相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2014年11月7日申請之美國臨時專利申請案第62/123,123號之優先權,其整個內容以引用之方式併入本文中。
本發明係關於α-芋螺毒素肽RgIA (SEQ ID NO:1)、為α-芋螺毒素肽RgIA之類似物之芋螺毒素肽以及其修飾(在本文中統稱為「RgIA類似物」)。該等RgIA類似物阻斷菸鹼乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型且可用於治療疼痛及發炎。該等疼痛病狀包括肌肉骨骼疼痛、發炎性疼痛、癌症疼痛、包括糖尿病神經病變疼痛之神經病變疼痛症候群、化學療法誘導之疼痛、皰疹後神經痛、原發性神經病變周邊疼痛、幻肢疼痛、包括骨關節炎之矯形外科疼痛及包括類風濕性關節炎疼痛之自體免疫/發炎誘導之疼痛。RgIA類似物亦可用於如本文中所述之進一步藥物研發。
海螺產生許多對被捕食者具有神經毒性效應之肽。來自芋螺屬之肽通常具有在12個至30個胺基酸範圍內之長度且含有4個或更多個半胱胺酸殘基;亞型α之芋螺毒素在C1-C3及C2-C4連結中含有並形成兩個二硫鍵。α-芋螺毒素肽結合nAChR。該等中之一者RgIA (SEQ ID NO:1)對已證明在神經病變疼痛及發炎之若干模型中具有止痛性質之α9α10 nAChR具有選擇性。除保守半胱胺酸殘基以外,脯胺酸殘基亦係保守的且DPR區域在結合至α9α10 nAChR中起作用。9位處之精胺酸殘基與對人類α9α10 nAChR之增加之選擇性相關。
RgIA之先前所述(PCT/US2014/040374)類似物具有期望類藥物特徵,例如對人類α9α10 nAChR標靶之與親代RgIA相比增加之親和力及增加之活體外及活體內穩定性(表1)。先前所述RgIA類似物亦揭示於美國專利第6,797,808號;第7,279,549號;第7,666,840號;第7,902,153號;第8,110,549號;第8,487,075號;及第8,735,541號;及美國專利申請案第12/307,953號及第13/289,494號中;其之序列以引用方式併入本文中。本發明亦係關於如表2中所列示之RgIA之額外類似物。
本發明闡述一系列可對RgIA類似物(包括表1表2中所列示之彼等)進行以改良其用於其治療用途(包括作為止痛劑)之類藥物特徵的修飾。
表1.
類似物 | 序列 | SEQ ID NO. |
CSP-P | GCCSDPRCRYRCR | 1 |
CSP-1 | GCCSDPRCRX12RCR | 2 |
CSP-2 | GCCTDPRCX11X12QCR | 3 |
CSP-3 | GCCTDPRCX11X12QCRRR | 4 |
CSP-4 | GCCTDPRCX11X12QCY | 5 |
CSP-5 | GX13CTDPRX13X11X12QCR | 6 |
CSP-6 | GCCTDPRCRX12QCF | 7 |
CSP-7 | GCCTDPRCRX12QCY | 8 |
CSP-8 | GCCTDPRCRX12QCW | 9 |
X11 = 瓜胺酸
X12 = 3-碘-酪胺酸
X13 = 硒半胱胺酸
表2.
序列 | SEQ ID NO. |
GCCTDPRCX21X12QCYRR | 222 |
GCCTDPRCX21X12QCRRY | 223 |
GCCTDPRCX21X12QCF | 224 |
GCCTDPRCX21X12QCW | 225 |
GCCTDPRCX21X12QCYY | 226 |
GCCTDPRCX21X12QCYR | 227 |
GCCTDPRCRX12QCRRR | 228 |
GCCTDPRCRX12QCYRR | 229 |
GCCTDPRCRX12QCRRY | 230 |
GCCTDPRCRX12QCYY | 231 |
GCCTDPRCRX12QCYR | 232 |
GCCSDPRCNYDHPEIC-COOH | 233 |
GCCSDPRCNYDHPEIC-醯胺 | 234 |
GCCSHPACSVNHPELC-COOH | 235 |
GCCSHPACSVNHPELC-醯胺 | 236 |
GCCTDPRCRYRCR | 237 |
GCCSDX14QRCRYRCR | 238 |
GCCTDX14RCRYRCR | 239 |
GCCSDPRCRX15RCR | 240 |
GCCTDPRCRX15RCR | 241 |
X15GCCSDX14RCRX15RCR | 242 |
X15GCCTDX14RCRX15RCR | 243 |
GCCSDPRCX16YRCR | 244 |
GCCSDPRCX21X12RCR | 245 |
GX13CTDPRX13X21X12QCK | 246 |
GX13CSDPRX13RYRCR | 247 |
GCCTDPRCX21X12RCR | 248 |
GCCSDPRCX21YRCR | 249 |
GCCSDPRCRYQCR | 250 |
GCCSDPRCFWRCR | 251 |
GX17CSDPRCRYRCR | 252 |
GCCADPRCRYRCR | 253 |
GCCYDPRCRYRCR | 254 |
GCCSDPRX17RYRCR | 255 |
GCCSDPRCGYRCR | 256 |
GCCSDPRCAYRCR | 257 |
GCCSDPRCVYRCR | 258 |
GCCSDPRCLYRCR | 259 |
GCCSDPRCIYRCR | 260 |
GCCSDPRCMYRCR | 261 |
GCCSDPRCFYRCR | 262 |
GCCSDPRCWYRCR | 263 |
GCCSDPRCPYRCR | 264 |
GCCSDPRCSYRCR | 265 |
GCCSDPRCTYRCR | 266 |
GCCSDPRCCYRCR | 267 |
GCCSDPRCYYRCR | 268 |
GCCSDPRCNYRCR | 269 |
GCCSDPRCQYRCR | 270 |
GCCSDPRCDYRCR | 271 |
GCCSDPRCEYRCR | 272 |
GCCSDPRCKYRCR | 273 |
GCCSDPRCHYRCR | 274 |
GCCSDPRCRFRCR | 275 |
GCCSDPRCRYHCR | 276 |
GCCSDPRCX18X12RCR | 277 |
GCCSDPRCRYRC | 278 |
GCCSEPRCRYRCR | 279 |
GCCSDVRCRYRCR | 280 |
GCCSDPRCAYRCR | 281 |
GCCSHPACRYRCR | 282 |
GCCSDPRCX19YRCR | 283 |
ACCSDRRCRWRC | 284 |
FDGRNAPADDKASDLIAQIVRRACCSDRRCRWRCG | 285 |
X15GCCSX14RCRX15RCR | 286 |
SNKRKNAAMLDMIAQHAIRGCCSDPRCRYRCR | 287 |
DECCSNPACRVNNPHV | 288 |
SDGRNVAAKAFHRIGRTIRDECCSNPACRVNNPHVCRRR | 289 |
DECCSNPACRLNNPHACRRR | 290 |
DX20CCSNPACRLNNPHACRRR | 291 |
DECCSNX14ACRLNNPHACRRR | 292 |
X20DX20CCSNX14ACRLNNPHACRRR | 293 |
DECCSNPACRLNNX14HACRRR | 294 |
X20DX20CCSNPACRLNX14HACRRR | 295 |
DECCSNX14ACRLNNX14HACRRR | 296 |
X20DX20CCSNX14ACRLNNX14HACRRR | 297 |
DECCSNPACRLNNPHVCRRR | 298 |
DX20CCSNPACRLNNPHVCRRR | 299 |
DECCSNX20ACRLNNPHVCRRR | 300 |
X20DX20CCSNX14ACRLNPHVCRRR | 301 |
DECCSNPACRLNNX14HVCRRR | 302 |
X20DX20CCSNX14ACRLNNPHVCRRR | 303 |
DECCSNX14ACRLNNX14HVCRRR | 304 |
X20DX20CCSNX14ACRLNNX14HVCRRR | 305 |
GCCSHPACNVDHPEIC | 306 |
MFTVFLLVVLATTVVSFTSDRAFRGRNSAANDK
RSDLAALSVRRGCCSHPACSVNHPELCGRRR | 307 |
ECCTNPVCHAEHQHELCARRR | 308 |
ECCTNPVCHAX21HQELCARRR | 309 |
ECCTNPVCHAX21HQX21LCARRR | 310 |
ECCTNPVCHAX12HQX21LCARRR | 311 |
X21CCTNPVCHAEHQHELCARRR | 312 |
X21CCTNPVCHAX21HQELCARRR | 313 |
X21CCTNPVCHAX21HQX21LCARRR | 314 |
X21CCTNPVCHAX12HQX21LCARRR | 315 |
GCCSHPVCSAMSPIC | 316 |
GCCSHPVCSAMSX1IC | 317 |
GCCSHX14VCSAMSX1IC | 318 |
GCCSHX14VCSAMSPIC | 319 |
X11 = 瓜胺酸
X12 = 3-碘-酪胺酸
X13 = 硒半胱胺酸
X14 = 羥基-Pro
X15 = 單鹵代Tyr,包括碘-Tyr、溴-Tyr
X16 = 高Arg或鳥胺酸
X17 = 高半胱胺酸
X18 = ω-硝基-Arg
X19 = D-Arg
X20 = γ-羧基-Glu (Gla)
X21 = 7-羧基-Glu
在各種實施例中,本文中所揭示之RgIA類似物具有式X10 X6 X7 X3 D P R X8 X1 X12 X4 X9 X5 (SEQ ID NO:10),其中X1係des-X1、Arg或瓜胺酸;X3係des-X3、Ser或Thr;X4係des-X4、Arg或Gln;X5係des-X5、Arg、Tyr、Phe、Trp、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg、Arg-Tyr、Arg-Arg-Tyr或Tyr-Arg-Arg;X6係des-X6、Cys或硒半胱胺酸;X7係des-X7、Cys或硒半胱胺酸;X8係des-X8、Cys或硒半胱胺酸;X9係des-X9、Cys或硒半胱胺酸;且X10係des-X10或Gly。在一個實施例中,X10係Gly,X6係Cys或硒半胱胺酸,X7係Cys,X3係Ser或Thr;X8係Cys或硒半胱胺酸,X1係Arg或瓜胺酸,X4係Arg或Gln,X9係Cys,且X5係Arg、Tyr、Phe、Trp或Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO:11)。在一個實施例中,X10係Gly,X6係Cys或硒半胱胺酸,X7係Cys,X3係Thr,X8係Cys或硒半胱胺酸,X1係Arg或瓜胺酸,X4係Gln,X9係Cys,且X5係Arg或Tyr (SEQ ID NO:12)。
在各種實施例中,對RgIA及其類似物進行修飾以防止在保守三肽序列「Asp-Pro-Arg」中保守天冬胺酸殘基至異天冬胺酸之異構化。此異構化顯示於圖1A中。此方法防止此異構化並產生維持其在結合至預期標靶(即α9α10 nAChR)中之高親和力及高選擇性之藥理學性質之穩定RgIA類似物。因此,儘管RgIA芋螺毒素肽之球狀大小較小,但肽鍵置換及藉此展示之建議策略產生具有生物活性、強有力且更穩定之肽。使用並評價三種不同化學方法。在第一教示中,用胺基丙二酸(amino malonic acid) (2-胺基丙二酸(2-amino propandioic acid))置換天冬胺酸(圖1B),胺基丙二酸相當於具有縮短之側鏈之天冬胺酸。此具有縮短之側鏈之衍生物不能形成產生異構體所必需之5員琥珀酸酐中間體。合成可經由標準肽化學使用經適當保護之胺基丙二酸來實現(例如圖1C)。
在接下來兩個教示中,非肽鍵經改造以將天冬胺酸置換與脯胺酸經由脯胺酸之N-烷基化鏈接在一起;兩個實例皆非可水解的且因此不易受異構化影響。
第二個方法用亞甲基置換天冬胺酸之肽鏈羰基(圖1D)以提供’還原型肽鍵’。此可藉由用經適當保護之Asp置換(例如(3
S
)-4-溴-3-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]胺基]-丁酸(圖1E),其本身經由標準肽化學納入肽鏈中)使脯胺酸烷基化來製備。
第三個方法用酮甲基置換天冬胺酸之肽鏈羰基(圖1F),此相當於將亞甲基插入Asp與Pro之間之肽鏈中。此可藉由用經適當保護之Asp置換(例如(3
S
)-5-氯-4-側氧基-3-[[(苯基甲氧基)羰基]胺基]-戊酸1,1-二甲基乙酯(圖1G),其本身經由標準肽化學納入肽鏈中)使脯胺酸烷基化來製備。
在各種實施例中,胺基酸修飾可藉由置換可易於酶促裂解之胺基酸殘基來增加肽穩定性。該等修飾包括:任何L-胺基酸經相應D-胺基酸之置換;Gly經中性胺基酸(包括Val、Nor-Val、Leu或Ile)之置換;Arg經His或Lys之置換;Pro經Gly之置換;Gly經Pro之置換及/或半胱胺酸經硒半胱胺酸之置換。具有該等修飾之說明性肽序列係闡述於表4中。
表4. 具有胺基酸修飾之經修飾肽序列
序列 | SEQ ID NO. |
GCCSDPRCRYRCH | 30 |
GCCSDPRCRYRCK | 31 |
GCCSDPRCRX22RCR | 32 |
X23CCSDPRCRYRCR | 33 |
X24CCSDPRCRYRCR | 34 |
GCCSDX25RCRYRCR | 35 |
GCCSX26PRCRYRCR | 36 |
GCCSDPX27CRYRCR | 37 |
GCCSX26X25RCRYRCR | 38 |
GCCSDX25X27CRYRCR | 39 |
GCCSX26X25X27CRYRCR | 40 |
GCCSDPRCRYHCR | 41 |
GCCSDPRCRYKCR | 42 |
PCCSDPRCRYRCR | 43 |
GCCSDPRCRX12RCH | 44 |
GCCSDPRCRX12RCK | 45 |
GCCSDPRCRX22RCH | 46 |
X23CCSDPRCRX12RCR | 47 |
X24CCSDPRCRX12RCR | 48 |
GCCSDX25RCRX12RCR | 49 |
GCCSX26PRCRX12RCR | 50 |
GCCSDPX27CRX12RCR | 51 |
GCCSX26X25RCRX12RCR | 52 |
GCCSDX25X27CRX12RCR | 53 |
GCCSX26X25X27CRX12RCR | 54 |
GCCSDPRCRX12HCR | 55 |
GCCSDPRCRX12KCR | 56 |
PCCSDPRCRX12RCR | 57 |
GCCSDPRCHX12RCR | 58 |
GCCSDPRCKX12RCR | 59 |
GCCTDPRCRX12RCH | 60 |
GCCTDPRCRX12RCK | 61 |
GCCTDPRCRX22RCR | 62 |
X23CCTDPRCRX12RCR | 63 |
X24CCTDPRCRX12RCR | 64 |
GCCTDX25RCRX12RCR | 65 |
GCCTX26PRCRX12RCR | 66 |
GCCTDPX27CRX12RCR | 67 |
GCCTX26X25RCRX12RCR | 68 |
GCCTDX25X27CRX12RCR | 69 |
GCCTX26X25X27CRX12RCR | 70 |
GCCTDPRCRX12HCR | 71 |
GCCTDPRCRX12KCR | 72 |
PCCTDPRCRX12RCR | 73 |
GCCTDPRCHX12RCR | 74 |
GCCTDPRCKX12RCR | 75 |
GCCTDPRCX11X12QCHRR | 76 |
GCCTDPRCX11X12QCKRR | 77 |
GCCTDPRCX11X12QCRHR | 78 |
GCCTDPRCX11X12QCRKR | 79 |
GCCTDPRCX11X12QCRRH | 80 |
GCCTDPRCX11X12QCRRK | 81 |
GCCTDPRCX11X22QCRRR | 82 |
X23CCTDPRCX11X12QCRRR | 83 |
X24CCTDPRCX11X12QCRRR | 84 |
GCCTDX25RCX11X12QCRRR | 85 |
GCCTX26PRCX11X12QCRRR | 86 |
GCCTDPX27CX11X12QCRRR | 87 |
GCCTX26X25RCX11X12QCRRR | 88 |
GCCTDX25X27CX11X12QCRRR | 89 |
GCCTX26X25X27CX11X12QCRRR | 90 |
PCCTDPRCX11X12QCRRR | 91 |
GCCTDPRCX11X22QCY | 92 |
GCCTDPRCX11X12QCX22 | 93 |
X23CCTDPRCX11X12QCY | 94 |
X24CCTDPRCX11X12QCY | 95 |
GCCTDX25RCX11X12QCY | 96 |
GCCTX26PRCX11X12QCY | 97 |
GCCTDPX27CX11X12QCY | 98 |
GCCTX26X25RCX11X12QCY | 99 |
GCCTDX25X27CX11X12QCY | 100 |
GCCTX26X25X27CX11X12QCY | 101 |
PCCTDPRCX11X12QCY | 102 |
GX13CTDPRX13X11X12QCH | 103 |
GX13CTDPRX13X11X12QCK | 104 |
GX13CTDPRX13X11X22QCR | 105 |
X23X13CTDPRX13X11X12QCR | 106 |
X24X13CTDPRX13X11X12QCR | 107 |
GX13CTDX25RX13X11X12QCR | 108 |
GX13CTX26PRX13X11X12QCR | 109 |
GX13CTDPX27X13X11X12QCR | 110 |
GX13CTX26X25RX13X11X12QCR | 111 |
GX13CTDX25X27X13X11X12QCR | 112 |
GX13CTX26X25X27X13X11X12QCR | 113 |
PX13CTDPRX13X11X12QCR | 114 |
GCCTDPRCRX22QCF | 115 |
X23CCTDPRCRX12QCF | 116 |
X24CCTDPRCRX12QCF | 117 |
GCCTDX25RCRX12QCF | 118 |
GCCTX26PRCRX12QCF | 119 |
GCCTDPX27CRX12QCF | 120 |
GCCTX26X25RCRX12QCF | 121 |
GCCTDX25X27CRX12QCF | 122 |
GCCTX26X25X27CRX12QCF | 123 |
PCCTDPRCRX12QCF | 124 |
GCCTDPRCRX22QCY | 125 |
GCCTDPRCRX12QCX22 | 126 |
X23CCTDPRCRX12QCY | 127 |
X24CCTDPRCRX12QCY | 128 |
GCCTDX25RCRX12QCY | 129 |
GCCTX26PRCRX12QCY | 130 |
GCCTDPX27CRX12QCY | 131 |
GCCTX26X25RCRX12QCY | 132 |
GCCTDX25X27CRX12QCY | 133 |
GCCTX26X25X27CRX12QCY | 134 |
PCCTDPRCRX12QCY | 135 |
GCCTDPRCRX22QCW | 136 |
X23CCTDPRCRX12QCW | 137 |
X24CCTDPRCRX12QCW | 138 |
GCCTDX25RCRX12QCW | 139 |
GCCTX26PRCRX12QCW | 140 |
GCCTDPX27CRX12QCW | 141 |
GCCTX26X25RCRX12QCW | 142 |
GCCTDX25X27CRX12QCW | 143 |
GCCTX26X25X27CRX12QCW | 144 |
PCCTDPRCRX12QCW | 145 |
GX13CTDPRCX11X12QCY | 146 |
GCX13TDPRCX11X12QCY | 147 |
GCCTDPRX13X11X12QCY | 148 |
GCCTDPRCX11X12QX13Y | 149 |
GX13CTDPRX13X11X12QCY | 150 |
GCX13TDPRCX11X12QX13Y | 151 |
GX13X13TDPRCX11X12QCY | 152 |
GCCTDPRX13X11X12QX13Y | 153 |
GX13CTDPRCX11X12QX13Y | 154 |
GX13X13TDPRX13X11X12QCY | 155 |
GCX13TDPRX13X11X12QX13Y | 156 |
GX13CTDPRX13X11X12QX13Y | 157 |
GX13X13TDPRCX11X12QX13Y | 158 |
GX13X13TDPRX13X11X12QX13Y | 159 |
GX13CTDPRCRX12QCY | 160 |
GCX13TDPRCRX12QCY | 161 |
GCCTDPRX13RX12QCY | 162 |
GCCTDPRCRX12QX13Y | 163 |
GX13CTDPRX13RX12QCY | 164 |
GCX13TDPRCRX12QX13Y | 165 |
GX13X13TDPRCRX12QCY | 166 |
GCCTDPRX13RX12QX13Y | 167 |
GX13CTDPRCRX12QX13Y | 168 |
GX13X13TDPRX13RX12QCY | 169 |
GCX13TDPRX13RX12QX13Y | 170 |
GX13CTDPRX13RX12QX13Y | 171 |
GX13X13TDPRCRX12QX13Y | 172 |
GX13X13TDPRX13RX12QX13Y | 173 |
X11 = 瓜胺酸
X12 = 3-碘-酪胺酸
X13 = 硒半胱胺酸
X14 = 羥基-Pro
X15 = 單鹵代Tyr,包括碘-Tyr、溴-Tyr
X16 = 高Arg或鳥胺酸
X17 = 高半胱胺酸
X18 = ω-硝基-Arg
X19 = D-Arg
X20 = γ-羧基-Glu (Gla)
X21 = 7-羧基-Glu
X22 = O-磷酸基-Tyr、O-磺基-Tyr或O-氟-Tyr
X23 = 單-氟-甘胺酸
X24 = 二-氟-甘胺酸
X25 = D-Pro
X26 = D-Asp
X27 = D-Arg
在各種實施例中,使用標準肽化學將連接體添加至RgIA類似肽中。在已顯示涉及標靶識別之保守區域周圍添加一或多個連接體增加RgIA類似物之穩定性及結合親和力。具有該等改變之說明性肽序列係闡述於表5中。
表5. 添加有連接體之肽序列
序列 | SEQ ID NO. |
X10X6X7X3[AEA]DPRX8X1X2X4X9X5 | 174 |
X10X6X7X3D[AEA]PRX8X1X2X4X9X5 | 175 |
X10X6X7X3DP[AEA]RX8X1X2X4X9X5 | 176 |
X10X6X7X3DPR[AEA]X8X1X2X4X9X5 | 177 |
X10X6X7X3[AEEA]DPRX8X1X2X4X9X5 | 178 |
X10X6X7X3D[AEEA]PRX8X1X2X4X9X5 | 179 |
X10X6X7X3DP[AEEA]RX8X1X2X4X9X5 | 180 |
X10X6X7X3DPR[AEEA]X8X1X2X4X9X5 | 181 |
X10X6X7X3[AEEEA]DPRX8X1X2X4X9X5 | 182 |
X10X6X7X3D[AEEEA]PRX8X1X2X4X9X5 | 183 |
X10X6X7X3DP[AEEEA]RX8X1X2X4X9X5 | 184 |
X10X6X7X3DPR[AEEEA]X8X1X2X4X9X5 | 185 |
X1 = des-X1、Arg、瓜胺酸或ω-硝基-Arg
X2 = des-X2、Tyr或單-碘-Tyr
X3 = des-X3、Ser或Thr
X4 = des-X4、Arg或Gln
X5 = des-X5、Arg、Tyr、苯基丙胺酸(Phe或F)、色胺酸(Trp或W)、Tyr-Tyr、Tyr-Arg、Arg-Arg-Arg、Arg-Arg、Arg-Tyr、Arg-Arg-Tyr或Tyr-Arg-Arg
X6 = des-X6、Cys或硒半胱胺酸
X7 = des-X7、Cys或硒半胱胺酸
X8 = des-X8、Cys或硒半胱胺酸
X9 = des-X9、Cys或硒半胱胺酸
X10 = des-X10或Gly
AEA = 2-胺基乙氧基乙酸
AEEA = 2-[2-[乙氧基]乙氧基]乙酸
AEEEA = 2-[2-[2-[乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙酸
在各種實施例中,RgIA類似物可具有對N末端及/或C末端之修飾。該等修飾包括:N末端Gly之醯化及/或C末端之醯胺化(表7);N末端Gly之醯化、C末端胺基酸經相應D-異構體(由小寫字母指示)之置換及/或C末端之醯胺化(表8)。所選之具有該等改變之說明性肽序列係顯示於表7及8中。
表7. 具有N末端之修飾或N末端及C末端之修飾之肽序列
序列 | SEQ ID NO. |
Ac-GCCSDPRCRYRCR-COOH | 186 |
Ac-GCCSDPRCRX3RCR-COOH | 187 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCR-COOH | 188 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCRRR-COOH | 189 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCY-COOH | 190 |
Ac-GX4CTDPRX4X2X3QCR-COOH | 191 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCF-COOH | 192 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCY-COOH | 193 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCW-COOH | 194 |
Ac-GCCSDPRCRYRCR-醯胺 | 195 |
Ac-GCCSDPRCRX3RCR-醯胺 | 196 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCR-醯胺 | 197 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCRRR-醯胺 | 198 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCY-醯胺 | 199 |
Ac-GX4CTDPRX4X2X3QCR-醯胺 | 200 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCF-醯胺 | 201 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCY-醯胺 | 202 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCW-醯胺 | 203 |
表8. 具有C末端L-胺基酸經D-胺基酸之置換及N末端之修飾或N末端及C末端之修飾之肽序列
序列 | SEQ ID NO. |
Ac-GCCSDPRCRYRCr-COOH | 204 |
Ac-GCCSDPRCRX3RCr-COOH | 205 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCr-COOH | 206 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCRRr-COOH | 207 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCy-COOH | 208 |
Ac-GX4CTDPRX4X2X3QCr-COOH | 209 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCf-COOH | 210 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCy-COOH | 211 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCw-COOH | 212 |
Ac-GCCSDPRCRYRCr-醯胺 | 213 |
Ac-GCCSDPRCRX3RCr-醯胺 | 214 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCr-醯胺 | 215 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCRRr-醯胺 | 216 |
Ac-GCCTDPRCX2X3QCr-醯胺 | 217 |
Ac-GX4CTDPRX4X2X3QCr-醯胺 | 218 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCf-醯胺 | 219 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCy-醯胺 | 220 |
Ac-GCCTDPRCRX3QCw-醯胺 | 221 |
在各種實施例中,RgIA類似物可藉由添加諸如內醯胺橋或三唑橋等橋來修飾。作為實例,圖3至5顯示藉由SEQ ID NO:25之肽之修飾形成之橋結構。圖3A至3C顯示RgIA類似物中之橋之三種不同連結方案。在如應用於SEQ ID NO:25之橋之連結方案中,X指示各自經天然或非天然存在之胺基酸殘基取代之半胱胺酸殘基。1號及2號橋係自如圖3D中所顯示之橋接部分形成。對於所給肽,1號及2號橋可自相同或不同橋接部分形成。RgIA類似物可具有自二硫橋形成之1號及2號橋二者。
RgIA類似物可具有經內醯胺橋置換之二硫橋中之一者或兩者。圖4顯示RgIA類似物CSP-4-NH
2
(SEQ ID NO: 25)中之該等內醯胺橋置換之4種構型之實例。2位、3位、8位及12位之X指示經不同天然胺基酸或經非天然胺基酸置換之半胱胺酸殘基。採用標準肽合成方法用於主肽鏈;橋接醯胺可經由使用與主肽鏈所採用之化學正交之保護基團來選擇性形成。
RgIA類似物亦可具有一個半胱胺酸二硫橋及一個三唑橋。半胱胺酸殘基中之每一者經為橋前體組份且在其側鏈中含有炔烴基團或疊氮基團之胺基酸置換,其中炔烴基團及疊氮基團係經由1,3-偶極環加成化學偶合以形成1,2,3-三唑。三唑橋係自1,3偶極環加成反應(例如「點擊化學」)形成。圖5顯示RgIA類似物CSP-4-NH
2
(SEQ ID NO:25)中之該等三唑橋置換之4種構型之實例。在本文所給實例中,該肽中之每一X代表經(S)-炔丙基甘胺酸或(S)-疊氮基正纈胺酸置換之半胱胺酸殘基。
本文所揭示之RgIA類似物之「變體」包括如與本文所揭示之類似物芋螺毒素肽相比具有一或多個胺基酸添加、缺失、終止位或取代之肽。
胺基酸取代可為保守或非保守取代。本文所揭示之RgIA類似物之變體可包括具有一或多個保守胺基酸取代之彼等。本文中所用之「保守取代」涉及以下保守取代群組中之一者中所存在之取代:群組1:丙胺酸(Ala或A)、甘胺酸(Gly或G)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T);群組2:天冬胺酸(Asp或D)、麩胺酸(Glu或E);群組3:天冬醯胺(Asn或N)、麩醯胺酸(Gln或Q);群組4:精胺酸(Arg或R)、離胺酸(Lys或K)、組胺酸(His或H);群組5:異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、纈胺酸(Val或V);及群組6:苯基丙胺酸(Phe或F)、酪胺酸(Tyr或Y)、色胺酸(Trp或W)。
另外,胺基酸可藉由類似功能、化學結構或組成(例如酸性、鹼性、脂族、芳香族、含硫)分成保守取代群組。例如,出於取代之目的,脂族分組可包括Gly、Ala、Val、Leu及Ile。含有視為彼此之保守取代之胺基酸之其他群組包括:含硫:Met及Cys;酸性:Asp、Glu、Asn、及Gln;較小脂族、非極性或略帶極性之殘基:Ala、Ser、Thr、Pro、及Gly;極性、帶負電荷之殘基及其醯胺:Asp、Asn、Glu、及Gln;極性、帶正電荷之殘基:His、Arg、及Lys;較大脂族、非極性殘基:Met、Leu、Ile、Val、及Cys;及較大芳香族殘基:Phe、Tyr、及Trp。其他資訊參見Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company。
本文中所揭示或引用之類似物芋螺毒素肽序列之變體亦包括與本文所揭示或引用之肽序列具有至少70%序列一致性、至少80%序列一致性、至少85%序列一致性、至少90%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。更特定而言,本文所揭示之RgIA類似物之變體包括共享如下序列一致性之肽:與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享70%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享80%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享81%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享82%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享83%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享84%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享85%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享86%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享87%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享88%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享89%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享90%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享91%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享92%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享93%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享94%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享95%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享96%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享97%序列一致性;與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享98%序列一致性;或與SEQ ID NO:1至319中之任一者共享99%序列一致性。
「%序列一致性」係指兩個或更多個序列之間之關係,如藉由比較該等序列來測定。業內,「一致性」亦意指肽序列之間序列關聯之程度,如藉由該等序列之串之間之匹配測定。「一致性」 (常稱為「類似性」)可容易地藉由已知方法計算,包括闡述於以下參考文獻中之彼等:Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.編輯) Oxford University Press, NY (1988);Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W.編輯) Academic Press, NY (1994);Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編輯) Humana Press, NJ (1994);Sequence Analysis in Molecular Biology (Von Heijne, G.編輯) Academic Press (1987);及Sequence Analysis Primer (Gribskov, M.及Devereux, J.編輯) Oxford University Press, NY (1992)。測定序列一致性之較佳方法經設計以得到所測試序列間之最佳匹配。在公開之電腦程式中編纂測定序列一致性及類似性之方法。序列比對及一致性百分比計算可使用LASERGENE生物資訊學計算套件(DNASTAR公司, Madison, Wisconsin)之Megalign程式來實施。序列之多重比對亦可使用Clustal比對方法(Higgins及Sharp CABIOS, 5, 151-153 (1989))利用缺省參數(間隔罰分=10,間隔長度罰分=10)來實施。相關程式亦包括GCG程式套件(Wisconsin Package 9.0版, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin);BLASTP、BLASTN、BLASTX (Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990);DNASTAR (DNASTAR公司, Madison, Wisconsin);及納入Smith-Waterman演算法之FASTA程式(Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. 編輯:Suhai, Sandor. 出版商:Plenum, New York, N.Y.)。在本發明之上下文中,應瞭解,若使用序列分析軟體用於分析,則分析結果係基於所參考程式之「缺省值」。本文所用之「缺省值」將意指在首次初始化時隨軟體最初加載之值或參數之任何集。
「D-取代類似物」包括本文中所揭示之具有一或多個經D-胺基酸取代之L-胺基酸之RgIA類似物。D-胺基酸可為與類似物序列中所見類型相同之胺基酸類型或可為不同胺基酸。因此,D-類似物亦為變體。
「修飾」包括本文中所揭示之其中一或多個胺基酸已經非胺基酸組份置換或其中該胺基酸已與官能團偶聯或官能團已以其他方式與胺基酸聯結之RgIA類似物。經修飾胺基酸可為(例如)糖基化胺基酸、聚乙二醇化胺基酸(聚乙二醇(PEG)聚合物之共價及非共價附接或融合(amalgamation))、法呢基化(farnesylated)胺基酸、乙醯基化胺基酸、醯化胺基酸、生物素化胺基酸、磷酸化胺基酸、與諸如脂肪酸等脂肪部分偶聯之胺基酸或與有機衍生劑偶聯之胺基酸。經修飾胺基酸之存在在以下方面可係有利的:例如,(a) 增加多肽血清半衰期及/或活體內功能性半衰期,(b) 降低多肽抗原性,(c) 增加多肽儲存穩定性,(d) 增加肽溶解性,(e) 延長循環時間,及/或(f) 增加生物可用度,例如增加曲線下面積(AUC
sc
)。胺基酸可(例如)在重組產生期間以共轉譯或後轉譯方式經修飾(例如在哺乳動物細胞中表現期間於N-X-S/T模體處之N連接糖基化),或藉由合成方式經修飾。經修飾胺基酸可位於序列內或序列之末端處。修飾可包括如本文其他地方所述之衍生物。
肽在投與後容易且很快由腎或吞噬細胞清除。此外,肽易於由蛋白水解酶降解。芋螺毒素肽與不同長度及結構之脂肪醯基鏈之連接(脂化)可藉由促進與血液中充當載劑之蛋白質(例如白蛋白)之相互作用來增加肽在循環中之半衰期。適宜經脂化部分包括完全飽和之脂肪以及不飽和脂肪(例如單不飽和、雙不飽和、三不飽和及多不飽和脂肪)。在一些實施例中,核心脂肪部分可與一個以上芋螺毒素肽偶聯。例如,兩個相同芋螺毒素肽可與單一脂肪部分偶聯。
將脂肪酸之活化酯(例如N-羥基琥珀醯亞胺酯)或衍生自具有游離羧酸之脂肪酸之其他活化酯以及市售肽偶合試劑與所關注之含有游離胺(例如N末端甘胺酸)之芋螺毒素肽混合在諸如二甲基甲醯胺等溶劑及如二異丙基乙胺之鹼中。將該混合物在黑暗中攪拌12小時至16小時,並藉由半製備型逆相層析分離經脂化芋螺毒素肽產物。
本文中所揭示之RgIA類似物之修飾亦包括肽與IgG之Fc結構域之融合,從而組合RgIA肽之生物活性與單株抗體之穩定性。如本文中所述,該等RgIA肽體將藉由重組技術藉由將RgIA類似物框內與人類IgG之Fc部分融合來生成。該等肽-Fc融合蛋白通常具有小於60 kDa至70 kDa或為單株抗體之重量之大約一半之分子量。將IgG之Fc部分納入肽體中可藉助FcRn保護延長半衰期。兩個Fc區域之二聚合使與標靶相互作用之活性肽數量增加高達兩倍(Wu等人,2014)。
在某些實施例中,將肽與IgG之其他結構域或與白蛋白融合。
經修飾胺基酸之存在在以下方面可係有利的:例如,(a) 增加肽血清半衰期及/或活體內功能性半衰期,(b) 降低肽免疫原性,(c) 增加肽儲存穩定性,(d) 增加肽溶解性,(e) 延長循環時間,(f) 增加生物可用度,例如增加曲線下面積(AUC
sc
),及/或(g) 藉由增加黏膜吸收增加經頰或經口生物可用度。胺基酸可(例如)在重組產生期間以共轉譯或後轉譯方式經修飾(例如在哺乳動物細胞中表現期間於N-X-S/T模體處之N連接糖基化),或藉由合成方式經修飾。經修飾胺基酸可位於序列內或序列之末端處。修飾可包括如本文其他地方所述之衍生物。
C末端可為羧酸或醯胺基團。本發明亦係關於進一步藉由以下方式修飾之RgIA類似物:(i) 對C末端進行之添加,例如Tyr、碘-Tyr、螢光標籤,及/或(ii)對N末端進行之添加,例如Tyr、碘-Tyr、焦麩胺酸或螢光標籤。
另外,可將熟習此項技術者已知改良穩定性之殘基或殘基之基團添加至C末端及/或N末端。而且,可將熟習此項技術者已知改良經口可用度之殘基或殘基之基團添加至C末端及/或N末端。
在某些實施例中,N末端之修飾包括含有N-甲醯基、N-乙醯基、N-丙基及長鏈脂肪酸基團之醯化。在某些實施例中,N末端之修飾包括PYRO基團之添加。在某些實施例中,C末端及/或N末端之修飾包括藉由添加長度為4個至24個、10個至18個或12個至16個碳原子之脂肪酸進行之脂肪醯化。
在某些實施例中,肽之修飾包括肽與螢光標記(包括螢光染料)之連接。
在某些實施例中,肽之修飾包括一或多個二硫鍵經一或多個以下部分之置換:二卡巴(dicarba)橋,如烷烴(經由烯烴之氫化)、Z-烯烴、E-烯烴、硫醚、硒醚、三硫化物、四硫化物、聚乙氧基醚、脂族連接體及/或脂族連接體與一或多個經由閉環置換反應合成之烯烴部分(Z-或E-異構體)之組合。
在某些實施例中,肽之修飾包括聚乙二醇化。聚乙二醇化由一或多個聚-(乙二醇) (PEG)分子至肽或蛋白質之添加組成,且常增強蛋白質及肽遞送(Davies等人,1977)。肽在投與後容易且很快由腎或吞噬細胞清除。此外,肽易於由血液中之蛋白水解酶降解。芋螺肽(conopeptide)與不同長度及結構之聚乙二醇(PEG)之連接可增加肽在循環中之半衰期。聚乙二醇化增加肽之分子量且由此降低其在腎中過濾之速率;聚乙二醇化亦可使肽屏蔽可去除其之蛋白酶及巨噬細胞及網狀內皮系統(RES)之其他細胞。另外,聚乙二醇化可降低任何與外來肽相關之免疫原性。
芋螺毒素肽可與PEG偶聯之方式之實例係甲氧基聚(乙二醇)-琥珀醯亞胺基戊酸酯與芋螺毒素肽RgIA類似物CSP-4-NH
2
(SEQ ID NO:25)之偶聯。在黑暗中在室溫下,於0.25 mL之無水二甲基甲醯胺中在存在0.0026 mL N,N-二異丙基乙胺之情況下,藉由攪拌使5 mg至10 mg之芋螺毒素肽及mPEG-丁醛以1.5:1莫耳比反應16小時。藉由逆相層析使用Poroshell C18管柱量測反應完整性及聚乙二醇化芋螺毒素肽之濃度。在另一類型之PEG偶聯反應中,將甲氧基聚(乙二醇) (即PEG)-丁醛鏈接至芋螺毒素肽。在室溫下於0.2 mL之100%甲醇中,藉由攪拌使5 mg至10 mg之芋螺毒素肽CSP-4-NH
2
及mPEG-丁醛以1.5:1莫耳比反應15分鐘。之後加入氰基硼氫化鈉之水溶液達1 mg/mL之最終濃度,接著在室溫下在黑暗中混合16小時。藉由逆相層析使用Poroshell C18管柱量測反應完整性及聚乙二醇化芋螺毒素肽之濃度。藉由在去鹽管柱中離心去除過量芋螺毒素肽來純化mPEG偶聯之芋螺毒素肽。於經甲醇平衡之Zeba Spin去鹽管柱(2 mL體積,7,000分子量截止值,ThermoScientific)中以1000×g對樣品離心2分鐘。藉由逆相層析使用Poroshell C18管柱量測反應完整性及旋轉穿過(spun-through)材料中之聚乙二醇化芋螺毒素肽之濃度。
本發明亦係關於所揭示RgIA類似物之衍生物。衍生物包括RgIA類似物具有環狀排列,其中環狀排列體保持天然芋螺毒素肽之天然橋接模式(Craik等人,(2001)),例如具有醯胺環化主鏈之環化芋螺毒素肽,以便芋螺毒素肽不具有任何游離N末端或C,其中該芋螺毒素肽包括天然二硫鍵(美國專利第7,312,195號)。在一個實施例中,環化芋螺毒素肽包括線性芋螺毒素肽及肽連接體,其中經由肽連接體連接線性芋螺毒素肽之N端及C端以形成醯胺環化肽主鏈。在一些實施例中,肽連接體包括選自Gly、Ala及其組合之胺基酸。
各種環化方法可適用於本文中所述之RgIA類似物。本文中所述之RgIA類似物可容易使用丙胺酸橋如(例如) Clark等人,2013及Clark等人,2012中所述環化。使RgIA類似物環化可改良其經口生物可用度並降低對蛋白質水解之敏感性,且不影響RgIA類似物對其特異性標靶之親和力。環化發生在N端與C端之間且二硫橋分別發生在C1至C3及C2至C4之間,其中GAAGAG環化連接體可具有介於1個與8個胺基酸之間之任何長度且可由任何胺基酸序列組成。在某些實施例中,環化係使用可經由環閉合置換反應合成之替代性連接體(例如包括聚乙氧基醚、脂族連接體、及/或脂族連接體與烴鏈中之一或多個烯烴部分(Z-或E-異構體)之任何組合之非肽連接體)進行。
表3. RgIA類似物之環化序列
序列 | SEQ ID NO. |
GCCSDPRCRX3RCRGAAGAG | 13 |
GCCTDPRCX2X3QCRGAAGAG | 14 |
GCCTDPRCX2X3QCRRRGAAGAG | 15 |
GCCTDPRCX2X3QCYGAAGAG | 16 |
GX4CTDPRX4X2X3QCRGAAGAG | 17 |
GCCTDPRCRX3QCFGAAGAG | 18 |
GCCTDPRCRX3QCYGAAGAG | 19 |
GCCTDPRCRX3QCWGAAGAG | 20 |
X3 = des-X3、Ser或Thr
本文中所揭示之實施例包括本文中所述之RgIA類似物以及本文中所述之RgIA類似物之變體、D-取代類似物、修飾及衍生物。在一些實施例中,變體、D-取代類似物、修飾及衍生物具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個序列添加、缺失、終止位、取代、置換、偶聯、聯結或排列。本文中所揭示之每一芋螺毒素肽亦可在任何位置處包括添加、缺失、終止位、取代、置換、偶聯、聯結或排列,該任何位置包括本文中所揭示之類似物芋螺毒素肽序列之1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位或18位。
在一些實施例中,Xaa位可包括在類似物芋螺毒素肽之任何位置處,其中Xaa代表添加、缺失、終止位、取代、置換、偶聯、聯結或排列。在特定實施例中,每一類似物芋螺毒素肽在1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位、11位、12位、13位、14位、15位、16位、17位或18位中之一或多者處具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個Xaa位。
An類似物可具有一個以上改變(添加、缺失、終止位、取代、置換、偶聯、聯結或排列)並鑒定為變體、D-取代類似物、修飾及/或衍生物中之一或多者。亦即,包括類似物、變體、D-取代類似物、修飾及/或衍生物之一個類別與包括在其他類別中並不排斥,且在本文中全部統稱為「芋螺毒素肽」。
芋螺毒素肽可使用重組DNA技術製備。芋螺毒素肽亦可使用Merrifield固相合成製備,但亦可使用業內已知之其他等效化學合成。固相合成係藉由將經保護α胺基酸偶合至適宜樹脂而自芋螺毒素肽之C末端開始。此一起始材料可藉由酯連接將經α-胺基保護之胺基酸附接至氯甲基化樹脂或羥基甲基樹脂或藉由醯胺鍵附接至二苯甲基胺(BHA)樹脂或對甲基二苯甲基胺(MBHA)樹脂來製備。羥基甲基樹脂之製備係由Bodansky等人(1966)闡述。氯甲基化樹脂係自Bio Rad Laboratories (Richmond, Calif.)購得。此一樹脂之製備係由Stewart及Young (1969)闡述。BHA及MBHA樹脂載體市面有售,且通常在正合成之期望芋螺毒素肽在C末端處具有未經取代醯胺時使用。因此,固體樹脂載體可為業內已知之彼等中之任一者,例如具有者式—O—CH2-樹脂載體、—NH BHA樹脂載體或—NH-MBHA樹脂載體。當未經取代醯胺合意時,使用BHA或MBHA樹脂可係有利的,此乃因裂解直接得到醯胺。若N-甲基醯胺合意,則其可自N-甲基BHA樹脂生成。若其他經取代醯胺合意,則可使用美國專利第4,569,967號之教示,或若在C末端處除游離酸以外之其他基團合意,則可使用Houben-Weyl text (1974)中所闡述之古典方法合成芋螺毒素肽。
當欲合成在C末端處具有游離酸之芋螺毒素肽時,可根據Horiki等人(1978)中所闡述之程序,在約60℃下使用KF於二甲基甲醯胺(DMF)中,首先將由Boc或Fmoc並由側鏈保護基團(若適當)保護之C末端胺基酸偶合至氯甲基化樹脂並持續24小時,同時攪拌。在將BOC-保護胺基酸偶合至樹脂載體後,可如藉由使用於二氯甲烷中之三氟乙酸(TFA)或單獨TFA去除α-胺基保護基團。可在介於0℃與室溫之間之溫度下實施去保護。其他標準裂解試劑(例如於二噁烷中之HCl)及具體α-胺基保護基團之去除條件可如Schroder及Lubke (1965)中所闡述來使用。
在去除α-胺基-保護基團後,剩餘經α-胺基-及側鏈保護之胺基酸可以期望順序逐步偶合以獲得中間化合物或作為在合成中單獨地添加每一胺基酸之替代方案,其中一些可在添加至固相反應器之前彼此偶合。適當偶合試劑之選擇為熟習此項技術者所熟知。說明性偶合試劑包括N,N’-二環己基碳化二亞胺(DCC、DIC、HBTU、HATU、TBTU,在存在HoBt或HoAt之情況下)。
用於肽(包括芋螺毒素肽)之固相合成之活化試劑為業內所熟知。適宜活化試劑之實例包括碳化二亞胺,例如N,N’-二異丙基碳化二亞胺及N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺。其他活化試劑及其於肽偶合中之用途係由Schroder及Lubke (1965)及Kapoor (1970)闡述。
可將每一保護胺基酸或胺基酸序列以二倍或更多過量引入固相反應器中,且可在DMF:CH
2
Cl
2
(1:1)之介質中或在單獨DMF或CH
2
Cl
2
中實施偶合。在發生中間偶合之情形下,可在去除α-胺基保護基團之前重複偶合程序,然後偶合下一胺基酸。若手動實施,則在合成之每一階段處偶合反應之成功可藉由寧海準(ninhydrin)反應來監測,如由Kaiser等人(1970)闡述。可如在Beckman 990自動合成儀上使用諸如報導於Rivier等人(1978)中之彼等之程式來自動實施偶合反應。
在已完成期望胺基酸序列後,可自樹脂載體藉由利用諸如液體氟化氫或TFA (若使用Fmoc化學)等試劑處理來去除中間肽,該試劑不僅自樹脂裂解該肽,且亦裂解所有剩餘側鏈保護基團以及若先前未經去除則N末端處之α-胺基保護基團,以獲得呈游離酸形式之肽。若該序列中存在Met,可在用HF自樹脂裂解該肽之前首先使用TFA/乙烷二硫醇去除Boc保護基團,以消除可能S-烷基化。當使用氟化氫或TFA用於裂解時,在反應容器中可包括一或多種捕獲劑,例如苯甲醚、甲酚、二甲基硫醚及甲基乙基硫醚。
可如以肽-樹脂之一部分使芋螺毒素肽環化相反實現線性芋螺毒素肽之環化,以在Cys殘基之間產生鍵。為實現此一二硫環化連接,可如業內所熟知藉由氨解自羥甲基化樹脂或氯甲基化樹脂載體裂解經完全保護之芋螺毒素肽,以產生經完全保護之醯胺中間體,其後其以適當方式環化並去保護。另一選擇為,可在0℃下利用氫氟酸(HF)或TFA進行芋螺毒素肽之去保護以及自以上樹脂或二苯甲基胺(BHA)樹脂或甲基二苯甲基胺(MBHA)之裂解,接著如上文所述氧化。
亦可使用自動合成儀合成芋螺毒素肽。在該等實施例中,可使用Advanced Chemtech 357自動肽合成儀於C末端處開始,將胺基酸依序偶合至MBHA Rink樹脂(通常100 mg之樹脂)。使用1,3-二異丙基碳化二亞胺於N-甲基吡咯啶酮(NMP)中或藉由六氟磷酸2-(1H-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(HBTU)及二乙基異丙基乙胺(DIEA)實施偶合。可藉由利用六氫吡啶存於二甲基甲醯胺(DMF)中之20%溶液處理來去除Fmoc保護基團。隨後用DMF (兩次)、接著甲醇及NMP洗滌樹脂。
可將芋螺毒素肽調配於醫藥組合物內。「醫藥組合物」意指適於醫學投與之物理離散相關單元。「呈劑量單元形式之醫藥組合物」意指適於醫學投與之物理離散相關單元,每一者含有治療有效量或治療有效量之倍數(最多四倍)或約數(最低四十分之一)之芋螺毒素肽以及醫藥上可接受之載劑。該醫藥組合物含有日劑量還是日劑量之(例如)一半、三分之一或四分之一將分別取決於該醫藥組合物欲投與一次還是(例如)一天投與兩次、三次或四次。
醫藥組合物中之芋螺毒素肽之量及濃度以及醫藥組合物之量可基於臨床相關因素、醫藥組合物中芋螺毒素肽之溶解性、芋螺毒素肽之效能及活性及醫藥組合物之投與方式來選擇。芋螺毒素肽僅必須構成治療有效量,即以便適宜有效劑量將與單一或多個單位劑量中所採用之劑型一致。
醫藥組合物將通常含有以總組合物之重量計0.0001 wt. %至99 wt. %、較佳0.001 wt. %至50 wt. %或0.01 wt. %至10 wt. %之芋螺毒素肽。除芋螺毒素肽以外,醫藥組合物亦可含有其他藥物或藥劑。其藥物或藥劑之實例包括臨床醫學之所有主要領域中之止痛劑、細胞因子及治療劑。當與其他藥物或藥劑一起使用時,芋螺毒素肽可以藥物混合物(cocktail)之形式遞送。混合物(cocktail)係任一芋螺毒素肽與另一藥物或藥劑之混合物(mixture)。在此實施例中,常見投與媒劑(例如丸劑、錠劑、植入物、幫浦、可注射溶液等)將含有芋螺毒素肽與其他藥物或藥劑二者之組合。該混合物之個別組份可各自以治療有效量投與,或其組合投與可產生治療有效量。
醫藥組合物包括醫藥上可接受之載劑包括不產生無論對於研究、預防性及/或治療性治療皆超過投與益處之顯著不良、過敏或其他不適反應之彼等。說明性醫藥上可接受之載劑及調配物係揭示於Remington, 2005中。此外,醫藥組合物可經製備以滿足如美國食品與藥品管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)生物標準辦公室(Office of Biological Standards)及/或其他相關管製機構所要求之無菌性、發熱性及/或一般安全性及純度標準。
通常,將芋螺毒素肽與一或多種針對選定投與模式所選之醫藥上可接受之載劑混合。遞送方法之實例參見美國專利第5,844,077號。
說明性常用醫藥上可接受之載劑包括任何及所有增積劑、填充劑、溶劑、共溶劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑、等滲劑、釋放劑、吸收延遲劑、鹽、穩定劑、緩衝劑、螯合劑、凝膠、黏合劑、崩解劑、潤濕劑、乳化劑、潤滑劑、著色劑、調味劑、甜味劑及芳香劑。
說明性緩衝劑包括檸檬酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑、酒石酸鹽緩衝劑、富馬酸鹽緩衝劑、葡萄糖酸鹽緩衝劑、草酸鹽緩衝劑、乳酸鹽緩衝劑、乙酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑、組胺酸緩衝劑及三甲基胺鹽。
說明性防腐劑包括苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化銨、苄烷銨鹵化物(benzalkonium halide)、氯化六羥季銨、對羥基苯甲酸烷基酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇及3-戊醇。
說明性等滲劑包括多元糖醇、三元糖醇或更高元糖醇,例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇(arabitol)、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
說明性穩定劑包括有機糖、多元糖醇、聚乙二醇、含硫還原劑、胺基酸、低分子量肽、免疫球蛋白、親水聚合物及多糖。
說明性抗氧化劑包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、半胱胺酸鹽酸鹽、亞硫酸氫鈉、偏二亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、油溶性抗氧化劑、抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚、金屬螯合劑、檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸及磷酸。
說明性潤滑劑包括月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂。
說明性醫藥上可接受之鹽包括與無機或有機酸及/或鹼形成之酸性及/或鹼性鹽,較佳鹼性鹽。儘管醫藥上可接受之鹽較佳,但特定而言當採用芋螺毒素肽作為藥品時,其他鹽可用於(例如)處理該等芋螺毒素肽或預期非藥品類型用途之情形。該等芋螺毒素肽之鹽可藉由業內公認之技術來製備。
說明性醫藥上可接受之鹽包括無機及有機加成鹽,例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、甲烷-磺酸鹽、羥乙磺酸鹽、茶鹼乙酸鹽及水楊酸鹽。亦可使用低碳烷基四級銨鹽。
對於經口投與,可將芋螺毒素肽調配成固體或液體製劑,例如膠囊、丸劑、錠劑、菱形錠劑、熔體、粉劑、懸浮液或乳液。在製備經口劑型之組合物中,可採用任一常見醫藥上可接受之載劑,例如諸如以下等載劑:在經口固體製劑(例如,粉劑、膠囊及錠劑)之情形下澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑、及諸如此類;或在經口液體製劑(例如,懸浮液、酏劑及溶液)之情形下水、二醇、油、醇、調味劑、防腐劑、著色劑、懸浮劑及諸如此類。因錠劑及膠囊易於投與,故其可代表有利之經口劑量單位形式,在該情形下,顯然採用固體醫藥載劑。若需要,錠劑可藉由標準技術經糖包衣或經腸溶包衣。芋螺毒素肽可經囊封以使其穩定穿過胃腸道,而同時在某些實施例中,允許穿過血腦障壁。例如,參見WO 96/11698。
對於非經腸投與,可將芋螺毒素肽溶解於醫藥上可接受之載劑中並以溶液或懸浮液形式投與。說明性醫藥上可接受之載劑包括水、鹽水、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇或動物、植物或合成來源之油。載劑亦可含有其他成份,例如,防腐劑、懸浮劑、增溶劑、緩衝劑及諸如此類。
芋螺毒素肽可呈粉末形式,用於在遞送時於適當醫藥上可接受之載劑中重構。在另一實施例中,芋螺毒素肽之單位劑型可為無菌、氣密性密封安瓿或無菌注射器中芋螺毒素肽或其醫藥上可接受之鹽於適宜稀釋劑中之溶液。
芋螺毒素肽亦可調配為儲積製劑。儲積製劑可利用適宜聚合或疏水性材料(例如作為於可接受油中之乳液)或離子交換樹脂來調配,或作為微溶衍生物(例如,作為微溶鹽)來調配。
另外,芋螺毒素肽可利用含有至少一種化合物之固體聚合物之半滲透基質調配為緩釋系統。各種緩釋材料已經確立且為熟習此項技術者所熟知。緩釋系統可端視其化學性質在投與後釋放芋螺毒素肽並持續幾周至長達100天以上。
芋螺毒素肽之投與亦可使用幫浦達成(例如參見Luer等人(1993)、Zimm等人(1984)及Ettinger等人(1978));微囊體(例如參見美國專利第4,352,883號、第4,353,888號及第5,084,350號);連續釋放聚合物植入物(例如參見美國專利第4,883,666號);及巨囊體(例如參見美國專利第5,284,761號、第5,158,881號、第4,976,859號及第4,968,733號及公開之PCT專利申請案WO92/19195、WO 95/05452)。
當經鞘內投與芋螺毒素肽時,其亦可溶解於腦脊髓液中。亦可使用至CNS之裸或未經囊封細胞移植物。(例如參見美國專利第5,082,670號及第5,618,531號)。
本發明之芋螺毒素肽及其醫藥組合物可用於治療個體之與菸鹼乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10受體亞型相關之病狀之方法。本文在使用表現nAChR之卵母細胞之不同亞型之研究中已顯示某些α-芋螺毒素(包括RgIA及其類似物)在阻斷α9α10亞型之nAChR中之活性(Ellison等人,2006;Vincler等人,2006;WO 2008/011006;US 2009/0203616;US 2012/0220539)。α-芋螺毒素(包括RgIA)作為鎮痛劑及止痛劑之活性已顯示在之研究中慢性壓迫性損傷(Vincler等人,2006;WO 2008/011006;US 2009/0203616)。在慢性壓迫性損傷之研究中已顯示α-芋螺毒素(包括RgIA)在抑制免疫細胞之遷移中之活性(Vincler等人,2006;WO 2008/011006;US 2009/0203616)。
本文中所述之方法包括向有需要之個體投與治療有效量之所揭示芋螺毒素肽或其醫藥上可接受之鹽,其中所揭示之芋螺毒素肽阻斷nAChR之α9α10亞型。阻斷nAChR之α9α10亞型之芋螺毒素肽可用於治療疼痛、用於治療發炎及/或發炎性病狀並用於治療癌症及/或癌症相關疼痛。在某些實施例中,芋螺毒素肽基於其抑制免疫細胞遷移之能力係有效的。在其他實施例中,該等化合物基於其減緩脫髓鞘及/或增加完整神經纖維之數量之能力係有效的。
本文中所揭示之方法包括利用本文中所揭示之包括醫藥上可接受之鹽及其前藥之芋螺毒素肽治療個體(人類、脊椎動物(狗、貓、爬行動物、鳥類等)、家畜(馬、牛、山羊、豬、雞等)及研究動物(猴子、大鼠、小鼠、魚等))。治療個體包括遞送治療有效量之所揭示之芋螺毒素肽。治療有效量包括彼等提供有效量、預防性治療及/或治療性治療之量。
「有效量」係在個體中引起期望生理變化所需芋螺毒素肽之量。通常投與有效量用於研究目的。本文中所揭示之有效量在意欲研究芋螺毒素肽在治療疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症中之有效性之研究分析中引起期望生理變化。
「預防性治療」包括向不展示疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之體徵或症狀之個體投與或向僅展示疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之早期體徵或症狀之個體投與,以便投與治療用於減少、預防或降低進一步發展為疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之風險之目的之治療。因此,預防性治療(prophylactic treatment)作為針對疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之預防性治療(preventative treatment)起作用。
「治療性治療」包括向展示疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之症狀或體徵之個體投與之治療並向該個體投與用於減少或消除疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之彼等體徵或症狀之目的。治療性治療可減少、控制或消除疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之存在或活性及/或減少、控制或消除疼痛、發炎性病狀、發炎及/或癌症之副效應。
可治療之說明性類型之疼痛包括一般性疼痛、慢性疼痛、神經病變疼痛、感覺接受性疼痛及發炎性疼痛。另外,該等類型之疼痛可與包括以下之病因相關及/或由其誘導:周邊神經或痛覺感受器損害、發炎性病狀、代謝性病症、病毒感染、癌症、由化學治療劑誘導之疼痛、外科程序後誘導之疼痛及由灼傷或其他物理組織損傷誘導之疼痛。
在治療化學療法誘導之神經病變疼痛(CINP)中之治療有效量可包括降低機械性痛覺過敏、機械性觸感痛(由通常不僅引起疼痛之刺激物導致之疼痛)、熱(熱誘導)痛覺過敏、熱(低溫誘導)觸感痛、遷移免疫細胞之數量、發炎媒介之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度之彼等。
在治療灼傷誘導之神經病變疼痛中之治療有效量可包括降低機械性痛覺過敏、機械性觸感痛、熱(熱誘導)痛覺過敏、熱(低溫誘導)觸感痛、遷移免疫細胞之數量、發炎媒介之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度之彼等。
在治療手術後神經病變疼痛中之治療有效量可包括降低機械性痛覺過敏、機械性觸感痛、熱(熱誘導)痛覺過敏、熱(低溫誘導)觸感痛、遷移免疫細胞之數量、發炎媒介之含量及/或個體報導之主觀疼痛程度之彼等。
可治療之說明性發炎性病狀包括發炎、慢性發炎、風濕性疾病(包括關節炎、狼瘡、關節黏連性脊椎炎、纖維肌痛、肌腱炎、黏液囊炎、硬皮病及痛風)、敗血症、纖維肌痛、發炎性腸病(包括潰瘍性結腸炎及克隆氏病(Crohn’s disease))、類肉瘤病、子宮內膜組織異位症、子宮纖維瘤、發炎性皮膚疾病(包括牛皮癬及受損之創傷癒合)、肺之發炎性病狀(包括氣喘及慢性阻塞性肺病)、與神經系統之發炎相關疾病之(包括多發性硬化症、帕金森氏病(Parkinson’s Disease)及阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease))、牙周病及心血管疾病。
在治療發炎性病狀中之治療有效量可包括降低在基因表現層級發炎性標記物之含量或蛋白質含量及/或減少遷移免疫細胞之數量之彼等。另外, 與發炎性病狀相關之疼痛可藉由引起機械性痛覺過敏、機械性觸感痛、熱(熱誘導)痛覺過敏、熱(低溫誘導)觸感痛及/或個體報導之主觀疼痛程度降低之治療有效量來治療。
可治療之說明性癌症包括乳癌。α9-nAChR在人類乳房腫瘤組織中過度表現(Lee等人,2010a)且藉由siRNA之受體抑制或其他機制降低乳癌細胞之活體外及活體內致癌性質,包括癌細胞增殖之抑制(Chen等人,2011)。在某些實施例中,RgIA類似物係以治療量使用以藉由抑制α9-nAChR來抑制腫瘤生長。
在治療諸如乳癌等癌症中之治療有效量可包括在治療後在個體中降低腫瘤細胞之數量、降低轉移之數量、降低腫瘤體積、增加預期壽命、誘導癌細胞之凋亡、誘導癌細胞死亡、誘導癌細胞中之化學敏感性或輻射敏感性、抑制癌細胞附近之血管生成、抑制癌細胞增殖、抑制腫瘤生長、預防轉移、延長個體之壽命、減少癌症相關疼痛及/或減少癌症之復發(relapse或re-occurrence)之彼等。
對於投與,初始可基於來自活體外分析及/或動物模型研究之結果估計治療有效量。例如,可在動物模型中調配劑量以達成循環濃度範圍(包括IC50),如在細胞培養物中針對特定標靶所測定。該資訊可用於更準確地確定在所關注個體中之治療有效量。
向特定個體投與作為治療有效量之實際量可由醫師、獸醫或研究者慮及諸如物理及生理學因素等參數來確定,包括目標;體重;病狀之嚴重程度;疼痛、發炎性病狀或癌症之類型;先前或並存之治療性干預;個體之特發病;及投與途徑。
劑量可經適當調整以局部地或全身性地達成期望芋螺毒素肽含量。通常,本發明之芋螺毒素肽在0.001 mg/kg至250 mg/kg、較佳0.01 mg/kg至100 mg/kg之芋螺毒素肽、更佳0.05 mg/kg至75 mg/kg之劑量範圍下呈現其效應。適宜劑量可每天以多個分劑量投與。通常,劑量或分劑量可含有每個單位劑型0.1 mg至500 mg之芋螺毒素肽。更佳劑量將含有每個單位劑型0.5 mg至100 mg之芋螺毒素肽。
為治療有效量之其他劑量常可在0.1 µg/kg至5 µg/kg或0.5 µg/kg至1 µg/kg範圍內。在其他實例中,劑量可包括1 µg/kg、5 µg/kg、10 µg/kg、15 µg/kg、20 µg/kg、25 µg/kg、30 µg/kg、35 µg/kg、40 µg/kg、45 µg/kg、50 µg/kg、55 µg/kg、60 µg/kg、65 µg/kg、70 µg/kg、75 µg/kg、80 µg/kg、85 µg/kg、90 µg/kg、95 µg/kg、100 µg/kg、150 µg/kg、200 µg/kg、250 µg/kg、350 µg/kg、400 µg/kg、450 µg/kg、500 µg/kg、550 µg/kg、600 µg/kg、650 µg/kg、700 µg/kg、750 µg/kg、800 µg/kg、850 µg/kg、900 µg/kg、950 µg/kg、1000 µg/kg、0.1 mg/kg至5 mg/kg或0.5 mg/kg至1 mg/kg。在其他實例中,劑量可包括1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg、45 mg/kg、50 mg/kg、55 mg/kg、60 mg/kg、65 mg/kg、70 mg/kg、75 mg/kg、80 mg/kg、85 mg/kg、90 mg/kg、95 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg、250 mg/kg、350 mg/kg、400 mg/kg、450 mg/kg、500 mg/kg、550 mg/kg、600 mg/kg、650 mg/kg、700 mg/kg、750 mg/kg、800 mg/kg、850 mg/kg、900 mg/kg、950 mg/kg、1000 mg/kg或更多。
在特定實施例中,劑量可以降低含量起始並增加直至達成期望效應為止。若在該等劑量下個體中之反應不足,則可採用甚至更高劑量(或藉由不同、更局部性遞送途徑之有效的較高劑量),達個體耐受性允許之程度。預期經(例如) 24小時之連續劑量或每天多個劑量達成芋螺毒素肽之適當全身性含量。
治療有效量可藉由在治療方案之過程期間投與單個或多個劑量來達成(例如,每天、每隔一天、每3天、每4天、每5天、每6天、每週、每2週、每3週、每個月、每2個月、每3個月、每4個月、每5個月、每6個月、每7個月、每8個月、每9個月、每10個月、每11個月或每年)。
可使用各種投與途徑。所選之特定模式可取決於所遞送之特定芋螺毒素肽、所治療之疼痛、發炎性病狀或癌症之嚴重程度及提供治療有效量所需要之劑量。可使用醫學上可接受之任何投與模式,意指提供治療有效量之芋螺毒素肽而不引起根據合理醫學判斷超過投與益處之臨床上不可接受之不良效應的任何模式。說明性投與途徑包括靜脈內、真皮內、動脈內、非腸內、鼻內、結內、淋巴內、腹膜內、病灶內、前列腺內、陰道內、直腸內、局部、鞘內、瘤內、肌內、囊內、經口、皮下及/或舌下投與,且更特定而言藉由靜脈內、真皮內、動脈內、非腸內、鼻內、結內、淋巴內、腹膜內、病灶內、前列腺內、陰道內、直腸內、局部、鞘內、瘤內、肌內、囊內、經口、皮下及/或舌下注射。
在一個實施例中,將芋螺毒素肽直接遞送至中樞神經系統(CNS)中,較佳至腦室、腦實質、鞘內空間或其他適宜CNS位置中。
另一選擇為,靶向治療可用於藉由使用靶向系統(例如抗體或細胞特異性配體)將芋螺毒素肽更明確地遞送至某些類型之細胞。
芋螺毒素肽亦可在基於細胞之遞送系統中投與,在該基於細胞之遞送系統中將編碼芋螺毒素肽之核酸序列引入經設計用於植入個體體內之細胞中。在特定實施例中,此遞送方法可用於脊髓區域中。適宜遞送系統係闡述於美國專利第5,550,050號及公開之PCT申請案第WO 92/19195號、第WO 94/25503號、第WO 95/01203號、第WO 95/05452號、第WO 96/02286號、第WO 96/02646號、第WO 96/40871號、第WO 96/40959號及第WO 97/12635號中。
可針對每一芋螺毒素肽基於所揭示序列及已知遺傳密碼以合成方式製備適宜核酸序列。在一些實施例中,多核苷酸包括質粒、cDNA或mRNA,其可包括(例如)用於表現芋螺毒素肽之序列(例如基因)。適宜質粒包括可用於將基因轉移至細胞之標準質粒載體及微環質粒。多核苷酸(例如微環質粒)可進一步包括促進遺傳物質(例如編碼芋螺毒素肽之序列)轉移至細胞中之任何額外序列資訊。例如,多核苷酸可包括啟動子,例如一般啟動子、組織特異性啟動子、細胞特異性啟動子及/或對細胞核或細胞質具有特異性之啟動子。啟動子及質粒(例如微環質粒)為業內眾所周知且可使用習用技術製備。如本文中進一步闡述,多核苷酸可用於轉染細胞。除非另有說明,否則術語轉染(transfect、transfected或transfecting)可用於指示細胞中外源多核苷酸或自其所表現之多肽之存在。已知許多載體能夠調介基因至細胞之轉移,如業內所熟知。
簡言之,術語「基因」係指編碼芋螺毒素肽之核酸序列。此定義包括各種序列多態性、突變及/或序列變體,其中該等改變不影響所編碼芋螺毒素肽之功能。術語「基因」可不僅包括編碼序列,且亦包括調控區域,例如啟動子、增強子及終止區域。「基因」進一步可包括所有內含子及自mRNA轉錄物剪接之其他DNA序列以及自替代性剪接位點產生之變體。編碼芋螺毒素肽之核酸序列可為引導芋螺毒素肽之表現之DNA或RNA。該等核酸序列可為轉錄為RNA之DNA鏈序列或轉譯為蛋白質之RNA序列。核酸序列包括全長核酸序列以及源自全長蛋白質之非全長序列。該等序列亦可包括天然序列或可引入之序列在具體細胞類型中提供密碼子偏愛性之簡併密碼子。編碼本文中所揭示之芋螺毒素肽之基因序列可在公開獲得之數據庫及出版物中獲得。
如所述,本文中所揭示之芋螺毒素肽阻斷nAChR之α9α10亞型。阻斷可藉由任何有效方式量測。在一個實施例中,阻斷係量測為來自nAChR之α9α10亞型之經標記RgIA經本文中所揭示之芋螺毒素肽之置換。在一個實施例中,阻斷可為本文中所揭示之芋螺毒素肽置換20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之來自nAChR之α9α10亞型之經標記RgIA。
在第二個實施例中,阻斷可藉由對本文中所揭示之芋螺毒素肽實施生物分析以測定其如與自RgIA之生物分析獲得之結果相比之治療性活性來量測。在一個實施例中,阻斷可為在與如藉由生物分析量測之RgIA相比時,本文中所揭示之芋螺毒素肽之治療性活性大20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在第三個實施例中,可量測本文中所揭示之芋螺毒素肽對nAChR之α9α10亞型之結合親和力並與RgIA對nAChR之α9α10亞型之結合親和力相比。在一個實施例中,阻斷可為本文中所揭示之芋螺毒素肽之結合親和力較RgIA大20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
在第四個實施例中,藉由量測在功能分析(例如電生理學分析、鈣成像分析及諸如此類)中之影響來分析本文中所揭示之芋螺毒素肽對nAChR之α9α10亞型之功能之影響。在一個實施例中,阻斷包括如藉由功能分析量測當與RgIA相比時nAChR之α9α10亞型之功能之20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%減少。
本文中所揭示之芋螺毒素肽亦可用於識別用以治療與nAChR之α9α10亞型相關之病狀之藥物候選物的方法。該等方法包括針對阻斷nAChR之α9α10亞型之活性之能力篩選藥物候選物。
「藥物候選物」係指可阻斷或以其他方式干預標靶(即α9α10亞型)之活性之任何肽(包括抗體或抗體片段)或化合物(小分子或其他形式)。小分子可屬懷疑與肽複合物相互作用並預期為醫藥上可接受之任何化學類別。藥物候選物可在自然界中發現,藉由組合化學方法合成,及/或經由合理藥物設計創造。
阻斷可如本文其他地方所闡述量測,惟代替RgIA或除RgIA以外,可將藥物候選物與本文中所揭示之芋螺毒素肽相比。芋螺毒素肽可用於識別模擬芋螺毒素肽之治療性活性之藥物候選物的方法。該等方法包括以下步驟:(a) 對藥物候選物實施生物分析以測定其治療性活性;及(b) 將自藥物候選物之生物分析獲得之結果與自本文中所揭示之芋螺毒素肽之生物分析獲得之結果比較。
藥物候選物亦可藉助與多核苷酸(例如DNA及/或RNA)及/或酶之相互作用干預α9α10亞型之活性。該等藥物候選物可為已知或可能DN修飾劑,包括DNA破壞劑(例如干預核酸之結構之嵌入劑);DNA結合劑;失配結合蛋白;及/或烷化劑。
合理藥物設計之一個目標係識別(例如)為芋螺毒素肽之更具活性或更穩定形式或(例如)增強或干預活體內肽之功能之藥物候選物。合理藥物設計中所用之若干方法包括三維結構分析、丙胺酸掃描、分子建模及抗獨特型(anti-id)抗體之使用。該等技術可包括提供定義藉由芋螺毒素肽及nAChR之α9α10亞型形成之蛋白質複合物之三維結構之原子座標及基於原子座標設計或選擇能夠干預間芋螺毒素肽與nAChR之α9α10亞型之相互作用之藥物候選物。
在選擇藥物候選物用於進一步研究或研發後,可根據其物理性質(例如立體化學、鍵結、大小及/或電荷)使用來自一系列來源(例如光譜技術、x射線繞射數據及NMR)之數據模擬其結構。可在此建模製程中使用計算分析、類似性映射(其模擬藥物候選物之電荷及/或體積,而非原子間之鍵結)及其他技術。
當選擇藥物候選物時,可評價其他化學基團之附接。可選擇化學基團,以便藥物候選物易於合成,很可能為醫藥上可接受的,且不會在活體內降解,同時在一些實施例中保留或改良前導芋螺毒素肽之生物活性。另一選擇為,若藥物候選物係基於肽的,則可藉由使肽環化以增加其剛性來達成更高穩定性。可進一步篩選附接有化學基團之藥物候選物以確保其保留標靶性質。然後可實施其他最佳化或修飾以達成一或多種用於活體內或臨床測試之最終藥物候選物。
在藥物候選物之選擇及最佳化後,可製造及/或在用於向個體投與之醫藥組合物中使用所選擇並最佳化之藥物候選物。
包括以下實例以證明特定實施例。熟悉此項技術者根據本發明應認識到,可對本文中所揭示具體實施例作出多種改變且仍獲得相似或類似結果,而不背離本發明之精神及範圍。
實例
實例 1. C 末端之醯胺化增加 RgIA 類似物之穩定性。
針對兩種RgIA類似物用醯胺基團置換肽C末端羧基中之羥基以增加穩定性。CSP-2 (SEQ ID NO:3)明顯更穩定,如藉由當C末端醯胺化(即將NH
2
添加至C末端)時與原始羧基相比生物基質中更高之剩餘肽百分比來證明(圖2A)。利用CSP-4 (SEQ ID NO:5)得到類似發現並顯示於圖2B中。
所選擇之C末端經醯胺化以增加穩定性之說明性肽序列係闡述於表6中。
表6. C末端經醯胺化之肽序列
序列 | SEQ ID NO. |
GCCSDPRCRYRCR-醯胺 | 21 |
GCCSDPRCRX12RCR-醯胺 | 22 |
GCCTDPRCX11X12QCR-醯胺 | 23 |
GCCTDPRCX11X12QCRRR-醯胺 | 24 |
GCCTDPRCX11X12QCY-醯胺 | 25 |
GX13CTDPRX13X11X12QCR-醯胺 | 26 |
GCCTDPRCRX12QCF-醯胺 | 27 |
GCCTDPRCRX12QCY-醯胺 | 28 |
GCCTDPRCRX12QCW-醯胺 | 29 |
X11 = 瓜胺酸
X12 = 3-碘-酪胺酸
X13 = 硒半胱胺酸
實例 2. 芋螺毒素肽之脂化。
使經脂化琥珀醯亞胺基戊酸酯與CSP-4-NH
2
(SEQ ID NO:25)偶聯。在黑暗中在室溫下,於0.25 mL之無水二甲基甲醯胺中在存在0.0026 mL N,N-二異丙基乙胺之情況下,藉由攪拌使5 mg至10 mg之芋螺毒素肽及經脂化琥珀醯亞胺基戊酸酯以1.5:1分子量比反應16小時。藉由逆相層析使用Poroshell C18管柱量測反應完整性及經脂化芋螺毒素肽之濃度。藉由逆相層析經Hypersep C18管柱利用重力進給純化於二甲基甲醯胺中之經脂化芋螺毒素肽。將樣品加載至經校準管柱上95% H
2
O / 5%甲醇/ 0.1%甲酸中。將該管柱加載於相同緩衝液中。將該樣品溶析於95%甲醇/ 5% H
2
O / 0.1%甲酸之四個床體積流分中。將藉由逆相層析使用Poroshell C18管柱顯示含有經脂化芋螺毒素肽之流分彙集,凍乾並再懸浮於甲醇中。
圖6顯示藉由脂化增加之肽藥物之藥物動力學及藥效動力學性質。圖6顯示當與12個或16個碳脂肪偶聯時CSP-4-NH
2
之濃度之增加。CSP-4-NH
2
之穩定性亦顯示於圖2B中。CSP-4-NH
2
藉由12個碳的脂肪酸之活化酯之脂化產生C12-CSP-4-NH
2
,且藉由16個碳的脂肪酸之活化酯之脂化產生C16-CSP-4-NH
2
。可檢測C12-CSP-4-NH
2
長達16 h,而可檢測C16-CSP-4-NH
2
長達24 h。
實例 3. 辣椒素模型中之經脂化 CSP-4 之評價。
使用神經病變疼痛之辣椒素模型評價RgIA類似物治療神經病變疼痛之治療可能性。在此模型中,將30 µg之辣椒素蹠內注射於大鼠後爪中以在大鼠中產生辣椒素誘導之疼痛。在辣椒素注射後15 min、30 min及45 min處實施如藉由哈貴夫士測試量測之熱痛覺過敏(對疼痛之靈敏度之量度;Hargreaves等人,1988)。在辣椒素注射之前量測爪縮回潛伏期(Paw withdrawal latency) (基線)。在辣椒素注射之前2小時至3小時經皮下注射C12-CSP-4-NH
2
、C16-CSP-4-NH
2
或不具有肽之媒劑。如圖7A及7B中可見,經脂化C12-CSP-4-NH
2
及C16-CSP-4-NH
2
之注射導致辣椒素誘導之熱痛覺過敏減少。
實例 4. CINP 模型中之經脂化並經聚乙二醇化 CSP-4 之評價。
在大鼠中經由在3週期間一週兩次靜脈內注射鉑鹽奧沙利鉑(oxaliplatin) (2.4 mg/kg)來誘導CINP。在CINP模型中通常截至第14天誘導機械性痛覺過敏,在第14天開始治療性方案。使用Randall-Selitto測試評估機械性痛覺過敏。Randall-Selitto測試係對疼痛之敏感度之量度。如圖8及9中所見,脂化及聚乙二醇化分別導致神經病變疼痛之此大鼠模型中之痛覺過敏減少。CSP-4-NH
2
經十二烷酸之活化酯脂化(圖8)以產生C12-CSP-4-NH
2
可提供持續29 h之治療性益處。CSP-4-NH
2
經PEG-SVA聚乙二醇化(圖9)以產生PEG-SVA-CSP-4-NH
2
可延長此藥理學治療性效應達3天以上。
實例性實施例
實施例1. 一種芋螺毒素肽,其包含式SEQ ID NO:10。
實施例2. 如實施例1之芋螺毒素肽,其包含式SEQ ID NO:11。
實施例3. 如實施例2之芋螺毒素肽,其包含式SEQ ID NO:12。
實施例4. 一種芋螺毒素肽,其包含來自以下之任一者之式:SEQ ID NO:13至20。
實施例5. 一種芋螺毒素肽,其包含來自以下之任一者之式:SEQ ID NO: 174至185。
實施例6. 如實施例1至5中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽之C末端係醯胺基團(-NH
2
)。
實施例7. 如實施例1至6中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係連接至脂肪酸。
實施例8. 如實施例7之芋螺毒素肽,其中該脂肪酸係3個至60個碳的脂肪酸。
實施例9. 如實施例1至8中任一實施例之芋螺毒素肽,其中在該芋螺毒素肽之C末端處之胺基酸係經D-胺基酸立體異構體置換。
實施例10. 如實施例1至9中任一實施例之芋螺毒素肽,其中N末端胺基酸係乙醯基化胺基酸。
實施例11. 如實施例1至10中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係經生物素化。
實施例12. 如實施例1至11中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係經甲基化。
實施例13. 如實施例1至12中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係在一或多個位點處境磷酸化。
實施例14. 如實施例1至13中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係經糖基化。
實施例15. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係連接至螢光染料或螢光蛋白。
實施例16. 如實施例1至15中任一實施例之芋螺毒素肽,其中兩個半胱胺酸殘基各自經天然或非天然胺基酸置換,然後使該等天然或非天然胺基酸偶合用於橋形成。
實施例17. 如實施例16之芋螺毒素肽,其中該等半胱胺酸殘基中之每一者係經選自天冬胺酸、麩胺酸或離胺酸之天然存在之胺基酸之(R)-或(S)-形式置換。
實施例18. 如實施例16之芋螺毒素肽,其中該兩個半胱胺酸殘基之第一者係經側鏈中含有羧酸之非天然胺基酸置換且該兩個半胱胺酸殘基中之第二者係經側鏈中含有胺基團之非天然胺基酸置換。
實施例19. 如實施例16之芋螺毒素肽,其中該等半胱胺酸殘基中之每一者係經(
S
)-炔丙基甘胺酸或(S)-疊氮基正纈胺酸置換。
實施例20. 如實施例16至19中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該橋係內醯胺橋或三唑橋。
實施例21. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中引入連接體以生成N末端至C末端環化肽。
實施例22. 如實施例21之芋螺毒素肽,其中該連接體由1個至100個胺基酸之序列組成。
實施例23. 如實施例21之芋螺毒素肽,其中該連接體為非肽連接體。
實施例24. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係連接至聚乙二醇聚合物。
實施例25. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該肽係表現為與蛋白質之融合形式。
實施例26. 如實施例25之芋螺毒素肽,其中該蛋白質係免疫球蛋白G (IgG)之Fc部分。
實施例27. 一種醫藥組合物,其包含如實施例1至26中任一實施例之芋螺毒素肽。
實施例28. 一種醫藥上可接受之鹽,其包含如實施例1至26中任一實施例之芋螺毒素肽。
實施例29. 一種用於在有需要之個體中治療至少一種與菸鹼乙醯膽鹼受體(nAChR)之α9α10亞型相關之病狀之方法,其包含向該個體投與治療有效量之芋螺毒素肽、包含該芋螺毒素肽之組合物或包含該芋螺毒素肽之醫藥上可接受之鹽,其中該芋螺毒素肽係如實施例1至26中任一實施例之芋螺毒素肽,藉此治療該病狀。
實施例30. 如實施例29之方法,其中至少一種病狀為疼痛。
實施例31. 如實施例30之方法,其中該疼痛係一般性疼痛、慢性疼痛、神經病變疼痛、感覺接受性疼痛、發炎性疼痛、由周邊神經損害誘導之疼痛、由發炎病症誘導之疼痛、由代謝性病症誘導之疼痛、由癌症誘導之疼痛、由化學療法誘導之疼痛、由外科程序誘導之疼痛及/或由灼傷誘導之疼痛。
實施例32. 如實施例31之方法,其中該疼痛係癌症相關之慢性疼痛及/或癌症相關之神經病變。
實施例33. 如實施例29之方法,其中該至少一種病狀為發炎性病狀。
實施例34. 如實施例33之方法,其中該發炎性病狀係發炎、慢性發炎、風濕性疾病、敗血症、纖維肌痛、發炎性腸病、類肉瘤病、子宮內膜組織異位症、子宮纖維瘤、發炎性皮膚疾病、肺之發炎性病狀、與神經系統之發炎相關之疾病、牙周病或心血管疾病。
實施例35. 如實施例33至34中任一實施例之方法,其中該發炎性病狀係藉由免疫細胞調介。
實施例36. 如實施例33至35中任一實施例之方法,其中該發炎性病狀係長期發炎及損傷後周邊神經病變。
實施例37. 如實施例29之方法,其中該至少一種病狀為疼痛及發炎。
實施例38. 如實施例29之方法,其中該至少一種病狀為發炎及神經病變。
實施例39. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中Asp-Pro-Arg區域中之天冬胺酸殘基與脯胺酸殘基之間之肽鍵係經非肽鍵置換,其中將亞甲基納入天冬胺酸之羰基與脯胺酸之氮之間。
實施例40. 如實施例1至14中任一實施例之芋螺毒素肽,其中該Asp-Pro-Arg區域中之天冬胺酸係經胺基丙二酸置換。
本文所示之詳情係作為實例且僅用於說明性討論本發明之較佳實施例之目的且為了提供據信係最有用且易於理解本發明各個實施例之原理及概念性態樣之描述而呈現。為此,僅詳細地顯示為了基本上理解本發明所必需的本發明之結構細節,結合附圖及/或實例進行之說明可使熟悉此項技術者明瞭如何在實踐中體現本發明的若干種形式。
除非另有所示,否則本發明之實踐採用熟習此項技術者所熟知之化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉基因生物學之習用技術。例如,參見Maniatis等人,Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1982);Sambrook等人,Molecular Cloning, 第2版. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989);Sambrook及Russell, Molecular Cloning, 第3版. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001);Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 更新到2005年);Glover, DNA Cloning (IRL Press, Oxford, 1985);Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992);Guthrie及Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991);Harlow及Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1998);Jakoby及Pastan, 1979;Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯1984);Transcription And Translation (B. D. Hames及S. J. Higgins編輯1984);Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss公司, 1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986);B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press公司, N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller及M. P. Calos編輯, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer及Walker編輯, Academic Press, London, 1987);Handbook Of Experimental Immunology, 第I卷至第IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯, 1986);Riott, Essential Immunology, 第6版, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988);Hogan等人,Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986);Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 第4版, (Univ. of Oregon Press, Eugene, Oregon, 2000)。
如熟悉此項技術者應瞭解,本文所揭示之每一實施例可包含其特別闡明之元素、步驟、成份或組份,基本上由其組成或由其組成。因此,術語「包括(include或including)」應解釋為敘述:「包含、由...組成或基本上由...組成」。過渡術語「包含(comprise或comprises)」意指包括(但不限於),且允許包括未指明之元素、步驟、成份或組份,即使該等係大量的。過渡性片語「由...組成」排除未指明之元素、步驟、成份或組份。過渡性片語「基本上由...組成」將實施例之範圍限於指明之元素、步驟、成份或組份及不會實質上影響實施例之彼等。
除非另有指示,否則應瞭解說明書及申請專利範圍中所用之所有數字在所有情形中皆由術語「約」修飾。因此,除非說明相反情況,否則說明書及隨附申請專利範圍中所列示數字參數皆為可隨本發明尋求獲得之期望性質而變化的近似值。最低限度地,且並非試圖限制申請專利範圍之等效項之原則的應用,每一數字參數皆應至少根據所報告有效位的數量且藉由應用普通舍入技術來解釋。在需要進一步明確時,術語「約」當與規定數值或範圍結合使用時具有熟悉此項技術者合理地歸於其之含義,即,表示比規定值或範圍稍微多或稍微少,至以下範圍內:±20%之規定值;±19%之規定值;±18%之規定值;±17%之規定值;±16%之規定值;±15%之規定值;±14%之規定值;±13%之規定值;±12%之規定值;±11%之規定值;±10%之規定值;±9%之規定值;±8%之規定值;±7%之規定值;±6%之規定值;±5%之規定值;±4%之規定值;±3%之規定值;±2%之規定值;或±1%之規定值。
儘管闡述本發明寬範圍之數值範圍及參數係近似值,但在具體實例中所闡述之數值儘可能準確地報告。然而,任何數值皆固有地含有必然由其各別測試量測中存在之準則偏差所引起的必然誤差。
除非本文中另有指示或上下文明顯矛盾,否則在闡述本發明的上下文(尤其在下文申請專利範圍之上下文)中所用術語「一(a、an)」、「該」及類似指示物皆應理解為涵蓋單數與複數兩者。本文列舉之數值範圍僅意欲作為個別提及此範圍內各單獨值之速記方法。除非本文另有所示,否則各個別值皆如同其在本文中個別引用一般併入本說明書中。除非本文另有所示或上下文另外明顯矛盾,否則本文所述之所有方法可以任何適宜順序實施。除非另外闡明,否則本文所提供之任何及所有實例或說明性語言(例如「諸如」)僅意欲更好地闡明本發明且並不限制本發明範圍。本說明書中之任何語言皆不應理解為指示任何未主張要素對本發明實踐係必不可少的。
本文所揭示本發明之替代要素或實施例之分組不應理解為具有限制性。各群組成員皆可個別地或以與該群組之其他成員或本文所發現之其他要素的任一組合提及並主張。預期出於便利性及/或可專利性之原因,可在群組中納入群組之一或多個成員或自群組刪除群組之一或多個成員。當進行任一此納入或刪除時,認為本說明書含有所修改之群組,由此實現隨附申請專利範圍中所用所有馬庫西群組(Markush group)之書面說明。
本文闡述了本發明之某些實施例,包括本發明者已知用於實施本發明之最佳模式。當然,彼等熟悉此項技術者在閱讀上述說明後將明瞭該等所述實施例之變化。本發明者期望熟悉此項技術者視情況採用該等變化,且本發明者意欲本發明可以不同於本文具體闡述之方式來實踐。因此,本發明包括適用法律所允許之本文隨附申請專利範圍中所引述標的物之所有修改形式及等效形式。此外,除非本文另有所示或上下文另外明顯矛盾,否則在其所有可能的變化中,上述要素之任何組合皆涵蓋於本發明中。
此外,在整個說明書中大量引用了出版物、專利及/或專利申請案(統稱為「參考文獻」)。每一所引用參考文獻針對其特別引用教示以引用的方式個別地併入本文中。
除非清晰且明確地在實例中修改或當含義之應用使得任何構造無意義或基本上無意義,否則本發明中所用之定義及解釋意欲且打算在任何未來構造中進行控制。在術語之構造使得其無意義或基本上無意義之情形中,定義應來自韋氏辭典(Webster’s Dictionary), 第3版或熟悉此項技術者已知之辭典,例如,Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (編者Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)。
最後,應瞭解,本文所揭示之本發明實施例用於說明本發明之原理。可採用之其他修改形式屬本發明範圍內。因此,舉例而言(但不限於),可根據本文教示內容利用本發明之替代構形。因此,本發明並不限於所準確顯示及闡述者。