NO160380B - Fremgangsmaate for innkapsling av et kjernemateriale, f.eks. levedyktig vev, i en membran. - Google Patents

Abstract

Levedyktig vev så som Langerhans-øyei- fra patte-. dyr eller levervev blir innkapslet i en semipermeabel membran som tillater gjennomgang av oksygen, aminosyrer og nød-vendige næringsmidler for opprettholdelse av og fortsatt metabolisme av vevet, men sam er impermeabel for bakterier, lymfocytter og proteiner sam har en molekylvekt over et valgt nivå, for a utelukke potensielle skadelige store molekyler så som. immunoglobuliner. Ved hjelp av fremgangsmåten kan det dannes et insulinutviklende system hvori Langerhans-øyer fra pattedyr opprettholdes i en levedyktig og beskyttet tilstand inne i kapselen og utskiller hormoner. Pattedyrs levervev kan også innkapsles for anvendelse som et legemsvæske-avtoksifiserings-system. Det innkapslede levervev blir beskyttet mot plasma-protein av den type som er ansvarlig for immunologisk rejeksjon og fra leukocytter og bakterier, men toksiner og nødven-dige næringsmidler for opprettholdelse av og fortsatt normal metabolisme i vevet, fritt går gjennom membranen. Kapslene kan injiseres på et egnet sted i et pattedyrs legeme og virke som et kunstig organ, f.eks. en kunstig bukspyttkjertel.Fremgangsmåten omfatter de trinn å suspendere materialet som skal innkapsles i et fysiologisk forlikelig medium så som et kulturmedium inneholdende en vannløselig substans som kan danne gel i dråper for å danne atskilte, formbevarende temporære kapsler, danne en semipermeabel membran omkring de temporære kapsler og, eventuelt, gjøre det gelformede indre flytende på nytt. Fremgangsmåten kan også anvendes for innkapsling av kjemisk aktive substanser så som aktiverte tre-kullpartikler og labile biologiske materialer.

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for innkapsling av vev eller enkeltceller slik at de blir værende levedyktige og i en beskyttet tilstand inne i en membran som er gjennomtrengelig for næringsmidler, ioner, oksygen og andre materialer som er nødvendige for både å opprettholde og under-

i

støtte vevets normale metaboliske funksjoner, men ugjennomtrengelig for bakterier, lymfocytter og store proteiner av den type som er ansvarlig for immunokjemiske reaksjoner som resulterer i rejeksjon. Fremgangsmåten muliggjør f.eks. dannelse av et insulindannende system eller annet hormondannende system da den tillater innkapsling av pattedyrs bukspyttk jertel-/3-celler,

-a-celler, intakte Langerhans-øyer eller annet vev eller vevfraksjoner som utskiller hormoner. Kapslene kan suspenderes i et kulturmedium og vil skille ut hormon i en lang tidsperiode. Kapslene kan også anvendes som en kunstig bukspyttkjertel som kan innpodes, f.eks. ved injeksjon, i et diabetisk pattedyr og vil virke in vivo for å utskille insulin og andre hormoner som respons på omgivende sukkerkonsentrasjon. i

Norsk patent nr. 147.603 hvis åpenbarelse her inkorporeres ved henvisning, åpenbarer en teknikk for innkapsling av labile biologiske materialer inne i en semipermeabel membran. Ved denne teknikk er det f.eks. mulig å innkapsle enzymer inne i en membran hvorfra enzymet ikke kan unnslippe, mens det tillates fri gjennomgang av enzymets substrat. Selv om denne teknikk innebærer reaksjonsforhold som bevarer forsiktig håndterbarhet av biologiske materialer, så er det imidlertid ikke gjort noen antydninger om at levende vev kan innkapsles.

Innkapslede levende celler, organeller eller vev har

mange potensielle anvendelser. Inne i en semipermeabel membran kan. f.eks. det innkapslede levende materiale konserveres i et permanent sterilt miljø, og kan beskyttes mot direkte kontakt med store, potensielt destruktive molekyl-arter, og allikevel vil det tillates fri gjennomgang av vev med lavere molekylvekt, næringsmidler og metabolske produkter. Således vil utvikling av en slik innkapslingsteknikk føre til systemer for dannelse av nyttige hormoner så som insulin. I slike systemer vil pattedyrs vev som er ansvarlig for dannelse av materialet, bli innkapslet på en måte som tillater fri gjennomgang av næringsmidler og metabolske produkter tvers gjennom membranen, og

allikevel hindre gjennomgang av bakterier. Dersom membran-permeabiliteten kan reguleres, er det mulig at dette forsøk også kan føre til kunstige organer som kan innpodes i et pattedyrs legeme, f.eks. et diabetisk pattedyr, uten rejeksjon og med regulert hormonfrigjøring, f.eks. insulinfrigjøring utløst av glukosekonsentrasjon.

Det er gjort forskjellige forsøk på å fremstille kunstige organer egnet for innpoding i pattedyrs legemer ved å tilveiebringe en semipermeabel barriere, f.eks. et millipore-diffu-sjons-kammer eller et kapillært rør-kammer, rundt vev fjernet fra en giver. Slike kunstige organer krever vanligvis kirurgisk innpoding. Dessuten isolerer de beskyttende mekanismer i patte-dyrlegemer innpodingen, typisk ved å tilstoppe porer ved( fibro-blastisk overvekst.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse er karakterisert ved følgende trinn: A. kjernematerialet anbringes i en løsning av en vannløselig polysakkaridgummi som kan geleres reversibelt, eller findelt levende vev suspenderes i et vandig medium som er fysiologisk forlikelig med vevet og som inneholder en vannløselig polysakkaridgummi som a) har flere grupper som er lett ioniserbare, b) er fysiologisk forlikelig med vevet og c) kan geleres reversibelt for dannelse av en koherent, formbevarende masse. B. suspensjonen resp. løsningen dannes til dråper, for suspen-sjonens vedkommende med en størrelse som er tilstrekkelig til å omhylle vev, C. dråpene geleres for dannelse av adskilte, formbevarende temporære kapsler, D. en semipermeabel membran formes om de temporære kapsler ved omsetning av den gelbare sustans med en polymer som inneholder flere grupper med motsatt ladning, og

E. gelen gjøres flytende igjen inne i membranen.

i De temporære kapsler kan fremstilles fra hvilken som helst ikke-toksisk, vannløselig substans som kan danne gel for å danne en formbevarende masse, ved en forandring av forholdene i det medium hvori den er anbragt, og omfatter også flere grupper som lett ioniseres for å danne anioniske eller kationiske grupper. Nærværet av slike grupper i polymeren muliggjør at overflate-

sjikt i kapselen kan tverrbindes for å danne en "permanent" membran når den utsettes for polymerer som inneholder flere funksjonaliteter av den motsatte ladning.

Som vannløselig polysakkarid for dannelse av de temporære kapsler kan det anvendes materiale av naturlig eller syntetisk type, som kan bli a) gelert for å danne en formbevarende masse ved å utsettes for en forandring av forholdene så som en pH-forandring eller ved å utsettes for flerverdige kationer så som Ca<++>, og b) permanent "tverrbundet" eller herdet med polymerer som inneholder reaktive grupper så som amin- eller imin-grupper som kan omsettes med sure polysakkaridbestanddeler. Fortrinnsvis anvendes alkalimetallalginat. Andre vannløselige gummier som kan anvendes innbefatter guar-gummi, gummi arabicum, karragen, pektin, tragantgummi, xantangummi eller sure fraksjoner derav. Når termisk tungt smeltelige materialer innkapsles, kan det anvendes gelatin eller agar istedenfor gummiene.

Den foretrukne fremstillingsmåte for dråpene er å tyinge gummi/næringsstoff/vev-suspensjonen gjennom et vibrerende kapillar-rør anbragt i sentrum av hvirvelen skapt ved rask røring av en løsning av et flerverdig kation. Dråper som sprøy-tes fra spissen av kapillar-røret kommer øyeblikkelig i kontakt med løsningen og danner gel som kuleformede legemer.

Den foretrukne fremgangsmåte for dannelse av en permanent semipermeabel membran omkring de temporære kapsler er å "tverrbinde" overflatesjikt av en gelert gummi av den type som har frie syregrupper, med polymerer som inneholder syre-reaktive grupper så som amin- eller imin-grupper. Dette blir typisk utført i en fortynnet løsning av den valgte polymer. vanligvis er det slik at jo lavere molekylvekten til polymeren er, desto sterkere er penetreringen inn i overflaten av den temporære kapsel, og jo sterkere penetreringen er, desto mindre perme-

abel er den resulterende membran. Permanent tverrbinding blir dannet som følge av saltdannelse mellom de syre-reaktive grupper i den tverrbindende polymer og de sure grupper i polysakkarid-gummien. Innen grenser kan semipermeabiliteten reguleres ved å fastsette molekylvekten av den tverrbindende polymer, dens konsentrasjon og varigheten av omsetningen. Tverrbindende polymerer som med hell har vært anvendt, innbefatter polyetylenimin

og polylysin. Molekylvekten kan variere, i avhengighet av den grad av permeabilitet som kreves, mellom 3000 og 100.000 dalton eller mer. Det er oppnådd gode resultater ved anvendelse av polymerer som har en gjennomsnittlig molekylvekt av størrelses-orden 3 5.000.

Kapslene kan tilvirkes slik at de får en valgt nyttig varighet in vivo ved et klokt valg av den tverrbindende polymer. Proteiner og polypeptid-tverrbindingsmidler, f.eks. polylysin, angripes lett in vivo, hvilket resulterer i relativt hurtig ødeleggelse av membranen. Tverrbindingsmidler som ikke er lett oppsluttbare i pattedyrs legemer, f.eks. polyetylenimin, resulterer i mer langvarige membraner. Ved valg av den tverrbindende polymer eller ved tverrbinding samtidig eller i trinn med to eller flere slike materialer, er det mulig på forhånd å velge lengden på den tid det innpodete vev blir værende beskyttet.

Med visse materialer anvendt for å danne de temporære kapsler, er det eventuelt mulig å forbedre masse-overføringen inne i kapselen etter dannelsen av den permanente membran ved å re-etablere de forhold hvorunder materialet er flytende, f.eks. ved å fjerne det flerverdige kation. Dette kan utføres ved ionebytte, f.eks. nedsenking i fosfat-pufret saltløsning eller citrat-puffer. I noen tilfeller, slik som når det er ønsket å bevare det innkapslede vev, eller hvor den temporært gelerte kapsel er permeabel, kan det være å foretrekke å etterlate den innkapslede gummi i den tverrbundne, gelerte tilstand.

En alternativ fremgangsmåte for membrandannelse innebærer en grenseflate-polykondensasjon eller polyaddisjon som er lik fremgangsmåten åpenbaret i norsk patent nr. 147.603. Denne ut-førelse innebærer fremstilling av en suspensjon av temporære kapsler i en vandig løsning av den vannløselige reaktant eller av et par komplementære monomerer som kan danne en polymer. Deretter suspenderes den vandige fase i en hydrofob væske hvori den komplementære reaktant er løselig. Når den annen reaktant er tilsatt til to-fase-systemet, foregår det polymerisering ved grenseflaten. permeabiliteten kan reguleres ved å regulere sammensetningen av det hydrofobe løsningsmiddel og konsentrasjonen av reaktantene. Enda en annen fremgangsmåte for å danne en semipermeabel membran er å inkludere en mengde av protein i den temporære kapsel, som så kan tverrbindes i over flatesjikt ved å utsettes for en løsning av et tverrbindingsmiddel så som glutaraldehyd.

Den her beskrevne fremgangsmåte er blitt anvendt til å innkapsle levedyktige Lagerhans-øyer som, i et medium som inneholder næringsmidlene og de andre materialer som er nød-vendige for å opprettholde levedyktighet og in vitro under-

støtte metabolismen til vevet, utskiller insulin i nærvær av glukose. Innkapslet vev er blitt holdt i levedyktig tilstand i 3 måneder. Dessuten er lever-celler blitt innkapslet, og det er blitt vist at disse er i en fysiologisk aktiv tilstand.

Kapslene som produseres ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan injiseres på et egnet sted i et pattedyrs lemgeme og funksjonere normalt inntil vevet dør ut, eller inntil naturlige legemsprosesser lykkes i å isolere kapslene slik at substansene som kreves for levedyktighet av vevet, ikke lenger er tilgjengelige. Ved dette punkt kan det, på grunn av at kirurgiske inngrep ikke

er nødvendige for innpodingen, lett tilveiebringes friskt vev ved en ny injeksjon. <p>attedyrlegemet kan følgelig bli forsynt med den spesielle funksjon til vevet så lenge det er ønskelig.

Ved en foretrukket utførelse av oppfinnelsen blir pattedyrs Lagerhans-øyer eller preparater av slike Lagerhans-øyer som inneholder valgte mengder av a -, - eller delta-celler fra Lagerhans-øyer, innkapslet i polylysin- eller polyetylenimin-tverrbundne alginatmembraner. Disse kan injiseres periodisk, f.eks. i det peritoneale hulrom i legemet til et diabetisk pattedyr og virke som en kunstig bukspyttkjertel.

Det oppnås følgelig med oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for innkapsling av levende celler, organeller eller vev i en membran som er gjennomtrengelig for næringsstoffer og andre nødvendige substanser for bevaring og metabolisme og for metabolske produkter, men ugjennomtrengelig for bakterier og substanser som har molekylvekt over et valgt nivå, for å utelukke midler som er ansvarlig for immunologisk rejeksjon av det fremmede vev.

Den eneste figur i tegningen illustrerer skjematisk en foretrukket fremgangsmåte for innkapsling av levende vev egnet for anvendelse ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Vevet, organellen eller cellen som skal innkapsles, fremstilles i henhold til teknikk som er velkjent i industrien i findelt form og suspenderes i et vandig medium som er egnet for bevaring av og understøttelse av de pågående metaboliske prosesser til det spesielle vev som er involvert. Medier som er egnet for dette formål er kommersielt tilgjengelige. Den gjennomsnittlige diameter til materialet som skal innkapsles kan variere meget, mellom mindre enn 1 ^ira og flere millimeter. Pattedyrs Lagerhans-øyer er typisk 140 til 200 ^im i diameter. Etter ønske kan det selvfølgelig innkapsles individuelle celler så som /3-celler, rv-celler, delta-celler eller forskjellige blandinger derav fra bukspyttkjertelen, hele Lagerhans-øyer, individuelle hepatocytter, organeller eller andre vev-enheter. Også mikroorganismer kan bli innkapslet, og også ikke-levende materialer så som biologiske materialer.

Den fortsatte levedyktighet av slikt levende stoff er blant annet avhengig av tilgjengeligheten av nødvendige næringsstoffer, oksygen-overføring, fravær av toksiske substanser i mediet og pH i mediet. Hittil har det ikke vært mulig å holde slikt levende stoff i et fysiologisk forlikelig miljø med samtidig innkapsling. problemet har vært at de forhold som kreves for membrandannelse har vært dødelige eller skadelige for vevet, og det er ikke fremkommet noen fremgangsmåte for membrandannelse hvorved vevet kan overleve i frisk tilstand. Det er nå blitt oppdaget at visse vannløselige substanser som er fysiologisk forlikelige med levende vev og kan'gjøres vann-uløselige for å danne en formbevarende, koherent masse, kan anvendes for å danne en "temporær kapsel" eller et beskyttende barrieresjikt rundt partiklene. Et slikt materiale tilsettes, typisk ved lav konsentrasjon, til vev-kulturmediet. Løsningen blir så formet til dråper som inneholder vev sammen med dets nærende medium, og blir øyeblikkelig gjort vann-uløselig og gelert, i det minste i et overflatesjikt. Deretter blir de formbevarende temporære kapsler forsynt med en permanent semipermeabel membran. Når materialet som er anvendt til å danne de temporære kapsler tillater det, kan det indre av kapselen på nytt gjøres flytende etter dannelsen av den permanente membran. Dette blir gjort ved å re-etablere de forhold i mediet hvorved materialet er løselig.

Materialet som anvendes til å danne de temporære kapsler, kan være hvilket som helst ikke-toksisk, vannløselig materiale som, ved en forandring i den omgivende temperatur, pH, eller ionisk miljø eller konsentrasjon, kan omdannes til en formbevarende masse. Materialet inneholder også fortrinnsvis flere lett ioniserbare grupper, f.eks. karboksyl- eller amino-grupper, som kan omsettes ved saltdannelse med polymerer som inneholder flere grupper som ioniserer for å danne arter med motsatt ladning. Som det vil bli forklart nedenfor, muliggjør denne material-type at det avsettes en permanent membran av en valgt porøsitet og en valgt in vivo livstid i overflatesjikt av den temporære kapsel.

De foretrukne materialer for dannelse av den temporære kapsel er vannløselige, naturlige eller syntetiske polysakkarid-gummier. Mange slike materialer er kommersielt tilgjengelige. De blir typisk ekstrahert fra vegetabilsk stoff og blir ofte anvendt som additiver til forskjellige næringsmidler. Natriumalginat er den foretrukne vannløselige gummi. Andre anvendbare gummier innbefatter guargummi, gummi arabicum, karragen, pektin, tragantgummi, xantangummi eller

deres sure fraksjoner.

Disse materialer omfatter glykosid-bundne sakkaridkjeder. Mange inneholder frie syregrupper, som ofte er til stede i alkalimetall-ione-formen, f.eks. natriumformen. Dersom et flerverdig ion f.eks. kalsium eller strontium blir utbyttet med alkalimetallionet, blir de flytende, vannløselige poly-sakkaridmolekyler "tverrbundet" for å danne en vann-uløselig, formbevarende gel som igjen kan oppløses ved fjerning av ionene ved ionebytte eller via et kompleksdannende middel. Selv pm praktisk talt hvilket som helst flerverdig ion som kan danne et salt, er anvendbart, foretrekkes det å benytte fysiologisk forlikelige ioner, f.eks. kalsium. Disse er tilbøyelig til å konservere vevet i levende tilstand. Andre flerverdige kationer kan anvendes for mindre skjøre materialer.

Andre gummier kan variere mellom den vannløselige og den gelerte, vann-uløselige tilstand ved bare å forandre pH i det medium hvori de er oppløst.

Andre typiske vev/vevmedium/gummi-løsningsblandinger omfatter like volumdeler av vev i deres medier og en 1-2% løsning av gummi i fysiologisk saltløsning. Når natriumalginat anvendes, er en 1,0-1,5% løsning med hell blitt anvendt.

Når det innkapsles materialer som kan motstå forandringer

i temperaturen, kan gelatin eller agar anvendes for å danne de temporære kapsler. Disse kan geleres ved injeksjon inn i et miljø med lav temperatur. Andre vannløselige substanser, så

som hydroksyetylmetakrylat, kan også anvendes.

I det neste trinn av innkapslingsprosessen blir gummi-løsningen som inneholder vevet, dannet til dråper av ønsket størrelse. Deretter blir dråpene øyeblikkelig gelert for å

danne formbevarende sfæriske eller sfæroidale masser. Apparat for å utføre disse siste trinn er illustrert ved trinn BC i tegningen.. Et begerglass 10 som inneholder en vandig løsning av flerverdig kation, f.eks. 1,5% Cac^-løsning, er forsynt med en magnetisk røres tang 11 og rører 12. Røremekanismen blir drevet for å frembringe en hvirvel 14 som har et hult sentrum 16. Et kapillar-rør 18 med valgt innside-diameter er anbragt inne i det hule område 16 av hvirvelen, og forsynt med en vibrator 20. Suspensjonen som inneholder vev og den solubili-serte gummi blir matet gjennom kapillar-røret. Virkningen av

. i

overflatespenningen som ville indusere dannelse av relativt store dråper, blir minimalisert av vibratoren slik at dråper, illustrert ved 22, av en størrelse som er sammenlignbar med innside-diameteren i kapillar-røret, blir ristet bort fra kapillar-spissen . Disse kommer øyeblikkelig ', i kontakt med løsningen hvor de absorberer kalsiumioner. Dette resulterer i "tverrbinding" av gelen og i dannelse av en formbevarende, høyviskøs beskyttende temporær kapsel som inneholder det suspenderte vev og dets medium. Kapslene oppsamles i løsningen som en separat fase, og blir separert ved aspirasjon.

Ved en alternativ utførelsesform av fremgangsmåten blir

en liten mengde med polymer av den type som anvendes for permanent tverrbinding av gummien, inkludert i løsningen sammen med de flerverdige ioner (eller annen løsning som er i stand til å danne gel av den spesielle gummi som anvendes). Dette resulterer i dannelse av permanente tverrbindinger. Kapsler av denne type har visse fordeler dersom målet er å konservere vevet. /

I det neste trinn av fremgangsmåten blir en semipermeabel membran avsatt omkring overflaten av de temporære kapsler.

Det er tilgjengelig en rekke metoder for å utføre dette trinn, og noen av disse er kjent på området. Det kan f.eks. benyttes grenseflate-polymerisasjonsteknikk. Ved grenseflate-polymerisasjon blir et par av i det minste di funksjonelt gjensidig reaktive monomerer, eller en monomer og en relativt lavmolekylær polymer, hvorav én er løselig i polare løsningsmidler, så som vann, og den annen er løselig i hydrofobe løsningsmidler, f.eks. heksan, bragt til å reagere ved grenseflaten i en emulsjon av vann-i-olje-type. I overensstemmelse, med fremgangsmåten i henhold til norsk patent nr. 147.603 som er anført ovenfor, blir materialet som skal innkapsles, suspendert eller oppløst i vann sammen med den vannløselige komponent i reaksjonsblandingen, den vandige fase blir emulgert i et hydrofobt løsningsmiddel og den komplementære monomer blir satt til den kontinuerlige fase i systemet slik at polymerisasjbnen foregår omkring de vandige dråper. Ved å regulere naturen av løsningsmidlet i den kontinuerlige fase og konsentrasjonen av reaktanten som inneholdes deri, er det mulig å utøve kontroll over pore-størrelse og å danne semipermeable mikrokapsler.

Denne teknikk kan anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse dersom den vannløselige reaktant oppløses i en vandig løsning, og løsningen anvendes til å suspendere de temporære kapsler. Denne flytende suspensjon blir så emulgert i f.eks. heksan eller en heksan/kloroform-blanding. Den komplementære monomer blir deretter tilsatt, fortrinnsvis i økende grad, for å indusere grenseflate-polymerisasjon ved overflaten av de vandige dråper. på grunn av at den gelerte masse av polysakkarid som omgir det suspenderte vev, og spesielt dersom passende pufrede polyfunksjonelle aminogruppeholdige polymerer så som visse proteiner blir anvendt som den vannløselige reaktant, er prosessen slik at vevet overlever innkapslingen i frisk tilstand. De substanser som er nyttige for dannelse av membraner med de polyfunksjonelle aminer, innbefatter disyrer, disyrehalogenider og flerfunksjonelle sulfonylhalogenider. I tillegg til polyaminene kan det anvendes diaminer, polyoler og dioler. Molekyler som inneholder flere amingrupper kati også tverrbindes med glutaraldehyd for å danne en membran. En annen nyttig fremgangsmåte for membrandannelse er å benytte poly-addisjonsreaksjoner ved grenseflate-polymerisasjon. I dette tilfelle blir for eksempel flerfunksjonelle aminer som er absorbert i over flatesjiktene av de temporære kapsler, omsatt med epiklorhydrin, epoksyderte polyestere eller diisocyanat.

Den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling av membranen, illustrert som trinn D i tegningen, er å tverrbinde overflate-sjiktene av dråpene permanent ved å utsette dem for en vandig løsning av en polymer som inneholder grupper som er reaktive med funksjonaliteter i gel-molekylene. Visse langkjedete kvaternære ammoniumsalter kan anvendes for dette formål under noen omstendigheter. Når det anvendes sure gummier, kan det anvendes polymerer som inneholder syrereaktive grupper så som polyetylenimin og polylysin. I denne situasjon blir polysakka-ridene tverrbundet ved gjensidig innvirkning mellom karboksyl-gruppene og amingruppene. permeabiliteten kan fordelaktig reguleres ved valg av molekylvekten av den tverrbindende polymer som anvendes. En løsning av polymer med lav molekylvekt vil f.eks. i et gitt tidsrom trenge lengre inn i de temporære kapsler enn en polymer med høy molekylvekt vil gjøre. Gjennom-trengningsgraden for tverrbindingsmidlet er blitt korrelert med den resulterende permeabilitet. vanligvis er det slik at jo høyere molekylvekten og jo lavere gjennomtrengningen er, desto større er porestørrelsen. Grovt sagt kan det anvendes polymerer innen molekylvektområdet fra 3000 til 100.000 dalton eller mer, i avhengighet av varigheten av reaksjonen, konsentrasjonen av polymerløsningen og den ønskede grad av permeabilitet. Et vellykket sett av reaksjons forhold, ved anvendelse av polylysin med gjennomsnittlig molekylvekt på ca. 35.000 dalton, innebærer omsetning i 2 minutter, under omrøring, av en fysiologisk saltløsning som inneholder 0,0167% polylysin. Optimale reaksjonsforhold som er egnet for regulering av permeabiliteten i et gitt system, kan lett bestemmes empirisk uavhengig av oppfinnelsen.

valget av tverrbindingsmiddel eller -midler bestemmer også varigheten in vivo av kapslene. I systemet beskrevet ovenfor, omfatter den permanente kapselmembran polysakkarid (en lett injiserbar substans) tverrbundet med enten polypeptid eller protein eller begge deler, f.eks. polylysin, eller en syntetisk

f substans, f.eks. polyetylenimin. Polymerer er varierende med hensyn til den grad de kan dispergeres in vivo. Noen opp-sluttes uten vanskelighet, f.eks. protein, andre degraderes sakte, og atter andre bevares ubegrenset. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen betrakter tverrbinding med én eller flere polymerer for å fremstille kapsler som har en valgt opp-løsningshastighet in vivo, som vanligvis varierer mellom noen få timer eller dager til praktisk talt permanent tilstand. De eksempler som følger åpenbarer hvorledes det skal fremstilles kapsler som forblir intakte i minst ca. 2 måneder inne i det peritoneale hulrom hos rotter. Oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til disse spesielle kapselmembraner, og heller ikke til kapsler av denne grad av livstid in vivo. I virkeligheten avhenger den optimale livstid in vivo for mikrokapslene av deres påtenkte anvendelse og stedet for innpoding. Fagfolk på området vil være i stand til å fremstille mikrokapsler med en valgt in vivo livstid empirisk uavhengig av oppfinnelsen i betraktning av det som her er angitt.

Ved dette punkt av innkapslingen kan det oppsamles kapsler som omfatter en permanent semipermeabel membran som omgir en gelert løsning av gummi, vev-forlikelig kulturmedium og vev-partikler. Dersom formålet ganske enkelt er å konservere vevet i et beskyttende miljø, er det ikke nødvendig å utføre noen flere trinn. Dersom det imidlertid skal befordres masse-overføring inne i kapslene og tvers gjennom membranene, foretrekkes det å gjøre gelen flytende igjen ved å føre den tilbake til sin vannløselige form. Dette kan gjøres ved å re-etablere

de forhold hvorunder gummien er en væske, f. eks. forandre pH

i mediet eller fjerne kalsiumet eller andre anvendte flerfunksjonelle kationer. I de geler som er uløselige i nærvær av flerverdige kationer, kan mediet i kapselen gjenoppløses ved ganske enkelt å senke kapslene ned i fos fat-pufret salt-løsning som inneholder alkalimetallioner og hydrogenioner. Enverdige ioner byttes med kalsiumet eller andre flerverdige ioner inne i gummien når kapslene, som vist ved trinn E i tegningen, er nedsenket i løsningen under omrøring. Andre salter, f.eks. natriumcitrat, kan anvendes for samme formål.

Endelig kan det være ønskelig, avhengig av den dannelses-

1 teknikk for semipermeable membraner som anvendes, å behandle kapslene for å binde opp frie aminogrupper eller lignende som gir eller ville gi kapslene en tilbøyelighet til sammenklumping. Dette kan f.eks. utføres ved å senke ned kapslene i en løsning

i av natriumalginat.

Ved oppfinnelsen betraktes injeksjonen av innkapslet, fin-j delt vev, multicellulære fraksjoner derav eller enkelte celler på et passende sted i et pattedyrs legeme med det formål å forsyne legemet, i det minste temporært, med vevets spesiali-serte fysiologiske funksjon. Fremgangsmåten har dobbelte for- i-deler ved at den fjerner behovet for kirurgisk innpoding (selv om kapsler kan innpodes kirurgisk om så ønskes) og er vellykket'

i forbindelse med problemene vedrørende immun-rejeksjon og t naturlig fysikalsk isolasjon. Kapselmembranene består fortrinnsvis av substanser som blir oppsluttet etter at vevet er dødt. Som bemerket ovenfor kan dette utføres ved å anvende et tverrbindingsmiddel som gjør motstand mot nedbrytning in

1 vivo slik at det oppnås en gitt nyttig livstid in vivo.

Av det foregående vil det fremgå at innkapslingsprosessen' og innpodningsteknikken i henhold til oppfinnelsen kan prak"ti- i seres ved anvendelse av en stor mengde reagenser og innkapsledé

i

materialer, og kan varieres betraktelig uten å avvike fra opp-finnelsens omfang.

Eksempel 1

Lagerhans-øyer ble oppnådd fra rotte-bukspyttkjertler og ble satt til en fullstendig vev-kultur (CMRL-1969) ved en konsentrasjon pa tilnærmet 10 3øyer pr. milliliter. Vevkulturen inneholder alle nødvendige næringsstoffer for fortsatt levedyktighet for cellene, og også aminosyrene som anvendes av B - cellene for dannelse av insulin. 0,4 ml av celle-suspensjonen ble så satt til et volum på 0,5 ml av 1,2 %ig natriumalginat i fysiologisk saltløsning.

Dernest ble 80 ml av en 1,5 %ig kalsiumkloridløsning anbragt i et 150 ml begerglass med rører, og ble rørt med en hastighet som induserte dannelse av en hvirvel med et konisk formet hulrom i dens sentrum. Et glass-kapillarrør med en gradvis avtagende diameter som ble avsluttet i en spiss 'med inn-vendig diameter på ca. 300 ble så forsynt, med en vibrator

(60 sykluser pr. sek.). Kapillarrørspissen ble så anbragt inne i sentrum av hvirvelen, vibratoren ble satt igang og natriumalginat-kulturmedium-vev-suspensjonen ble tvunget derigjennom med en infusjonspumpe. Dråper av størrelsesorden 300 - 400

i diameter ble dryppet fra spissen av kapillarrøret og kom øyeblikkelig inn i kalsiumløsningen.

Etter 10 minutter ble røreren slått av, og den overflytende løsning ble fjernet ved aspirasjon. De gelerte kapsler ble så overført til et begerglass som inneholdt 15 ml av en løsning som omfattet én del av en 2 %ig 2(cykloheksylamino)etan-sulfon-syreløsning i 0,6 %ig Nacl (isotonisk, pH = 8,2) fortynnet med 20 deler 1 %ig Cacl2. Etter nedsenking i 3 minutter ble kapslene vasket to ganger i 1 %ig Cac^-

Kapslene ble så overført til 32 ml av en lesning som omfattet 1/80 % polylysin (gjennomsnittlig m.v. 35.000 AMU) i fysiologisk saltløsning. Etter 3 minutter ble polylysinløsningen dekantert. Kapslene ble så vasket med 1 %ig Cac^» og så suspendert i 3 minutter i en løsning av polyetylenimin (m.v. 40.000-60.000) dannet ved fortynning av en 3,3 %ig polyetylenimin-forrådsløsning i morfolinopropansulfonsyre-puffer (0,2 M, pH = 6) med tilstrekkelig 1 %ig cacl- til å gi en endelig polymerkonsentrasjon på 0,12%. De resulterende kapsler, med permanent semipermeable membraner, ble så vasket to ganger med 1 %ig cac^i to ganger med fysiologisk saltløsning og ble blandet med 10 ml.av en 0,12 %ig alginsyreløsning.

Kapslene motstår sammenklumping, og mange kan ses å inné-i holde Lagerhans-øyer. Gel i det indre av kapslene blir på nytt gjort flytende ved å senke kapslene ned i en blanding av saltløsning og citrat-puffer (pH = 7,4) i 5 minutter. Til slutt blir kapslene suspendert i CMLR-69 medium.

Under mikroskopet har disse kapsler et utseende som illustrert på tegningen. De omfatter en svært tynn membran 24 sbm inneslutter en øy 26 inne i hvilken det kan ses enkelte celler 28. Molekyler som har en molekylvekt på opp til ca. 100.000 kan gå gjennom membran 24. Dette tillater at oksygen, aminosyrer, næringsmidler og plasma-komponenter som anvendes i kulturmedier (f.eks. kalvefosterplasma-komponenter) kan nå frem til øyene og tillater at insulin blir utskilt.

Eksempel 2

Etter gjentatte vaskinger i fysiologisk saltløsning blé mikrokapsler dannet som angitt i eksempel 1, inneholdende tilnærmet 15 celler,suspendert i 3 ml med CMRL-1969. Da de var 8 dager gamle, utskilte kapslene, i nærvær av 600 mg/dl av glukose, i ett forsøk 67 enheter/ml med insulin i løpet av 1 1/2 timer. I et annet forsøk ble det fremstilt 68 enheter/ml av insulin i samme tidsrom. Kapsler som var én uke gamle, utskilte i samme medium, men i nærvær av 100 mg/dl av glukose, i et første forsøk 25 enheter/ml av insulin på 1,2 timer, og i et annet forsøk utskilte de 10 enheter/ml.

Eksempel 3

Diabetiske rotter med blodglukose-mengder i området 500-700 mg/dl ble hver behandlet med tilnærmet 10 3 øyer innkapslet som angitt i eksempel 1, og ble suspendert i fysiologisk salt-løsning. Kapslene ble ved injeksjon innført i det peritoneale hulrom ved anvendelse av en nål nr. 19 festet til en sprøyte. Blodsukker-mengdene ble målt daglig og ble jevnt funnet å være under 300 mg/dl. Dyr som ble avlivet etter 2 måneder, frem-viste ingen tegn på toksiske reaksjoner omkring innpodnings-stedet. Kapsler fjernet fra avlivede dyr etter en 2 måneders in vivo livstid, var intakte og viste ingen tegn på degradering.

Eksempel 4: Innkapsling av hepatocytter Fremgangsmåten fra eksempel 1 ble gjentatt bortsett fra

at 0,5 ml av en levercelle-suspensjon i Hank's løsning ble anvendt istedenfor suspensjonen med 0,4 ml celler. Den ved-varende levedyktighet til levervev er vist ved farvestoff-eksklusjonsteknikken (trypanblått-eksklusjon). Det er kjent at levervev in vitro kan oppslutte toksiner fra deres miljø. Følgelig blir toksiner med molekylvekt lav nok til å gå gjennom de semipermeable membraner oppsluttet og ødelagt av vevet, praktisk talt alle toksiner som behandles med leveren, er lav-molekylære materialer. Imidlertid kan toksinene ha dannet komplekser med protein. Kapsel-permeabiliteten kan varieres i henhold til behovet.

Eksempel 5

Fremgangsmåten fra eksempel 1 blir gjentatt, bortsett fra at partikkelformet aktivert trekull blir suspendert direkte i natriumalginatløsningen, halv-milliliteren av vev-suspensjonen utelates og polylysin med gjennomsnittlig molekylvekt på 35.000 anvendes som tverrbindingsmiddel. så lenge trekullpartiklene er mindre enn den minste innvendige diameter på det anvendte kapilar-rør for fremstilling av dråpene, er resultatet trekull med høyt over flateareal omgitt av en semipermeabel membran. Denne forhindrer effektivt at spon eller støv av trekull kan unnslippe, men kan allikevel anvendes for å absorbere materialer i det midlere molekylvektsområde (opp til ca. 2.000 dalton) fra fluider som føres omkring kapslene.

Anvendbarheten av fremgangsmåten er blitt vist med andre levende celler, innbefattet røde blod-celler, ved anvendelse av serum som et medium, sperm-celler, ved anvendelse av semen som mediet, og bakegjær. Fagfolk på området vil forstå at en rekke andre materialer kan innkapsles i tillegg til dem som spesielt er nevnt her, og at permeabiliteten kan reguleres etter ønske for valgte anvendelser av fremgangsmåten.:

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for innkapsling av et kjernemateriale, f.eks. levedyktig rev, i en membran, karakterisert ved følgende trinn: A. kjernematerialet anbringes i en løsning av en vannløselig polysakkaridgummi som kan geleres reversibelt, eller findelt levende vev suspenderes i et vandig medium som er fysiologisk forlikelig med vevet og som inneholder en vannløselig polysakkaridgummi son (a) har flere grupper som er lett ioniserbare, (b) er fysiologisk forlikelig med vevet og (c) kan geleres reversibelt for dannelse av en koherent, formbevarende masse, idet det som vannløselig polysakkarid fortrinnsvis anvendes et alkalimetallalginat, B. suspensjonen resp. løsningen dannes til dråper, for suspen-sjonens vedkommende med en størrelse som er tilstrekkelig til å omhylle vev, C. dråpene geleres for dannelse av adskilte, formbevarende temporære kapsler, D. en semipermeabel membran formes om de temporære kapsler ved omsetning av den gelbare substans med en polymer som inneholder flere grupper med motsatt ladning, og E. gelen gjøres flytende igjen inne i membranen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes et polysakkarid som har frie syregrupper og at membrandannelsestrinnet utføres ved å bringe de temporære kapsler i kontakt med en j polymer med molekylvekt mellom 3000 og 100.000 daltons og som har frie aminogrupper, idet den nevnte kontakt utføres for dannelse av permanente polymere tverrbindinger mellom syregrupper' i et overflatesjikt av kapslen.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det anvendes en polymer for tverrbinding som er utvalgt fra gruppen som består av polylysin og polyetylenimin, idet polymeren har en gjennomsnittlig molekylvekt på ca. 35.000 daltons.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en løsning som omfatter et fullstendig vevdyrkningsmedium som er tilstrekkelig til å holde vevet levende.