2010). α-코노톡신 펩티드 RgIA (RgIA; GCCSDPRCRYRCR; 서열 1)는 α9α10 nAChR을 차단하는 것으로 나타났다 (Ellison, et al., 2006). RgIA의 특정 유사체는 또한 α9α10 nAChR을 차단하는 것으로 나타났다 (US 2009/0203616, US 2012/0220539 및 WO 2008/011006).

본 개시내용은 α-코노톡신 펩티드 RgIA의 유사체 (본원에서 유사체 코노톡신 펩티드)에 관한 것이다. 이러한 유사체 코노톡신 펩티드는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형을 차단하고, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 트레오닌 (Thr 또는 T)56/이소류신 (Ile 또는 I)이 RgIA에 의한 억제의 효력에 있어서 래트 대 인간 차이를 담당한다는 것을 보여준다. 래트 α9 서브유닛에서 Thr56의 Ile로의 돌연변이는 래트 수용체에 대한 RgIA 효력을 인간 수용체의 경우에 발견된 수준으로 감소시킨다 (도 1a). 인간 α9 수용체에서 Ile56의 Thr로의 대체는 인간 수용체에 대한 RgIA 효력을 래트에서 발견된 수준으로 상승시킨다 (도 1b). 값은 α9 및 α10 서브유닛 유전자로부터의 1:1 비의 cRNA를 주입한 적어도 3개의 난모세포로부터 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)이다.
도 2는 유사체 2 (표 1; 서열 4)가 α9α10 vs. α7 nAChR을 선택적으로 차단한다는 것을 보여준다. 유사체 2를 인간 α9α10 또는 인간 α7 nAChR을 발현하는 크세노푸스(Xenopus) 난모세포에 적용하였다. 10 nM에서의 유사체 2는 α9α10 nAChR의 ACh-유발 반응의 75 ± 2.8%를 차단하였다. 1000배 더 높은 농도 (10 μM 펩티드)가 α7 nAChR을 차단하는데는 실패하였다. (n=5). 대표적인 추적은 개별 난모세포로부터 나타낸다.
도 3은 신경 손상 후 물질 P 발현을 보여준다. 열 손상 24시간 및 1주 후에 척수 배각에서 물질 P의 증진된 발현의 현미경사진.
도 4a-4j는 화학요법 유발 신경병증성 통증에서 코노톡신 펩티드의 효능을 보여준다. RgIA의 매일 투여는 제14일 및 제21일에 유의한 진통제 효과를 가졌다 (도 4a, 4b, 4e, 4f 및 4i). 도 4c, 4d, 4g, 4h 및 4j는 이 예방적 치료 패러다임에서 CSP-4의 진통제 효과를 증명하는 데이터를 보여준다.
도 5a 및 5b는 RgIA (도 5a) 및 CSP-7 (도 5b)가 시험된 모든 3가지 용량 (4, 20 및 100 mcg/Kg)에서 하그리브스 방법에 의해 측정 시에 화상-유발된 열 통각과민을 유의하게 감소시켰음을 보여준다.

본 개시내용은 α-코노톡신 펩티드 RgIA의 유사체 (본원에서 유사체 코노톡신 펩티드), 뿐만 아니라 변이체, d-치환된 유사체, 그의 변형 및 유도체인 코노톡신 펩티드 (본원에서 집합적으로 "코노톡신 펩티드")에 관한 것이다. 이러한 코노톡신 펩티드는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형을 차단하고, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 코노톡신 펩티드는 또한 본원에 기재된 바와 같이 추가 약물 개발에 사용될 수 있다.

I. α-코노톡신 펩티드 RgIA의 유사체

급성 또는 만성 독성의 부재와 연결된 동물 통증 모델로부터의 데이터는 α-코노톡신 펩티드가 약물 개발에 유망한 선례를 제공한다는 것을 시사한다. 이 결론을 지지하기 위해, 코누스 빅토리아에(Conus victoriae) (Vc1.1)로부터의 관련 펩티드는 2기 임상 시험으로 진행되었고, 그 후에 이것은 래트에 비해 인간 α9α10 nAChR에 대해 상당히 덜 강력한 것으로 발견되었다 (Livett, et al., 2006). 마찬가지로 RgIA의 연구는 이 펩티드가 래트에 비해 인간 수용체에 대해 ~170배 덜 강력하다는 것을 확인하였다 (Azam et al., 2012). 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여, α9 서브유닛에 있는 단일 잔기 (Thr/Ile 56)가 래트 및 인간 α9α10 및 RgIA 사이의 상호작용에 있어서 대부분의 차이를 설명하는 것으로 확인되었다 (도 1a). 인간 α9의 Ile56을 래트에서 발견된 Thr로 변경하는 것은 인간 수용체에 대한 RgIA 효력에서 2 log 증가를 생성하였다 (도 1b).

수용체-리간드 동역학의 지식을 RgIA의 핵 자기 공명 (NMR) 구조와 함께 사용하여, 인간 및 래트 수용체에 대해 대략 동등효력인 RgIA의 구조적 유사체를 디자인하였다. 인간 α9α10 결합을 증진시킨 RgIA에서의 4가지 돌연변이가 확인되었다. 아르기닌 (Arg 또는 R)9에서 시트룰린 또는 ω-니트로-Arg로의 단일 치환, 및 티로신 (Tyr 또는 Y)10에서 모노-아이오도-Tyr (후자에 대하여 서열 21)로의 단일 치환 각각은 래트 수용체에 대한 효력을 약간 증가시키지만, 인간 수용체에 대한 효력은 4-8배 증가시켰다. 세린 (Ser 또는 S)4에서 Thr, 또는 Arg11에서 글루타민 (Gln 또는 Q)으로의 변경은 또한 인간 수용체에 대한 효력을 각각 3-4배 증가시켰다. 단일 펩티드 (유사체 2; 서열 19)에서 이들 4가지 변경을 함께 조합하는 것은 인간 수용체에 대한 효력을 IC50 ~8nM로 >100배 증가시켰다 (표 2).

유사체 2의 추가 최적화는 인간 수용체에 대한 개선된 효력이 펩티드의 말단에 2개의 Arg 잔기의 추가적 부가에 의해 (유사체 4; 서열 4) 및/또는 Arg13의 Tyr로의 변형에 의해 (유사체 3; 서열 3) 달성될 수 있다는 것을 입증하였다. 이들 치환 이외에도, 시스테인 (Cys 또는 C) 잔기 중 2개 (Cys2 및 Cys3)는 또한 셀레노시스테인으로 변형되어 펩티드 안정성 및 리폴딩 효율을 향상시켰다 (서열 20). 이중 셀레노시스테인 돌연변이체는 비변형 RgIA에 비해 인간 수용체에 대한 효력을 10배 증가시키는 것으로 입증되었다. RgIA에 대한 상기 변화는 단독으로 또는 조합으로 인간 채널에 대한 향상된 효력을 갖는 유사체를 구축하는데 사용되었으며, 이는 이전의 임상 후보 Vc1.1의 주요 개발 문제를 해결하였다.

다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GX6X7X3DPRX8X1X2X4X9X5 (서열 22)를 갖고, 여기서 X1은 Arg, 시트룰린, 또는 ω-니트로-Arg이고; X2는 Tyr 또는 모노-아이오도-Tyr이고; X3은 Ser 또는 Thr이고; X4는 Arg, Gln, 또는 Glu이고; X5는 Arg, Tyr, 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 트립토판 (Trp 또는 W), Tyr-Tyr, Tyr-Arg, Arg-Arg-Arg, Arg-Arg-Tyr, 또는 Tyr-Arg-Arg이고; X6은 Cys 또는 셀레노시스테인이고; X7은 Cys 또는 셀레노시스테인이고; X8은 Cys 또는 셀레노시스테인이고; X9는 Cys 또는 셀레노시스테인이다. 한 실시양태에서, X1은 Arg이다. 한 실시양태에서, X1은 시트룰린이다. 한 실시양태에서, X1은 ω-니트로-Arg이다. 한 실시양태에서, X3은 Ser이다. 한 실시양태에서, X3은 Thr이다. 한 실시양태에서, X4는 Arg이다. 한 실시양태에서, X4는 Gln이다. 한 실시양태에서, X4는 Glu이다. 한 실시양태에서, X5는 Arg이다. 한 실시양태에서, X5는 Tyr이다. 한 실시양태에서, X5는 Phe이다. 한 실시양태에서, X5는 Trp이다. 한 실시양태에서, X5는 Tyr-Tyr이다. 한 실시양태에서, X5는 Tyr-Arg이다. 한 실시양태에서, X5는 Arg-Arg-Arg이다. 한 실시양태에서, X5는 Arg-Arg-Tyr이다. 한 실시양태에서, X5는 Tyr-Arg-Arg이다. 한 실시양태에서, X6은 Cys이다. 한 실시양태에서, X6은 셀레노시스테인이다. 한 실시양태에서, X7은 Cys이다. 한 실시양태에서, X7은 셀레노시스테인이다. 한 실시양태에서, X8은 Cys이다. 한 실시양태에서, X8은 셀레노시스테인이다. 한 실시양태에서, X9는 Cys이다. 한 실시양태에서, X9는 셀레노시스테인이다.

다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCX3 (서열 2)을 갖고, 여기서 X1은 Arg 또는 시트룰린이고; X2는 모노-아이오도-Tyr이고; X3은 Tyr, Phe, Trp, Tyr-Tyr, Tyr-Arg, Arg-Arg-Arg, Arg-Arg-Tyr, 또는 Tyr-Arg-Arg이다. 한 실시양태에서, X1은 Arg이다. 또 다른 실시양태에서, X1은 시트룰린이다. 한 실시양태에서, X3은 Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Phe이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Trp이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Tyr-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Tyr-Arg이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Arg-Arg-Arg이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Arg-Arg-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, X3은 Tyr-Arg-Arg이다.

한 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCY (서열 3; 또한 본원에서 유사체 3으로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCRRR (서열 4; 또한 본원에서 유사체 4로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCYRR (서열 5; 또한 본원에서 유사체 5로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCRRY (서열 6; 또한 본원에서 유사체 6으로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCF (서열 7; 또한 본원에서 유사체 7로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCW (서열 8; 또한 본원에서 유사체 8로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCYY (서열 9; 또한 본원에서 유사체 9로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCX1X2QCYR (서열 10; 또한 본원에서 유사체 10으로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X1은 시트룰린이고, X2는 모노-아이오도-Tyr이다.

한 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCY (서열 11; 또한 본원에서 유사체 11로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCRRR (서열 12; 또한 본원에 유사체 12로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCYRR (서열 13; 또한 본원에서 유사체 13으로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCRRY (서열 14; 또한 본원에서 유사체 14로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCF (서열 15; 또한 본원에서 유사체 15로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCW (서열 16; 또한 본원에서 유사체 16으로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 추가 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCYY (서열 17; 또한 본원에서 유사체 17으로서도 언급됨)를 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다. 또 다른 실시양태에서, 유사체 코노톡신 펩티드는 서열식 GCCTDPRCRX2QCYR (서열 18; 또한 본원에서 유사체 18으로서도 언급됨)을 갖고, 여기서 X2는 모노-아이오도-Tyr이다.

본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드의 "변이체"는 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 부가, 결실, 정지 위치 또는 치환을 갖는 펩티드를 포함한다.

아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다. 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "보존적 치환"은 하기 보존적 치환 군 중 하나에서 발견된 치환을 포함한다: 군 1: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), Ser, Thr; 군 2: 아스파르트산 (Asp 또는 D), Glu; 군 3: 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 군 4: Arg, 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 군 5: Ile, 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 군 6: Phe, Tyr, Trp.

추가로, 아미노산은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성에 따라 보존적 치환 군 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황-함유 군)으로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹화는, 치환에 대해, Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile를 포함할 수 있다. 서로에 대한 보존적 치환으로 여겨지는 아미노산을 함유하는 다른 군은 황-함유: Met 및 Cys; 산성: Asp, Glu, Asn, 및 Gln; 소형 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, 및 Gly; 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, 및 Gln; 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, 및 Lys; 대형 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, 및 Cys; 및 대형 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp를 포함한다. 추가의 정보는 문헌 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 발견된다.

본원에 개시되거나 언급된 유사체 코노톡신 펩티드 서열의 변이체는 또한 본원에 개시되거나 언급된 펩티드 서열에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 보다 상세하게는, 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드의 변이체는, 서열 1 - 22 중 어느 하나와 70% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 80% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 81% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 82% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 83% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 84% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 85% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 86% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 87% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 88% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 89% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 90% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 91% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 92% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 93% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 94% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 95% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 96% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 97% 서열 동일성; 서열 1 - 22 중 어느 하나와 98% 서열 동일성; 또는 서열 1-22 중 어느 하나와 99% 서열 동일성을 공유하는 펩티드를 포함한다.

"% 서열 동일성"은 서열 비교에 따른 결정 시에 2개 이상의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 관련 기술분야에서, "동일성"은 또한 이러한 서열들의 가닥 간의 매치에 따른 결정 시에 펩티드 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. "동일성" (종종 "유사성"으로도 지칭됨)은 하기에 기재된 것을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 문헌 [Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)]. 서열 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열들 사이의 최고의 매치를 산출하도록 디자인된다. 서열 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 공공으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 편성되어 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 레이저진(LASERGENE) 생물정보학 컴퓨팅 모음 (드나스타, 인크.(DNASTAR Inc.), 위스콘신주 매디슨)의 메갈라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=10)를 갖는 군집 정렬법 (Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989))을 사용하여 수행될 수 있다. 관련 프로그램은 또한 프로그램의 GCG 모음 (위스콘신(Wisconsin) 패키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group) (GCG), 위스콘신주 매디슨); BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)); DNASTAR (드나스타, 인크., 위스콘신주 매디슨); 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 통합시킨 FASTA 프로그램 (Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.)을 포함한다. 본 개시내용의 문맥에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우에, 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"을 기초로 할 것임이 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 소프트웨어에 본래 탑재된 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.

"D-치환된 유사체"는 한번 더 L-아미노산을 D-아미노산으로 치환시킨 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드를 포함한다. D-아미노산은 유사체 서열에서 발견된 것과 동일한 아미노산 유형일 수 있거나, 또는 상이한 아미노산일 수 있다. 따라서, D-유사체는 또한 변이체이다.

"변형"은, 1개 이상의 아미노산이 비-아미노산 구성성분으로 대체되거나, 또는 아미노산이 관능기에 접합되거나, 또는 관능기가 아미노산과 다르게 회합된 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드를 포함한다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 글리코실화 아미노산, PEG화 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 비오티닐화 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 또는 유기 유도체화제에 접합된 아미노산일 수 있다. 변형된 아미노산의 존재는, 예를 들어, (a) 폴리펩티드 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기 증가, (b) 폴리펩티드 항원성 감소, (c) 폴리펩티드 저장 안정성 증가, (d) 펩티드 용해도 증가, (e) 순환 시간 연장, 및/또는 (f) 생체이용률 증가, 예를 들어 곡선하 면적 (AUC_sc) 증가에서 유리할 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합 생산 (예를 들어, 포유동물 세포에서 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 글리코실화) 동안 번역과 동시에 또는 번역 후에 변형되거나, 또는 합성 수단에 의해 변형될 수 있다. 변형된 아미노산은 서열 내 또는 서열의 말단에 있을 수 있다. 변형은 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 유도체를 포함할 수 있다.

C-말단은 카르복실산 또는 아미드 기, 바람직하게는 코노톡신 펩티드 각각에 대한 카르복실산 기일 수 있다. 본 개시내용은 또한 (i) C-말단에 이루어진 부가, 예컨대 Tyr, 아이오도-Tyr, 형광 태그, 또는 (ii) N-말단에 이루어진 부가, 예컨대 Tyr, 아이오도-Tyr, 피로글루타메이트 또는 형광 태그에 의해 추가로 변형된 유사체 코노톡신 펩티드에 관한 것이다.

또한, 안정성을 개선하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 잔기 또는 잔기의 군이 C-말단 및/또는 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 경구 유용성을 개선하기 위해 통상의 기술자에게 공지된 잔기 또는 잔기의 군이 C-말단 및/또는 N-말단에 부가될 수 있다.

본 개시내용은 추가로, 개시된 유사체 코노톡신 펩티드의 유도체에 관한 것이다. 유도체는 비-시클릭 순열을 갖는 유사체 코노톡신 펩티드를 포함하며, 여기서 시클릭 순열은 천연 코노톡신 펩티드의 천연 가교 패턴을 보유한다 (문헌 [Craik, et al. (2001)], 예를 들어, 코노톡신 펩티드가 유리 N- 또는 C-말단을 전혀 갖지 않도록 아미드 고리화 백본을 갖는 고리화 코노톡신 펩티드, 여기서 코노톡신 펩티드는 천연 디술피드 결합을 포함함 (미국 특허 번호 7,312,195)). 한 실시양태에서, 고리화 코노톡신 펩티드는 선형 코노톡신 펩티드 및 펩티드 링커를 포함하고, 여기서 선형 코노톡신 펩티드의 N- 및 C-말단은 펩티드 링커를 통해 연결되어 아미드 고리화 펩티드 백본을 형성한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 Gly, Ala, 및 그의 조합으로부터 선택된 아미노산을 포함한다.

다양한 고리화 방법이 본원에 기재된 유사체 코노톡신 펩티드에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 유사체 코노톡신 펩티드는 알라닌 가교를 사용하여 용이하게 고리화될 수 있다. (Clark, et al., 2013; Clark, et al., 2012). 고리화 유사체 코노톡신 펩티드는, 그의 특이적 표적에 대한 유사체 코노톡신 펩티드의 친화도에는 영향을 미치지 않으면서, 그의 경구 생체이용률을 개선하고 단백질분해에 대한 감수성을 감소시킬 수 있다.

본원에 개시된 실시양태는 본원에 기재된 유사체 코노톡신 펩티드, 뿐만 아니라 본원에 기재된 변이체, D-치환된 유사체, 변형 및 유사체 코노톡신 펩티드의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체, D-치환된 유사체, 변형 및 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 서열 부가, 결실, 정지 위치, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열을 갖는다. 추가 실시양태에서 Xaa 위치는 유사체 코노톡신 펩티드의 임의의 위치에 포함될 수 있으며, 여기서 Xaa는 부가, 결실, 정지 위치, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열을 나타낸다.

본원에 개시된 각 코노톡신 펩티드는 또한 본원에 개시된 유사체 코노톡신 펩티드 서열의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18을 비롯한 임의의 위치에서의 부가, 결실, 정지 위치, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열을 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 각 유사체 코노톡신 펩티드의 각 아미노산 위치는 Xaa 위치일 수 있으며, 여기서 Xaa는 특정한 위치에서의 아미노산의 부가, 결실, 정지 위치, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열을 나타낸다. 특정한 실시양태에서, 각 유사체 코노톡신 펩티드는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 중 하나 이상에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 Xaa 위치를 갖는다.

유사체는 하나 초과의 변화 (부가, 결실, 정지 위치, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열)를 갖고, 변이체, D-치환된 유사체, 변형 및/또는 유도체 중 하나 이상으로서 적합할 수 있다. 즉, 한 분류의 유사체, 변이체, D-치환된 유사체, 변형 및/또는 유도체의 포함은 다른 분류에서의 포함에 대해 독점적이지 않고, 이들 모두는 본원에서 "코노톡신 펩티드"로서 집합적으로 지칭된다.

언급된 바와 같이, 본원에 개시된 코노톡신 펩티드는 nAChR의 α9α10 하위유형을 차단한다. 차단은 임의의 효과적인 수단에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 차단은 nAChR의 α9α10 하위유형으로부터의 표지된 RgIA의, 본원에 개시된 코노톡신 펩티드에 의한 대체로서 측정된다. 한 실시양태에서, 차단은 nAChR의 α9α10 하위유형으로부터의 표지된 RgIA의, 본원에 개시된 코노톡신 펩티드에 의한 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 대체일 수 있다. 제2 실시양태에서, 차단은, 본원에 개시된 코노톡신 펩티드에 대한 생물학적 검정을 수행하여 그의 치료 활성을 결정함으로써, RgIA의 생물학적 검정으로부터 획득된 결과와 비교하여 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 차단은, 생물학적 검정에 의해 측정된 바와 같은 RgIA와 비교하는 경우에, 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 치료 활성이 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 더 커지게 할 수 있다. 제3 실시양태에서, nAChR의 α9α10 하위유형에 대한 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 결합 친화도를 측정하고, nAChR의 α9α10 하위유형에 대한 RgIA의 결합 친화도와 비교할 수 있다. 한 실시양태에서, 차단은, RgIA에 비해 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 결합 친화도가 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 더 커지게 할 수 있다. 제4 실시양태에서, nAChR의 α9α10 하위유형의 기능에 대한 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 효과는 기능적 검정, 예컨대 전기생리학적 검정, 칼슘 영상화 검정 등에서 효과를 측정함으로써 분석된다. 한 실시양태에서, 차단은, RgIA와 비교하는 경우에 기능적 검정에 의해 측정된 바와 같이, nAChR의 α9α10 하위유형의 기능에서 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소를 포함한다.

코노톡신 펩티드는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 코노톡신 펩티드는 또한 메리필드(Merrifield) 고체-상 합성을 사용하여 제조될 수 있지만, 관련 기술분야에 공지된 다른 동등한 화학적 합성이 또한 사용될 수 있다. 고체-상 합성은 보호된 α-아미노산을 적합한 수지에 커플링시킴으로써 코노톡신 펩티드의 C-말단으로부터 시작된다. 이러한 출발 물질은 α-아미노-보호된 아미노산을 에스테르 연결에 의해 클로로메틸화 수지 또는 히드록시메틸 수지에 부착시킴으로써, 또는 벤즈히드릴아민 (BHA) 수지 또는 파라-메틸벤즈히드릴아민 (MBHA) 수지에 대한 아미드 결합에 의해 제조될 수 있다. 히드록시메틸 수지의 제조는 문헌 [Bodansky et al. (1966)]에 기재되어 있다. 클로로메틸화 수지는 바이오 라드 래버러토리즈(Bio Rad Laboratories) (캘리포니아주 리치몬드)로부터 및 랩. 시스템스, 인크.(Lab. Systems, Inc.)로부터 상업적으로 입수가능하다. 이러한 수지의 제조는 문헌 [Stewart and Young (1969)]에 기재되어 있다. BHA 및 MBHA 수지 지지체는 상업적으로 입수가능하고, 일반적으로, 합성된 목적 코노톡신 펩티드가 C-말단에 비치환된 아미드를 갖는 경우에 사용된다. 따라서, 고체 수지 지지체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 것들, 예컨대 서열식 -O-CH2-수지 지지체, -NH BHA 수지 지지체, 또는 -NH-MBHA 수지 지지체를 갖는 것일 수 있다. 비치환된 아미드가 바람직한 경우에, BHA 또는 MBHA 수지의 사용은 절단이 아미드를 직접적으로 제공하기 때문에 유리할 수 있다. N-메틸 아미드가 바람직한 경우에, 이는 N-메틸 BHA 수지로부터 생성될 수 있다. 다른 치환된 아미드가 바람직한 경우에, 미국 특허 번호 4,569,967의 교시가 사용될 수 있거나 또는 C-말단에서 바람직한 것이 또한 유리 산 이외의 다른 기인 경우에, 문헌 [Houben-Weyl text (1974)]에 설명된 바와 같은 고전적 방법을 사용하여 코노톡신 펩티드를 합성하는 것이 바람직할 수 있다.

Boc 또는 Fmoc에 의해 및 측쇄 보호기에 의해 보호된 C-말단 아미노산은, 적절한 경우에, C-말단에 유리 산을 갖는 코노톡신 펩티드가 합성될 때 디메틸포름아미드 (DMF) 중 KF를 약 60℃에서 24시간 동안 교반하면서 사용하여 문헌 [Horiki et al. (1978)]에 설명된 절차에 따라 클로로메틸화 수지에 먼저 커플링될 수 있다. BOC-보호 아미노산을 수지 지지체에 커플링시킨 후에, 메틸렌 클로라이드 중 트리플루오로아세트산 (TFA) 또는 단독 TFA를 사용함으로써 α-아미노 보호기를 제거할 수 있다. 탈보호는 0℃ 내지 실온의 온도에서 수행될 수 있다. 특이적 α-아미노 보호기의 제거를 위한 다른 표준 절단 시약, 예컨대 디옥산 중 HCl, 및 조건은 문헌 [Schroder & Lubke (1965)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.

α-아미노-보호기의 제거 후에, 남아있는 α-아미노- 및 측쇄-보호된 아미노산을 바람직한 순서로 단계별로 커플링시켜 중간체 화합물을 수득할 수 있거나 또는 대안으로서 각 아미노산을 개별적으로 합성에 첨가할 수 있으며, 이들 중 일부는 고체 상 반응기에 첨가 전에 서로 커플링될 수 있다. 적절한 커플링 시약의 선택은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 예시적인 커플링 시약은 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (HoBt 또는 HoAt의 존재 하에 DCC, DIC, HBTU, HATU, TBTU)를 포함한다.

코노톡신 펩티드를 비롯한 펩티드의 고체 상 합성에 사용된 활성화 시약은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적합한 활성화 시약의 예는 카르보디이미드, 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 및 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 포함한다. 펩티드 커플링에서의 다른 활성화 시약 및 그의 용도는 문헌 [Schroder & Lubke (1965) 및 Kapoor (1970)]에 기재되어 있다.

각각의 보호된 아미노산 또는 아미노산 서열은 2배 이상 과량으로 고체-상 반응기에 도입될 수 있고, 커플링은 DMF:CH₂Cl₂ (1:1) 또는 단독 DMF 또는 CH₂Cl₂의 매질 중에서 수행될 수 있다. 중간체 커플링이 발생하는 경우에, α-아미노 보호기의 제거 전에 커플링 절차를 반복한 후에, 후속 아미노산을 커플링시킬 수 있다. 문헌 [Kaiser, et al. (1970)]에 기재된 바와 같이, 합성의 각 단계에서의 커플링 반응의 성공은, 수동으로 수행되는 경우에, 닌히드린 반응에 의해 모니터링될 수 있다. 커플링 반응은 프로그램, 예컨대 문헌 [Rivier, et al. (1978)]에 보고된 것을 사용하여 베크만(Beckman) 990 자동화 합성기에서와 같이 자동으로 수행될 수 있다.

목적하는 아미노산 서열이 완성된 후에, 중간체 펩티드는 시약, 예컨대 액체 플루오린화수소 또는 TFA (Fmoc 화학을 이용하는 경우)로의 처리에 의해 수지 지지체로부터 제거될 수 있으며, 이는 펩티드를 수지로부터 절단할 뿐만 아니라, 또한 N-말단에서 모든 남아있는 측쇄 보호기 및 또한 α-아미노 보호기를 이것이 유리 산 형태로 펩티드를 획득하기 위해 제거되지 않은 경우에 절단한다. Met이 서열에 존재하는 경우에, Boc 보호기를 TFA/에탄디티올을 사용하여 먼저 제거한 후에, 펩티드를 수지로부터 HF를 사용하여 절단함으로써 잠재적 S-알킬화를 제거할 수 있다. 절단을 위해 플루오린화수소 또는 TFA를 사용하는 경우에, 하나 이상의 스캐빈저, 예컨대 아니솔, 크레졸, 디메틸 술피드 및 메틸에틸 술피드가 반응 용기에 포함될 수 있다.

선형 코노톡신 펩티드의 고리화는, 펩티도-수지의 일부에 대한 코노톡신 펩티드의 고리화와는 대조적으로, Cys 잔기 사이에 결합을 생성하는데 영향을 줄 수 있다. 이러한 디술피드 고리화 연결을 달성하기 위해, 완전히 보호된 코노톡신 펩티드는, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 히드록시메틸화 수지 또는 클로로메틸화 수지 지지체로부터 가암모니아분해에 의해 절단되어, 완전 보호된 아미드 중간체를 수득할 수 있고, 그 후에 이를 적절하게 고리화 및 탈보호시킨다. 대안적으로, 상기 수지 또는 벤즈히드릴아민 (BHA) 수지 또는 메틸벤즈히드릴아민 (MBHA)으로부터의 코노톡신 펩티드의 탈보호 뿐만 아니라 절단은 0℃에서 플루오린화수소산 (HF) 또는 TFA를 사용하여 수행한 다음, 상기 기재된 바와 같은 산화를 수행할 수 있다.

코노톡신 펩티드는 또한 자동화 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 아미노산은 어드밴스드 켐테크(Advanced Chemtech) 357 자동 펩티드 합성기를 사용하여 C-말단에서 시작하는 MBHA 링크(Rink) 수지 (전형적으로 100 mg의 수지)에 순차적으로 커플링될 수 있다. 커플링은 N-메틸피롤리디논 (NMP) 중에서 1,3-디이소프로필카르보디이미드를 사용하여 또는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 디에틸이소프로필에틸아민 (DIEA)에 의해 수행된다. Fmoc 보호기는 디메틸포름아미드 (DMF) 중 피페리딘의 20% 용액으로의 처리에 의해 제거될 수 있다. 수지는 후속적으로 DMF (2회)에 이어서 메탄올 및 NMP로 세척된다.

II. 사용 방법

A. 치료 방법

본 개시내용의 코노톡신 펩티드는 대상체에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 수용체 하위유형과 연관된 상태를 치료하는 방법에 유용하다. 이러한 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 개시된 코노톡신 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개시된 코노톡신 펩티드는 nAChR의 α9α10 하위유형을 차단한다.

nAChR의 α9α10 하위유형을 차단하는데 있어서, RgIA 및 그의 유사체를 비롯한 특정 α-코노톡신의 활성은 본원에서 nAChR의 다양한 하위유형을 발현하는 난모세포를 사용하는 연구에서 제시되었다 (Ellison et al., 2006; Vincler et al., 2006; WO 2008/011006; US 2009/0203616; US 2012/0220539). 항침해수용제 및 진통제로서 RgIA를 비롯한 α-코노톡신의 활성은 만성 압박 손상의 연구에서 제시되었다 (Vincler, et al., 2006; WO 2008/011006; US 2009/0203616). 면역 세포의 이동을 억제하는데 있어서, RgIA를 비롯한 α-코노톡신의 활성은 만성 압박 손상의 연구에서 제시되었다 (Vincler, et al., 2006; WO 2008/011006; US 2009/0203616).

nAChR의 α9α10 하위유형을 차단하는 코노톡신 펩티드는 통증의 치료, 염증 및/또는 염증성 상태의 치료, 및 암의 치료에 유용하다. 특정 실시양태에서, 코노톡신 펩티드는 면역 세포의 이동을 억제하는 그의 능력에 기초하여 효과적이다. 다른 실시양태에서, 화합물은 탈수초화의 저속화 및/또는 무손상 신경 섬유의 수의 증가에 대한 그의 능력에 기초하여 효과적이다.

치료될 수 있는 통증의 예시적인 유형은 일반적 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 침해수용성 통증 및 염증성 통증을 포함한다. 또한, 이들 유형의 통증은, 말초 신경 또는 침해수용체 손상, 염증성 장애, 대사 장애, 바이러스 감염, 암, 화학요법제에 의해 유발된 통증, 외과적 절차 후에 유발된 통증, 및 화상 또는 다른 물리적 조직 손상에 의해 유발된 통증을 포함하는 원인과 연관되고/거나 이에 의해 유발될 수 있다.

치료될 수 있는 예시적인 염증성 상태는 염증, 만성 염증, 류마티스성 질환 (관절염, 루푸스, 강직성 척추염, 섬유근육통, 건염, 윤활낭염, 경피증 및 통풍 포함), 패혈증, 섬유근육통, 염증성 장 질환 (궤양성 결장염 및 크론병 포함), 사르코이드증, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 염증성 피부 질환 (건선 및 상처 치유 장애 포함), 폐의 염증성 상태 (천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환 포함), 신경계의 염증과 연관된 질환 (파킨슨병 및 알츠하이머병 포함), 치주 질환 및 심혈관 질환을 포함한다.

치료될 수 있는 예시적인 암은 유방암을 포함한다. α9-nAChR은 인간 유방 종양 조직에서 과다발현되고 (Lee et al., 2010(a)), siRNA 또는 다른 메카니즘에 의한 수용체 억제는 암 세포 증식의 억제를 포함하여, 유방암 세포의 시험관내 및 생체내 발암 특성을 감소시켰다 (Chen et al., 2011). 특정 실시양태에서, RgIA 유사체는 치료량으로 사용되어 α9-nAChR의 억제에 의해 종양 성장을 억제한다.

본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 코노톡신 펩티드 (그의 제약상 허용되는 염 및 전구약물 포함)를 사용하는 치료 대상체 (인간, 수의학적 동물 (개, 고양이, 파충류, 조류 등), 가축 (말, 소, 염소, 돼지, 닭 등), 및 연구용 동물 (원숭이, 래트, 마우스, 어류 등))를 포함한다. 대상체를 치료하는 것은 치료 유효량의 개시된 코노톡신 펩티드를 전달하는 것을 포함한다. 치료 유효량은 유효량, 예방적 치료 및/또는 치유적 치료를 제공하는 양을 포함한다.

"유효량"은 대상체에서 목적하는 생리적 변화를 생성하는데 필요한 코노톡신 펩티드의 양이다. 유효량은 종종 연구 목적을 위해 투여된다. 본원에 개시된 유효량은 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 치료에서 코노톡신 펩티드의 유효성을 연구하도록 의도되는 연구 검정에서 목적하는 생리적 변화를 생성한다.

"예방적 치료"는, 치료가 추가로 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 발병 위험을 축소, 예방 또는 감소시키는 목적을 위해 투여되도록 하는, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 징후 또는 증상을 나타내지 않거나 또는 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 단지 조기 징후 또는 증상을 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함한다. 따라서, 예방적 치료는 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암에 대한 방지적 치료로서 기능한다.

"치유적 치료"는 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 증상 또는 징후를 나타내는 대상체에게 투여되는 치료를 포함하고, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 그러한 징후 또는 증상을 축소 또는 제거하려는 목적을 위해 대상체에게 투여된다. 치유적 치료는 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 존재 또는 활성을 감소, 제어 또는 제거할 수 있고/거나, 통증, 염증성 상태, 염증 및/또는 암의 부작용을 감소, 제어 또는 제거할 수 있다.

화학요법-유발된 신경병증성 통증 (CINP)의 치료에서의 치료 유효량은 기계적 통각과민, 기계적 이질통, 열 (열-유발된) 통각과민, 열 (냉각-유발된) 이질통, 이동 면역 세포의 수, 염증 매개체의 수준, 및/또는 대상체-보고된 주관적 통증 수준을 감소시키는 양을 포함할 수 있다.

화상-유발된 신경병증성 통증의 치료에서의 치료 유효량은 기계적 통각과민, 기계적 이질통, 열 (열-유발된) 통각과민, 열 (냉각-유발된) 이질통, 이동 면역 세포의 수, 염증 매개체의 수준, 및/또는 대상체-보고된 주관적 통증 수준을 감소시키는 양을 포함할 수 있다.

수술후 신경병증성 통증의 치료에서의 치료 유효량은 기계적 통각과민, 기계적 이질통, 열 (열-유발된) 통각과민, 열 (냉각-유발된) 이질통, 이동 면역 세포의 수, 염증 매개체의 수준, 및/또는 대상체-보고된 주관적 통증 수준을 감소시키는 양을 포함할 수 있다.

염증성 장애의 치료에서의 치료 유효량은, 유전자 발현에서 염증 마커의 수준 또는 단백질 수준을 감소시키고/거나 이동 면역 세포의 수를 감소시키는 양을 포함할 수 있다. 또한, 염증성 장애와 연관된 통증은 기계적 통각과민, 기계적 이질통, 열 (열-유발된) 통각과민, 열 (냉각-유발된) 이질통, 및/또는 대상체-보고된 주관적 통증 수준을 감소시키는 치료 유효량에 의해 치료될 수 있다.

암, 예컨대 유방암의 치료에서의 치료 유효량은, 치료 후에 대상체에서 수많은 종양 세포를 감소시키고/거나, 전이의 수를 감소시키고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 기대 수명을 증가시키고/거나, 암 세포의 아폽토시스를 유발하고/거나, 암 세포 사멸을 유발하고/거나, 암 세포에서 화학- 또는 방사선감수성을 유발하고/거나, 암 세포 근처의 혈관신생을 억제하고/거나, 암 세포 증식 세포를 억제하고/거나, 종양 성장 세포를 억제하고/거나, 전이를 예방하고/거나, 대상체의 수명을 연장하고/거나, 암-연관 통증을 감소시키고/거나, 암의 재발 또는 재발생을 감소시키는 양을 포함할 수 있다.

투여를 위해, 치료 유효량 (또한 본원에서 용량으로도 언급됨)은 처음에 시험관내 검정 및/또는 동물 모델 연구로부터의 결과를 기초하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 특정한 표적에 대한 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제제화될 수 있다. 이러한 정보는 관심 대상체에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.

치료 유효량으로서 특정한 대상체에게 투여되는 실제량은 표적, 체중, 상태의 중증도, 통증의 유형, 염증성 상태 또는 암, 이전 또는 공동 치료적 개입, 대상체의 특발증 및 투여 경로를 비롯한 파라미터, 예컨대 물리적 및 생리학적 인자를 고려하여 의사, 수의사 또는 연구원에 의해 결정될 수 있다.

투여량은 목적하는 코노톡신 펩티드 수준까지 국부로 또는 전신적으로 적절하게 조정될 수 있다. 전형적으로 본 개시내용의 코노톡신 펩티드는 0.001 mg/kg 내지 250 mg/kg, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg의 코노톡신 펩티드, 보다 바람직하게는 0.05 mg/kg 내지 75 mg/kg의 투여량 범위에서 그의 효과를 나타낸다. 적합한 용량은 하루에 다수의 하위-용량으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 용량 또는 하위-용량은 단위 투여 형태 당 0.1 mg 내지 500 mg의 코노톡신 펩티드를 함유할 수 있다. 보다 바람직한 투여량은 단위 투여 형태 당 0.5 mg 내지 100 mg의 코노톡신 펩티드를 함유할 것이다.

추가의 유용한 용량은 종종 0.1 내지 5 μg/kg 또는 0.5 내지 1 μg /kg의 범위일 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 μg /kg, 5 μg /kg, 10 μg /kg, 15 μg /kg, 20 μg /kg, 25 μg /kg, 30 μg /kg, 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg, 50 μg/kg, 55 μg/kg, 60 μg/kg, 65 μg/kg, 70 μg/kg, 75 μg/kg, 80 μg/kg, 85 μg/kg, 90 μg/kg, 95 μg/kg, 100 μg/kg, 150 μg/kg, 200 μg/kg, 250 μg/kg, 350 μg/kg, 400 μg/kg, 450 μg/kg, 500 μg/kg, 550 μg/kg, 600 μg/kg, 650 μg/kg, 700 μg/kg, 750 μg/kg, 800 μg/kg, 850 μg/kg, 900 μg/kg, 950 μg/kg, 1000 μg/kg, 0.1 내지 5 mg/kg, 또는 0.5 내지 1 mg/kg을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용량은 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 또는 그 초과일 수 있다.

특정한 실시양태에서, 투여량은 보다 낮은 수준에서 개시하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 증가시킬 수 있다. 대상체에서의 반응이 이러한 용량으로 불충분한 경우에, 대상체 내성이 허용하는 한도까지 보다 높은 용량 (또는 상이한, 보다 국부적인 전달 경로에 의해 효과적인 보다 높은 용량)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 24시간에 걸친 연속 투여 또는 1일 당 다중 용량이 코노톡신 펩티드의 적절한 전신 수준을 달성하기 위해 예상된다.

치료 유효량은 치료 요법의 과정 동안 단일 또는 다중 용량을 투여함으로써 달성될 수 있다 (예를 들어, 매일, 격일, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 7개월마다, 8개월마다, 9개월마다, 10개월마다, 11개월마다, 또는 매년).

다양한 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정한 방식은 전달되는 특정한한 코노톡신 펩티드, 치료하려는 통증, 염증성 상태 또는 암의 중증도, 및 치료 유효량을 제공하는데 필요한 투여량에 의존적일 수 있다. 타당한 의학적 판단에 따라 투여의 이익을 능가하는 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 일으키지 않으면서 치료 유효량의 코노톡신 펩티드를 제공하는 임의의 방식을 의미하는, 의학적으로 허용가능한 임의의 투여 방식이 사용될 수 있다. 예시적인 투여 경로는 정맥내, 피내, 동맥내, 비경구내, 비강내, 결절내, 림프내, 복강내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척수강내, 종양내, 근육내, 방광내, 경구, 피하 및/또는 설하 투여, 및 보다 특히 정맥내, 피내, 동맥내, 비경구내, 비강내, 결절내, 림프내, 복강내, 병변내, 전립선내, 질내, 직장내, 국소, 척수강내, 종양내, 근육내, 방광내, 경구, 피하 및/또는 설하 주사를 포함한다.

한 실시양태에서, 코노톡신 펩티드는 중추 신경계 (CNS) 내로 직접적으로, 바람직하게는 뇌실, 뇌 실질, 척수강내 공간 또는 다른 적합한 CNS 위치에 전달된다.

대안적으로, 표적화 요법은 표적화 시스템, 예컨대 항체 또는 세포 특이적 리간드의 사용에 의해 코노톡신 펩티드를 보다 구체적으로 특정 유형의 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.

코노톡신 펩티드는 또한 세포 기반 전달 시스템으로 투여될 수 있고, 여기서 코노톡신 펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 대상체의 신체에서 이식을 위해 디자인된 세포 내에 도입된다. 특정한 실시양태에서, 이 전달 방법은 척수 영역에 사용될 수 있다. 적합한 전달 시스템은 미국 특허 번호 5,550,050 및 공개된 PCT 출원 번호 WO 92/19195, WO 94/25503, WO 95/01203, WO 95/05452, WO 96/02286, WO 96/02646, WO 96/40871, WO 96/40959, 및 WO 97/12635에 기재되어 있다.

적합한 DNA 서열은 개시된 서열 및 공지된 유전자 코드에 기초하여 각각 코노톡신 펩티드를 합성적으로 제조할 수 있다. 간략하게, 용어 "유전자"는 코노톡신 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이 정의는 다양한 서열 다형성, 돌연변이 및/또는 서열 변이체를 포함하며, 여기서 이러한 변경은 코딩된 코노톡신 펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는다. 용어 "유전자"는 코딩 서열 뿐만 아니라 조절 영역, 예컨대 프로모터, 인핸서 및 종결 영역을 포함할 수 있다. 상기 용어는 선택적 스플라이스 부위로부터 유래하는 변이체와 함께, mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 모든 인트론 및 다른 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 코노톡신 펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 코노톡신 펩티드의 발현을 지시하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 핵산 서열은 단백질로 번역되는 RNA 또는 RNA 서열로 전사되는 DNA 가닥 서열일 수 있다. 핵산 서열은 전장 단백질로부터 유래된 전장 핵산 서열 뿐만 아니라 비-전장 서열 둘 다를 포함한다. 서열은 또한 특정한 세포 유형에서 코돈 선호성을 제공하기 위해 도입될 수 있는 천연 서열 또는 서열들의 축중성 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 코노톡신 펩티드를 코딩하기 위한 유전자 서열은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 및 간행물에서 입수가능하다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 코노톡신 펩티드를 발현하기 위한 서열 (예를 들어, 유전자)을 포함할 수 있는 플라스미드, cDNA 또는 mRNA를 포함한다. 적합한 플라스미드는 유전자를 세포로 전달하는데 사용될 수 있는 표준 플라스미드 벡터 및 미니서클 플라스미드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 미니서클 플라스미드)는 유전 물질 (예를 들어, 코노톡신 펩티드를 코딩하는 서열)을 세포에 전달하는 것을 용이하게 하기 위해 임의의 추가의 서열 정보를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 예컨대 일반적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 세포-특이적 프로모터 및/또는 핵 또는 세포질에 특이적인 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터 및 플라스미드 (예를 들어, 미니서클 플라스미드)는 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 통상의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어는 형질감염시키다, 형질감염된, 또는 형질감염시킨이란 세포에서 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 이로부터 발현된 폴리펩티드의 존재를 나타내는데 사용될 수 있다. 다수의 벡터는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 유전자를 세포에 전달하는 것을 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다.

B. 약물 후보를 확인하는 방법

본원에 개시된 코노톡신 펩티드는 또한 nAChR의 α9α10 하위유형과 연관된 상태를 치료하는데 사용하기 위한 약물 후보를 확인하는 방법에서 유용하다. 이러한 방법은 nAChR의 α9α10 하위유형의 활성을 차단하는 그의 능력에 대한 약물 후보의 스크리닝을 포함한다.

"약물 후보"는 표적 (즉, α9α10 하위유형)의 활성을 차단하거나 또는 달리 방해할 수 있는 임의의 펩티드, 단백질 (항체 또는 항체 단편 포함) 또는 화합물 (소분자 또는 그외)을 지칭한다. 소분자는, 단백질 복합체와 상호작용하는 것으로 의심되고 제약상 허용되는 것으로 예상되는 임의의 화학물질 부류에 속할 수 있다. 약물 후보는 자연에서 발견될 수 있고/있거나, 조합 화학 접근법에 의해 합성될 수 있고/있거나, 합리적 약물 디자인을 통해 만들어질 수 있다.

차단은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 측정될 수 있으며, 단 약물 후보를 RgIA보다는 또는 이것 이외의 본원에 개시된 코노톡신 펩티드와 비교할 수 있다. 코노톡신 펩티드는 코노톡신 펩티드의 치료 활성을 모방하는 약물 후보를 확인하는 방법에서 유용하다. 이러한 방법은 (a) 약물 후보에 대한 생물학적 검정을 수행하여 그의 치료 활성을 결정하는 단계; 및 (b) 약물 후보의 생물학적 검정으로부터 획득된 결과를 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 생물학적 검정으로부터 획득된 결과와 비교하는 단계를 포함한다.

약물 후보는 또한 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA) 및/또는 효소와의 상호작용을 통해 α9α10 하위유형의 활성을 방해할 수 있다. 이러한 약물 후보는 공지된 또는 잠재적 DNA 개질제, 예컨대 DNA 손상 작용제 (예를 들어, 핵산의 구조를 방해하는 삽입제); DNA 벤딩제; 미스매치 결합 단백질; 및/또는 알킬화제일 수 있다.

합리적 약물 디자인의 한가지 목적은, 예를 들어, 보다 활성이거나 안정한 형태의 코노톡신 펩티드인 약물 후보, 또는 예를 들어, 생체내 펩티드의 기능을 개선하거나 방해하는 약물 후보를 확인하는 것이다. 합리적 약물 디자인에 사용하기 위한 여러 접근법은 3차원적 구조의 분석, 알라닌 스캔, 분자 모델링 및 항-id 항체의 사용을 포함한다. 이러한 기술은 코노톡신 펩티드 및 nAChR의 α9α10 하위유형에 의해 형성된 단백질 복합체의 3차원적 구조를 규정하는 원자 좌표를 제공하는 것, 및 상기 원자 좌표를 기준으로 하여 코노톡신 펩티드 및 nAChR의 α9α10 하위유형 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 약물 후보를 디자인하거나 선택하는 것을 포함할 수 있다.

코노톡신 펩티드의 효과를 모방하거나 개선하는 약물 후보의 디자인은 "리드" 코노톡신 펩티드를 기초로 하는 제약의 개발을 위한 공지된 접근법이다. 이러한 접근법은 특정한 코노톡신 펩티드가 합성하기 어렵거나 비싼 경우에, 또는 이것이 투여의 특정한 방법에 부적합한 경우에 바람직하며, 예를 들어, 경구 조성물을 위한 활성제로서의 순수한 펩티드의 사용은 이들이 소화관에서 프로테아제에 의해 신속하게 분해되는 경향이 있기 때문에 도전할 수 있다. 모방체 디자인, 합성 및 시험은 또한 표적 특성을 위해 다수의 원자를 무작위로 스크리닝하는 것을 피하기 위해 사용된다.

약물 후보가 추가의 연구 또는 개발을 위해 선택된다면, 그의 구조는 그의 물리적 특성, 예를 들어, 입체화학, 결합, 크기 및/또는 전하에 따라, 공급원 범위, 예를 들어, 분광학적 기술, X선 회절 데이터 및 NMR로부터의 데이터를 사용하여 모델링될 수 있다. 컴퓨터 분석, 유사성 맵핑 (원자 사이의 결합보다는 약물 후보의 전하 및/또는 부피를 모델링함), 및 다른 기술이 이 모델링 과정에 사용될 수 있다.

약물 후보가 선택되는 경우에, 추가의 화학적 기의 부착을 평가할 수 있다. 화학적 기는, 약물 후보가 합성되기 쉽고 약리학상 허용되는 것일 가능성이 있고 생체내 분해되지 않도록 선택될 수 있지만, 일부 실시양태에서는 리드 코노톡신 펩티드의 생물학적 활성을 유지하거나 개선한다. 대안적으로, 약물 후보가 펩티드-기재인 경우에, 추가적 안정성은 그의 강성을 증가시키는 펩티드의 고리화에 의해 달성될 수 있다. 부착된 화학적 기를 갖는 약물 후보는 이들이 표적 특성을 보유하는 것을 확실하게 보여주기 위해 추가로 스크리닝될 수 있다. 이어서, 추가적 최적화 또는 변형은 생체내 또는 임상 시험을 위한 하나 이상의 최종 약물 후보에 도달하도록 수행될 수 있다.

약물 후보의 선택 및 최적화에 따라, 선택되고 최적화된 약물 후보는 대상체에게의 투여를 위한 제약 조성물로 제조되고/거나 사용될 수 있다.

III. 제약 조성물

코노톡신 펩티드는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. "제약 조성물"은 의학적 투여에 적합한 물리적으로 이산된 결집 단위를 의미한다. "투여 단위 형태의 제약 조성물"은, 각각 치료 유효량, 또는 다중 (4배 이하) 또는 하위-다중 (40분의 1까지) 치료 유효량의 코노톡신 펩티드를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는, 의학적 투여에 적합한 물리적으로 이산된 결집 단위를 의미한다. 제약 조성물이 1일 용량 또는 예를 들어, 1일 용량의 절반, 3분의 1 또는 4분의 1을 함유하는지는 제약 조성물이 각각 1일에 1회 또는, 예를 들어, 1일에 2회, 3회 또는 4회 투여되는 것인지에 달려있을 것이다.

제약 조성물에서의 코노톡신 펩티드의 양 및 농도, 뿐만 아니라 제약 조성물의 정량은 임상 관련 인자, 제약 조성물에서 코노톡신 펩티드의 용해도, 코노톡신 펩티드의 효력 및 활성, 및 제약 조성물의 투여의 방식을 기준으로 하여 선택될 수 있다. 코노톡신 펩티드가 치료 유효량을 구성하여, 즉, 적합한 유효 투여량이 단일 또는 다중 단위 용량으로 사용되는 투여 형태와 일치하게 할 것만이 필요하다.

제약 조성물은 일반적으로 전체 조성물 중량에 따라 0.0001 내지 99 wt%, 바람직하게는 0.001 내지 50 wt%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 wt%의 코노톡신 펩티드를 함유할 것이다. 코노톡신 펩티드 이외에도, 제약 조성물은 또한 다른 약물 또는 작용제를 함유할 수 있다. 다른 약물 또는 작용제의 예는 진통제, 시토카인, 및 모든 주 영역의 임상 의학에서의 치료제를 함유할 수 있다. 다른 약물 또는 작용제와 함께 사용되는 경우에, 코노톡신 펩티드는 약물 칵테일 형태로 전달될 수 있다. 칵테일은 코노톡신 펩티드 중 어느 하나와 또 다른 약물 또는 작용제와의 혼합물이다. 이러한 실시양태에서, 공동 투여 비히클 (예를 들어, 환제, 정제, 임플란트, 펌프, 주사액 등)은 다른 약물 또는 작용제와 조합하여 코노톡신 펩티드 둘 다를 함유할 것이다. 칵테일의 개별 구성성분은 각각 치료 유효량으로 투여될 수 있거나, 또는 조합물로의 그의 투여는 치료 유효량을 생성할 수 있다.

제약 조성물은 연구, 예방적 및/또는 치유적 치료를 위한 것인지에 상관 없이 제약상 허용되는 담체, 예컨대 투여의 이익을 능가하는 유의한 유해 반응, 알레르기성 반응, 또는 다른 부작용을 생성하지 않는 것을 포함한다. 예시적인 제약상 허용되는 담체 및 제제는 문헌 [Remington, 2005]에 개시되어 있다. 더욱이, 제약 조성물은 생물학적 표준 및/또는 다른 관련된 외국 규제청의 미국 식품 의약품국 (FDA) 사무실에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성 및/또는 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족시키도록 제조될 수 있다.

전형적으로, 코노톡신 펩티드는 선택된 투여 방식을 위해 선택된 하나 이상의 제약상 허용되는 담체와 혼합될 것이다. 전달의 방법의 예에 대하여 미국 특허 번호 5,844,077을 참조한다.

일반적으로 사용되는 예시적인 제약상 허용되는 담체는 임의의 및 모든 벌킹제, 충전제, 용매, 공-용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제, 등장화제, 방출제, 흡수 지연제, 염, 안정화제, 완충제, 킬레이트화제, 겔, 결합제, 붕해제, 습윤제, 유화제, 윤활제, 착색제, 향미제, 감미제 및 퍼퓸제를 포함한다.

예시적인 완충제는 시트레이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 푸마레이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 아세테이트 완충제, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염을 포함한다.

예시적인 보존제는 페놀, 벤질 알콜, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 알킬 파라벤, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다.

예시적인 등장화제는 다가 당 알콜, 3가 당 알콜 또는 그 초과의 당 알콜, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.

예시적인 안정화제는 유기 당, 다가 당 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 황-함유 환원제, 아미노산, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 이뮤노글로불린, 친수성 중합체 및 폴리사카라이드를 포함한다.

예시적인 항산화제는 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E, 시스테인 히드로클로라이드, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 유용성 항산화제, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤, 금속 킬레이트화제, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산을 포함한다.

예시적인 윤활제는 소듐 라우릴 술페이트 및 스테아르산마그네슘을 포함한다.

예시적인 제약상 허용되는 염은 무기 또는 유기 산 및/또는 염기를 사용하여 형성되는 산성 및/또는 염기성 염, 바람직하게는 염기성 염을 포함한다. 제약상 허용되는 염이, 특히 코노톡신 펩티드를 의약으로서 사용하는 경우에 바람직하지만, 다른 염은, 예를 들어 이들 코노톡신 펩티드를 가공하는데 있어서 또는 비-의약-유형의 사용이 예상되는 경우에 유용성을 발견한다. 이들 코노톡신 펩티드의 염은 관련 기술분야에서 인식된 기술에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 제약상 허용되는 염은 무기 및 유기 부가염, 예컨대 히드로클로라이드, 술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 시트레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 메탄-술포네이트, 이소티오네이트, 테오필린 아세테이트 및 살리실레이트를 포함한다. 저급 알킬 4급 암모늄 염이 또한 사용될 수 있다.

경구 투여를 위해, 코노톡신 펩티드는 고체 또는 액체 제제, 예컨대 캡슐, 환제, 정제, 로젠지, 용해물, 분말, 현탁액 또는 에멀젼으로 제제화될 수 있다. 경구 투여 형태의 조성물을 제조함에 있어서, 임의의 통상의 제약상 허용되는 담체, 예컨대, 예를 들어, 경구 고체 제제 (예컨대, 예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제)의 경우에 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등; 또는 경구 액체 제제 (예컨대, 예를 들어, 현탁액, 엘릭시르 및 용액)의 경우에 물, 글리콜, 오일, 알콜, 향미제, 보존제, 착색제, 현탁화제 등과 같은 담체가 사용될 수 있다. 투여에서의 그의 용이성 때문에, 정제 및 캡슐은 유리한 경구 투여 단위 형태를 나타낼 수 있으며, 이러한 경우에 고체 제약 담체가 명백히 사용된다. 원하는 경우에, 정제는 표준 기술에 의해 당-코팅 또는 장-코팅될 수 있다. 코노톡신 펩티드는, 이를 위장관을 통해 통과하는데 안정하게 하고 동시에 특정 실시양태에서 혈액 뇌 장벽을 가로질러 통과하도록 하기 위해 캡술화될 수 있다. 예를 들어, WO 96/11698을 참조한다.

비경구 투여를 위해, 코노톡신 펩티드는 제약상 허용되는 담체에 용해될 수 있고, 용액 또는 현탁액으로서 투여될 수 있다. 예시적인 제약상 허용되는 담체는 물, 염수, 덱스트로스 용액, 프룩토스 용액, 에탄올, 또는 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일을 포함한다. 담체는 또한 다른 성분, 예를 들어, 보존제, 현탁화제, 가용화제, 완충제 등을 함유할 수 있다.

코노톡신 펩티드는 전달 시에 적절한 제약상 허용되는 담체 중에 재구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 코노톡신 펩티드의 단위 투여 형태는 멸균, 기밀 밀봉된 앰플 또는 멸균 시린지 내에 적합한 희석제 중 코노톡신 펩티드 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용액일 수 있다.

코노톡신 펩티드는 또한 데포 제제로서 제제화될 수 있다. 데포 제제는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체, 예를 들어 난용성 염으로서 제제화될 수 있다.

추가로, 코노톡신 펩티드는 하나 이상의 화합물을 함유하는 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 활용하는 지속-방출 시스템으로서 제제화될 수 있다. 다양한 지속-방출 물질이 통상의 기술자에 의해 확립되었고 널리 공지되어 있다. 지속-방출 시스템은, 이들의 화학적 성질에 따라, 수주 동안 100일 초과까지 투여 후에 코노톡신 펩티드를 방출할 수 있다.

코노톡신 펩티드의 투여는 또한 펌프를 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Luer et al., (1993), Zimm, et al. (1984) 및 Ettinger, et al. (1978)] 참조); 마이크로캡슐화 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,352,883, 4,353,888 및 5,084,350 참조); 연속 방출 중합체 임플란트 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,883,666 참조); 및 마크로캡슐화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 및 4,968,733 및 공개 PCT 특허 출원 WO92/19195, WO 95/05452 참조).

코노톡신 펩티드가 척수강내로 투여되는 경우에, 이들은 또한 뇌척수액 중에 용해될 수 있다. CNS에 대해 네이키드 또는 비캡슐화된 세포 이식편이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,082,670 및 5,618,531을 참조한다.

예시적인 실시양태

1. 서열 22의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.

2. 실시양태 1에 있어서, 서열 2의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.

3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20 또는 서열 21의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.

4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 코노톡신 펩티드의 C-말단이 카르복실산 기인 코노톡신 펩티드.

5. 실시양태 4에 있어서, Tyr, 아이오도-Tyr 또는 형광 태그가 카르복실산 기에 부가된 것인 코노톡신 펩티드.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 코노톡신 펩티드의 N-말단에 부가된 Tyr, 아이오도-Tyr, 피로글루타메이트 또는 형광 태그를 갖는 코노톡신 펩티드.

7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 아미드 고리화 백본을 포함하는 코노톡신 펩티드.

8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나의 코노톡신 펩티드 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.

9. 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형과 연관된 하나 이상의 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나의 코노톡신 펩티드 또는 실시양태 8의 제약 조성물을 투여하여 상기 상태를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형과 연관된 하나 이상의 상태를 치료하는 방법.

10. 실시양태 9에 있어서, 하나 이상의 상태가 통증인 방법.

11. 실시양태 10에 있어서, 통증이 일반적 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 침해수용성 통증, 염증성 통증, 말초 신경 또는 침해수용체 손상과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 염증성 장애와 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 대사 장애와 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 바이러스 감염과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 암과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 화학요법제와 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 외과적 절차 후에 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증, 및/또는 화상 및/또는 다른 물리적 조직 손상과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 통증인 방법.

12. 실시양태 10에 있어서, 통증이 화학요법-유발된 신경병증성 통증인 방법.

13. 실시양태 10에 있어서, 통증이 화상 또는 다른 열 조직 손상과 관련된 만성 통증 및/또는 신경병증인 방법.

14. 실시양태 10에 있어서, 통증이 수술 또는 다른 물리적 조직 손상 후에 유발된 통증 및/또는 신경병증인 방법.

15. 실시양태 9에 있어서, 하나 이상의 상태가 염증성 상태인 방법.

16. 실시양태 15에 있어서, 염증성 상태가 염증, 만성 염증, 류마티스성 질환, 패혈증, 섬유근육통, 염증성 장 질환, 사르코이드증, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 염증성 피부 질환, 폐의 염증성 상태, 신경계의 염증과 연관된 질환, 치주 질환 및/또는 심혈관 질환인 방법.

17. 실시양태 16에 있어서, 류마티스성 질환이 관절염, 루푸스, 강직성 척추염, 섬유근육통, 건염, 윤활낭염, 경피증 또는 통풍 중 하나 이상인 방법.

18. 실시양태 16에 있어서, 염증성 장 질환이 궤양성 결장염 또는 크론병인 방법.

19. 실시양태 16에 있어서, 염증성 피부 질환이 건선 또는 상처 치유 장애인 방법.

20. 실시양태 16에 있어서, 폐의 염증성 상태가 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환인 방법.

21. 실시양태 16에 있어서, 신경계의 염증이 파킨슨병 또는 알츠하이머병인 방법.

22. 실시양태 9에 있어서, 하나 이상의 상태가 통증 및 염증인 방법.

23. 실시양태 9 및 15-21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 상태가 염증 및 신경병증인 방법.

24. 실시양태 15-20 중 어느 하나에 있어서, 염증이 면역 세포에 의해 매개되는 것인 방법.

25. 실시양태 9 및 15-21 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 상태가 손상 후 장기 염증 및 말초 신경병증인 방법.

26. 실시양태 9에 있어서, 하나 이상의 상태가 암 관련 만성 통증 및 신경병증인 방법.

27. 실시양태 9에 있어서, 하나 이상의 상태가 암인 방법.

28. 실시양태 27에 있어서, 암이 유방암인 방법.

29. 실시양태 10 또는 11에 있어서, 통증이 화학요법-관련 만성 통증 및/또는 화학요법-관련 신경병증인 방법.

하기 실시예는 특정한 실시양태를 증명하기 위해 포함된다. 통상의 기술자는 본 개시내용의 관점에서, 본 개시내용의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 많은 변화가 본원에 개시된 구체적 실시양태에 이루어질 수 있고, 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 수득할 수 있음을 인지해야 한다.

실시예

실시예 1. RgIA의 전임상 최적화. 리드 유사체 코노톡신 펩티드를 시험관내 특성화 연구 및 동물 통증 모델에서 평가하여 전임상 개발을 위한 리드 코노톡신 펩티드를 선택하였다.

<표 1> 펩티드

X2 = 시트룰린

X3 = 모노-아이오도-티로신

X4 = 셀레노시스테인

<표 2> 펩티드의 활성

Sel = 셀레노시스테인

IC₅₀ hα9α10: 크세노푸스 난모세포에서 발현되는 인간 α9α10 nAChR에 대한 IC₅₀ (nM 단위).

표 2에서의 IC₅₀ 값은 C-말단 COOH를 갖는 유사체 X-Y를 사용하여 계산하였음.

모 펩티드 RgIA는 인간 α9α10 nAChR에 대해 494 nM의 IC₅₀을 가졌다 (Azam et al., 2012). 따라서, 이들 유사체 코노톡신 펩티드는 인간 α9α10 nAChR에 대해 모 펩티드보다 80-1100배 더 강력하다.

실시예 2. nAChR 하위유형 특이성 및 효력의 분석. 유사체 코노톡신 펩티드는 크세노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 난모세포에서 이종으로 발현되는 클로닝된 nAChR에 대한 기능적 활성에 대하여 시험하였다. 이를 달성하기 위한 방법이 통상적으로 사용되었다 (McIntosh et al., 2005). 난모세포 시스템은 길항제 vs. 효능제 활성과 관련된 즉각적인 정보를 제공하는 이점을 갖고, 알로스테릭 메카니즘에 의해 작용하는 유사체 코노톡신 펩티드를 검출할 수 있다. α9α10 수용체에 대한 활성을 갖는 화합물은 α7 및 α1β1δε nAChR에 대해 대응-스크리닝될 것이고, 이들 2가지 하위유형은 α9α10과 가장 밀접하게 관련된 것이다. 추가 개발을 위해 선택된 유사체 코노톡신 펩티드는 α9α10 수용체에 대한 IC₅₀ ≤ 100 nM 및 Imax ≥ 80%, 및 α7 또는 α1β1δε에 비해 α9α10에 대한 ≥ 200배 선택성을 입증할 것이다. 이들 기준을 충족시키지 못하는 유사체 코노톡신 펩티드는 추가의 평가 없이 제외할 것이고, 나머지 유사체는 nAChR 서브유닛의 모든 발현가능한 쌍별 및 동종체성 조합에 대해 상세하게 시험되어 이들의 하위유형 특이성을 결정할 것이다. 용량-반응 곡선 및 동역학적 상수 (회합 및 해리 둘다)는 각각의 하위유형 조합에 대해 획득될 것이다. 난모세포의 사용이 기능적 검정을 나타내기 때문에, 유사체 코노톡신 펩티드의 다른 추가의 미묘한 특징, 예컨대 역전위에 대한 이들의 효과 및 이들 차단의 전압 의존성을 평가할 수 있다.

유사체 2 (서열 4)는 허용되는 효력 및 선택성을 이미 입증하였다. 이 유사체 코노톡신 펩티드는 α9α10 nAChR에 대한 강력한 길항제 활성 (~8 nM IC₅₀, 도 2)을 갖지만, 모든 다른 하위유형에 대한 그의 IC₅₀은 10 μM (n=3-5) 초과이다. 따라서, 유사체 2 (서열 4)는 α9α10 nAChR 대 다른 주요 하위 유형, 예컨대 근육 nAChR (α1β1γδ) 및 뉴런 nAChR (α2β2, α2β4, α3β2, α3β4, α4β2, α4β4, α6/α3β2, α6β4 및 α7)에 대한 그의 IC₅₀에서 1000배 차이로 식별하였다.

리드 유사체 코노톡신 펩티드를 구조적으로 관련된 5-HT3 및 GABAA 수용체를 비롯한 다른 수용체 하위유형에 대해 시험하였다. 오피오이드, GABAB, 무스카린성 및 노르에피네프린 수송체 및 수용체를 비롯한 보다 일반적인 무통각-관련 표적을 또한 검사하였다.

실시예 3. α9α10 nAChR를 안정하게 발현하는 세포주의 생산. nAChR의 다양한 하위유형을 안정하게 발현하는 세포주는 종래에 생성된 바 있다. 그러나, 보다 최근에 확인된 α9α10 하위유형을 안정하게 발현하는 세포주는 아직 개발되지 않았다. nAChR을 자연발생적으로 발현하지 않는 인간 배아 신장 (HEK) 세포가 다수의 nAChR 하위유형을 발현하는데 성공적으로 사용된 바 있다 (Capelli, et al., 2011; Abdrakhmanova, et al., 2010; Xiao, et al., 2009; Kracun, et al., 2008; Xiao, et al., 1998). 이들 세포는 이들이 nAChR을 자연발생적으로 발현하지 않는다는 점에서 유리하다. HEK293 세포는 α9α10 nAChR을 발현하는 안정한 클론을 구축하는데 사용하였다. 1차 발현 구축물은 뇌심근염 바이러스 내부 리보솜 진입 서열 (IRES)에 의해 분리되는 α9 및 α10의 코딩 서열을 함유하였다. RNA, (알팔파 모자이크 바이러스의 RNA4의 5'UTR (비번역 영역)-α9 코딩 서열-α9의 부분 3'UTR 서열) 및 (알팔파 모자이크 바이러스의 RNA4의 5'UTR-α10 코딩 서열-α10의 부분 3'UTR 서열)의 혼합물은 일시적 형질감염 후에 크세노푸스 난모세포에서 α9α10 수용체의 고도의 발현을 생성하는 것으로 관찰되었다. 이들 2가지 발현 카세트를 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터의 pIRES 벡터 하류 내로 클로닝하고, 선택 마커를 녹색 형광 단백질 (GFP):제오신 유전자로 대체하여 (Bennett, et al., 1998), 이로써 GFP 형광 및 제오신-기반의 선택 둘 다에 의해 클론을 확인하도록 하였다.

HEK293 세포는 시약, 예컨대 FuGENE® HD 형질감염 시약 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 사용하여 발현 벡터로부터의 DNA로 형질감염시켰다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 GFP 발현 클론을 확인하였고, 형광 현미경검사-기반의 세포내 칼슘 검정을 사용하여 기능적 α9α10 수용체를 발현하는 클론을 확인하였다 (Capelli, et al., 2011; Kracun, et al., 2008; Teichert, et al., 2012). 형질감염 48시간 후에, GFP-발현 세포를 FACS에 의해 단리하고, 완전 배지에 플레이팅하였다. 플레이팅 24시간 후에, 일부의 세포 (~50,000개)를 칼슘 영상화 연구를 위해 폴리-L-리신 코팅된 24-웰 플레이트 상에 재플레이팅하였다. 세포를 칼슘 감수성 형광 염료 플루오-4-아세톡시 메틸 에스테르 (Fura-2-AM, 인비트로젠(Invitrogen))에 노출시킴으로써 칼슘 영상화를 착수하였다. Fura-2-AM을 세포에 진입시키고, 칼슘에 결합 시에 여기 스펙트럼에서 변화를 겪었다 (Barreto-Chang and Dolmetsch, 2009). 세포내 칼슘 수준이 α9α10 수용체 발현에 비례하게 상승하기 때문에, 이 분석으로 고발현 클론을 확인할 수 있다. Fura-2-AM에 대해 표준 비율측정 영상화 비디오 현미경검사를 사용할 것이다. 형광 방출에 대한 효능제 및 길항제의 효과를 모니터링할 것이다. 비형질감염 세포를 음성 대조군으로서 사용할 것이고, 확립된 α3β4 nAChR 세포를 양성 대조군으로서 사용할 것이다. 수용체를 안정하게 발현하는 클론을 표준 방법에 따라 선택 하에 성장시키고 동결보존할 것이다. 최종 세포주(들)를 패치 클램프 전기생리학을 사용하여 검정하여, 발현된 수용체의 약리학 및 기능을 확인할 것이다.

α9α10 하위유형을 적절하게 발현하는 세포주를 생성하는데 사용되는 대체 시스템은 (1) α9 및 α10 유전자로부터의 내인성 5'- 및 3'-UTR을 양방향 벡터인 pBi (클론테크(Clontech)) 내로 클로닝하여 (5'α9UTR-α9 코딩 서열-3'α9UTR)-양방향프로모터-(5'α10UTR-α10 코딩 서열-3'α10UTR)을 얻고, 상기 기재된 바와 같이 선택 마커를 GFP:제오신으로 대체한 것; 및 (2) 내인성 UTR을 갖는 α9α10을 코딩하는 cDNA를 pTRE3G-hyg 벡터 (tet-유도성 양방향 벡터) 내로 삽입하고, 선택 마커를 GFP:제오신으로 대체하여 발현을 위한 테트라시클린-유도성 시스템을 생산하는 것을 포함한다. 대체 시스템 #2의 경우에, HEK293 Tet-On® 세포 (클론테크)를 형질감염시키고, 배지에 독시시클린을 첨가함으로써 유전자 발현을 개시할 것이다.

실시예 4. 코노톡신 펩티드의 효능을 평가하기 위한 생체내 통증 모델. 전층 열 손상 모델: 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트를 열 손상 이전에 산소 중 4% 이소플루란으로 마취시켰다. 기울어진 납땜 팁이 장착된 온도-제어된 과 납땜 스테이션 (RX-80HRT-5.4D) (구트(Goot), 일본 히로시마)을 사용하여 손상을 유도하였다. 이 절차는 전층 열 손상을 유발하였다. 헤마톡실린 및 에오신을 사용하는 피부 조직학은 이러한 손상의 깊이 및 반복성을 확인하였다. 감염을 방지하기 위해, 반흔 조직이 손상된 동물에 형성될 때까지 (손상 7일 후), 뒷발의 손상 또는 비손상 부위에 1일 1회 은 술파디아진 (1%) 연고를 도포하였다. 열 손상-유발된 통증에 대한 코노톡신 펩티드의 효능 및 효력을 검사하기 위해, 기계적 이질통 및 열 통각과민을 손상 후 최대 21일 동안 분석하였다.

척수 신경 결찰 모델 (SNL): SNL은 L5 척수 신경의 결찰을 통한 부분 탈구심화를 포함하여, 이로써 근처의 다른 무손상 신경을 이탈시키고, 래트 뒷발에 대한 행동 시험을 허용하였다. 이환 신경의 변성 동안, 근처의 예비 신경을 임상에서 외상성 손상으로 보여지는 것과 유사한 화학적 염증 매개체의 환경에 노출시켰다. SNL 모델은, 변동성이 낮고 운동 조정 결손이 없는, 결찰 1-2일 내에 열 통각과민 및 기계적 이질통 둘 다를 확실하게 발생시키는 실험적 신경병증성 통증의 널리 허용되는 모델이다 (Kim et al., 1992).

산소 중 4% 이소플루란을 사용하여 스프라그 돌리 래트의 마취를 유도하고, 후속적으로 노즈 콘을 통해 전달되는 ~2-2.5% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지하였다. 래트 상의 모발을 깎고, 수술 부위를 물 중 2% 베타딘 및 70% 에탄올의 상호 처리로 소독하였다. 해부 현미경의 도움으로 수술을 수행하였다. ~2 cm 종축 절개는 동물의 중심선으로부터 0.8 cm 외측에 만들었다. 절개는 척추인접 근육을 노출시키고, 이를, 인접한 결합 조직과 함께, L5 척수 돌기의 수준으로부터 갑각으로 제거하였다. L6 가로 돌기를 척추에 매우 근접하게 제거하여, L4 및 L5 척수 신경에 접근하도록 하였다. 6-0 실크 스레드를 L5 신경 아래에 놓고, 신경을 단단하게 결찰시켰다. 모의 동물의 경우에, 스레드를 L5 신경 아래에 놓지만, 결찰 없이 제거하였다. 주목 할 만한 출혈 없이, 상처를 층에서 폐쇄하였다. 근막을 3-0 실크 스레드를 사용하여 봉합하고, 금속 상처 클립을 사용하여 피부를 폐쇄하였다. 마취를 중단하고, 동물을 그의 케이지로 복귀시켰다. 0.05 mg/kg 부프레노르핀의 2회 피하 주사를 제공하며; 1회는 수술 직후에, 및 1회는 수술 8시간 후에 제공하였다. 이러한 무통각은 수술의 침습성 때문에 필요하고, 코노톡신 펩티드의 진통제 활성의 후속적 측정과 충돌하지 않았다. 수술 후에 명백한 운동 결손을 갖는 동물을 안락사시키고, 행동 연구에서 제외하였다.

기계적 이질통 시험: 통상적으로 통증의 원인이 되지 않을 자극으로부터 발생한 통증인 기계적 이질통이 발병된 손상 래트는 전자 폰 프라이(von Frey) 촉각계를 사용함으로써 확인하였다 (Pitcher, et al., 1999). 절차 출발 전 20분 동안 래트를 시험 챔버에 적응시켰다. 이 장치는 최고 15초 동안 뒷발의 중족저 영역에 압력을 전달하였다 (2g/s 증가). 시험을 위한 상한 역치는 30 그램이다. 손상 래트가 자극으로부터 그의 발을 피하는 압력 (회피 역치)을, 이것이 손상 전에 그의 발을 피하는 압력 (기준 역치)과 비교하였다. 이어서, 회피 역치에 대한 코노톡신 펩티드 치료의 효과를 평가하였다. 모의-수술된 및 비히클-처리된 동물을 대조군으로서 사용하였다. 각 시점에 각 동물에 대해 삼중으로 측정을 수행하였다.

열 통각과민 시험: 열 통각과민은 통증성 열 또는 냉각에 대한 과도한 반응이며, 이는 때때로 손상으로부터 발생한다. 열에 대한 동물의 반응은 코노톡신 펩티드로의 치료가 이러한 통각과민을 완화시키는지 결정하기 위해 시험되었다. 기계적 이질통 시험을 사용할 때와 같이, 동물을 손상 전에 시험하여 기준 반응을 확립하였다. 열-회피 역치를 측정하기 위해, 족저 시험 (하그리브스 방법)을 사용하였다 (Hargreaves, et al., 1988). 동물을 상승된 온도-제어된 유리 플레이트 상단에 위치한 아크릴 인클로져에 넣었다. 방사열 공급원 (가시 광선)을 뒷발의 족저 표면 상에 집중시키고, 열 역치는 열 공급원으로부터 발을 회피할 때까지의 시간으로 확인하였다.

면역조직화학 연구: 시험 군 각각에서 대상체로부터 획득된 조직에 대한 면역조직화학 분석은, 시험 코노톡신 펩티드가 침해수용의 분자 매개체의 활성화 및/또는 발현에 영향을 미치는지 결정하기 위해 수행하였다. 획득된 조직은 척수의 배각, 뿐만 아니라 다른 신경계 구성성분을 포함한다. p38 MAPK, 인산화 p38 MAPK, OX-42, c-Fos, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP), 물질 P, 뮤 오피오이드 수용체, 뉴런 핵 및 다른 분자에 대해 상승된 항체를 필요에 따라 이들 분석에 사용하였다. 조직을 획득하기 위해, 래트를 소듐 펜토바르비탈로 마취시키고, 이어서 4% 파라포름알데히드를 사용하는 방혈-관류에 의해 안락사시켰다. 조직을 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 중에 후-고정시키고, 이어서 절편화시까지 30% 수크로스 중에 저장하였다. 조직을 처리된 슬라이드 상으로 직접적으로 저온유지장치 상에서 30 μm로 동결-절편화하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 특이적 1차 항체와 함께 인큐베이션하여 관심 분자를 표지하였다. 형광으로-표지된 또는 비오틴-접합된 2차 항체를 검출 시약으로서 사용하였고, 생성된 슬라이드를 형광 또는 명시야 현미경검사에 의해 가시화하였다.

설치류 통증 모델에서의 약물 효능에 대한 유사체 스크리닝: 초기 스크리닝 실험에서는, 33 μg/kg의 1일 피하 용량을 사용하여 SNL 및 FTB 통증 모델에서 유사체를 평가하였다. 이 용량은 이전 RgIA 실험으로부터의 최대 용량의 대략 절반과 일치하고, α9α10 수용체에 대한 각 유사체의 대략적인 IC₅₀의 최대 혈청 농도가 수득되는 것으로 예상된다. 코노톡신 펩티드 또는 비히클 대조군 치료는 손상 당일에 시작하고, 21일 동안 계속하였다. 동물을 제7일, 제14일 및 제21일에 평가하였다. 용량 투여 직전 (바로 앞 용량 후 24시간) 및 시험 당일의 용량 투여 후 30분에 시험을 수행하였다. 연구 종점은 기계적 및 열 회피 역치, 매일 임상 관찰 및 매주 체중을 포함한다. 이 초기 연구는 용량-반응 연구를 위한 2종의 가장 유효한 유사체를 선택하는데 사용될 수 있다.

척수로부터의 침해수용유발성 펩티드 방출에 대한 코노톡신 펩티드의 효과: 열 손상 및 척수 신경 결찰은 척수의 감각 배각에서 CGRP 및 물질 P를 비롯한 염증유발성 펩티드의 방출을 증진시켰다 (도 3). 코노톡신 펩티드가 열 손상 후 통증을 위한 효과적인 진통제인 경우에, CGRP 및 물질 P의 발현에서의 상응하는 감소는 감소된 통증 신호전달의 척도로서 척수에서 관찰되어야 한다. 이 가설을 시험하기 위해, 래트의 우측 뒷발을 열 손상시키고, 그 후 24시간에 코노톡신 펩티드 또는 비히클의 매일 피하 투여를 시작하였다. 동물군 (n=5마리/군)을 24시간, 1주 및 2주에 희생시키고, 이들의 조직을 관류-고정에 의해 고정시켰다. 회수된 조직을 슬라이드 상에서 동결시키고 절편화하였다. 슬라이드를 완충제에 헹구고, 24시간 동안 CGRP (1:10,000; 이뮤노스타(Immunostar)) 또는 물질 P (1:50,000; 이뮤노스타)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션하고, 적절한 2차 항체 및 니켈-증진 디아미노벤지딘으로 현상하였다.

이 연구로부터의 동일한 래트를 사용하여, 화상 병리상태 및 상처 치유에 대한 RgIA 치료의 효과를 또한 평가하였다. 고정된 뒷발을 H&E 염색 및 형광 면역조직화학 둘 다를 위해 수집하고 절편화하여 RgIA-치료된 vs. 비히클-치료된 래트를 비교하였다. 형광 면역조직화학을 사용하여, 신경 섬유 신경지배에서의 변화, 다양한 염증 매개체의 발현, 반흔 형성의 분자 결정자, 세포 증식의 마커, 및 매트릭스 재형성에 속하는 단백질을 검출하였다.

실시예 5. 화학요법 유발된 신경병증성 통증에서의 효능.

옥살리플라틴 (OXA) (통상적으로 사용되는 백금 염 화학요법제)에 의해 도출되는 말초 통증에 대한 RgIA 투여의 효과는 화학요법-유발된 신경병증성 통증 (CINP)의 확립된 생체내 모델을 사용하여 평가하였다. 설치류에서의 OXA CINP는 고도로 관련되고 널리 사용되는 신경병증성 통증 (NPP)의 모델이다 (Authier et al., 2009). OXA로 만성 처리된 래트에서는 기계적 통각과민, 기계적 이질통 및 열 이질통을 비롯한 말초 NPP가 발병하였다 (도 4a-4j). 이 모델에서, RgIA의 매일 투여는 제14일 및 제21일에 상당한 진통제 효과를 가졌다 (도 4a, 4b, 4e, 4f 및 4i). 이들 데이터는 RgIA가 화학요법-유발된 말초 NPP를 예방할 수 있다는 개념 증명으로서 작용한다. 동일한 모델을 사용하여 코노톡신 펩티드의 생체내 진통제 잠재력을 평가하였다. 도 4c, 4d, 4g, 4h 및 4j는 예방적 치료 패러다임에서 유사체 3 (또한 CSP-4로서도 지칭됨; 서열 3)의 진통제 효과를 입증하는 데이터를 보여준다.

RgIA 및 코노톡신 펩티드는 OXA CINP 모델의 예방적 치료 패러다임 및 치유적 치료 패러다임 둘 다에서 시험될 수 있다. 양쪽 패러다임에서, 최소 유효 용량은 용량 반응 연구를 통해 결정될 것이며, 여기서 최소 3-5가지 치료 용량을 시험하였다. 추가의 연구에서, 코노톡신 펩티드는 낮은 유효 용량으로 투여되는 경우에 효능에 대해 시험되고 비교되었다.

OXA-유발된 CINP 모델에서, 수컷 스프라그-돌리 래트 (~250 g)는 3주 동안 매주 연속 5일 동안 복강내로 (i.p.) 투여되는 2.4 mg/kg OXA로 처리하였다 (15회 주사). OXA를 5% 글루코스-물 용액 중에 용해시켰다. RgIA 및 코노톡신 펩티드, 양성 대조군 약물 또는 음성 대조군 비히클은 주어진 실험을 위해 지정된 날짜에서 출발하여 근육내로 (i.m.) 또는 피하로 (s.c.) 매일 투여하였다 (Bennet, 2003). 양성 대조군 약물의 예는 가바펜틴/프레가발린 및 모르핀을 포함한다. 예방 양식으로의 치료를 위해, 래트는 OXA 주사 전날 출발하여 21일 동안 RgIA 또는 코노톡신 펩티드를 투여받았다. 치유적 치료를 위해, NPP의 발병 후, 즉 전형적으로 OXA CINP의 경우에 14일 후에 약물 투여를 시작하였다.

기계적 통각과민은 랜달-셀리토(Randall-Selitto) 시험에 의해 측정하였다 (Di Cesare, 2012). 문헌 [Chaplan, et al., 1994]에 기재된 바와 같이 폰 프라이 시험 및 업/다운 방법에 의해 기계적 이질통이 사용될 수 있다. 냉각-이질통은 하기 기재된 바와 같이 냉각 플레이트 시험을 사용하여 측정하였다. 모든 시험에 대한 측정은 제0일 (기준선), 제7일, 제14일 및 제21일에 치료 후 30분 및/또는 치료 후 24시간에 출발하여 수행하였다.

또한, 혈액-혈장, 후근 신경절 (DRG) 및 척수를 이들 연구에서 처리된 동물로부터 수확하여 염증 매개체의 발현에서의 변화를 검정하였다. 이러한 마커는 RT-qPCR에 의해 유전자 발현 수준에서 및 면역조직화학에 의해 DRG 및 척수 조직 샘플에서 측정하였다.

수컷 스프라그-돌리 래트는 3주 동안 매주 연속 5일 동안 i.p. 투여되는 5% 글루코스-물 용액 중에 용해된 2.4 mg/kg OXA (세콰이아 리써치 프로덕츠(Sequoia Research Products), 영국 팡본)로 처리하였다 (15회 i.p. 주사). RgIA 또는 CSP-4를 OXA 투여의 제1일에 3가지 용량 수준 (0.89 nmol/kg, 2.67 nmol/kg 및 8.0 nmol/kg)에서 시작하여 대안적으로 우측 및 좌측 외측 광근 내로 i.m. 주사하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에 치료 후 30분 및/또는 치료 후 24시간에 출발하여 측정을 수행하였다. 기계적 통각과민은 랜달-셀리토 시험에 의해 측정하였다. 기계적 이질통은 폰 프라이 시험을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. 냉각-이질통은 냉각 플레이트 시험을 사용하여 측정하였으며, 여기서 냉각 플레이트는 통증-관련 행동의 첫번째 징후 (냉각 플레이트와 접촉 시에 발을 들어올리고/거나 핥는 것 포함)가 측정될 때까지 4℃에서 및 그 시간을 유지하였다.

기계적 통각과민. RgIA 및 CSP-4를 시험된 모든 3가지 용량 (0.89, 2.67, 및 8.0 nmol kg^{- 1})에서 OXA-유발된 통각과민을 유의하게 예방하였다 (도 4a-d). RgIA 및 CSP-4는 주사 후 30분에 측정 시에 통증 역치를 예리하게 증가시켰다. 주사 후 24시간에서의 효능은 여전히 유의하였다. 프레가발린은 0.89 nmol kg^-1 (시험된 가장 낮은 용량)으로 투여된 코노톡신 펩티드와 유사한 프로파일을 나타내었다.

기계적 이질통. 기계적 이질통에 대한 폰 프라이 시험 측정은 도 4e-h에 나타낸 바와 같이 보고되었다. 제7일에, OXA 처리에 의해 유발된 통증 역치 감소는 2.67 및 8.0 nmol kg^-1의 RgIA 및 CSP-4 투여 후 30분에 복귀하였고; 투여 후 24시간에는 진통제 효과가 관찰되지 않았다. 프레가발린은 유사한 효과를 보여주었다. 제14일 및 제21일에 RgIA 및 CSP-4 (모든 투여량) 및 프레가발린은 주사 후 30분 및 24시간 둘 다에서 활성이었으며, 이는 RgIA 및 CSP-4에 대한 장기 지속성 진통제 효과를 입증하였다.

열 이질통. 열 이질통은 냉각 플레이트 시험에 의해 평가하였고, 그 결과를 도 4i 및 4j에 나타내었다. RgIA 및 CSP-4의 반복 투여 (제7일에 2.67 및 8.0 nmol kg^-1, 및 제14일 및 제21일에 모든 투여량)는 OXA-유발된 냉각 이질통을 예방할 수 있었다.

실시예 6. 전층 손상 (화상) 통증 모델에서의 효능.

화상 손상은 신경병증성 및 염증 구성성분 둘 다를 포함한다. 래트에서의 화상 손상의 생체내 모델, 예컨대 실시예 4에 기재된 모델 (전층 열 손상 모델; FTTI)은 화상-유발된 기계적 이질통 및 열 통각과민을 나타내었다.

RgIA를 사용한 급성기 치료가 FTTI 모델에서 열 통각과민 및 기계적 이질통 둘 다를 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. RgIA과 비교 시에 인간 α9α10 nAChR 채널에 대해 더 큰 효력을 나타내는 코노톡신 펩티드는, 기계적 이질통, 열 통각과민 및/또는 염증 마커의 발현 중 하나 이상에서의 감소에 의해 측정되는 바와 같이 화상-유발된 통증을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다.

일측성 뒷발 FTTI를 갖는 래트는 코노톡신 펩티드의 1일당 단일 주사를 14일 동안 또는 동등한 용량의 음성 대조군 염수 주사를 투여받았다. 용량-의존성 효과를 연구하기 위해, 적어도 3가지 용량의 코노톡신 펩티드를 시험하였다. 약물 주사는 s.c. 또는 i.m.을 비롯한 경로에 의해 투여될 수 있다

유사체의 항침해수용성 효과는 손상후/치료후 제1일, 제4일, 제7일 및 제14일의 시간 과정에 걸쳐 측정하였다. 상기 기재된 바와 같이, 기계적 이질통은 폰 프라이 방법으로 측정하였고, 열 통각과민은 하그리브스 방법에 의해 측정하였다. 추가로, 염증 마커의 수준은 동일한 동물로부터의 혈액-혈장, 발 조직, DRG 및 척수 샘플에서 측정하였다. qPCR에 의해 측정되는 염증 매개체는 물질 P, CGRP, TGF-β, TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 포함한다. DRG 및 척수에서의 선택 마커는 대식세포 마커 특이적 및 T 세포 마커 특이적 항체를 사용하여 면역조직화학에 의해 분석하였다.

수행된 이러한 한 연구로부터의 데이터는 도 5a 및 5b에 나타내었다. RgIA (도 5a) 및 유사체 11 (또한 CSP-7로도 지칭됨; 서열 11) (도 5b)은 시험된 모든 3가지 용량 (4, 20, 및 100 mcg/Kg)에서 하그리브스 방법에 의해 측정된 바와 같이 화상-유발된 열 통각과민을 유의하게 감소시켰다.

통계적 분석. 결과는 평균 ± S.E.M.으로서 표현하였고, 분산 분석은 ANOVA에 의해 수행하였다. 듀넷(Dunnet)의 유의차 절차는 사후 비교로서 사용되었다. 0.05 또는 0.01 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 7. 수술후 신경병증성 통증 모델에서의 효능.

수술후 통증의 발 절개 모델은 수술 후에 경험하게 되는 통증을 모방하기 위해 디자인되었다. 모델은 한쪽 발의 족저 표면 상에 1 cm 절개를 만들어 환자에 의해 보고된 것과 유사한 통증 및 감수성을 생성하는 것을 포함한다. 기계적 감수성 및 기계적 통각과민의 수술전 측정은 하기 기재된 바와 같이 수행하여, 기계적 이질통 및 통각과민을 감소시키는데 있어서 코노톡신 펩티드 효능의 평가에 대한 기준 값을 제공하였다.

래트는 코노톡신 펩티드의 1일당 단일 주사를 7일 동안 또는 동등한 용량의 음성 대조군 염수 주사 또는 양성 대조군 모르핀 주사를 투여받았다. 코노톡신 펩티드의 용량-의존성 효과는 다중 용량 수준으로 투여함으로써 시험될 수 있다. 주사는 s.c. 또는 i.m.을 비롯한 경로에 의해 투여될 수 있다.

기계적 이질통은 폰 프라이 방법에 의해 측정하였다. 수술전 (제-3일 및 제0일), 수술후 대략 2시간 (제0일), 및 수술후 제1일, 제2일, 제4일 및 제7일에 코노톡신 펩티드를 사용한 투여후 대략 30분에 측정을 수행하였다. 기계적 감수성에 대한 값은 전자 폰 프라이 장치 (eVF, IITC 라이프 사이언시스(IITC Life Sciences)ⓒ; 캘리포니아주 우드랜드 힐)를 사용하여 측정하였다. 동물을 금속 메쉬 표면 상의 개별 아크릴 챔버에 위치시키고, 시험 전 최소 15분 동안 그의 주변에 적응하도록 하였다. 자극은 발의 족저 표면에 대해 수직으로 제공하고, 압력은 점진적으로 적용하였다. 발 회피 역치 값은 양성 반응이 보고되거나 (발을 급히 후퇴시킴) 또는 발을 메쉬 표면에서 들어올릴 때 기록하였다. 3개의 eVF 역치는 시점 당 각 뒷발에 대해 측정하였다. 3개 값의 평균은 그 시점에 대한 발 회피 역치로서 취하였다. 자극은 반응 역치를 측정하기 위해 디자인되고, 피할 수 있고, 동물에게 어떠한 손상의 원인도 되지 않았다.

기계적 통각과민은 디지털 랜달-셀리토 발 압력 시험에 의해 측정하였다. 수술전 (제-3일) 및 수술후 제1일, 제2일, 제4일 및 제7일에 투여후 대략 2시간에 측정을 수행하였다. 동물을 시험 전 최소 15분 동안 시험 공간에 적응하도록 하였다. 동물은 뒷다리를 시험에 이용가능한 채로 남겨두면서, 동물을 매달아 놓는 구속 슬링에 위치시켰다. 자극은 원추형 팁에 의해 뒷발의 족저 표면에 적용하고, 압력은 대략 10초에 걸쳐 점진적으로 적용하였다. 발 압축 역치 값은 제1 관찰된 침해방어성 행동 (소리냄, 몸부림 또는 회피) 시에 기록하였다. 발 당 하나의 판독을 취하고, 300 그램의 최대 자극 컷오프를 사용하여 동물에 대한 손상을 방지하였다. 자극은 반응 역치를 측정하기 위해 디자인되고, 피할 수 있고, 동물에게 어떠한 손상의 원인도 되지 않았다.

본 개시내용의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 화학의 통상의 기술, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 세포 배양 및 트랜스제닉 생물학을 사용하고, 이는 통상의 기술 내이 있다. 예를 들어, 문헌 [Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982); Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989); Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, updated through 2005); Glover, DNA Cloning (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 4th Ed., (Univ. of Oregon Press, Eugene, Oregon, 2000)]을 참조한다.

통상의 기술자에 의해 이해될 것과 같이, 본원에 개시된 각 실시양태는 그의 특정한 언급된 요소, 단계, 성분 또는 구성성분을 포함할 수 있거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 따라서, 용어 "비롯하다" 또는 "비롯한"은 "포함하거나, 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진다"를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 전환 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 이에 제한되지는 않지만 구체적으로 지시하지 않은 요소, 단계, 성분 또는 구성성분을 심지어 주요량으로 포함하고, 이의 포함을 허용하는 것을 의미한다. 전환 어구 "이루어지는"은 구체화되지 않은 임의의 요소, 단계, 성분 또는 구성성분을 제외한다. 전환 어구 "본질적으로 이루어진다"는 구체화된 요소, 단계, 성분 또는 구성성분에 및 실시양태에 실질적으로 영향을 미치지 않은 것들에 대한 실시양태의 범위를 제한한다. 본원에 사용된 바와 같이, 중대한 효과는 RgIA와 비교 시에 nAChR의 α9/α10 하위유형을 차단하는 본원에 개시된 코노톡신 펩티드의 능력에서 통계학적으로 유의한 감소의 원인이 될 것이다.

달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 모든 숫자는 모든 예에서 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 및 청구범위의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도가 아닌 것으로서, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 추가적 명료성이 요구되는 경우에, 용어 "약"은 언급된 수치 값 또는 범위와 함께 사용되는 경우에 통상의 기술자에 의해 합리적으로 여겨지는 의미를 갖고, 즉 언급된 값 또는 범위의 다소 초과 또는 다소 미만, 언급된 값의 ±20%; 언급된 값의 ±19%; 언급된 값의 ±18%; 언급된 값의 ±17%; 언급된 값의 ±16%; 언급된 값의 ±15%; 언급된 값의 ±14%; 언급된 값의 ±13%; 언급된 값의 ±12%; 언급된 값의 ±11%; 언급된 값의 ±10%; 언급된 값의 ±9%; 언급된 값의 ±8%; 언급된 값의 ±7%; 언급된 값의 ±6%; 언급된 값의 ±5%; 언급된 값의 ±4%; 언급된 값의 ±3%; 언급된 값의 ±2%; 또는 언급된 값의 ±1%의 범위 내에 있는 것을 나타낸다.

본 발명의 넓은 범위를 기재한 수치 범위 및 파라미터는 근사치이지만, 구체적 예에서 기재된 수치 값은 가능한 정확하게 기록된 것이다. 그러나 임의의 수치 값은 본질적으로 개별 시험 측정 시에 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인한 오차를 포함한다.

본 개시내용을 기술하는 문맥 (특히, 하기 특허청구범위의 문맥)에서 사용된 단수 용어 및 유사한 지시 대상은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한, 단수형과 복수형을 둘 다 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 그 범위에 포함되는 각 개별적 수치를 개별적으로 언급하기 위한 간단한 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 명세서에 달리 나타내지 않는 한, 각각의 개별적인 값은 본 명세서에 개별적으로 인용된 것과 같이 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 용어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 더 잘 예시하고자 하는 것이고, 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 실시양태의 분류는 제한적으로 해석되지 않아야 한다. 각 군의 구성원은 개별적으로 또는 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되거나 청구될 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원이 편의성 및/또는 특허성의 이유로 1개의 군에 포함되거나 그로부터 삭제될 수 있음을 예상할 것이다. 이러한 임의의 포함 또는 삭제가 발생할 경우, 명세서는 변형된 군을 함유하여, 첨부된 청구항에서 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 군의 서면상 기재를 충족하는 것으로 간주된다.

본 발명을 수행하기 위해 본 발명자에게 공지된 최선의 방식을 포함하는 본 발명의 특정 실시양태를 본원에 기재하였다. 물론, 기재된 실시양태에 대한 변형은 상기 기재를 읽은 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명자는 통상의 기술자가 적절한 변형을 사용할 것으로 예상하고, 본 발명자들은 본원에 명백히 기재한 것과 다르게 발명을 실행하는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 해당 법에 의해 허용된 본원에 첨부된 청구의 범위에 인용된 대상체의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본 발명의 모든 가능한 변형에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합은, 본원에 달리 나타내거나 또는 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.

또한, 다수의 참고문헌은 본 명세서 전체에 걸쳐 공개, 특허 및/또는 특허 출원 (집합적으로 "참고문헌")으로 이루어져 있다. 각각의 인용된 참고문헌은 그의 특정한 인용된 교시에 대한 참고로 본원에 개별적으로 포함된다.

끝으로, 본원에 개시된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원리를 예시하는 것임을 이해하여야 한다. 사용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예로서, 본 발명의 대안적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 나타내고 기재된 바에 정확하게 제한되는 것은 아니다.

본원에 나타낸 상세한 설명은 단지 예로서 본 발명의 바람직한 실시양태의 예시적인 논의를 위한 것으로, 본 발명의 다양한 실시양태의 원리 및 개념적 측면의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 기재인 것으로 여겨지는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해에 필요한 것보다 더 자세히 본 발명의 구조적인 세부 항목을 보여주기 위한 시도는 없었으며, 이러한 기재는 본 발명의 여러 형태가 실제로 구현될 수 있는 방법을 통상의 기술자에게 명백히 하기 위한 도면 및/또는 실시예와 함께 해석된다.

본 발명의 개시내용에 사용된 정의 및 설명은, 실시예에서 명백하게 및 분명하게 변형되지 않는 한, 또는 의미의 적용이 임의의 구성을 의미 없게 또는 본질적으로 의미 없게 하는 경우가 아닌 한, 임의의 미래 구성에서 지배적인 것으로 의미되고 의도된다. 용어의 구성이 그것을 의미 없게 또는 본질적으로 의미 없게 하는 경우에, 정의는 [Webster's Dictionary, 3rd Edition] 또는 통상의 기술자에게 공지된 사전, 예컨대 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)]으로부터 취해야 한다.

참고문헌

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Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 4 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 5 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Arg Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 6 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 7 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 8 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Trp 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 9 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 10 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 11 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 12 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Arg Arg Arg 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 13 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Tyr Arg Arg 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 14 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 15 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 16 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Trp 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 17 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Tyr Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 18 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Tyr Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 19 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is selenocysteine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is selenocysteine. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is citrulline. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 20 Gly Xaa Xaa Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is mono-iodo-Tyr <400> 21 Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Arg Cys Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conotoxin Peptide Analog <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Cys or selenocysteine <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Cys or selenocysteine <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser or Thr <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Cys or selenocysteine <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> Xaa is Arg, citrulline, or [omega]-nitro-Arg <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Tyr or mono-iodo-Tyr <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> Xaa is Arg, Gln, or Glu <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> Xaa is Cys or selenocysteine <220> <221> VARIANT <222> (13)..(13) <223> Xaa is Arg, Tyr, Phe, Trp, Tyr-Tyr, Tyr-Arg, Arg-Arg-Arg, Arg-Arg-Tyr, or Tyr-Arg-Arg <400> 22 Gly Xaa Xaa Xaa Asp Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (20)

1. 서열 22의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 2의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.
3. 제1항에 있어서, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20 또는 서열 21의 서열식을 포함하는 코노톡신 펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코노톡신 펩티드의 C-말단이 카르복실산 기인 코노톡신 펩티드.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Tyr, 아이오도-Tyr 또는 형광 태그가 카르복실산 기에 부가된 것인 코노톡신 펩티드.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 코노톡신 펩티드의 N-말단에 부가된 Tyr, 아이오도-Tyr, 피로글루타메이트 또는 형광 태그를 갖는 코노톡신 펩티드.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미드 고리화 백본을 포함하는 코노톡신 펩티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 코노톡신 펩티드 또는 그의 염, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
9. 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형과 연관된 하나 이상의 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 코노톡신 펩티드 또는 제8항의 제약 조성물을 투여하여 상기 상태를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (nAChR)의 α9α10 하위유형과 연관된 하나 이상의 상태를 치료하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상태가 통증인 방법.
11. 제10항에 있어서, 통증이 일반적 통증, 만성 통증, 신경병증성 통증, 침해수용성 통증, 염증성 통증, 말초 신경 손상에 의해 유발된 통증, 염증성 장애에 의해 유발된 통증, 대사 장애에 의해 유발된 통증, 암에 의해 유발된 통증, 화학요법에 의해 유발된 통증, 외과적 절차에 의해 유발된 통증 및/또는 화상에 의해 유발된 통증인 방법.
12. 제10항에 있어서, 통증이 화학요법-관련 만성 통증 및/또는 화학요법-관련 신경병증인 방법.
13. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상태가 염증성 상태인 방법.
14. 제13항에 있어서, 염증성 상태가 염증, 만성 염증, 류마티스성 질환, 패혈증, 섬유근육통, 염증성 장 질환, 사르코이드증, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 염증성 피부 질환, 폐의 염증성 상태, 신경계의 염증과 연관된 질환, 치주 질환 또는 심혈관 질환인 방법.
15. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상태가 통증 및 염증인 방법.
16. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상태가 염증 및 신경병증인 방법.
17. 제13항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 상태 및/또는 염증이 면역 세포에 의해 매개되는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 염증성 상태 및/또는 염증이 손상 후 장기 염증 및 말초 신경병증인 방법.
19. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상태가 암인 방법.
20. 제19항에 있어서, 암이 유방암인 방법.

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