JP6798998B2

JP6798998B2 - コノトキシンペプチドの修飾および使用

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Publication number: JP6798998B2
Application number: JP2017544555A
Authority: JP
Inventors: ショーン・ピー・アイアドナト; エルネスト・ジェイ・ムニョス
Original assignee: Kineta Chronic Pain LLC
Current assignee: Kineta Chronic Pain LLC
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2020-12-09
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: US11618772B2; KR102623475B1; IL284236B2; IL284236B; TW202120525A; US20210122792A1; TWI777260B; JP2022063872A; IL284236A; IL252152B; EP3215172A4; AU2015342767B2; AU2015342767A1; US11014970B2; HK1244201A1; TW201629085A; EP3215172B1; CA2966865C; JP2018500385A; TWI708790B

Description

この出願は、２０１４年１１月７日に出願された米国仮特許出願第62/123,123号を基礎とする優先権主張を行っており、その全内容は出典明示して本明細書に組み込まれる。

本開示は、コノトキシンペプチドの修飾配列、コノトキシンペプチドの医薬組成物、および疼痛その他の障害を処置するためのその使用方法を提供する。

イモガイ属の捕食性海カタツムリは、神経薬理学的活性ペプチド（コノトキシンペプチド、すなわち、イモガイタンパク質「CSP」）に富む毒を有する。イモガイ属には約５００種があり、すでに調査済みのものの中でも、保存された特徴は、それらの毒におけるα-コノトキシンペプチドの存在である。天然α-コノトキシンペプチドは、C1-C3およびC2-C4ジスルフィド結合で高度にジスルフィド架橋されたペプチドである。

それらの非システイン残基の高い配列変異のため、α-コノトキシンは極度に多様化し、各イモガイ種は、α-コノトキシンペプチドの独特の補体を有する。α-コノトキシンペプチドは、大きな前駆体として合成され、成熟トキシンは、その前駆体のC-末端に向かうタンパク質分解切断により生じる。成熟トキシンの変動的なシステイン間配列と比較して、前駆体およびそれらをコードする遺伝子は、所定のイモガイ種におけるα-コノトキシンペプチドの間および種から種への双方において完全に保存されている。

α-コノトキシンペプチドは、ニコチン様アセチルコリン受容体 (nAChR)アンタゴニストであることが遺伝子学的に示されている (McIntosh, et al., 1999; Janes, 2005; Dutton et al., 2001; Arias et al., 2000)。nAChRは、リガンド開口型イオンチャネルスーパーファミリーの一部であるアセチルコリン開口型イオンチャネルのグループである。それらは、中央イオン伝導チャネルを取り巻く膜貫通サブユニットのペンタマーである。多くの異なるサブユニットが同定され、ほとんどが、２つのメインのサブファミリー（αサブユニットおよびβサブユニット）に該当する。それらのサブユニットは、受容体ペンタマーにおける様々な組合せに関連し、受容体サブタイプの多様なファミリーをもたらす。ほとんどのサブタイプは、αおよびβサブユニットファミリーの双方に由来するサブユニットを含有し、例えば、成人筋肉サブタイプは、２つのαサブユニットおよびひとつのβサブユニット（δおよびεサブユニットに加えて）を含有し、そして、α4β2中枢神経系サブタイプは、α4およびβ2サブユニットから構成される。αサブユニットのみから構成されるnAChRの例は、α7およびα9サブタイプ（ホモペンタマー）およびα9α10サブタイプ（全てαヘテロペンタマー）から構成される。系統発生分析は、α7、α9、およびα10サブユニットは、それらが他のnAChRサブユニットに対するよりも、より密接に関連することを示す。

α9およびα10 nAChRサブユニットは、多様な組織の中で発現される。内耳において、α9α10 nAChRは、遠心性オリーブ蝸牛束と蝸牛有毛細胞との間のシナプス伝達を介在する。α9およびα10サブユニットは、後根神経節ニューロン、リンパ球、皮膚ケラチノサイト、および脳下垂体の結節部にも見出される。さらに、α9 nAChRサブユニットは、乳がんにおいて活性である。α-コノトキシンペプチドRgIA（配列番号：1）は、α9α10 nAChRをブロックすることが示された (Ellison, et al., 2006)。RgIAのある種のアナログもα9α10 nAChRをブロックすることが、米国特許出願公開第2009/0203616号、米国特許出願公開第2012/0220539号、および国際公開第2008/011006号で実証されている。

一般に、ペプチド薬物候補の治療可能性は、処方によって、または、それらの非共有または共有化学修飾によって向上することができる。治療薬としてのペプチドの実用化は、比較的低い溶解性および物理化学的安定性のため、薬物としての処方、および、動物またはヒトへの投与後のイン・ビボの双方において、制限されてきた。非経口ペプチド薬物は、特に、腎臓ろ過または細網内皮系によって、急速に、循環から取り除かれる。それらは、循環プロテアーゼによる急速分解にも頻繁に影響を受ける。最後に、ペプチドは免疫原性であり得、それは、抗体による除去または、いくつかの場合、炎症性反応（例えば、アナフィラキシー様反応）の発生のリスクのため、それらの治療的使用を制限する。さらに、ペプチドの経口送達は、２〜４個を超えるアミノ酸長のペプチドの取り込みを可能にする腸内での専用ペプチド輸送体の欠如、ならびに、胃の低pH環境の通過の困難性によって妨害される。

本開示は、RgIAおよびRgIAアナログを包含するα-コノトキシンペプチドに対する、疼痛および炎症用の治療薬におけるそれらの使用の可能性を増大するための修飾に関する。これらの変化はアミノ酸修飾を包含し、それは、ここで用いるとき、欠失、置換、および付加を含む。これらの変化は、脂肪酸鎖、アセチル基、PEG化、および／またはグリコシル化基のようなペプチドに対する非アミノ酸官能基または分子の付加も包含する。付加的な変化は、効率的に当該ペプチドを環化するグリシン-アラニンのN-からC-末端ブリッジを含有するように修飾されたRgIAアナログを包含する。これらのアプローチは、イン・ビトロおよびイン・ビボでのペプチド安定性を含む所望の薬物様特性を増強し、循環におけるそれらの半減期を増大し、胃の通過の容易化によるように経口バイオアベイラビリティーを増強し、吸収を増大し、ならびに、循環における一度の腎／肝クリアランスを減少させる。アナログコノトキシンペプチドのこれらの修飾を用いて、非常に高い選択性および親和性で、ニコチン様アセチルコリン受容体(nAChR)のα9α10サブタイプをブロックし、それによって、炎症性、神経性、がん性、およびその他の疾患状態における鎮痛および抗炎症性効果を生じる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号：10の式を含むコノトキシンペプチド。
（項目２）
配列番号：11の式を含む、項目１のコノトキシンペプチド。
（項目３）
配列番号：12の式を含む、項目２のコノトキシンペプチド。
（項目４）
配列番号：13-20のいずれかひとつの式を含むコノトキシンペプチド。
（項目５）
配列番号：174-185のいずれかひとつの式を含むコノトキシンペプチド。
（項目６）
前記ペプチドのC-末端がアミド基 (-NH2)である、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目７）
ペプチドが脂肪酸に結合されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目８）
前記脂肪酸が3から60個の炭素の脂肪酸である、項目７のコノトキシンペプチド。
（項目９）
コノトキシンペプチドのC末端のアミノ酸がD-アミノ酸立体異性体で交換されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１０）
前記N-末端アミノ酸がアセチル化アミノ酸である、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１１）
前記ペプチドがビオチン化されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１２）
前記ペプチドがメチル化されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１３）
前記ペプチドが１以上の部位にてリン酸化されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１４）
前記ペプチドがグリコシル化されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１５）
前記ペプチドが蛍光染料または蛍光性タンパク質に結合されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１６）
２つのシステイン残基が、各々、天然または非天然アミノ酸で交換され、ブリッジ形成のためにそれらが連結されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目１７）
システイン残基の各々が、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリシンから選択される天然産出アミノ酸の(R)-もしくは(S)-バージョンで交換されている、項目１６のコノトキシンペプチド。
（項目１８）
前記２つのシステイン残基のひとつ目が、側鎖にカルボン酸を含有する非天然アミノ酸で交換され、前記２つのシステイン残基のふたつ目が、側鎖にアミノ酸を含有する非天然アミノ酸で交換されている、項目１６のコノトキシンペプチド。
（項目１９）
前記システイン残基の各々が、(S)-プロパルギルグリシンまたは(S)-アジドノルバリンで交換されている、項目１６のコノトキシンペプチド。
（項目２０）
前記ブリッジがラクタムブリッジまたはトリアゾールブリッジである、項目１６のコノトキシンペプチド。
（項目２１）
リンカーが導入されてN-末端からC-末端への環化ペプチドが生成されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目２２）
前記リンカーが100個のアミノ酸の配列からなる、項目２１のコノトキシンペプチド。
（項目２３）
前記リンカーが非ペプチドである、項目２１のコノトキシンペプチド。
（項目２４）
前記ペプチドがポリエチレングリコールポリマーに結合されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目２５）
前記ペプチドがタンパク質に対する融合体として発現されている、項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチド。
（項目２６）
前記タンパク質が免疫グロブリンG (IgG)のFc部である、項目25のコノトキシンペプチド。
（項目２７）
項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチドを含む、医薬組成物。
（項目２８）
項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチドを含む、医薬上許容される塩。
（項目２９）
処置が必要な対象におけるニコチン様アセチルコリン受容体 (nAChR)のα9α10サブタイプに関連する少なくともひとつの症状の処置方法であって、治療的有効量のコノトキシンペプチド、コノトキシンペプチドを含む組成物またはコノトキシンペプチドを含む医薬上許容される塩を前記対象に投与することを含み、ここに、コノトキシンペプチドは項目１〜３いずれかのコノトキシンペプチドであって、それによって前記症状を処置する、処置方法。
（項目３０）
少なくともひとつの症状が疼痛である、項目２９の方法。
（項目３１）
疼痛が、全身疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、末梢神経損傷によって誘発された疼痛、炎症性障害によって誘発された疼痛、代謝障害によって誘発された疼痛、ガンによって誘発された疼痛、化学療法によって誘発された疼痛、手術によって誘発された疼痛および／または熱傷によって誘発された疼痛である、項目３０の方法。
（項目３２）
前記疼痛ががん関連慢性疼痛および／またはがん関連神経障害である、項目３１の方法。
（項目３３）
前記少なくともひとつの症状が炎症症状である、項目２９の方法。
（項目３４）
前記炎症症状が、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、子宮内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚病、肺の炎症症状、神経系の炎症に関連する疾患、歯周病、または心血管疾患である、項目３３の方法。
（項目３５）
前記炎症症状が免疫細胞によって媒介される、項目３４の方法。
（項目３６）
前記炎症症状が、手術後の長期炎症および末梢神経障害である、項目３５の方法。
（項目３７）
前記少なくともひとつの症状が疼痛および炎症である、項目２９の方法。
（項目３８）
前記少なくともひとつの症状が炎症および神経障害である、項目２９の方法。

図1A-1Gは、保存配列Asp-Pro-Argにおける保存アスパラギン酸残基の異性化を制約するRgIAに対する修飾を示す。異性化を図1Aに示す。修飾を図1B-1Gに示す。

図2Aおよび図2Bは、それぞれ、C-末端のアミド化後の血清中のCSP-2（配列番号：3）およびCSP-4（配列番号：5）の増大した安定性を示す。図2Aは、時刻0-2時間でのラット血清中のCSP-2およびCSP-2-NH2安定性を示し；CSP-2-NH2は、全時間にわたってCSP-2と比較して増大した安定性を示す。図2Bは、時刻0-24時間中、ヒト血漿（クエン酸）中のCSP-4およびCSP-4-NH2安定性を示し；CSP-4-NH2は、全時間にわたってCSP-4と比較して増大した安定性を示す。時刻=0にて採られた測定は、ペプチドを血清と混合する３０秒間以内に行われた。

図3A-3Dは、RgIAアナログにおけるブリッジの接続スキームを示す。XおよびYは、連結されてブリッジ形成するR-またはS-配置（すなわち、D-またはL-アミノ酸）の天然または非天然産出アミノ酸でのアミノ酸残基の置換を表す。配列番号：25において、XおよびYでの原アミノ酸はシステインであり、ブリッジはジスルフィド架橋である。連結基は、ペプチド、C1-C5アルカン、ジアルキルエーテル、ジアルキルチオエーテル、繰返しエトキシエーテル、アルケン；または、ブリッジング部分はペプチド骨格に直接結合させることができる。ブリッジング部分は、ジセレニド、ジスルフィド、5-または6-員環ヘテロサイクリック環、アルケン、アミド結合、カルバマート、ウレア、チオウレア、スルホナミド、スルホニルウレアであり得る。５員環の例示は、1,2-ジアゾール、オキサゾール、およびチアゾール、1,3-ジアゾール、オキサゾールおよびチアゾール、1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール、テトラゾールを含む。連結基ユニットに対する接続性は隣接環原子を通じて（すなわち、1,2-、もしくは1,5-）、または一つの環原子で隔てられ得る（すなわち、1,3-もしくは1,4-）。

図4は、ひとつのシステインジスルフィドおよびひとつのラクタムブリッジ（後者はグルタミン酸およびリシンに依拠する）で各々架橋されたペプチドの４つの例を示す。標準ペプチド合成法は主ペプチド鎖のために用いられ；ブリッジングアミドは、主ペプチド鎖に用いられる化学物質に関連しない保護基の使用により、選択的に形成し得る。Xは、システイン残基の天然または非天然産出アミノ酸での交換を示す。ここに示す４つの実例において、システインは、ポジション２にてグルタミン酸で、かつ、ポジション８にてリシンで交換され（ラクタム#1）、システインは、ポジション２にてリシンで、かつ、ポジション８にてグルタミン酸で交換され（ラクタム#2）、システインは、ポジション３にてグルタミン酸で、かつ、ポジション１２にてリシンで交換され（ラクタム#3）、システインは、ポジション３にてリシンで、かつ、ポジション１２にてグルタミン酸で交換されている（ラクタム#4）。

図5は、ひとつのシステインジスルフィドおよびひとつのトリアゾールブリッジ（後者は、修飾アミノ酸からの1,3-双極子環付加反応（すなわち「クリックケミストリー」）で形成される）で架橋されたペプチドの２つの実例を示す。Xは、ブリッジ形成用システイン残基を交換する修飾アミノ酸；ここでの実例において、前記修飾アミノ酸は(S)-プロパルギルグリシンおよび(S)-アジドノルバリンであって、それらは、結合して、示されるような1,2,3-トリアゾール環を形成している。

図6は、血漿中で測定されたCSP-4-NH2の薬物動態およびCSP-4-NH2の脂質化アナログを示す。CSP-4-NH2 (白抜き三角)、C12-CSP-4-NH2 (白抜き丸)およびC16-CSP-4-NH2 (黒四角)をマウスに皮下投与した (500 mg/Kg)。マウス、n=3。エラーバーは、３つのサンプルの平均値の標準誤差 (S.E.M.)を表す。CX-は、CSPにコンジュゲートした長さXの脂質部分を表す。

図7Aおよび7Bは、神経因性疼痛のカプサイシンモデルにおける脂質化CSP-4-NH2アナログの有効性を示す。500 mg/kg C12-CSP-4-NH2（図7A）およびC16-CSP-4-NH2（図7B）の皮下投与は、カプサイシン誘発熱的痛覚過敏を低減するのに有効であった（Hargreaves試験）。* は、ビヒクルと有意に異なる値を示す。P<0.05。ラット、n=6。エラーバーは、６つのサンプルのS.E.M.を表す。

図8は、ラットの化学療法誘発神経障害モデルにおける脂質化アナログ、C12-CSP-4-NH2の効力を示す。機械的痛覚過敏（t=0；Randal Selitto試験）は、C12-CSP-4-NH2 (500 mg/Kg)の単一皮下注射後、低下し、53時間持続した。* は、時刻0と有意に異なる値を示す。P<0.05。ラット、n=8。エラーバーは、８つのサンプルのS.E.M.を表す。

図9は、化学療法誘発神経因性疼痛モデルにおけるCSP-4-NH2のPEG化アナログの延長した薬物治療効果を示す。PEG-SVA-CSP-4-NH2は、PEG-SVA-CSP-4-NH2 (500 mg/Kg)の単一皮下注射後、化学療法誘発神経因性疼痛 (CINP)-機械的痛覚過敏（t=0；Randal-Selitto試験）を低減するのに有効であった。効果は75時間持続した。* は、時刻0と有意に異なる値を示す。P<0.05。ラット、n=8。エラーバーは、８つのサンプルのS.E.M.を表す。

本開示は、α-コノトキシンペプチドRgIA（配列番号：1）、α-コノトキシンペプチドRgIAのアナログであるコノトキシンペプチド、ならびに、それらの修飾物（集約的に、ここでは「RgIAアナログ」）に関する。これらのRgIAアナログは、ニコチン様アセチルコリン受容体 (nAChR)のα9α10サブタイプをブロックし、疼痛および炎症の処置に使用できる。これらの疼痛症状は、筋骨格疼痛、炎症性疼痛、ガン性疼痛、糖尿病性神経因性疼痛を含む神経因性疼痛シンドローム、化学療法誘発疼痛、帯状疱疹後神経痛、特発性神経因性末梢疼痛、幻肢疼痛、変形性関節症を含む整形外科性疼痛、および関節リウマチ性疼痛を含む自己免疫／炎症誘発性疼痛を含む。RgIAアナログは、ここに記載されるさらなる薬物開発にも用い得る。

海カタツムリは、餌食に対する神経毒性作用を有する多数のペプチドを産生する。イモガイ属由来のペプチドは、典型的に、長さにおいて１２〜３０個のアミノ酸の範囲であり、４個以上のシステイン残基を含有し；コノトキシンのサブタイプアルファは、C1-C3およびC2-C4接続性の２つのジスルフィド結合を含有し、形成する。α-コノトキシンペプチドはnAChRを結合する。これらのうちの一つ、RgIA（配列番号：1）は、神経因性疼痛および炎症のいくつかのモデルにおいて、鎮痛特性を有することが実証されているα9α10 nAChRに対して選択的である。保存システイン残基に加えて、プロリン残基も保存され、DPR領域はα9α10 nAChRに対する結合に機能する。9位のアルギニン残基はヒトα9α10 nAChRに対する増大した選択性と関連する。

すでに記載されている(PCT/US2014/040374)ように、RgIAのアナログが、ヒトα9α10 nAChR標的に対する親RgIAと比較して増大した親和性ならびに増大したイン・ビトロおよびイン・ビボ安定性のような所望する薬物様特性を有する（表１）。すでに記載されているように、RgIAアナログも、米国特許第6,797,808; 7,279,549; 7,666,840; 7,902,153; 8,110,549; 8,487,075; および8,735,541号；ならびに米国特許出願公開第12/307,953および13/289,494号に開示され；それらの配列は出典明示により本明細書に組み込まれる。本開示は、表２に列記するRgIAの付加的なアナログにも関する。

本開示は、鎮痛剤としての使用を含むそれらの治療的使用に対する薬物様特性を向上するために、表１および２に列記したものを含むRgIAアナログに施すことができる一連の修飾を記載する。

X11 = シトルリン
X12 = 3-ヨード-チロシン
X13 = セレノシステイン

X1 = des-X1, Argまたはシトルリン
X11 = シトルリン
X12 = 3-ヨード-チロシン
X13 = セレノシステイン
X14 = ヒドロキシ-Pro
X15 = ヨード-Tyr, ブロモ-Tyrを含むモノ-ハロTyr
X16 = ホモ-Argまたはオルニチン
X17 = ホモシステイン
X18 = オメガ-ニトロ-Arg
X19 = D-Arg
X20 = γ-カルボキシ-Glu (Gla)
X21 = 7-カルボキシ-Glu

様々な具体例において、ここに開示されるアナログRgIAアナログは、式X10 X6 X7 X3 D P R X8 X1 X12 X4 X9 X5 （配列番号：10）、式中、X1はdes-X1、Argまたはシトルリン；X3はdes-X3、Ser、またはThr；X4はdes-X4、ArgまたはGln；X5はdes-X5、Arg、Tyr、Phe、Trp、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg、Arg-Tyr、Arg-Arg-Tyr、またはTyr-Arg-Arg；X6はdes-X6、Cys、またはセレノシステイン；X7はdes-X7、Cys、またはセレノシステイン；X8はdes-X8、Cys、またはセレノシステイン；X9はdes-X9、Cys、またはセレノシステイン；およびX10はdes-X10またはGlyを有する。ひとつの具体例において、X10はGly、X6はCysまたはセレノシステイン、X7はCys、X3はSerまたはThr；X8はCysまたはセレノシステイン、X1はArgまたはシトルリン、X4はArgまたはGln、X9はCys、およびX5はArg、Tyr、Phe、Trp、またはArg-Arg-Arg（配列番号：11）である。ひとつの具体例において、X10はGly、X6はCysまたはセレノシステイン、X7はCys、X3はThr、X8はCysまたはセレノシステイン、X1はArgまたはシトルリン、X4はGln、X9はCys、およびX5はArgまたはTyr（配列番号：12）である。

様々な具体例において、RgIAおよびそのアナログに対する修飾がなされ、保存トリペプチド配列「Asp-Pro-Arg」中の保存アスパラギン酸残基のイソアスパラギン酸への異性化を防ぐ。この異性化を図1Aに示す。このアプローチは、この異性化を防ぎ、意図する標的への結合において高親和性および高い選択性の薬理特性を維持する安定なRgIAアナログ、すなわち、α9α10 nAChRを生じる。したがって、RgIAコノトキシンペプチドの小さな球状サイズにもかかわらず、ペプチド結合交換および、それによって提示される立案は、バイオ活性、強力、かつ、より安定なペプチドを生じる。３つの異なる化学アプローチを用いて評価する。第１の教示において、アスパラギン酸はアミノマロン酸（図1B；2-アミノプロパン二酸）で交換され、それは、側鎖が短縮されたアスパラギン酸の等価物である。短縮側鎖のこの誘導体は、異性体の生成に必要な5-員環無水コハク酸中間体を形成することができない。合成は、適当な保護アミノマロン酸（例えば、図1C）を用いる標準ペプチド化学で達成し得る。

次の２つの教示において、非-ペプチド結合は、アスパラギン酸交換およびプロリンのN-アルキル化によるプロリンに参画するように操作され；双方の実例は非加水分解性であり、それゆえ、異性化されにくい。

第２のアプローチは、アスパラギン酸のペプチド鎖カルボニル基をメチレン基で交換して（図1D）、「還元ペプチド結合」を得る。これは、自体が標準ペプチド化学によりペプチド鎖に組み込まれる(3S)-4-ブロモ-3-[[(1,1-ジメチルエトキシ)カルボニル]アミノ]-ブタン酸（図1E）のような適当に保護されたAsp交換でプロリンをアルキル化することによって調製できる。

第３のアプローチは、アスパラギン酸のペプチド鎖カルボニル基をケトメチル基で交換し（図1F）、それはAspおよびProの間でペプチド鎖にメチレン基を挿入した等価物である。これは、自体が標準ペプチド化学によりペプチド鎖に組み込まれる1,1-ジメチルエチル-(3S)-5-クロロ-4-オキソ-3-[[(フェニルメトキシ)カルボニル]アミノ]-ペンタノン酸塩（図1G）のような適当に保護されたAsp交換でプロリンをアルキル化することによって調製できる。

様々な具体例において、アミノ酸修飾は、酵素切断されやすいアミノ酸残基の交換によってペプチド安定性を向上し得る。そのような修飾は、対応するD-アミノ酸でのいずれかのL-アミノ酸の交換；Val、Nor-Val、Leu、またはIleを含む天然アミノ酸でのGlyの交換；HisまたはLysでのArgの交換；GlyでのProの交換；ProでのGlyの交換；および／またはセレノシステインでのシステインの交換を含む。そのような修飾がされた代表的ペプチド配列を表３に記載する。

X11 = シトルリン
X12 = 3-ヨード-チロシン
X13 = セレノシステイン
X14 = ヒドロキシ-Pro
X15 = ヨード-Tyr, ブロモ-Tyrを含むモノ-ハロTyr
X16 = ホモ-Argまたはオルニチン
X17 = ホモシステイン
X18 = オメガ-ニトロ-Arg
X19 = D-Arg
X20 = γ-カルボキシ-Glu (Gla)
X21 = 7-カルボキシ-Glu
X22 = O-ホスホ-Tyr, O-スルホ-Tyr, またはO-フルオロ-Tyr
X23 = モノ-フルオロ-グリシン
X24 = ジ-フルオロ-グリシン
X25 = D-Pro
X26 = D-Asp
X27 = D-Arg

様々な具体例において、標準ペプチド化学を用いて、リンカーをRgIAアナログペプチドに付加する。標的認識に関与することが示された保存領域周りの１以上のリンカーの付加は、RgIAアナログの安定性および結合親和性を増強する。そのような変化のある代表的ペプチド配列を表４に記載する。

X1 = des-X1, Arg, シトルリン, またはω-ニトロ-Arg
X2 = des-X2, Tyr, またはモノ-ヨード-Tyr
X3 = des-X3 Ser, またはThr
X4 = des-X4, Arg, またはGln
X5 = des-X5, Arg, Tyr, フェニルアラニン (PheまたはF), トリプトファン (TrpまたはW), Tyr-Tyr, Tyr-Arg, Arg-Arg-Arg, Arg-Arg, Arg-Tyr, Arg-Arg-Tyr, またはTyr-Arg-Arg
X6 = des-X6, Cys, またはセレノシステイン
X7 = des-X7, Cys, またはセレノシステイン
X8 = des-X8, Cys, またはセレノシステイン
X9 = des-X9, Cys, またはセレノシステイン
X10 = des-X10またはGly
AEA = 2-アミノエトキシ酢酸
AEEA = 2-[2-[エトキシ]エトキシ]酢酸
AEEEA = 2-[2-[2-[エトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸

様々な具体例において、RgIAアナログはN-末端および／またはC-末端に修飾を有することができる。そのような修飾は、N-末端Glyのアシル化および／またはC-末端のアミド化（表５）；N-末端Glyのアシル化、対応するD-異性体でのC-末端アミノ酸の交換（下付き文字で示す）および／またはC-末端のアミド化（表６）を含む。これらの変化がある選択された代表的なペプチド配列を表５および６に示す。

様々な具体例において、RgIAアナログは、ラクタムブリッジまたはトリアゾールブリッジのようなブリッジの付加によって修飾することができる。一例として、図3-5は、配列番号：25のペプチドに対する修飾によって形成されたブリッジ構造を示す。図3A-3Cは、RgIAナログにおけるブリッジについての３つの異なる接続スキームを示す。配列番号：25に適用する接続スキームにおいて、Xは、天然または非天然産出アミノ酸残基で各々置換されたシステイン残基を示す。ブリッジ#1および#2は、図3Dに示すブリッジング部分から形成される。所定のペプチドにつき、ブリッジ#1および#2は、同一または異なるブリッジング部分から形成することができる。ジスルフィド架橋から形成されたRgIAアナログは、ブリッジ#1および#2の双方を有することができる。

RgIAアナログは、ジスルフィド架橋のひとつまたは双方がラクタムブリッジで交換されたものを有することができる。図4は、RgIAアナログCSP-4-NH2（配列番号：25）におけるそのようなラクタムブリッジ交換の４つの配置の実例を示す。ポジション2、3、8、および12のXは、異なる天然アミノ酸でまたは非天然アミノ酸で交換されたシステイン残基を示す。標準ペプチド合成法は主ペプチド鎖に採用され；ブリッジングアミドは、主ペプチド鎖に用いられる化学物質に関連しない保護基の使用により、選択的に形成し得る。

RgIAアナログはひとつのシステインジスルフィドおよびひとつのトリアゾールブリッジを有することもできる。システイン残基の各々は、ブリッジ前駆体成分であり、その側鎖にアルキン基またはアジド基を含有するアミノ酸で交換され、ここに、前記アルキン基およびアジド基は、1,3-双極子環付加化学により連結されて、1,2,3-トリアゾールを形成する。トリアゾールブリッジは、1,3双極子環付加反応、例えば、「クリックケミストリー」から形成される。図5は、RgIAアナログCSP-4-NH2（配列番号：25）におけるそのようなトリアゾールブリッジ交換の４つの配置の実例を示す。ここで与えられる実例において、前記ペプチドにおける各Xは、(S)-プロパルギルグリシンまたは(S)-アジドノルバリンで交換されたシステイン残基を表す。

ここに開示されるRgIAアナログの「変異体」は、ここに開示されるアナログコノトキシンペプチドと比較して１以上のアミノ酸付加、欠失、終了位置、または置換を有するペプチドを含む。

アミノ酸置換は保存的または非保存的置換であり得る。ここに開示されるRgIAアナログの変異体は、１以上の保存的アミノ酸置換を有するものを含み得る。ここで用いるとき、「保存的置換」は、以下の保存的置換群のひとつに見出される置換を要件とする：群１：アラニン (AlaまたはA)、グリシン (GlyまたはG)、セリン (SerまたはS)、トレオニン (ThrまたはT)；群２：アスパラギン酸 (AspまたはD)、グルタミン酸 (GluまたはE)；群３：アスパラギン (AsnまたはN)、グルタミン (GlnまたはQ)；群４：アルギニン (ArgまたはR)、リシン (LysまたはK)、ヒスチジン (HisまたはH)；群５：イソロイシン (IleまたはI)、ロイシン (LeuまたはL)、メチオニン (MetまたはM)、バリン (ValまたはV)；および群６：フェニルアラニン (PheまたはF)、チロシン (TyrまたはY)、トリプトファン (TrpまたはW)。

なお、アミノ酸は、同様の機能、化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫）によって保存的置換群に分類し得る。例えば、脂肪族群は、置換の目的で、Gly、Ala、Val、Leu、およびIleを含むことができる。お互いが保存的置換であると考えられるアミノ酸を含有する他の群は、含硫：MetおよびCys；酸性：Asp、Glu、Asn、およびGln；小脂肪族、非極性または弱極性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、およびGly；極性、負荷電残基およびそれらのアミド：Asp、Asn、Glu、およびGln；極性、正荷電残基：His、Arg、およびLys；大脂肪族、非極性残基：Met、Leu、Ile、Val、およびCys；ならびに大芳香族残基：Phe、Tyr、およびTrp。さらなる情報がCreighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyに見出される。

ここに開示されまたは参照されるアナログコノトキシンペプチド配列の変異体は、ここに開示されまたは参照されるペプチド配列に対して、少なくとも70％配列同一性、少なくとも80％配列同一性、少なくとも85％配列、少なくとも90％配列同一性、少なくとも95％配列同一性、少なくとも96％配列同一性、少なくとも97％配列同一性、少なくとも98％配列同一性、または少なくとも99％配列同一性を持つ配列も含む。より詳しくは、ここに開示されるRgIAアナログの変異体は、配列番号：1-319のいずれかと70％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの80％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの81％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの82％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの83％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの84％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの85％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの86％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの87％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの88％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの89％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの90％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの91％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの92％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの93％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの94％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの95％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの96％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの97％配列同一性；配列番号：1-319のいずれかとの98％配列同一性；または配列番号：1-319のいずれかとの99％配列同一性を共有するペプチドを含む。

「％配列同一性」とは、２以上の配列を比較して決定された、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」も、当該配列の文字列のマッチにより決定された、ペプチド配列間の配列関連性の度合いを意味する。「同一性」（しばしば「類似性」ともいわれる）は、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1994); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G., ed.) Academic Press (1987); およびSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Oxford University Press, NY (1992)に記載された物を含む公知の方法で容易に算出できる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間のベストマッチを与えるように設計される。配列同一性および類似性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムでコード化される。配列アライメントおよびパーセント同一性計算は、LASERGENEバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのMegalignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin)を用いて実行することができる。配列の多重アライメントは、アライメントのClustal法（Higgins and Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989)をデフォルトパラメータ (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)）と共に用いて実行することもできる。関連するプログラムは、プログラムのGCGスイート (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin); BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); およびSmith-Watermanアルゴリズムを取り込んだFASTA プログラム (Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N.Y.も含む。この開示の文脈の中で、配列解析ソフトウェアが解析に用いられ、その分析結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくと理解されるであろう。ここで用いるとき、「デフォルト値」は、初期化の時にソフトウェアと元々ロードされたいかなるセットの値またはパラメータを意味する。

「D-置換アナログ」は、D-アミノ酸で置換された１以上のL-アミノ酸を有する、ここで開示したRgIAアナログを含む。D-アミノ酸は、前記アナログ配列に見出されるものと同一のアミノ酸タイプ、または、異なるアミノ酸であり得る。よって、D-アナログは変異体でもある。

「修飾」は、ここに開示されるRgIAアナログを含み、ここに、１以上のアミノ酸が非アミノ酸成分で交換されているか、または、アミノ酸が官能基にコンジュゲートされているか、または、そうでなければ、官能基がアミノ酸と関連している。修飾アミノ酸は、例えば、グリコシル化アミノ酸、PEG化アミノ酸（共有および非共有付加もしくはポリエチレングリコール(PEG)ポリマーの融合）、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、アシル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、脂肪酸のような脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸、または、有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸であり得る。修飾アミノ酸の存在は、例えば、(a) ポリペプチド血清半減期および／または機能的イン・ビボ半減期を増大すること、(b) ポリペプチド抗原性を低減すること、(c) ポリペプチド保存安定性を増強すること、(d) ペプチド溶解性を増強すること、(e) 循環時間を延長すること、および／または(f) バイオアベイラビリティーを増強すること、例えば、曲線下面積 (AUC_sc)を増大することにおいて有利である。アミノ酸は、例えば、組換え産生（例えば、哺乳類細胞内の発現の間のN-X-S/TモチーフでのN-結合型グリコシル化）の間に、同時翻訳的または後翻訳的に修飾し得、または、合成手段によって修飾し得る。修飾アミノ酸は、配列内部または配列の末端であり得る。修飾は、本明細書のいずれかに記載される誘導体を含み得る。

ペプチドは、腎臓または貪食細胞によって、容易にかつ投与後短時間で取り除かれる。さらに、ペプチドは、タンパク質分解酵素によって分解されやすい。異なる長さや構造の脂質アシル鎖へのコノトキシンペプチドの結合（脂質化）は、担体として作用する、アルブミンのような血中タンパク質との相互作用を促進することによって、循環中のペプチドの半減期を増大し得る。適切な脂質化部分は、完全飽和脂質ならびにモノ-、ビス-、トリス-、およびポリ-不飽和脂質のような不飽和脂質を含む。いくつかの具体例において、コア脂質部分は１を超えるコノトキシンペプチドとコンジュゲートしてもよい。例えば、ふたつの同一のコノトキシンペプチドは単一脂質部分にコンジュゲートしてもよい。

脂肪酸の活性化エステル、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステルまたは、脂肪酸と遊離カルボン酸および商業的に入手可能なペプチドカップリング試薬から誘導される他の活性化エステルなどは、ジメチルホルムアミドおよび塩基様ジイソプロピルエチルアミンのような溶媒中、N-末端グリシンのような遊離アミンを含有する目的のコノトキシンペプチドと混合する。混合物を暗所で１２〜１６時間撹拌し、脂質化コノトキシンペプチド生成物をセミ分取逆相クロマトグラフィーによって単離する。

ここに記載されるRgIAアナログの修飾は、IgGのFcドメインに対する前記ペプチドの融合も含み、かくして、RgIAペプチドの生物学的活性とモノクローナル抗体の安定性が組み合わさる。ここで記載するように、これらのRgIAペプチボディは、RgIAアナログインフレームをヒトIgGのFc部と融合することによる組換え技術によって生成する。これらペプチド-Fc融合タンパク質は、通常、60-70 kDa未満の分子量、すなわち、モノクローナル抗体の約半分の重量を有する。ペプチボディへのIgGのFc部の取込みは、FcRn保護で半減期を延長し得る。２つのFc領域の二量体化は、標的と相互作用する活性ペプチドの数を２倍まで増進する (Wu et al., 2014)。

ある種の具体例において、前記ペプチドは、IgGの他のドメインに対して、または、アルブミンに対して融合される。

修飾アミノ酸の存在は、例えば、(a) ポリペプチド血清半減期および／または機能的イン・ビボ半減期を増大すること、(b) ポリペプチド抗原性を低減すること、(c) ポリペプチド保存安定性を増強すること、(d) ペプチド溶解性を増強すること、(e) 循環時間を延長すること、(f) バイオアベイラビリティーを増強すること、例えば、曲線下面積 (AUC_sc)を増大すること、および／または(g) 粘膜吸収を増大することによって、経口バイオアベイラビリティーを増強することにおいて有利である。アミノ酸は、例えば、組換え産生（例えば、哺乳類細胞内の発現の間のN-X-S/TモチーフでのN-結合型グリコシル化）の間に、同時翻訳的または後翻訳的に修飾し得、または、合成手段によって修飾し得る。修飾アミノ酸は、配列内部または配列の末端であり得る。修飾は、本明細書のいずれかに記載される誘導体を含み得る。

C-末端は、カルボン酸またはアミド基であってよい。本開示は、(i) Tyr、ヨード-Tyr、蛍光タグのようなC-末端になされる付加、および／または、(ii) Tyr、ヨード-Tyr、ピログルタマート、もしくは蛍光タグのようなN-末端になされる付加によってさらに修飾されたRgIAアナログにも関する。

さらに、安定性の向上することが当業者に知られている残基または残基の群をC-末端および／またはN-末端に付加し得る。また、経口アベイラビリティを向上することが当業者に知られている残基または残基の群をC-末端および／またはN-末端に付加し得る。

ある種の具体例において、N-末端の修飾は、N-ホルミル、N-アセチル、N-プロピル、および長鎖脂肪酸基を含むアシル化を包含する。ある種の具体例においてN-末端の修飾はPYRO基の付加を包含する。ある種の具体例において、C-末端および／またはN-末端の修飾は、長さが4から24、10から18、または12から16個の炭素原子の脂肪酸の付加による脂肪酸化を包含する。

ある種の具体例において、ペプチドの修飾は、蛍光染料を包含する蛍光性標識へのペプチドのリンケージを包含する。

ある種の具体例において、ペプチドの修飾は、１以上のジスルフィド結合のアルカン（アルケンの水素化による）、Z-アルケン、E-アルケン、チオエーテル、セレノエーテル、トリスルフィド、テトラスルフィド、ポリエトキシエーテル、脂肪族リンカー、および／または、脂肪族リンカーと、閉環メタセシス反応により合成された１以上のアルケン部分（Z-もしくはE-異性体）との組合せなどの１以上のジカルバブリッジでの交換を包含する。

ある種の具体例において、ペプチドの修飾はPEG化を包含する。PEG化は、１以上のポリ-（エチレングリコール） (PEG)分子のペプチドまたはタンパク質への付加からなり、しばしば、タンパク質およびペプチド送達を促進する (Davies et al., 1977)。ペプチドは、腎臓貪食細胞によって、容易にかつ投与後短時間で取り除かれる。さらに、ペプチドは、タンパク質分解酵素によって分解されやすい。異なる長さや構造のポリエチレングリコール (PEG)へのコノペプチドの結合は、循環中のペプチドの半減期を増大し得る。PEG化は、ペプチドの分子量を増大し、かくして、腎臓でろ過されるその速度を低減し；PEG化は、ペプチドをプロテアーゼおよびマクロファージおよび除去可能な細網内皮系 (RES)の他の細胞から防御する。さらに、PEG化は、外来ペプチドに関連するいずれの免疫原性も低減する。

コノトキシンペプチドがいかにしてPEGにコンジュゲートし得るかという例は、メトキシポリ（エチレングリコール）-スクシンイミジル吉草酸塩のコノトキシンペプチドRgIAアナログCSP-4-NH2（配列番号：25）へのコンジュゲートである。5-10 mgのコノトキシンペプチドおよびmPEG-ブチルアルデヒドを、1.5:1モル比にて、0.25 mLの無水ジメチルホルムアミド中、0.0026 mL N,N-ジイソプロピルエチルアミンの存在下、室温にて16時間、暗所で、撹拌することによって反応させる。反応終了およびPEG化コノトキシンペプチドの濃度をPoroshell C18カラムを用いる逆相クロマトグラフィーによって測定する。もうひとつのタイプのPEGコンジュゲーション反応において、メトキシポリ（エチレングリコール）（すなわち、PEG）-ブチルアルデヒドをコノトキシンペプチドに連結する。5-10 mgのコノトキシンペプチドCSP-4-NH2およびmPEG-ブチルアルデヒドを、1.5:1モル比にて、0.2 mLの100％メタノール中、室温にて15分間、撹拌することによって反応させる。シアノ水素化ホウ酸ナトリウムの水溶液を1 mg/mLの最終濃度にし、その後、16時間、室温にて、暗所で混合する。反応終了およびPEG化-コノトキシンペプチドの濃度をPoroshell C18カラムを用いる逆相クロマトグラフィーによって測定する。mPEG-コンジュゲーティッドコノトキシンペプチドを、脱塩カラム中での遠心による過剰なコノトキシンペプチドの除去によって精製する。サンプルを、メタノール-平衡化Zeba Spin脱塩カラム（2mL容積、7,000分子量カットオフ、ThermoScientific）中、1000 x gにて2分間、遠心する。反応終了およびspun-through material中のPEG化コノトキシンペプチドの濃度をPoroshell C18カラムを用いる逆相クロマトグラフィーによって測定する。

本開示は、さらに、開示されたRgIAアナログの誘導体を対象とする。誘導体は、循環置換 (cyclic permutation)を有するRgIAアナログを包含し、ここに、循環置換は天然コノトキシンペプチドの天然ブリッジングパターンを維持し（Craik, et al. (2001)）、例えば、環化コノトキシンペプチドはアミド環化骨格を有して、コノトキシンペプチドは、自由N-またはC-末端を有さず、コノトキシンペプチドは天然ジスルフィド結合を包含する（米国特許第7,312,195号）。ひとつの具体例において、環化コノトキシンペプチドは、線状コノトキシンペプチドおよびペプチドリンカーを結合して、アミド環化ペプチド骨格を形成する。いくつかの具体例において、ペプチドリンカーは、Gly、Alaおよびそれらの組合せから選択されるアミノ酸を包含する。

様々な環化方法を、ここに記載するRgIAアナログに適用し得る。ここに記載するRgIAアナログは、例えば、Clark, et al., 2013、およびClark, et al., 2012に記載されるアラニンブリッジを用いて容易に環化し得る。RgIAアナログを環化することは、それらの特定標的に対するRgIAアナログの親和性に影響することなく、それらの経口バイオアベイラビリティーを増進し、かつ、タンパク質分解への感受性を低減する。環化は、それぞれ、N-およびC-末端の間、ならびに、C1-C3およびC2-C4の間のジスルフィド架橋で生じ、GAAGAG環化リンカーは、１〜８個の間のいずれの長さのアミノ酸であり得、いずれかのアミノ酸配列から構成される。ある種の具体例において、環化は、ポリエトキシエーテル、脂肪族リンカー、および／または、脂肪族リンカーと閉環メタセシス反応により合成された、炭化水素鎖中の１以上のアルケン部分（Z-もしくはE-異性体）とのいずれかの組合せを包含する非-ペプチドリンカーのような代替的リンカーも用いてなされる。

X3 = des-X3, Ser, またはThr

ここに開示される具体例は、ここに記載されるRgIAアナログならびに、ここに記載されるRgIAアナログの変異体、D-置換アナログ、修飾、および誘導体を包含する。いくつかの具体例において、変異体、D-置換アナログ、修飾、および誘導体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18配列の付加 (additions)、欠失 (deletions)、終了位置 (stop positions)、置換 (substitutions)、交換 (replacements)、コンジュゲーション (conjugations)、アソシエーション (associations)、またはパーミューテーション (permutation)を有する。ここに開示する各コノトキシンペプチドは、ここに開示するアナログコノトキシンペプチド配列のポジション1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または8を包含するいずれかのポジションに付加、欠失、終了位置、置換、交換、コンジュゲーション、アソシエーション、またはパーミューテーションも包含する。

いくつかの具体例においてXaaポジションは、アナログコノトキシンペプチドのいずれかのポジションに包含され、Xaaは、付加、欠失、終了位置、置換、交換、コンジュゲーション、アソシエーションまたはパーミューテーションを示す。特別な具体例において、各アナログコノトキシンペプチドは、１以上のポジション1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、または18個のXaaポジションを有する。

アナログは、１を超える変化（付加、欠失、終了位置、置換、交換、コンジュゲーション、アソシエーション、またはパーミューテーション）を有し、１以上の変異体、D-置換アナログ、修飾、および／または誘導体としての資質がある。すなわち、アナログ、変異体、D-置換アナログ、修飾および／または誘導体のひとつの分類の包含は、他の分類への包含に対して排他的ではなく、全ては、集約的に、ここでは、「コノトキシンペプチド」という。

コノトキシンペプチドは組み換えDNA技術を用いて調製し得る。コノトキシンペプチドはMerrifield固相合成を用いて調製することもできるが、分野公知である他の等価な化学合成も使用できる。固相合成は、適切な樹脂への保護α-アミノ酸のカップリングによりコノトキシンペプチドのC-末端から開始する。そのような出発原料は、エステルリンケージによってα-アミノ-保護アミノ酸をクロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂に付着させるか、または、ベンゾヒドリルアミン (BHA)樹脂またはパラ-メチルベンゾヒドリルアミンアミン (MBHA)樹脂へのアミド結合により調製し得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodansky et al. (1966)に記載される。クロロメチル化樹脂は、Bio Rad Laboratories (Richmond, Calif.)から商業的に入手可能である。そのような樹脂の調製は、Stewart and Young (1969)に記載される。BHAおよびMBHA樹脂サポートは商業的に入手可能であり、合成される所望のコノトキシンペプチドがC-末端に未置換アミドを有する場合、通常用いられる。かくして、固体樹脂サポートは、式−O−CH2-樹脂サポート、−NH BHA樹脂サポート、または−NH-MBHA樹脂サポートを有するもののような、分野公知のもののいずれかである。未置換アミドが所望される場合、BHAまたはMBHA樹脂の使用が有利である。なぜならば、切断が直接アミドを与えるからである。N-メチルアミドが所望される場合、N-メチルBHA樹脂から発生し得る。他の置換アミドが所望されるならば、米国特許第4,569,967号の教示を使用し得、あるいは、遊離酸以外の基がC-末端に所望されるならば、Houben-Weylテキスト (1974)に記載される古典的な方法を用いてコノトキシンペプチドを合成することが可能である。

BocまたはFmocによって、かつ、側鎖保護基によって保護されるC-末端アミノ酸は、適当であれば、まず、Horiki et al. (1978)に記載された手順にしたがって、クロロメチル化樹脂に結合することができ、C-末端に遊離酸を有するコノトキシンペプチドが合成される場合、約60℃にて24時間撹拌しながら、ジメチルホルムアミド (DMF)中のKFを用いる。樹脂サポートに対するBOC-保護アミノ酸のカップリング後、α-アミノ保護基は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸 (TFA)または単独のTFAを用いることによって除去し得る。脱保護は、0℃と室温との間の温度にて実行し得る。ジオキサン中HClなどの他の標準切断試薬および特定α-アミノ保護基の除去の条件は、Schroder & Lubke (1965)に記載されるように用いることができる。

α-アミノ-保護基の除去後、残存するα-アミノ-および側鎖-保護アミノ酸は、所望する順序で段階的に連結して中間化合物を得るか、または、合成において各アミノ酸を別箇に添加することの代替として、固相反応器に添加する前に、それらのいくつかを互いに連結することができる。適当なカップリング試薬の選択は、当該分野の技術範囲内である。代表的なカップリング試薬は、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（HoBtまたはHoAtの存在下、DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU）を包含する。

コノトキシンペプチドを包含するペプチドの固相合成に用いる活性化試薬は分野周知である。適切な活性化試薬の例は、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミドおよびN-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドのようなカルボジイミドを包含する。他の活性化試薬およびペプチドカップリングにおけるそれらの使用は、Schroder & Lubke (1965)およびKapoor (1970)に記載される。

各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は、２倍量以上過剰に固相反応器に導入でき、カップリングは、DMF:CH₂Cl₂ (1:1)の媒体中で、または、単独のDMFもしくはCH₂Cl₂中で行うことができる。中間カップリングが発生する場合、カップリング手順は、次のアミノ酸のカップリングに先駆けて、α-アミノ保護基の除去前に反復し得る。合成の各段階でのカップリング反応の成功は、手動で実行するならば、Kaiser, et al. (1970)に記載されるように、ニンヒドリン反応でモニターし得る。カップリング反応は、Beckman 990自動合成器で、Rivier, et al. (1978)に報告されているもののようなプログラムを用いて、自動で実行し得る。

所望するアミノ酸配列が完了した後、ペプチドを樹脂から切断するのみならず、全ての残存側鎖保護基および、予め除去して遊離酸の形態のペプチドを得ていなければ、N-末端のα-アミノ保護基も切断する液体フッ化水素またはTFA（Fmoc化学を用いるならば）のような試薬での処置によって、中間ペプチドを樹脂サポートから除去し得る。Metが配列中に存在すれば、Boc保護基を、まず、TFA/エタンジチオールを用いて除去し、HFでペプチドを樹脂から切断して潜在的なS-アルキル化を除外する。切断にフッ化水素またはTFAを用いるとき、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメチルエチルスルフィドのような、１以上のスカベンジャーを反応容器に入れることができる。

線状コノトキシンペプチドの環化を行って、ペプチド-樹脂の一部分としてコノトキシンペプチドを環化するときとは対照的に、Cys残基間の結合を創製し得る。そのようなジスルフィド環化リンケージを行うために、完全保護コノトキシンペプチドを、分野周知のアンモノリシスによってヒドロキシメチル化樹脂またはクロロメチル化樹脂サポートから切断して、当該完全保護アミド中間体を生成し、その後、それを適宜環化し脱保護する。あるいは、脱保護、ならびに、上記樹脂またはベンズヒドリルアミン (BHA)樹脂もしくはメチルベンズヒドリルアミン (MBHA)からのコノトキシンペプチドの切断は、0℃にてフッ化水素酸 (HF)またはTFAで行い、その後上記のように酸化する。

コノトキシンペプチドは、自動合成器を用いて合成することもできる。これらの具体例において、アミノ酸は、Advanced Chemtech 357自動ペプチド合成器を用いて、C-末端から始めて、連続的にMBHA Rink樹脂（典型的に100 mgの樹脂）に連結し得る。カップリングは、N-メチルピロリドン (NMP)中の1,3-ジイソプロピルカルボジイミドを用いて、または、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩(HBTU)およびジエチルイソプロピルエチルアミン (DIEA)により行う。Fmoc保護基は、ジメチルホルムアミド (DMF)中ピペリジンの20％溶液で処置することによって除去し得る。樹脂は、引き続き、DMF（２回）、その後メタノールおよびNMPで洗浄する。

コノトキシンペプチド医薬組成物内に調合することができる。「医薬組成物」とは、医療投与に適した、物理的に分離した一貫性のある単位を意味する。「単位剤形の医薬組成物」とは、医療投与に適した、物理的に分離した一貫性のある単位であって、各々が、治療的有効量、または、治療的有効量の倍数（４倍まで）もしくは約数（４０分の１まで低下）のコノトキシンペプチドを医薬上許容される担体と共に含有する。医薬組成物が、日用量、または、例えば、日用量の半分、３分の１もしくは４分の１を含有するかどうかは、それぞれ、医薬組成物を一日１回または、例えば、２回、３回もしくは４回投与するかどうかに依存する。

医薬組成物中のコノトキシンペプチドの量および濃度ならびに医薬組成物の分量は、医薬組成物中のコノトキシンペプチドの溶解性、コノトキシンペプチドの薬効および活性、および医薬組成物の投与の仕方に基づき選択し得る。唯一必要なことは、コノトキシンペプチドが治療的有効量を構築すること、適切な有効用量が、単一または多重単位用量に採用される剤形と一致するようにすることである。

医薬組成物は、通常、組成物全体の重量あたり、0.0001から99重量％、好ましくは0.001から50重量％または0.01から10重量％のコノトキシンペプチドを含有する。コノトキシンペプチドに加えて、医薬組成物は、他の薬物または試薬も含有し得る。他の薬物または試薬の例は、鎮痛剤、サイトカイン、および、臨床医学の主要な領域の全てにおける治療薬を包含する。
他の薬物または試薬と共に用いる場合、コノトキシンペプチドは、薬物カクテルの形態で送達することができる。カクテルは、いずれかひとつのコノトキシンペプチドと別の薬物または試薬との混合物である。この具体例において、普通の投与媒体（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、ポンプ、注射用溶液など）は、コノトキシンペプチドを他の薬物または試薬と組み合わせて、双方を含有する。カクテルの個別の成分は、各々、治療的有効量で投与されるか、または、それらの投与が組合せで治療的有効量を創製する。

医薬組成物は、研究、予防、および／または治療処置のために関わらず、顕著に不利な、アレルギー性の、その他、投与の利益を上回る不都合な反応を生じないものを包含する医薬上許容される担体を含む。代表的な医薬上許容される担体および製剤は、Remington, 2005に開示される。さらに、医薬組成物は、生物標準の米国食品医薬品局 (FDA)事務局により要求される無菌性、発熱性、ならびに／または一般安全性および純度標準に合致するように調剤し得る。

典型的に、コノトキシンペプチドは、選択された投与の態様につき選ばれた１以上の医薬上許容される担体と混合される。送達方法の例は、米国特許第5,844,077号を参照せよ。

代表的な通常用いられる医薬上許容される担体は、いずれかのまたはすべての、増量剤、充填剤、溶媒、共溶媒、分散媒体、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、離型剤、吸収遅延剤、塩、安定化剤、緩衝剤、キレート剤、ゲル、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、着色剤、着香料、甘味剤、および芳香剤を包含する。

代表的な緩衝剤は、クエン酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、酒石酸塩バッファー、フマル酸塩バッファー、グルコン酸塩バッファー、シュウ酸塩バッファー、乳酸塩バッファー、酢酸塩バッファー、リン酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー、およびトリメチルアミン塩を包含する。

代表的な防腐剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ベンゾアルコニウムハライド、ヘキサメトニウムクロライド、アルキルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、および3-ペンタノールを包含する。

代表的な等張剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールのような、多価糖アルコール、三価糖アルコール、または高級糖アルコールを包含する。

代表的な安定化剤は、有機糖類、多価糖アルコール、ポリエチレングリコール、含硫還元剤、アミノ酸、低分子量ペプチド、免疫グロブリン、親水性ポリマー、および多糖類を包含する。

代表的な抗酸化剤は、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミン、システイン塩酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、油溶性抗酸化剤、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール (BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン (BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール、金属キレート剤、クエン酸、エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸を包含する。

代表的な滑沢剤は、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウを包含する。

代表的な医薬上許容される塩は、無機または有機酸および／または塩基、好ましくは塩基性塩で形成された、酸性および／または塩基性塩を包含する。医薬上許容される塩が好ましいが、特に、コノトキシンペプチドを医薬として採用するとき、例えば、これらのコノトキシンペプチドの処理において他の塩が有用であることが分かり、あるいは、非医薬的使用が想定される。これらのコノトキシンペプチドの塩は、当該分野で認識されている技術により調製することができる。

代表的な医薬上許容される塩は、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩,イソチオン酸塩、テオフィリン酢酸塩、およびサリチル酸塩のような無機および有機付加塩を包含する。低級アルキル四級アンモニウム塩を用いることもできる。

経口投与について、コノトキシンペプチドは、カプセル、丸剤、錠剤、トローチ、メルト、散剤、懸濁剤、または乳剤のような固体または液体製剤に調剤され得る。経口剤形の組成物を調製するにあたり、通常の医薬上許容される担体のいずれか、例えば、経口固体製剤（例えば、散剤、カプセルおよび錠剤など）の場合、デンプン、糖類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など；または、経口液体製剤（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤など）の場合、水、グリコール、オイル、アルコール、着香料、防腐剤、着色剤、懸濁化剤などの担体を採用することができる。それらの投与の容易さのため、錠剤およびカプセルが有利な経口単位剤形を代表し得、その場合、固体医薬担体が明らかに採用される。所望すれば、標準技術によって、錠剤を糖衣し、または腸溶性コートすることができる。コノトキシンペプチドをカプセル化して、消化管を通過するのに安定にすることができ、同時に、ある種の具体例において、血液脳関門の通過を可能にする。例えば、国際公開第96/11698号を参照せよ。

非経口投与について、コノトキシンペプチドを医薬上許容される担体に溶解し、液剤または懸濁剤のいずれかとして投与することができる。代表的な医薬上許容される担体は、水、食塩水、デキシトロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物性、植物性もしくは合成由来オイルを包含する。担体は、他の成分、例えば、防腐剤、懸濁化剤、可溶化剤、バッファーなども含有することができる。

コノトキシンペプチドは、送達と同時に適当な医薬上許容される担体で再生するために粉末状であり得る。もうひとつの具体例において、コノトキシンペプチドの単位剤形は、滅菌、気密アンプルまたは滅菌シリンジに入った、適切な希釈剤中のコノトキシンペプチドまたは医薬上許容されるその塩の溶液であり得る。

コノトキシンペプチドはデポ製剤にも調剤できる。デポ製剤は、適切なポリマー性または疎水性物質（例えば、許容されるオイル中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂で調剤され、または、難溶性誘導体、例えば、難溶性として調剤できる。

なお、コノトキシンペプチドは、少なくともひとつの化合物を含有する固体ポリマーの半透過性マトリクスを利用する徐放システムとして調剤できる。様々な徐放材料が確立され、当業者によく知られている。徐放システムは、その化学特性に応じて、投与後、数週間から１００日間を超えるまでコノトキシンペプチドを放出することができる。

コノトキシンペプチドの投与は、ポンプ（例えば、Luer et al., (1993), Zimm, et al. (1984) and Ettinger, et al. (1978)を参照せよ）；マイクロカプセル化（例えば、米国特許第4,352,883、4,353,888、および5,084,350号を参照せよ）；持続放出型ポリマーインプラント（例えば、米国特許第4,883,666号を参照せよ)；およびマクロカプセル化（例えば、米国特許第5,284,761、5,158,881、4,976,859、および4,968,733号ならびにＰＣＴ特許出願の国際公開92/19195、95/05452号を参照せよ）を用いて達成することもできる。

コノトキシンペプチドを髄腔内投与するとき、それらを脳脊髄液に溶解することもできる。CNSに対する裸のすなわち非カプセル化細胞移植も用いることができる。例えば、米国特許第5,082,670および5,618,531号を参照せよ。

本開示のコノトキシンペプチドおよびその医薬組成物は、対象におけるニコチン様アセチルコリン受容体 (nAChR)のα9α10受容体サブタイプに関連する症状を処置する方法に有用である。nAChRのα9α10サブタイプをブロックすることにおけるRgIAおよびそのアナログを含むある種のα-コノトキシンの活性は、nAChRの異なるサブタイプを発現する卵母細胞を用いる研究(Ellison et al., 2006; Vincler et al., 2006; 国際公開第2008/011006号; 米国特許出願公開第2009/0203616号; 米国特許出願公開第2012/0220539号)において、ここに示されている。RgIAを含むα-コノトキシンの抗侵害受容剤および鎮痛剤としての活性は、慢性絞扼損傷の研究 (Vincler, et al., 2006; 国際公開第2008/011006号; 米国特許出願公開第2009/0203616号)において、ここに示されている。免疫細胞の移動を阻害することにおける、RgIAを含むα-コノトキシンの活性は、慢性絞扼損傷の研究の研究 (Vincler, et al., 2006; 国際公開第2008/011006号; 米国特許出願公開第2009/0203616号)に示されている。

ここに記載される方法は、その必要のある対象に、治療的有効量の開示したコノトキシンペプチドまたは医薬上許容されるその塩を投与することを包含し、ここに、開示したコノトキシンペプチドはnAChRのα9α10サブタイプをブロックする。nAChRのα9α10サブタイプをブロックするコノトキシンペプチドは、疼痛の処置に、炎症および／または炎症症状の処置に、ならびに、がんおよび／またはがん関連疼痛の処置に、有用である。ある種の具体例において、コノトキシンペプチドは、免疫細胞の移動を阻害する能力に基づき、有効である。他の具体例において、化合物は、脱髄を遅延させ、および／または無傷の神経線維数を増加させる能力に基づき、有効である。

ここに開示する方法は、対象（ヒト、脊椎動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）、および実験動物（サル、ラット、マウス、魚類など））を、医薬上許容されるその塩およびそのプロドラッグ薬物を包含するここに開示するコノトキシンペプチドで、処置することを包含する。対象を処置することは、治療的有効量の開示したコノトキシンペプチドを送達することを包含する。治療的有効量は、有効量、予防処置、および／または治療処置に有効な量を提供するものを包含する。

「有効量」は、対象において所望する生理的変化を生じるのに必要なコノトキシンペプチドの量である。有効量は、しばしば、調査目的で投与される。ここに開示する有効量は、疼痛、炎症症状、炎症、および／またはがんの処置における、コノトキシンペプチドの有効性を研究する目的の調査アッセイにおいて、所望する生理的変化を生じる。

「予防処置」は、疼痛、炎症症状、炎症、および／もしくはがんの徴候もしくは症状を呈していない対象または疼痛、炎症症状、炎症、および／もしくはがんの初期の徴候もしくは症状を呈している対象に投与する処置を包含し、処置は、前記疼痛、炎症症状、炎症、および／またはがんがさらに進展するリスクを減退し、防止し、または低減する目的で投与される。かくして、予防処置は、疼痛、炎症症状、炎症、および／またはがんに対する防止的処置として機能する。

「治療処置」は、疼痛、炎症症状、炎症、および／またはがんの症状または徴候を呈している対象に投与する処置を包含し、処置は、前記疼痛、炎症症状、炎症、および／もしくはがんの徴候または症状を減退し、または、除外する目的で対象に投与される。治療処置は、疼痛、炎症症状、炎症、および／もしくはがんの存在もしくは活性を低減し、制御し、もしくは除外し、ならびに／または、疼痛、炎症症状、炎症、および／もしくはがんの副作用を低減し、制御し、もしくは除外し得る。

処置できる代表的なタイプの疼痛は、全身疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、および炎症性疼痛を包含する。さらに、これらのタイプの疼痛は、末梢神経または侵害受容器損傷、炎症症状、代謝障害、ウイルス感染、がん、化学療法剤によって誘発された疼痛、手術後誘発された疼痛、および、熱傷その他の物理的組織損傷によって誘発された疼痛を包含する原因に関連し、および／または誘発される。

化学療法誘発神経因性疼痛 (CINP)の処置における治療的有効量は、機械的痛覚過敏、機械的アロディニア（通常は疼痛を引き起こさない刺激による疼痛）、熱的（高温誘発 (heat-induced)）痛覚過敏、熱的（低温誘発 (cold-induced)）アロディニア、移動性免疫細胞数、炎症性メディエータのレベル、および／または対象報告主観的疼痛レベルを低減するものを包含し得る。

熱傷-誘発神経因性疼痛の処置における治療的有効量は、機械的痛覚過敏、機械的アロディニア（通常は疼痛を引き起こさない刺激による疼痛）、熱的（高温誘発 (heat-induced)）痛覚過敏、熱的（低温誘発 (cold-induced)）アロディニア、移動性免疫細胞数、炎症性メディエータのレベル、および／または対象報告主観的疼痛レベルを低減するものを包含し得る。

手術後神経因性疼痛の処置における治療的有効量は、機械的痛覚過敏、機械的アロディニア（通常は疼痛を引き起こさない刺激による疼痛）、熱的（高温誘発 (heat-induced)）痛覚過敏、熱的（低温誘発 (cold-induced)）アロディニア、移動性免疫細胞数、炎症性メディエータのレベル、および／または対象報告主観的疼痛レベルを低減するものを包含し得る。

処置できる代表的な炎症症状は、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患（関節炎、狼瘡、強直性脊椎、線維筋痛症、腱鞘炎、滑液包炎、強皮症、および痛風を包含する）、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を包含する）、サルコイドーシス、子宮内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚疾患（乾癬および創傷治癒障害を包含する）、肺の炎症症状（喘息および慢性閉塞性肺疾患を包含する）、神経系の炎症に関連する疾患（多発性硬化症、パーキンソン病およびアルツハイマー病を包含する）、歯周病、ならびに心血管疾患を包含する。

炎症症状の処置における治療的有効量は、遺伝子発現での炎症性マーカーのレベルもしくはタンパク質レベルを低減し、および／または、移動性免疫細胞数を減じるものを包含し得る。さらに、炎症症状に関連する疼痛は、機械的痛覚過敏、機械的アロディニア、熱的（高温誘発 (heat-induced)）痛覚過敏、熱的（低温誘発 (cold-induced)）アロディニアおよび／または対象報告主観的疼痛レベルの低減をもたらす治療的有効量で処置できる。

処置できる代表的ながんは、乳がんを包含する。α9-nAChRはヒト乳房腫瘍組織に過剰発現され (Lee et al., 2010a)、siRNAまたは他の機序による受容体阻害は、乳がん細胞のイン・ビトロおよびイン・ビボ発がん性を減少させ、がん細胞増殖の阻害を包含する (Chen et al., 2011)。ある種の具体例において、RgIAアナログは、α9-nAChRの阻害による腫瘍増殖を阻害するための治療量で用いる。

乳がんのようながんの処置における治療的有効量は、処置後の対象において、腫瘍細胞数を低減し、転移数を低減し、腫瘍体積を低減し、平均余命を増加し、がん細胞のアポトーシスを誘発し、がん細胞死を誘発し、がん細胞における化学または放射線感受性を誘発し、がん細胞近辺の血管新生を阻害し、がん細胞増殖細胞を阻害し、腫瘍増殖細胞を阻害し、転移を防止し、対象の生命を延長し、がん関連疼痛を減少し、および／またはがんのぶり返しもしくは再発を減少するものを包含し得る。

投与につき、治療的有効量は、最初、イン・ビトロアッセイおよび／または動物モデル研究からの結果に基づき、見積もることができる。例えば、用量を動物モデルに調合され、特別の標的に対して細胞培養で決定されたIC50を包含する循環濃度範囲を達成し得る。そのような情報を用いて、目的の対象における治療上有効量をより正確に決定し得る。

治療的有効量として、特別の対象に実際に投与される量は、医者、獣医、または研究者が、標的；体重；症状の重篤性；疼痛のタイプ、炎症症状、またはがん；事前または同時治療的介入；対象の特発性；および投与経路を包含する物理的および生理的因子などのパラメータを考慮して決定し得る。

用量は、局所的または全身的に所望されるコノトキシンペプチドレベルを達成するように、適宜調節することができる。典型的に、本開示のコノトキシンペプチドは、0.001 mg/kgから250 mg/kg、好ましくは0.01 mg/kgから100 mg/kgの範囲のコノトキシンペプチド、より好ましくは0.05 mg/kgから75 mg/kgの用量にてにてそれらの効果を奏する。適切な用量は、一日あたり多重または分割用量で投与し得る。典型的に、用量または分割用量は、単位剤形あたり0.1 mgから500 mgのコノトキシンペプチドを含有することができる。より好ましい用量は、単位剤形あたり0.5 mgから100 mgのコノトキシンペプチドを含有する。

治療上有効量である付加的な用量は、しばしば、0.1から5 μg/kgまたは0.5から1 μg /kgの範囲であり得る。他の具体例において、用量は、1 μg /kg、5 μg /kg、10 μg /kg、15 μg /kg、20 μg /kg、25 μg /kg、30 μg /kg、35 μg/kg、40 μg/kg、45 μg/kg、50 μg/kg、55 μg/kg、60 μg/kg、65 μg/kg、70 μg/kg、75 μg/kg、80 μg/kg、85 μg/kg、90 μg/kg、95 μg/kg、100 μg/kg、150 μg/kg、200 μg/kg、250 μg/kg、350 μg/kg、400 μg/kg、450 μg/kg、500 μg/kg、550 μg/kg、600 μg/kg、650 μg/kg、700 μg/kg、750 μg/kg、800 μg/kg、850 μg/kg、900 μg/kg、950 μg/kg、1000 μg/kg、0.1から5 mg/kg、または0.5から1 mg/kgまでを含み得る。他の具体例において、用量は、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg、65 mg/kg、70 mg/kg、75 mg/kg、80 mg/kg、85 mg/kg、90 mg/kg、95 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、1000 mg/kg以上を含み得る。

特別な具体例において、用量は低めのレベルから開始し、所望する効果に到達するまで増加させる。対象における応答が当該用量にて不十分な場合、さらに高い用量（または、異なる、より局所的な送達経路によるより有効な用量）を対象耐性が許容する限度まで採用する。例えば、２４時間にわたる連続用量または一日あたり多重用量を試みて、コノトキシンペプチドの適当な全身レベルを達成する。

治療的有効量は、処方計画（例えば、毎日、一日おき、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、２週毎、３週毎、毎月、２月毎、３月毎、４月毎、５月毎、６月毎、７月毎、８月毎、９月毎、１０月毎、１１月毎、毎年）の経過中で単一または多重用量を投与することによって達成し得る。

様々な投与経路が利用可能である。選択された特別の態様は、送達される特別のコノトキシンペプチド、疼痛の重篤性、処置される炎症症状またはがん、および治療的有効量を与えるのに必要な用量に依存し得る。医療上許容されるいかなる態様の投与は、正しい医療判断に基づく投与の利益を超える臨床学的に許容できない弊害を引き起こすことなく、治療的有効量のコノトキシンペプチドを提供するいずれかの態様を意味するが、使用できる。代表的投与経路は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、節内、リンパ内、腹膜内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、経口、皮下、および／または舌下投与、より特別には、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、節内、リンパ内、腹膜内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、経口、皮下、および／または舌下注射を包含する。

ひとつの具体例において、コノトキシンペプチドは、中枢神経系 (CNS)内に、好ましくは、脳室、脳実質、髄腔内空間、その他適切なCNS位置に直接、送達される。

あるいは、標的療法を用いて、コノトキシンペプチドを、より具体的には、あるタイプの細胞に、抗体または細胞特異的リガンドのような標的系を用いて、送達することができる。

コノトキシンペプチドは、細胞ベース送達システムで投与でき、そこでは、コノトキシンペプチドをコードする核酸配列を、対象の体内に移植するように設計された細胞内に導入する。特別な具体例において、この送達法は脊髄領域に使用できる。適切な送達システムは、米国特許第5,550,050号ならびに国際公開第92/19195号、国際公開第94/25503号、国際公開第95/01203号、国際公開第95/05452号、国際公開第96/02286号、国際公開第96/02646号、国際公開第96/40871号、国際公開第96/40959号、および国際公開第97/12635号に記載される。

適切な核酸配列は、開示された配列および既知の遺伝子コードに基づいて、各コノトキシンペプチドにつき合成的に調製し得る。いくつかの具体例において、ポリヌクレオチドは、プラスミド、cDNA、または、例えば、コノトキシンペプチドを発現するための配列（例えば、遺伝子）を包含し得るmRNAを包含する。適切なプラスミドは、標準プラスミドベクターおよび、遺伝子を細胞に導入するために用い得るミニサークルプラスミドを包含する。ポリヌクレオチド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、さらに、いずれかの付加的な配列情報を包含して、遺伝子物質（例えば、コノトキシンペプチドをコードする配列）を細胞に導入し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一般的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターおよび／または、核もしくは細胞質に特異的なプロモーターのようなプロモーターを包含し得る。プロモーターおよびプラスミド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、通常、分野周知であり、従来技術を用いて調製し得る。ここでさらに記載するように、ポリヌクレオチドを用いて細胞にトランスフェクトし得る。別段の定めがない限り、用語「トランスフェクトする (transfect)」、「トランスフェクトされた (transfected)」、「トランスフェクトしている (transfecting)」を用いて、外因性ポリヌクレオチドまたは、細胞内でそれから発現されたポリペプチドの存在を示し得る。多数のベクターが、分野公知であるように、遺伝子の細胞への導入を仲介できることが知られている。

簡単には、用語「遺伝子」は、コノトキシンペプチドをコードする核酸配列をいう。この定義は、さまざまな配列多型、突然変異、および／または配列変異体を包含し、そのような変形は、コードされたコノトキシンペプチドの機能に影響しない。用語「遺伝子」は、コーディング配列のみならず、プロモーターのような調節領域、エンハンサー、および終止領域も包含することができる。「遺伝子」は、さらに、全てのイントロンおよび、mRNA転写からスプライシングされた他のDNA配列ならびに代替的なスプライシング部位から生じた変異体を包含し得る。コノトキシンペプチドをコードする核酸配列は、コノトキシンペプチドの発現を指揮するDNAまたはRNAであり得る。これらの核酸配列は、タンパク質に翻訳されるRNAまたはRNA配列に転写されるDNAストランド配列であり得る。核酸配列は、完全長核酸配列ならびに、完全長タンパク質から誘導された不完全長配列の双方を包含する。配列は、天然配列または、特定の細胞型におけるコドン優先性を付与するために導入することができる配列の縮重コドンも包含し得る。ここに開示されるコノトキシンペプチドをコードする遺伝子配列は、公的に利用可能なデータベースおよび刊行物において入手可能である。

上述のように、ここに開示されるコノトキシンペプチドは、nAChRのα9α10サブタイプをブロックする。ブロッキングは、いずれかの有効な手段で測定し得る。ひとつの具体例において、ブロッキングは、ここに開示されるコノトキシンペプチドによるnAChRのα9α10サブタイプからの標識RgIAの排除 (displacement)として測定する。ひとつの具体例において、ブロッキングは、ここに開示されるコノトキシンペプチドよるnAChRのα9α10サブタイプからの標識RgIAの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％排除であり得る。

第２の具体例において、ブロッキングは、ここに開示されるコノトキシンペプチドへの生物学的アッセイを実行して、RgIAの生物学的アッセイから得られた結果と比較して、その治療活性を決定することによって測定し得る。ひとつの具体例において、ブロッキングは、生物学的アッセイによって測定して、RgIAと比較したとき、ここに開示されるコノトキシンペプチドの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％超の治療活性であり得る。

第３の具体例において、ここに開示されるコノトキシンペプチドのnAChRのα9α10サブタイプに対する結合親和性は、nAChRのα9α10サブタイプに対するRgIAの結合親和性と比較して測定し得る。ひとつの具体例において、ブロッキングは、RgIAに対して、ここに開示されるコノトキシンペプチドの20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％超の結合親和性であり得る。

第４の具体例において、ここに開示されるコノトキシンペプチドの、nAChRのα9α10サブタイプの機能に対する影響は、電気生理学的アッセイ、カルシウムイメージングアッセイなどの機能アッセイにおける効果を測定することによって分析する。ひとつの具体例において、ブロッキングは、機能アッセイにより測定して、RgIAと比較したとき、nAChRのα9α10サブタイプの機能における20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の低減を包含する。

ここに開示されるコノトキシンペプチドは、nAChRのα9α10サブタイプに関連する症状の処置に用いるための薬物候補を識別する方法においても有用である。これらの方法は、nAChRのα9α10サブタイプの活性をブロックする能力について、薬物候補をスクリーニングすることを包含する。

「薬物候補」は、いずれかのペプチド（抗体もしくは抗体断片を包含する）または、標的（すなわち、α9α10サブタイプ）の活性をブロックするか、さもなくば、干渉するかもしれない化合物（小分子その他）をいう。小分子は、ペプチド複合体と相互作用しやすく、かつ、医薬上許容されることが期待される、いずれかの化学分類に属するであろう。薬物候補は、天然に見出され、コンビナトリアル化学アプローチによって合成され、および／または、合理的薬物設計により創製される。

ブロッキングは、ここでいろいろな箇所に記載されるように、前記薬物候補がRgIAではなく、または、それに加えて、ここに開示するコノトキシンペプチドと比較し得ることを除いて、ここでいろいろな箇所に記載されるように、測定し得る。コノトキシンペプチドは、コノトキシンペプチドの治療活性を模倣する薬物候補を識別する方法において有用である。そのような方法は、以下の：（ａ）薬物候補に生物学的アッセイを実行して、その治療活性を決定するステップ；および（ｂ）前記薬物候補の生物学的アッセイから得られた結果と、ここに開示されるコノトキシンペプチドの生物学的アッセイから得られた結果とを比較するステップを包含する。

薬物候補は、ポリヌクレオチド（例えば、DNAおよび／もしくはRNA)、ならびに／または酵素との相互作用により、α9α10サブタイプの活性に干渉することもある。そのような薬物候補は、知られているか、または潜在的なDNA修飾剤であり得、DNA損傷剤（例えば、核酸の構造に干渉するインターカレーション剤）；DNA結合剤；ミスマッチ結合タンパク質；および／またはアルキル化剤を包含する。

合理的薬物設計のひとつの目標は、例えば、より活性もしくはより安定な形態のコノトキシンペプチドであるか、または、例えば、ペプチドの機能をイン・ビボで促進するかそれに干渉する、薬物候補を識別することにある。合理的薬物設計に用いられるいくつかのアプローチは、３次元構造の解析、アラニンスキャン、分子モデリング、および抗イディオタイプ抗体の使用を包含する。そのような技術は、コノトキシンペプチドおよびnAChRのα9α10サブタイプによって形成されたタンパク質複合体の３次元構造を規定する原子座標を提供すること、および、前記原子座標に基づき、コノトキシンペプチドおよびnAChRのα9α10サブタイプの相互作用に干渉できる薬物候補を設計すること、または、選択することを包含するであろう。

さらなる研究開発のため、一旦薬物候補が選択されれば、その構造を、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズ、および／または電荷に基づき、広汎な情報源、例えば、分光技術、x-線回折データ、およびNMRからのデータを用いて、モデル化し得る。コンピュータ解析、類似性マッピング（薬物候補の原子間の結合よりも、電荷および／または体積をモデル化する）および、その他の技術を、このモデリング法に使用し得る。

薬物候補を選択する場合、さらなる化学基の結合を評価し得る。化学基は、薬物候補を簡単に合成でき、薬理学上許容され、かつ、イン・ビボ崩壊せず、いくつかの具体例において、リードコノトキシンペプチドの生物学的活性を保持しまたは向上するように、選択し得る。あるいは、薬物候補がペプチドベースであれば、さらなる安全性はそのペプチドを環化することによって達成でき、その剛直性を増大する。結合された化学基を持つ薬物候補は、さらに、標的特性を保持することを補償するためにスクリーニングし得る。次いで、さらなる最適化または修飾を行って、イン・ビボまたは臨床試験用の１以上の最終薬物候補にたどり着く。

薬物候補の選択および最適化の後、選択され、最適化された薬物候補が製造され、および／または、対象に投与するために医薬組成物に用いることができる。

以下の実施例が、特別の具体例を実証するために包含される。当業者は、本開示に照らして、ここに開示する特定の具体例に多くの変化を施すことができ、本開示の精神および範疇を逸脱することなく、依然として、類似または同の結果を得ることを認識すべきである。

実施例

実施例１ C-末端のアミド化がRgIAアナログの安定性を増大する。
ペプチドのC-末端のカルボキシル基中のヒドロキシル基のアミド基による交換が、２つのRgIAアナログに対して行われ、安定性が増大した。CSP-2（配列番号：3）は、ペプチド残存のより高い割合によって証明されるように、C-末端をアミド化（すなわち、C-末端へのNH2の付加）すると、生体マトリクスにおいて、元来のカルボキシル基と比較してかなり安定性が増した（図2A）。同様の発見がCSP-4（配列番号：5）でなされ、図2Bに示す。

安定性を増大するためのC-末端のアミド化がされた選択された代表的なペプチド配列を表８に記載する。

X11 = シトルリン
X12 = 3-ヨード-チロシン
X13 = セレノシステイン
X28 = Cys、いずれかの天然アミノ酸、またはいずれかの非天然アミノ酸

実施例２コノトキシンペプチドの脂質化
脂質化-スクシンイミジル吉草酸塩をCSP-4-NH2（配列番号：25）にコンジュゲートした。5-10 mgのコノトキシンペプチドおよび脂質化スクシンイミジル吉草酸塩を、1.5:1分子量比にて、0.25 mLの無水ジメチルホルムアミド中、0.0026 mL N,N-ジイソプロピルエチルアミンの存在下、室温にて１６時間、暗所で撹拌することによって、反応させた。反応終了および脂質化コノトキシンペプチドの濃度をPoroshell C18カラムを用いる逆相クロマトグラフィーによって測定する。ジメチルホルムアミド中脂質化コノトキシンペプチドを重量供給のHypersep C18カラム上の逆相クロマトグラフィーによって精製する。サンプルを95％ H₂O/5％メタノール/0.1％ギ酸における校正されたカラム上に充填する。カラムを同一バッファーで充填する。サンプルを95％メタノール/5％ H₂O/0.1％ギ酸の４倍ベッドボリューム画分で溶出する。Poroshell C18カラムを用いる逆相クロマトグラフィーによって脂質化コノトキシンペプチドを含有することが示された画分を溜め、凍結乾燥し、メタノール中に再懸濁する。

図6は、脂質化によって増大された、ペプチド薬物の薬物動態および薬力学特性を示す。図6は、12または16個の炭素脂質にコンジュゲートしたときの、CSP-4-NH2の濃度の増加を示す。CSP-4-NH2の安定性も図2Bに示す。12個の炭素脂肪酸の活性化エステルによるCSP-4-NH2の脂質化は、C12-CSP-4-NH2を創製し、16個の炭素脂肪酸の活性化エステルによる脂質化はC16-CSP-4-NH2を創製する。C12-CSP-4-NH2は１６時間まで検出でき、C16-CSP-4-NH2は、２４時間まで検出できた。

実施例３カプサイシンモデルにおける脂質化CSP-4の評価
神経因性疼痛のカプサイシンモデルを用いて、神経因性疼痛を処置するRgIAアナログの治療可能性を評価した。このモデルにおいて、30 μgのカプサイシンをラット後肢に足底内注射して、ラットにおいてカプサイシン-誘発性疼痛を引き起こした。熱的痛覚過敏に対するHargreaves試験（疼痛に対する感受性の指標；Hargreaves, et al., 1988）による測定を、カプサイシン注射から１５、３０および４５分後に行った。足退避反応潜時は、カプサイシン注射前に測定した（ベースライン）。C12-CSP-4-NH2、C16-CSP-4-NH2、またはペプチドなしのビヒクルは、カプサイシン注射の２〜３時間前に皮下注射した。図7Aおよび7Bに見られように、脂質化したC12-CSP-4-NH2およびC16-CSP-4-NH2の注射は、カプサイシン誘発熱的痛覚過敏の低減をもたらした。

実施例４ CINPモデルにおける脂質化およびPEG化CSP-4の評価
CINPは、３週間のうち週に２回、オキサリプラチン白金塩 (2.4 mg/kg)を静脈内注射することで、ラットに誘発した。機械的痛覚過敏は、普通、治療計画を開始する１４日目までにCINPモデルに誘発される。機械的痛覚過敏はRandall-Selitto試験を用いて査定した。Randall-Selitto試験は、疼痛に対する感受性の指標である。図8および9に見られるように、脂質化およびPEG化は、それぞれ、神経因性疼痛のこのラットモデルにおいて、痛覚過敏の減少を生じた。C12-CSP-4-NH2を提供するためのドデカン酸の活性化エステルでのCSP-4-NH2の脂質化（図8）は、２９時間持続する治療上利益を付与した。PEG-SVA-CSP-4-NH2を提供するためのPEG-SVAでのCSP-4-NH2のPEG化（図9）は、この薬理治療効果を、３日間超延長した。

代表的具体例

具体例１．配列番号：10の式を含むコノトキシンペプチド。

具体例２．配列番号：11の式を含む、具体例１のコノトキシンペプチド。

具体例３．配列番号：12の式を含む、具体例２のコノトキシンペプチド。

具体例４．配列番号：13-20のいずれかひとつの式を含むコノトキシンペプチド。

具体例５．配列番号：174-185のいずれかひとつの式を含むコノトキシンペプチド。

具体例６．前記ペプチドのC-末端がアミド基 (-NH2)である、具体例１〜５いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例７．ペプチドが脂肪酸に結合されている、具体例１〜６いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例８．前記脂肪酸が3から60個の炭素の脂肪酸である、具体例７のコノトキシンペプチド。

具体例９．コノトキシンペプチドのC末端のアミノ酸がD-アミノ酸立体異性体で交換されている、具体例１〜８いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１０．前記N-末端アミノ酸がアセチル化アミノ酸である、具体例１〜９いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１１．前記ペプチドがビオチン化されている、具体例１〜１０いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１２．前記ペプチドがメチル化されている、具体例１〜１１いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１３．前記ペプチドが１以上の部位にてリン酸化されている、具体例１〜１２いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１４．前記ペプチドがグリコシル化されている、具体例１〜１３いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１５．前記ペプチドが蛍光染料または蛍光性タンパク質に結合されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１６．２つのシステイン残基が、各々、天然または非天然アミノ酸で交換され、ブリッジ形成のためにそれらが連結されている、具体例１〜１５いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例１７．システイン残基の各々が、アスパラギン酸、グルタミン酸またはリシンから選択される天然産出アミノ酸の(R)-もしくは(S)-バージョンで交換されている、具体例１６のコノトキシンペプチド。

具体例１８．前記２つのシステイン残基のひとつめが、側鎖にカルボン酸を含有する非天然アミノ酸で交換され、前記２つのシステイン残基のふたつめが、側鎖にアミノ酸を含有する非天然アミノ酸で交換されている、具体例１６のコノトキシンペプチド。

具体例１９．前記システイン残基の各々が、(S)-プロパルギルグリシンまたは(S)-アジドノルバリンで交換されている、具体例１６のコノトキシンペプチド。

具体例２０．前記ブリッジがラクタムブリッジまたはトリアゾールブリッジである、具体例１６〜１９いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例２１．リンカーが導入されてN-末端からC-末端への環化ペプチドが生成されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例２２．前記リンカーが100個のアミノ酸の配列からなる、具体例２１のコノトキシンペプチド。

具体例２３．前記リンカーが非ペプチドである、具体例２１のコノトキシンペプチド。

具体例２４．前記ペプチドがポリエチレングリコールポリマーに結合されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例２５．前記ペプチドがタンパク質に対する融合体として発現されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例２６．前記タンパク質が免疫グロブリンG (IgG)のFc部である、具体例25のコノトキシンペプチド。

具体例２７．具体例１〜２６いずれかのコノトキシンペプチドを含む、医薬組成物。

具体例２８．具体例１〜２６いずれかのコノトキシンペプチドを含む、医薬上許容される塩。

具体例２９．処置が必要な対象におけるニコチン様アセチルコリン受容体 (nAChR)のα9α10サブタイプに関連する少なくともひとつの症状の処置方法であって、治療的有効量のコノトキシンペプチド、コノトキシンペプチドを含む組成物またはコノトキシンペプチドを含む医薬上許容される塩を前記対象に投与することを含み、ここに、コノトキシンペプチドは具体例１〜２６いずれかのコノトキシンペプチドであって、それによって前記症状を処置する、処置方法。

具体例３０．少なくともひとつの症状が疼痛である、具体例２９の方法。

具体例３１．疼痛が、全身疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、末梢神経損傷によって誘発された疼痛、炎症性障害によって誘発された疼痛、代謝障害によって誘発された疼痛、ガンによって誘発された疼痛、化学療法によって誘発された疼痛、手術によって誘発された疼痛および／または熱傷によって誘発された疼痛である、具体例３０の方法。

具体例３２．前記疼痛ががん関連慢性疼痛および／またはがん関連神経障害である、具体例３１の方法。

具体例３３．前記少なくともひとつの症状が炎症症状である、具体例２９の方法。

具体例３４．前記炎症症状が、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、子宮内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚病、肺の炎症症状、神経系の炎症に関連する疾患、歯周病、または心血管疾患である、具体例３３の方法。

具体例３５．前記炎症症状が免疫細胞によって媒介される、具体例３３〜３４いずれかの方法。

具体例３６．前記炎症症状が、手術後の長期炎症および末梢神経障害である、具体例３３〜３５いずれかの方法。

具体例３７．前記少なくともひとつの症状が疼痛および炎症である、具体例２９の方法。

具体例３８．前記少なくともひとつの症状が炎症および神経障害である、具体例２９の方法。

具体例３９．前記Asp-Pro-Arg領域のアスパラギン酸残基とプロリン残基との間のペプチド結合が非ペプチド結合で交換されて、アスパラギン酸塩のカルボニルとプロリンの窒素との間にメチレン基が導入されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

具体例４０．前記Asp-Pro-Arg領域のアスパラギン酸塩がアミノマロン酸で交換されている、具体例１〜１４いずれかのコノトキシンペプチド。

本明細書に示された詳細は、例としてであり、本発明の好ましい実施形態の説明のためであり、原理および概念的側面の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示される本発明の様々な実施形態を示す。この点に関して、本発明の基本的な理解に必要なものよりも詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされておらず、図面および/または実施例の説明は、当業者には明らかである本発明の形態を実際に実施することができる。

本開示の実施は、特記なければ、従来の技術の化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養および遺伝形質転換生物学を採用し、それらは当該分野の範疇にある。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982); Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989); Sambrook and Russell, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, updated through 2005); Glover, DNA Cloning (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie and Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 4th Ed., (Univ. of Oregon Press, Eugene, Oregon, 2000)を参照せよ。

当業者によって理解されるように、ここに開示される各具体例は、特に明言した構成部分、工程、要素、または成分を含み、本質的にそれらからなり、または、それらからなる。かくして、用語「包含する (include)」または「包含している (including)」は、「含む (comprise)、からなる(consist of)、または、実質的にからなる (consist essentially of)」というものと解釈されるべきである。ここで用いるとき、移行用語「含む (comprise)」または「含む (comprises)」は、限定されないが、大量であっても、非特定の構成部分、工程、要素、または成分の包含を許容する意味である。移行句「からなる (consisting of)」は、特定されていないいかなる構成部分、工程、要素または成分をも排除する。移行句「実質的にからなる (consisting essentially of)」は、具体例の範囲を、特定の構成部分、工程、要素または成分および当該具体例に重大な影響を与えないものに限定する。

特記しない限り、明細書および特許請求の範囲に用いる全ての数字は、全ての場合において、用語「約」をもって修正されると理解されるべきである。したがって、別段の定めがない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ることが求められる所望の特性に依存して変化する概数である。最低でも、そして、特許請求の範囲に均等論の適用を制限する意図はなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告されている有効桁数および近似技術に照らして、解釈されるべきである。さらなる明確性が必要ならば、用語「約」は、所定の数値または範囲と共に用いられるとき、当業者によって合理的にそれに帰する意味を有し、すなわち、所定値の±20％；所定値の±19％；所定値の±18％；所定値の±17％；所定値の±16％；所定値の±15％；所定値の±14％；所定値の±13％；所定値の±12％；所定値の±11％；所定値の±10％；所定値の±9％；所定値の±8％；所定値の±7％；所定値の±6％；所定値の±5％；所定値の±4％；所定値の±3％；所定値の±2％；または所定値の±1％の範囲内で、当該所定の値または範囲よりも、幾分大きいか幾分小さいことを示す。

本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータが概数であるにもかかわらず、特定の実施襟に記載された数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、各試験測定に見出される標準偏差に必然的に起因するある誤差を本質的に含有する。

本発明を説明する文脈（特に、特許請求の範囲の文脈）で用いられる用語「不定冠詞 (a)」、「不定冠詞 (an)」、「定冠詞 (the)」および同様の関連語は、別段の定めがなく、文脈で明らかに矛盾しない限り、単数および複数の双方を対象にすると解釈されるべきである。ここでの値の範囲の記述は、単に、当該範囲に属する各別個の値を独立して言及するための簡潔表現方法として機能することを意図するに過ぎない。別段の定めがない限り、各独立した値は、あたかも、ここに独立して記述されているかのように明細書に含まれる。ここに記載される全ての方法は、別段の定めがなく、文脈で明らかに矛盾しない限り、いずれの適切な順序でも実行できる。ここに提供される、いかなるかつ全ての実例または代表語（例えば、「のような (such as)」）の使用は、単に、本発明をより理解を容易にする意図であり、特許請求されていない限り本発明の範囲に制限を置くものではない。明細書にない文言は、本発明の実施に必須のいかなる特許請求されていない構成部分をも示すものと解釈されるべきである。

ここに開示される本発明の代替的構成部分または具体例の分類は、制限と解釈されるべきではない。各群の構成因子は、独立して、または、当該群の他の構成因子もしくはここに見出される他の構成部分と組み合わせて、参照され、特許請求されるであろう。群の１以上の構成因子が、簡便性および／または特許性の理由で、ある群に含まれたり、ある群から除かれたりすることが予測される。いずれかのそのような包含または除去が発生するとき、明細書は、修正して付随する特許請求の範囲で用いられる全てのマーカッシュ群の記述要件を満たす群を含有するとみなされる。

本発明のある具体例が記載され、本発明を実行するための本発明者らが知っているベストモードを含んでいる。もちろん、これらの記載された具体例への変形は、上述の説明を読むことで当業者には明確になる。本発明者は、そのような変形を当業者が適宜採用することを予測し、本発明者らは、ここに具体的に記載する以外で実施される本発明についても意図している。よって、本発明は、適用される法律に許可されるようにここに付随する特許請求の範囲に記載される対象のすべての修飾および等価物を包含する。さらに、全ての可能な変形において上記構成部分のいかなる組合せも、別段の定めがなく、文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。

さらに、多数の参照が、この明細書を通して、刊行物、特許、および／または特許出願（集約的に、「参照」）がなされている。引用された参照は、独立して、具体的な引用の教示により本明細書に取り込まれる。

本開示で用いる定義および説明は、実施例で明確かつ疑義なく修正されない限り、または、意味の適用がいかなる解釈も無意味にするか、または、本質的に無意味にしない限り、いずれの将来の解釈をも制御する意味であり、意図される。用語の解釈がそれを、無意味にするか、本質的に無意味にする場合、当該定義は、Webster's Dictionary、第３版または、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)のような当業者に知られている辞書から導き出される。

終わりに、ここに開示された本発明の具体例は本発明の原理を例示するものであると理解されるべきである。採用されるであろう他の修飾は、本発明の範囲内である。かくして、限定されないが、例として、本発明の代替的配置は、ここでの教示に従って使用することができる。よって、本発明は、示され、説明されているものに正確に限定されない。

Claims

式（Ｉ）：

のコノトキシンペプチドであって、各Ｘは（Ｓ）−プロパルギルグリシンまたは（Ｓ）−アジドノルバリンで交換されたシステイン残基を表し、前記（Ｓ）−プロパルギルグリシンおよび前記（Ｓ）−アジドノルバリンは連結されてトリアゾールブリッジを形成し；
前記トリアゾールブリッジは、

であり；
Ｃ末端は、カルボン酸またはアミド基である、コノトキシンペプチド；あるいは、
保存的アミノ酸置換を有する少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体であって、前記保存的アミノ酸置換は、大芳香族残基を有するアミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含む保存的置換群において見出される置換を要件とし；ここで、前記変異体は、前記トリアゾールブリッジおよび前記ジスルフィドブリッジを含み；ここで、前記変異体は、鎮痛活性を有する、変異体；あるいは
前記コノトキシンペプチドまたは前記変異体の医薬上許容される塩。
前記トリアゾールブリッジが、

である、請求項１に記載のコノトキシンペプチド、変異体、または医薬上許容される塩。
請求項１または２に記載の、コノトキシンペプチドまたは前記コノトキシンペプチドの医薬上許容される塩。
ＰＥＧ化コノトキシンペプチドであって、前記ＰＥＧ化コノトキシンペプチドは、１以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの共有付加した式（Ｉ）：

であり；
各（Ｘ）は（Ｓ）−プロパルギルグリシンまたは（Ｓ）−アジドノルバリンで交換されたシステイン残基を表し、前記（Ｓ）−プロパルギルグリシンおよび前記（Ｓ）−アジドノルバリンは連結されてトリアゾールブリッジを形成し；
前記トリアゾールブリッジは、

であり；
Ｃ末端は、カルボン酸またはアミド基である、ＰＥＧ化コノトキシンペプチド；あるいは、
保存的アミノ酸置換を有する少なくとも９０％の配列同一性を有するそのＰＥＧ化変異体であって、前記保存的アミノ酸置換は、大芳香族残基を有するアミノ酸：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含む保存的置換群において見出される置換を要件とし；ここで、前記ＰＥＧ化変異体は前記トリアゾールブリッジ、前記ジスルフィドブリッジ、および前記１以上の共有付加したＰＥＧポリマーを含み；ここで、前記ＰＥＧ化変異体は、鎮痛活性を有する、ＰＥＧ化変異体；あるいは
前記ＰＥＧ化コノトキシンペプチドまたは前記ＰＥＧ化変異体の医薬上許容される塩。
前記トリアゾールブリッジが、

である、請求項４に記載のＰＥＧ化コノトキシンペプチド、ＰＥＧ化変異体、または医薬上許容される塩。
請求項４または５に記載の、ＰＥＧ化コノトキシンペプチドまたは前記ＰＥＧ化コノトキシンペプチドの医薬上許容される塩。
請求項１または２に記載のコノトキシンペプチド、変異体、または医薬上許容される塩、あるいは、請求項３に記載のコノトキシンペプチドまたはコノトキシンペプチドの医薬上許容される塩と、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
請求項４または５に記載のＰＥＧ化コノトキシンペプチド、ＰＥＧ化変異体、または医薬上許容される塩、あるいは、請求項６に記載のＰＥＧ化コノトキシンペプチドまたはＰＥＧ化コノトキシンペプチドの医薬上許容される塩と、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
疼痛、炎症症状、疼痛および炎症、または炎症および神経障害の処置において使用するための、請求項１または２に記載のコノトキシンペプチド、変異体、または医薬上許容される塩を含むか、あるいは請求項３に記載の、コノトキシンペプチドまたは前記コノトキシンペプチドの医薬上許容される塩を含む医薬組成物。
前記疼痛が、全身疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、末梢神経損傷によって誘発された疼痛、炎症性障害によって誘発された疼痛、代謝障害によって誘発された疼痛、ガンによって誘発された疼痛、化学療法によって誘発された疼痛、手術によって誘発された疼痛および／または熱傷によって誘発された疼痛である、疼痛、または疼痛および炎症の処置において使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
前記炎症症状が、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、子宮内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚病、肺の炎症症状、神経系の炎症に関連する疾患、歯周病、または心血管疾患である、炎症症状の処置において使用するための、請求項９に記載の医薬組成物。
疼痛、炎症症状、疼痛および炎症、または炎症および神経障害の処置において使用するための、請求項４または５に記載のＰＥＧ化コノトキシンペプチド、ＰＥＧ化変異体、または医薬上許容される塩を含むか、あるいは請求項６に記載の、ＰＥＧ化コノトキシンペプチドまたは前記ＰＥＧ化コノトキシンペプチドの医薬上許容される塩を含む医薬組成物。
前記疼痛が、全身疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、末梢神経損傷によって誘発された疼痛、炎症性障害によって誘発された疼痛、代謝障害によって誘発された疼痛、ガンによって誘発された疼痛、化学療法によって誘発された疼痛、手術によって誘発された疼痛および／または熱傷によって誘発された疼痛である、疼痛、または疼痛および炎症の処置において使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
前記炎症症状が、炎症、慢性炎症、リウマチ性疾患、敗血症、線維筋痛症、炎症性腸疾患、サルコイドーシス、子宮内膜症、子宮筋腫、炎症性皮膚病、肺の炎症症状、神経系の炎症に関連する疾患、歯周病、または心血管疾患である、炎症症状の処置において使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。