KR20070100908A - 내피 세포의 특성을 나타내는 지방 유래 성인 스트로마세포 - Google Patents

내피 세포의 특성을 나타내는 지방 유래 성인 스트로마세포 Download PDF

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제임스 케이. 핸드릭스
제임스 비 2세 미첼
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코그네이트 세러퓨틱 인크.
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Abstract

본 발명은 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 지방 유래된 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 포함한다. 본 발명은 또한, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 지방 유래된 성인 스트로마를 생성하는 방법 및 조성물을 포함한다. 상기 세포를 혈관 이식, 조직 조작, 혈관신생, 맥관신생 조절, 및 심장 질환을 포함하는 각종 질환의 치료에 사용하는 방법 또한 포함된다.

Description

내피 세포의 특성을 나타내는 지방 유래 성인 스트로마 세포{ADIPOSE DERIVED ADULT STROMAL CELLS EXHIBITING CHARACTERISTICS OF ENDOTHELIAL CELLS}
인간 발달에서 신생아 기간은 다중 분화 경로로 발달하는 잠재력을 가진 '줄기' 세포의 존재에 의해 특징지워진다. 이들 세포의 최종 분화는 기관 신생 및 조직 구조를 조절하는 사이토카인 및 호르몬 신호에 의해 결정된다. 마우스 배아 줄기 (ES) 세포가 시험관내 및 생체내에서 분리되어 널리 연구되어 왔다. 시험관내에서 외부 자극을 이용하여, 연구자들은 다중 계통 경로에 따른 ES 세포 분화를 유도하였다. 이들 경로는 뉴런성, B 계통 림프 및 지방세포를 포함한다 (Dani, 등, 1997, J. Cell Sci. 110:1279; Remoncourt, 등, 1998, Mech. Dev. 79.185; O'Shea, 1999, Mat. Rec. 257:32).
다분화능 줄기 세포 (multipotential stem cell)는, 또한 성체 조직에도 존재한다. 가장 잘 특정화된 성인 줄기 세포의 예는, 골수 및 말초 혈액에서 분리된 조혈성 전구 세포이다. 치료가 없는 경우, 치사량으로 방사능 조사된 마우스는 죽게 되는데, 이는 그 순환 혈액 세포를 재공급하지 못했기 때문이다; 그러나, 동계 (syngeneic) 공여자 동물로부터의 골수 이식에 의해 숙주 동물은 회생하였다. 공여자 세포가 순환 혈액 세포의 재공급을 담당한 것이다. 이후 실시된 연구들은 미분화 조혈 줄기 세포가 숙주 동물 내에서 상이한 혈액 세포 계통 을 재생 가능한 것을 시사한다. 이들 연구는, 암 및 대사의 선천적 오류에 대한 광범위하게 인정된 치료 양식인 골수 이식의 기초를 제공하여 왔다.
골수 유래 세포는, 또한 다른 세포 형태로 분화 가능한 것으로 밝혀졌다. 골수는 2가지 이상 타입의 줄기 세포, 즉 조혈 줄기 세포 및 중간엽 줄기세포 또는 뼈골 스트로마 세포 (MSC) 또는 골수 스트로마 세포 (BMSC)로 다양하게 언급되는 비조혈성 조직의 줄기 세포를 포함한다. 이들 용어는 본원에서 동의어적으로 사용된다. 골수의 흡입물에서 손쉽게 분리 가능하고, 단일 세포 유래된 컬러니를 쉽게 생성한다는 점에서 MSC가 흥미롭다. 단일 세포 유래된 컬러니는, 약 10 주 내에 많게는 50회의 군락 배가를 통해 팽창 가능하며, 골아세포, 지방세포, 연골세포 (Friedenstein, 등, 1970, Cell Tissue Kinet. 3: 393-403; Castro-Malaspina, 등, 1980, Blood 56:289-301; Beresford, 등, 1992, J. Cell Sci. 102:341-351; Prockop, 1997, Science 276:71-74), 근육세포 (Wakitani, 등, 1995, Muscle Nerve 18:1417-1426), 성상세포, 희소돌기아교세포 및 뉴런 (Azizi, 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-39 13; Kopen, 등, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10711-10716; Chopp, 등, 2000, Neuroreport II, 300 1-3005; Woodbury, 등, 2000, Neuroscience Res. 61:364-370)으로 분화 가능하다.
나아가, MSC는 모든 3개의 배엽 세포로 성장한다 (Kopen, 등, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:10711-10716; Liechty, 등, 2000, Nature Med. 6: 1282-1286; Kottonet, 등, 2001, Development 128:5181-5188; Toma, 등, 2002, Circulation 105:93-98; Jiang, 등, 2002, Nature 418:41-49). 생체내 증거에 따르면, 분획 화하지 않은 골수 유래 세포 및 순수 MSC 군은, 폐를 포함하는 상피 세포 타입으로 성장하는 것을 나타내었으며 (Krause, 등, 2001, Cell 105:369-377; Petersen, 등, 1999, Science 284:1168-1170), 최근 다수의 연구는, MSC의 접목 (engraftment)이 조직 손상에 의해 제고되는 것을 나타내었다 (Ferrari, 등, 1998, Science 279:1528-1530; Okamoto 등, 2002, Nature Med. 8:1101-1017). 이러한 이유로, MSC는 인간 질병 다수에서의 세포 및 유전자 치료를 위한 그 잠정적 용도에 대해 현재 시험되고 있다 (Horwitz, 등, 1999, Nat. Med. 5:309-3 13; Caplan, 등, 2000, Clin. Orthoped. 379:567-570).
MSC는, 다분화능 줄기 세포의 대체 공급원을 구성한다. 생리적 조건하에서, 이는 골수 구조를 유지하며, 상이한 세포 부착 분자의 도움으로 조혈을 조절하고 사이토카인의 분비를 각각 조절한다 (Clark, 등, 1995, Ann. NY Acad. Sci. 770:70-78). 조직 배양 플라스틱에 대한 선택적 부착에 따라 골수로부터 성장하여온 MSC는 효율적으로 팽창 가능하며 (Azizi, 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 95:3908-39 13; Colter, 등, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3213-218) 유전적으로 조작 가능하다 (Schwarz, 등, 1999, Hum. Gene Ther. 10:2539- 2549).
MSC는 또한 중간엽 줄기 세포로도 불리는데, 이는 이들이 다음을 포함하는 다중 중배엽 조직으로 분화 가능하기 때문이다; 뼈 (Beresford, 등, 1992, J. Cell Sci. 102:341-351), 연골 (Lennon, 등, 1995, Exp. Cell Res. 219:211-222), 지방 (Beresford, 등, 1992, J. Cell Sci. 102:341-351) 및 근육 (Wakitani, 등, 1995, Muscle Nerve 18:1417-1426). 또한, 뉴런성 마커를 발현하는 유사 뉴런 세포로 의 분화가 보고되었으며 (Woodbury, 등, 2000, J. Neurosci. Res. 61:364-370; Sanchez-Ramos, 등, 2000, Exp. Neurol. 164:247-256; Deng, 등, 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 282:148-152), 이는 MSC가 배엽에로의 결정을 극복 가능함을 시사한다. 이러한 발견을 기초로, 뼈, 연골, 근육, 지방 조직, 간, 신경 또는 기타 조직의 재생을 위한 스트로마 줄기 세포 공급원으로 골수가 제안되어 왔다. 그러나 골수 스트로마 세포의 추출은 공여자에 있어 높은 수준의 위험 및 불편함을 초래한다.
반면, 성인 인간 지방 조직 유래된 골수외 스트로마 세포 (ADAS)는, 환자에게 최소한의 위험 또는 불편과 함께 간단히 수확 가능한 스트로마 줄기 세포 공급원을 나타낸다. 병리학적 증거는, 지방 유래된 스트로마 세포가, 다중 계통 경로를 따라 분화 가능함을 제안한다. 또한, 지방 조직의 스트로마 세포는, 다중 중배엽 조직으로 분화 가능한 것으로 개시되었다.
혈관모세포로 알려진 원시 내피 전구세포의 기본 모세혈관 얼기로 응집하는 내피 세포로의 제자리 분화인 맥관신생은, 배아신생 동안 맥관계의 발달을 담당한다 (Peichev, 등, 2000, Blood 95:952-958). 반면, 기존 혈관으로부터의 발아 과정에 의한 새로운 혈관 형성으로 정의되는 혈관신생은 발달 및 출생 이후 일생 동안 발생한다 (Peichev, 등, 2000, Blood 95:952-958; Watt, 등, 1995, Leuk. Lymphoma 17:229- 235; Reyes, 등, 2001, Blood 98:26 15-2625). 최근까지, 출생 이후 일생 동안의 혈관 형성은, 기존 혈관으로부터의 내피세포 발아에 의해 매개되는 것으로 고려되었다. 그러나 최근의 연구는, 내피 줄기 세포가 성인 일 생 동안 지속되어, 새로운 혈관의 형성에 기여하는 것을 제시한다 (Nishikawa, 등, 1998, Development 125:1747-1757; Gehling, 등, 2000, Blood 95:3106- 3112; Rafli, 등, 1994, Blood 84:10-18; Asahara, 등, 1997, Science 275: 964-967). 이는, 즉 발달 동안과 마찬가지로, 성인에서의 신생혈관신생이 적어도 일부는 맥관신생 과정에 의존할 수 있음을 시사한다. 내피 세포의 전구체는 골수 및 말초 혈액으로부터 분리되었다 (Peichev, 등, 2000, Blood 95:952-958; Watt, 등, 1995, Leuk. Lymphoma 17:229-235). 이들 내피 전구체의 발생론은 비공지이다.
따라서 내피 세포로 성장 가능한 전구 세포의 용이하게 수득 가능한 공급원을 분리하고 전파하는 방법이 필요하다.
다수의 내피 전구 세포를 배양 및 수득하는 현재 방법은 성공적이지 못했다. 내피 전구 세포 다수의 공급 가능성은, 혈관 이식, 조직 조작, 혈관신생, 맥관신생의 조절, 및 심장 질병을 포함하는 각종 질환의 치료에 매우 유용할 것이다.
따라서 치료 및 실험 목적으로 유용한 그러한 다수의 세포를 수득하기 위해 내피 전구 세포 증식을 최대화를 위한 배양 조건 표준화 방법 및 조성물이 오랫동안 필요하였다. 본 발명은 그러한 필요를 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명은, 전 (pre)-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 지방 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 생성하는 조성물 및 방법을 포함한다.
한 면에서, ADAS 세포는 시험관내에서 분화하도록 유도된다.
다른 면에서, ADAS 세포는 생체내에서 분화하도록 유도된다.
추가의 면에서, ADAS 세포는 외래 유전 물질을 발현하도록 조작된다.
추가의 다른 면에서, ADAS 세포는 인간으로부터 유래한다.
본 발명은 또한 CD34 및 CD31 중 하나 이상을 발현하도록 유도된 ADAS 세포를 포함한다.
한 면에서, ADAS 세포는, 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도되지 않았으나 다른 면에서는 동일한 ADAS 세포의 CD34 및 CD31 각각의 발현 수준과 비교하여, CD34 및 CD31 하나 이상을 높은 수준으로 발현한다.
다른 면에서, ADAS 세포는, CD34, CD31, CD40, CD63의 하나 이상 또는 그 조합을 발현한다.
또 다른 면에서, ADAS 세포는, 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도되지 않았으나 다른 면에서는 동일한 ADAS 세포의 CD34, CD31, CD40 및 CD63 각각의 발현 수준과 비교하여, CD34, CD31, CD40, CD63의 하나 이상 또는 그 조합을 높은 수준으로 발현한다.
본 발명은 또한 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 하는 ADAS 세포의 분화 방법을 포함하며, 상기 방법은, 상기 세포를 MII 배지 내에서 인큐베이션하고 이후 상기 세포를 MIII 배지에서 인큐베이션하는 것을 포함한다.
한 면에서, 상기 방법은, 인간으로부터 유래된 ADAS 세포를 사용함을 포함한다.
다른 면에서, MII 배지는 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF)를 포함한다.
또 다른 면에서, MII 배지중 글루타민 농도는 약 2.3 mM이다.
추가의 면에서, MII 배지중 FGF 농도는 약 10 ng/mL이다.
한 면에서, MIII 배지는 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민, 니코틴아미드 및 소 태아 혈청 (FBS)를 포함한다.
다른 면에서, MIII 배지중 글루타민 농도는 약 2.3 mM이다.
추가의 면에서, MIII 배지중 니코틴아미드 농도는 약 10 mM이다.
추가의 면에서, MIII 배지중 FBS 농도는 약 2%이다.
본 발명은 또한,
a) 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록, 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 유도하고; 그리고
b) 상기 유도된 세포를 동물에게 투여하는 포함하는, 동물 내에서의 맥관신생(vasculogenesis)을 유도하는 방법을 포함한다.
한 면에서, ADAS 세포는 동물에 대해 자가유래이다.
다른 면에서, ADAS 세포는 동종 (allogeneic) 공여자로부터 단리된 것이다.
추가의 면에서, ADAS는 이종 (xenogeneic) 공여자로부터 단리된 것이다.
또 다른 면에서, ADAS 세포는 인간으로부터 유래된다.
본 발명은 또한 하기 과정을 포함하는, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포로의 ADAS 세포의 분화에 영향을 미치는 화합물의 능력을 측정하는 방법을 포함한다:
a) 상기 ADAS 세포를 일정 시간 동안 스트로마 세포 배지 내에서 배양하고;
b) 상기 스트로마 세포 배지를 화합물 또는 대조군 부형제 함유 분화 배지로 대체하고;
c) 일정 시간 동안 상기 화합물 또는 상기 대조군 부형제 함유 상기 분화 배지 내에서 상기 ADAS 세포를 인큐베이션하고;
d) 단계 (c)로부터의 상기 화합물 함유 상기 분화 배지를 사용하여 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
e) 단계 (c)로부터의 상기 부형제만을 함유한 상기 분화 배지를 사용하여 세포 중 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
f) 단계 (d) 및 (e)로부터의 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 비교하고;
g) 단계 (e)에서 분화된 세포의 개수 또는 백분율과 비교하여 단계 (d)에서 분화된 세포의 개수 또는 백분율이 더 큰 것은, 상기 화합물이 상기 ADAS 세포를 전-내피 세포 및/또는 내피 세포로 분화 유도 가능함을 나타내는 것으로 판단한다.
본 발명의 한 면에서, ADAS 세포는 인간으로부터 유래된다.
본 발명 예시를 위해, 본 발명 특정 구현을 도면에 개시한다. 그러나 본 발명은 도면에 개시된 구현의 정확한 배열 및 방편에 국한되지 않는다.
도 1A 내지 도 1F를 포함하는 도 1은, MII/MIII로 미처리 또는 처리된 ADAS 배양을 나타내는 일련의 영상이다. 도 1A 및 1B는, 각각 선-처리 및 미처리된 대조군 ADAS 배양을 나타낸다. 도 1C 및 1D는 MII 처리한 ADAS 배양을 나타낸다. 도 1E 및 1F는 MIII 처리한 ADAS 배양을 나타낸다.
본 발명은, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 지방 조직 유래된 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 유도하는 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명 방법에 의해 생성된 세포는, 연구, 이식 및, 질병의 치료 및 조직 수선을 위한 조직 조작 제품의 개발을 위해 사용 가능한 기능성 세포의 공급원을 제공한다.
정의
본원에 사용된 하기 각 용어들은 본 단원에 관련된 의미를 가진다.
본원에 사용된 "a" 및 "an"의 관사들은, 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과를 (즉, 적어도 하나) 일컫는다. 일례로, '한 성분"은, 한 개의 성분 또는 한 개 초과의 성분을 의미한다.
"약"의 용어는, 당업자에 의해 이해되는 것으로, 사용된 내용에 따라 어느 정도 가변이다.
본원에 사용된 "지방 유래된 스트로마 세포", "지방 조직 유래된 스트로마 세포", 또는 "지방 조직 유래된 성인 스트로마 (ADAS) 세포"는 상호 교환적으로 사용되며, 골아세포, 연골세포 및 지방세포와 같은 각종 상이한 세포에 대한 유사 줄기세포 전구체로 작용 가능하고, 지방 조직으로부터 기원한 스트로마 세포를 가리킨다.
“지방”은, 임의 지방 조직을 가리킨다. 지방 조직은 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게, 지방은, 피하 백색 지방 조직이다. 그러한 세포는 1차 세포 배양 또는 불사화 세포주를 포함 가능하다. 지방 조직은 지방 조직을 가지는 임의의 생물체로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 지방 조직은 포유류, 가장 바람직하게 지방 조직은 인간이다. 인간 지방 조직의 간편한 공급원은 지방 흡입 수술로부터이다. 그러나 지방 조직의 공급원 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에 있어 절대적인 것이 아니다.
"동종 (allogeneic)"은, 동일 종의 상이한 동물에서 유래한 이식물을 일컫는다.
본원에 정의된 바와 같이 “성인 스트로마 세포로부터 유래된 동종 지방”은, 수용자와 동일한 종의 상이한 개인으로부터 수득한 것이다.
"동종항원"은, 수용자에 의해 발현되는 항원과 상이한 항원이다.
“공여자 항원”은, 수용자에게 이식될 공여자 조직에 의해 발현되는 항원을 가리킨다.
본원에 사용된 "효과자 세포"는, 항원에 대항하여 면역반응을 매개하는 세포를 가리킨다. 수용자에게 이식편이 도입되는 경우, 효과자 세포는 공여자 이식편 내에 존재하는 항원에 대항하여 면역 반응을 일으키는 수용자 고유의 세포일 수 있다. 다른 경우에서, 효과자 세포는, 이식편의 일부일 수 있고, 이식편을 수용자에게 도입하는 것은, 이식편 내에 존재하는 효과자 세포가 이식편의 수용자에 대항한 면역 반응을 야기하게 한다.
본원에 사용된 "자가 유래"의 용어는, 동일한 개인에서 유래한 임의의 물질로, 상기 개인에게 이후 재도입되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 “혈관신생(angiogenesis)”의 용어는, 존재하는 맥관구조(vasculature) 및 조직으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정을 가리킨다 (Folkman, 1995, Nat. Med. 1:37-31). “수선 또는 리모델링”의 구는, 존재하는 맥관구조의 재형성을 가리킨다. 조직 허혈의 완화는 혈관신생에 절대적으로 의존한다. 새로운 혈관의 자발적 성장은, 허혈 부위 및 그 주변에서의 평행 순환을 제공하고, 혈류를 개선하여, 허혈에 의해 야기된 증상을 완화한다.
본원에 사용된 “혈관신생 인자” 또는 “혈관신생 단백질”의 용어는, 존재하는 맥관구조로부터 새로운 혈관의 성장 (“혈관신생”)을 촉진 가능한 임의의 공지 단백질을 가리킨다. 본 발명에 사용하기 적절한 혈관신생 인자는, 비제한적으로 다음을 포함한다; 태반 성장 인자, 대식구 컬러니 자극 인자 (M-CSF), 과립구 대식구 컬러니 자극 인자 (GM-CSF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 뉴로필린, 섬유아세포 성장 인자 (FGF)-I, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 에리트로포이에틴 (EPO), 골 형성 단백질 (BMP)-2, BMP-4, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 오스테오폰틴, 플레이오트로핀, 액티빈, 엔도텔린-1 및 그 조합. 혈관신생 인자들은 독립적으로 또는 상호간 조합으로 작용 가능하다. 조합시에, 혈관신생 인자들은 또한 상승적으로 작용하여, 인자들의 조합 효과가 각 인자들의 효과를 독립적으로 하여 합산한 것보다 큰 것이다. “혈관신생 인자” 또는 “혈관신생 단백질”의 용어는, 또한 그러한 인자와 기능적으로 유사한 것들을 포함한다. 기능적 유사체는, 일례로 인자들의 기능적 부분을 포함한다. 기능적 유사체는 또한 인자의 수용체에 결합하여 혈관신생 및/또는 조직 리모델링을 촉진하는 인자들의 활성을 모방하는, 항개별특이형 항체를 포함한다. 그러한 항개별특이형 항체의 생성 방법은 당업계 공지이며, 일례로 WO 97/23510에 기재되어 있고, 그 내용은 여기에 참조로 편입된다.
본원에 사용된 “혈관신생 인자”는, 임의의 적합한 공급원으로부터 제조 또는 수득 가능한 것이다. 일례로, 인자들은 그 천연 공급원으로부터 정제되거나, 합성적 또는 재조합 발현으로 생산 가능하다. 인자들은, 단백질 조성물로 환자에게 투여 가능하다. 인자들은 인자를 코딩하는 발현 플라스미드의 형태로 투여 가능하다. 적절한 발현 플라스미드의 구축은 당업계 공지이다. 발현 플라스미드 구축을 위한 적절한 벡터는, 일례로 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, RNA 벡터, 리포좀, 양이온성 지방, 렌트바이러스 벡터 및 트랜스포존을 포함한다.
본원에 사용된 "생물적합성 격자"의 용어는, 조직 발달에 도움이 되는 3차원 구조로의 형성을 촉진하는 기질을 이르는 것을 의미한다. 따라서 일례로, 세포외 매트릭스 물질, 합성 중합체, 사이토카인, 성장 인자 등을 포함하는 것과 같은 생물적합성 격자 상에 세포를 배양 또는 시딩 (seeding) 가능하다. 격자는, 조직 타입의 발달 촉진을 위해 목적 형상으로 성형 가능하다. 또한, 적어도 세포 배양의 초기 단계에서, 배지 및/또는 기질에 적절한 조직 타입 및 구조의 발달을 촉진하는 인자들을 보충한다 (일례로, 성장 인자, 사이토카인, 세포외 매트릭스 물질 등).
본원에 사용된 “분화된(differentiated)”은, 세포가 완전 발달하여 생물학적 특수성 및/또는 특이 환경에 대한 적응 및/또는 기능을 나타내도록 성숙의 최종 단계를 달성한 세포를 가리킨다. 보통, 분화된 세포는, 주어진 세포 내에서 분화된 관련 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 의해 특정지워진다. 일례로, 내피 세포 마커 CD31 및 본 윌데브란드 (von Willebrand) 인자의 발현 및 "조약돌" 형상의 형성은 분화된 성숙 내피 세포의 전형적 예이다. 본원에서 사용된 바와 같이 세포가 “분화된”이라고 할 때, 세포는 분화 과정 중에 있는 것이다.
본원에서 사용한 “분화 배지”는, 첨가제를 함유 또는 첨가제를 함유하지 않으며, 배지 중에서 인큐베이션시에 완전 분화되지 않은 줄기 세포, 지방 유래 성인 스트로마 세포 또는 기타 다른 선조 세포가, 분화된 세포의 일부 또는 모든 특성을 가지는 세포로 발달하게 하는 세포 성장 배지를 가리킨다.
본원에서 사용된 “내피 ADAS 세포”는 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS 세포를 가리킨다.
본원에서 사용된 “팽창성”은, 세포의 증식 용량, 일례로, 개수의 팽창 또는 세포 군락의 경우 군락 배가로 진행하는 것을 가리킨다.
"이식물(graft)"은, 세포, 조직, 장기 또는 기타 이식을 위한 임의의 생물적합성 격자를 일컫는다.
“성장 인자”는, 비제한적으로 하기를 포함하는 특정 인자를 의미한다; 피코그램/ml 내지 밀리그램/ml 수준 농도의 성장 인자, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 대식구 컬러니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기 세포 인자, 골프로테게린 리간드, 인슐린, 유사 인슐린 성장 인자, 상피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자, 섬모 신경영양 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 골 형성 단백질.
본원에 사용한 “성장 배지”의 용어는, 세포 성장을 촉진하는 배양 배지를 의미하는 것이다. 성장 배지는 보통 동물 혈청을 포함한다. 일부 예에서 성장 배지는 동물 혈청을 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 “다분화능” 또는 “다분화능성”의 용어는, 중추 신경계의 줄기 세포가 한 종류 이상의 세포로 분화 가능한 능력을 가리키는 것이다.
본원에 사용된 “증식”의 용어는, 유사 형태, 특히 세포의 재생 또는 증가를 가리키는 것이다. 즉, 증식은, 많은 수의 세포의 생산을 포괄하며, 다른 방법 중에서, 세포 내로 혼입되는 3H-티미딘을 측정함 등에 의해 세포의 개수를 간단히 계수하여 측정 가능하다.
“전구 세포", "선조 세포", 및 "줄기 세포"의 용어들은, 당업계 및 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 다능성 또는 계통-비결정된 선조세포를 가리키며, 이는 잠정적으로 비제한적인 횟수의 체세포 분열 가능한 것으로, 이에 따라 그 자신을 재생 또는 자손세포를 생산하여 일례로 내피 세포 또는 유사 내피 세포로 분화하거나; 또는 자가 재생이 가능하고, 내피 세포 또는 유사 내피 세포로 분화 가능한 계통 결정된 선조 세포 및 그 자손으로 분화하는 것이다. 다능성 줄기 세포와 달리, 계통 결정된 선조 세포는, 상호간 표현형이 상이한 각종 세포 타입을 발생하지 못하는 것으로 보통 간주된다. 대신 선조 세포는, 하나 또는 가능하게는 두 개의 계통 결정된 세포 타입으로 발전한다.
“전(pre)-내피 세포”라는 용어는, 내피 세포 또는 유사 내피 세포로 분화할 자손 세포를 생산 또는 스스로 재생 가능하도록 비제한적 횟수로 체세포 분열이 잠정적으로 가능한 세포를 가리킨다.
“스트로마 세포 배지”로 본원에 사용된 용어는, ADAS 세포 배양에 유용한 배지를 가리킨다. 보통, 스트로마 세포 배지는, 기본 배지, 혈청 및 항생제/항진균제를 포함한다. 그러나 ADAS 세포는 항생제/항진균제가 없고 하나 이상의 성장 인자가 보충된 스트로마 세포 배지로도 배양 가능하다. 바람직하게, 성장 인자는 인간 상피 성장 인자 (hEGF)이다. hEGF의 바람직한 농도는 약 1-50ng/ml, 더 바람직하게는 약 5ng/ml 농도이다. 바람직한 기본 배지는 DMEM/F12 (1:1)이다. 바람직한 혈청은 소 태아 혈청 (FBS)이나, 송아지 태아 혈청 (FCS), 말 혈청 또는 인간 혈청을 포함하여 다른 혈청을 사용 가능하다. 바람직하게, 상기 배지에 최대 20%의 FBS를 가하여 스트로마 세포의 성장을 유지한다. 그러나 FBS 중에 스트로마 세포 성장에 필요한 성장 인자, 사이토카인, 및 호르몬이 확인되고, 성장 배지 중에 이들이 적절한 농도로 제공된다면, 규정된 배지를 사용할 수도 있다. 나아가 배양 배지에는 또한 추가의 성분을 첨가할 수 있음이 인지된다. 비제한적인 그러한 성분은, 항생제, 항진균제, 알부민, 성장 인자, 아미노산 및 기타 세포 배양을 위해 당업계에 공지된 성분이다. 배지에 첨가 가능한 비제한적인 항생제는, 페니실린 및 스트렙토마이신이다. 배양 배지 중의 페니실린 농도는 약 10-약 200 유닛/ml 이다. 배양 배지 중의 스트렙토마이신 농도는 약 10-약 200 ㎍/ml 이다. 그러나 본 발명은 스트로마 세포 배양을 위해 임의의 한 배지에 제한되지 않는다는 점을 이해하여야한다. 오히려, 조직 배양 중에 스트로마 세포를 유지할 수 있는 임의의 배지가 사용 가능하다.
“MII/MIII 배지 계획”은, MII 배지로 ADAS 세포 인큐베이션한 후 MIII 배지로 세포를 인큐베이션함을 가리킨다.
"이식편"은, 이식될 공여자의 조직, 장기 또는 세포 또는 생물적합성 격자를 가리킨다.
본원에 사용된 "치료적 유효량"은, ADAS 세포가 투여되는 대상에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS 세포의 양이다.
"이종 (xenogeneic)"은, 상이한 종의 동물에서 유래한 이식물을 일컫는다.
본원에 사용된 "내재적"은, 생물, 세포 또는 시스템 내부로부터의 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.
"외래"는, 생물, 세포 또는 시스템 외부로부터 도입되는 또는 거기에서 생성되는 임의의 물질을 가리킨다.
"코딩하는(encoding)"은, 일례로 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 본질적 성질로서, 뉴클레오티드의 규정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는, 이에서 비롯되는 생물적 성질 및 아미노산 서열을 가지는, 생물 과정상 다른 중합체 및 고분자의 합성에서 주형으로 작용하는 것이다. 따라서 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이, 세포 내에서 또는 다른 생물 시스템에서 단백질을 생성하면, 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩(coding) 가닥 및, 유전자 또는 cDNA의 전사 주형으로 사용되는 비코딩(non-coding) 가닥 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로 언급 가능하다.
달리 특정되지 않는 한, "아미노산 서열 코딩 뉴클레오티드 서열"은, 상호의 퇴화형 (degenerate version)이면서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함 가능하다.
"단리된 핵산"은, 일례로, 천연에서 발생하는 게놈 내의 단편에 인접한 서열인, 일례로, 단편에 보통 인접한 서열들로부터 제거된 DNA 단편인, 천연 발생 상태에서 가장자리에 놓인 (flanking) 서열들로부터 분리한 핵산 조각 또는 단편을 가리킨다. 상기 용어는 또한, 세포 내에서 천연으로 수반되는 일례로 RNA 또는 DNA인 핵산 또는 단백질과 천연에서 수반되는 기타 성분들로부터 실질적으로 정제한 핵산에 적용된다. 상기 용어는 따라서, 일례로, 벡터, 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스 또는 진핵 또는 원핵의 게놈 DNA에 혼입된 재조합 DNA, 또는 다른 서열과 독립적으로 별도의 분자로 존재하는 것 (일례로, PCR 또는 제한 효소 분해에 의해 생성되는 게놈 또는 cDNA 단편 또는 cDNA)을 포함한다. 이는 또한, 추가의 폴리펩티드 서열 (들)을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본 발명의 내용에서 통상 발생하는 핵산 염기에 대한 하기의 약어를 사용한다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "T"는 티미딘", "G"는 구아노신을 의미하고 "U"는 우리딘을 의미한다.
"벡터"는, 세포 내부에 단리된 핵산을 전달하기 위하여 사용되며, 단리된 핵산을 포함하는 물질의 조성물이다. 각종 벡터가 당업계에 공지이고, 비제한적으로는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물 관련 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 따라서 "벡터"라는 용어는 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는, 일례로, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로의 핵산 전달을 촉진하는 비플라스미드 및 비바이러스성 화합물을 포함하는 것으로 또한 이해되어야 한다. 제한이 아닌 예로써의 바이러스성 벡터는, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함한다.
"발현 벡터"는, 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 가리킨다. 발현 벡터는, 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주세포에 의해 제공되거나, 시험관내 발현시스템 내로 제공 가능하다. 발현 벡터는, 일례로 코스미드, 플라스미드 (일례로 그 자체 또는 리포좀에 포함된 것) 및 재조합 뉴클레오티드를 혼입하는 바이러스와 같이 당업계 공지의 모든 것을 포함한다.
설명
지방 조직은, 줄기 세포의 공급원으로서 골수의 대안을 제공한다. 지방 조직은 많은 개인에 있어 쉽게 접근 가능하고 풍부하다. 지방 조직 유래된 줄기 세포는 상대적으로 비교란적 방법인 지방 흡입에 의해 수확 가능하고, 지방 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 충분량으로 수득 가능하다.
본 발명은, 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 규정된 배양 배지로 ADAS 세포로 처리할 수 있다는 발견에 기초한다. 이들 세포는 본원에서 “내피 ADAS 세포”로 언급된다. 따라서 본원의 개시를 바탕으로, 성숙한 내피 세포로 분화하는 세포 능력을 보존하면서도, 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 내피 ADAS 세포의 거대 군락을 생성 및 팽창 가능하다. 따라서 본 발명은, 실험/치료 목적에 유용한 내피 ADAS 세포의 다수를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다.
I. ADAS 의 단리 및 배양
본 발명 방법에 유용한 ADAS 세포는 당업자에게 공지인 각종 방법으로 단리 가능하다. 일례로, 그러한 방법은 미국 특허 제 6,153,432 호에 기재되어있고, 이는 그 전체가 여기에 참조로 편입된다. 바람직한 방법에서, ADAS 세포는 포유류 대상, 바람직하게는 인간 대상으로부터 단리된다. 인간에서 ADAS 세포는 보통 지방 흡입 물질로부터 단리된다. 본 발명 세포가 인간 대상에게 이식되는 경우, ADAS 세포를 동일한 대상으로부터 단리하여 자가 이식을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 면에서, 투여한 ADAS 세포는 수용자에게 대해 동종성일 수 있다. 동종 ADAS 세포는, 수용자와 동일한 종이면서 상이한 개인인 공여자로부터 단리된다. 단리 이후, 동종 생성물 제공을 위해 본원에 기재된 방법에 의해 세포를 배양한다. 본 발명은 또한 수용자에게 대해 이종성인 ADAS 세포를 포함한다.
어떤 방식으로도 본 발명을 제한하지 않으면서, 지방 조직의 스트로마 세포는 본원에 기재된 방법으로 단리 가능하다. 간단히, 피하 저장고의 인간 지방 조직을 지방 흡입 수술로 제거한다. 지방 조직을 이후 지방흡입 컵으로부터 500ml 소독 비이커로 옮기고, 약 10분간 정치시킨다. 침전 혈액을 흡입으로 제거한다. 약 125ml 부피의 (또는 그 미만) 조직을 250ml 원심분리 튜브로 옮기고, 튜브를 이후 Krebs-Ringer 완충액으로 충전한다. 약 3시간 동안 혹은 투명한 분리가 얻어질 때까지 튜브 및 완충액을 정치시킨 후, 완충액을 흡입으로 제거한다. 조직은 추가로 4-5회 또는 조직 색이 오렌지-황색이며 완충액의 색이 밝은 갈색이 될 때까지 Krebs-Ringer 완충액으로 세척 가능하다.
지방 조직 스트로마 세포는, 콜라게나제 처리로 분리 가능하다. 간단히, 완충액을 조직으로부터 제거하고, 조직 1ml 당 1ml 콜라게나제 용액의 비율로, 약 2mg 콜라게나제/ml Krebs 완충액 (Worthington, ME) 용액으로 대체한다. 튜브를 37℃의 수조에서, 약 30-35분간 간헐적으로 진탕하며 인큐베이션한다.
지방 조직의 기타 성분으로부터 실온에서 500 X g로 5분간 원심 분리하여 스트로마 세포를 단리한다. 오일 및 지방 세포층을 흡입으로 제거한다. 나머지 분획을 약 100ml 인산 완충 식염수 (PBS)에 격렬히 교반하여 재현탁하고, 50ml 튜브에 나누고, 500 X g에서 5분간 원심 분리할 수 있다. 완충액을 흡입으로 제거하여 스트로마 세포를 남긴다. 스트로마 세포를 이후 스트로마 세포 배지에 재현탁하고 적절한 세포 밀도로 도말하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. 조직 배양 디쉬 또는 플라스크에 일단 부착되면, 배양된 스트로마 세포는 즉각 사용 또는 일정 시간 동안 배양 중에 유지되거나, 일례로, 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 세포와 같은 목적 세포로 분화하도록 유도되기 이전의 다수의 계대를 위해 배양 중에 유지된다. 그러나 본 발명은 스트로마 세포를 단리하는 임의의 방법에 국한되는 것으로 어느 방식으로도 이해되어서는 안 된다. 오히려, ADAS 세포를 단리하는 임의의 방법이 본 발명 내에 포함된다.
세포 배양 중에 섬유아세포를 지지할 수 있는 임의의 배지가 ADAS 배양을 위해 사용 가능하다. 섬유아세포의 배양을 지지하는 배지 제형은 비제한적으로 다음을 포함한다; 최소 필수 이글 배지, ADC-1, LPM (소 혈청 무 알부민), FlO (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (Fitton-Jackson 개질 포함 또는 불포함), 기본 이글 배지 (Earle 염 염기를 첨가한 BME), Dulbecco 개질 Eagle 배지 (DMEM-무혈청), Yamane, IMEM-20, Glasgow 개질 Eagle 배지 (GMEM), Leibovitz L-15 배지, McCoy 5A 배지, 배지 M199 (M199E-Earle 염 염기와 함께), M199 배지 (M199H-Hank 염 염기와 함께), 최소 필수 Eagle 배지 (MEM-E-Earle 염 염기와 함께), 최소 필수 Eagle 배지 (MEM-H-Hank 염 염기와 함께) 및 최소 필수 Eagle 배지 (MEM-NAA-비필수 아미노산과 함께) 등. ADAS 배양에 바람직한 배지는 DMEM, 더 바람직하게는 DMEM/F12 (1:1)이다.
본 발명 방법에 유용한 추가의 비제한적 배지의 예는, 소 또는 기타 종의 태아 혈청을 적어도 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 포함 가능하다. 닭 또는 기타 종의 배아 추출물은 약 1% 내지 30%, 바람직하게는 적어도 약 5% 내지 15%, 가장 바람직하게는 약 10%의 농도로 존재 가능하다.
단리 이후, ADAS 세포는 일정 시간 동안 또는 세포가 다른 배양 기구로 넘어가기 이전에 컨플루언시에 도달할 때까지 배양 기구 내의 스트로마 세포 배지 내에서 인큐베이션된다. 배양 기구는, 시험관내에서 세포 배양을 위해 흔히 사용되는 임의의 세포 배양 기구일 수 있다. 바람직한 배양 기구는, 배양 플라스크이고, 더 바람직한 배양 기구는 T-225 배양 플라스크이다. ADAS 세포는 항생제/항진균제 없이 하나 이상의 성장 인자가 보충된 채로, 스트로마 세포 배지로 배양 가능하다. 바람직하게 성장 인자는 인간 상피 성장 인자 (hEGF)이다. hEGF의 바람직한 농도는 약 1-50ng/ml, 더 바람직하게는 약 5ng/ml 농도이다.
ADAS 세포는, 일정 시간 동안 또는 세포가 특정 컨플루언시 수준에 도달할 때까지 항생제/항진균제 없이 hEGF가 보충된 채로, 스트로마 세포 배지에서 배양 가능하다. 바람직하게, 컨플루언시 수준은 70% 초과이다. 더 바람직하게 컨플루언시 수준은 90% 초과이다. 시간 기간은 시험관내에서 세포 배양에 적절한 임의의 시간이다. 스트로마 세포 배지는, ADAS 세포 배양 동안 임의의 시점에서 교환 가능하다. 바람직하게, 스트로마 세포 배지는, 매 3-4일마다 교환한다. 이후 ADAS 세포를 배양 기구로부터 수확하여 ADAS 세포는 바로 사용 또는 추후 사용을 위해 동결보존 가능하다. ADAS 세포는 트립신화, EDTA 처리, 또는 세포 기구로부터 세포를 수확하기 위해 사용되는 임의의 기타 방법으로 수확 가능하다.
II . ADAS 세포의 처리
본 발명은, 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도하는 ADAS 세포 처리를 포함한다 (이들 세포는 내피 ADAS 세포로 불린다). 임의의 특정 이론에 묶이지 않고, 혈청, 배아 추출물, 바람직하게는 비인간 배아 추출물, 정제 또는 재조합 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 및/또는 화학 시약의 조합을 함유하는 규정된 배지와 ADAS 세포를 2차원 또는 3차원 생물적합성 격자 내에서 처리하는 것은, ADAS 세포의 분화를 유도하는 것으로 간주된다.
MII 배지:
갓 단리 또는 냉동 보존한 ADAS 세포를 하기 분화 배지 처리하여, ADAS 세포가 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내도록 유도할 수 있다. 미처리 ADAS 세포를 임의의 성장 배지, 일례로 DMEM/F12 (1:1), 10% FBS, 5 ng/mL hEGF 및 1 ng/mL hFGF 를 포함하는 배지에서 배양하여, 다른 면에서는 동일한 ADAS 세포를 분화 배지로 처리한 효과와 비교 가능하다. 일례로 처리군의 ADAS 세포는 DMEM/F12, N2 보충제, B27 보충제, 글루타민 및 FGF를 포함한 MII 배지로 배양 가능하다. 본 발명의 한 구현에서 MII 배지는 혈청을 포함하지 않는다.
바람직하게, MII 배지 내의 글루타민의 농도는 적어도 0.5 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 적어도 약 1 mM 내지 20 mM, 더 바람직하게는 적어도 약 1.5 mM 내지 15 mM, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 1.5 mM 내지 10 mM, 가장 바람직하게는 적어도 약 2 mM 내지 5 mM이다. 본 발명의 한 면에서, 글루타민의 농도는 약 2.3mM 이다.
MII 배지 내의 hFGF의 농도는 적어도 0.5 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 바람직하게는 적어도 약 1 ng/mL 내지 75 ng/mL, 더 바람직하게는 적어도 약 1.5 ng/mL 내지 50 ng/mL, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 2 ng/mL 내지 25 ng/mL, 가장 바람직하게는 적어도 약 3 ng/mL 내지 15 ng/mL이다. 본 발명의 한 면에서, MII 배지 내의 hFGF의 농도는 약 10 ng/mL이다.
ADAS 세포는, ADAS의 표현형/형태를 변화시키기에 충분한 시간 동안 MII 배지로 처리되어, 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내도록 할 수 있다. 바람직하게, ADAS 세포는 약 6일 동안의 MII 배지 초기 처리로 시작하는 단계적 처리 계획을 실시할 수 있으며, 여기에서 초기 도말 이후, 1, 3, 및 5일째에 MII 배지를 교환한다. 본 내용을 바탕으로, 당업자는, ADAS 세포를 6일 초과 동안 MII 배지로 처리할 수 있고, 일례로 ADAS 세포를 약 1주, 2주, 1개월, 2개월, 또는 6개월 처리 가능하며; MII 배지는 처리 기간 동안 임의의 시간에 교환 가능함을 알 수 있을 것이다.
일정 시간 동안 또는 세포가 특정 수준의 컨플루언시에 도달할 때까지 ADAS 세포를 MII 배지 내에서 인큐베이션한다. 바람직하게, 컨플루언시 수준은 70% 초과이다. 더 바람직하게 컨플루언시 수준은 90% 초과이다. MII 배지 내에서 세포가 배양되는 시간 기간은 시험관내에서의 세포 배양에 적절한 임의의 시간이다.
임의의 특정 이론에 묶이지 않고, MII 배지로 ADAS 세포를 처리하는 것은 ADAS 세포의 형태 및 표현형을 변화시키는 것으로 여겨진다. 일례로, 미처리 또는 선처리된 ADAS 세포와 비교하여, MII 처리된 ADAS 세포는 감소된 섬유아세포 형태를 나타내며, 세포-대-세포 연결의 네트워크를 형성하는 더 둥근 모양을 나타낸다.
MII 배지로 ADAS 세포를 처리한 이후, ADAS 세포는 실험/치료용으로 바로 수확되거나 또는 후일에 사용하기 위해 동결 보존된다. 본 발명 한 면에서, MII 배지 처리된 ADAS 세포는, 하기에 더 설명한 바와 같이 MIII 배지로 추가 처리된다.
MIII 배지:
MII 배지로 ADAS 세포 처리후, 이들 세포는 DMEM/F12, N2 보충제, B27 보충제, 글루타민, 니코틴아미드 및 FBS를 포함하는 MIII 배지로 추가 처리 가능하다. MII 배지 처리된 ADAS 세포를 MIII로 이어서 처리하는 것은 또한 MII/MIII 배지로 불린다. 임의의 특정 이론에 묶이지 않고, MII 배지로 ADAS 세포를 처리한 이후 MIII 배지로 ADAS 세포를 처리하는 것은, 내피 계통으로 세포를 추가 분화하는 것으로 여겨진다. MIII 배지로 ADAS 세포를 처리하는 것은, 보통 MII 처리 및 PBS 를 이용한 세척 단계 이후이다. PBS를 이용한 세척 단계는, MIII 배지로 ADAS 세포를 처리하기 이전에 세포 배양으로부터 MII 배지의 성분을 제거하기 위한 것이다. 그러나 본 발명은, MII 배지로 ADAS 세포를 처리한 이후 MIII 배지로 ADAS 세포를 처리하는 것에 제한되지 않는다. 본 발명은, 내피 계통으로 ADAS 세포가 분화하도록 임의의 시간에 MIII 배지를 사용하는 것을 포함한다.
바람직하게, MIII 배지 내의 글루타민의 농도는 적어도 0.5 mM 내지 약 25 mM, 바람직하게는 적어도 약 1 mM 내지 20 mM, 더 바람직하게는 적어도 약 1.5 mM 내지 15 mM, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 1.5 mM 내지 10 mM, 가장 바람직하게는 적어도 약 2 mM 내지 5 mM이다. 본 발명의 한 면에서, 글루타민의 농도는 약 2.3mM 이다.
MIII 배지 내의 니코틴아미드의 농도는 적어도 0.5 mM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 적어도 약 1 mM 내지 75 mM, 더 바람직하게는 적어도 약 1.5 mM 내지 50 mM, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 2 mM 내지 25 mM, 가장 바람직하게는 적어도 약 3 mM 내지 15 mM이다. 본 발명의 한 면에서, MIII 배지 내의 니코틴아미드의 농도는 약 10 mM 이다.
MIII 배지 내의 FBS의 농도는 적어도 0.5 % 내지 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 0.75% 내지 15%, 더 바람직하게는 적어도 약 1% 내지 10%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 1.5% 내지 7.5%, 가장 바람직하게는 적어도 약 1.75% 내지 5%이다. 본 발명의 한 면에서, MIII 배지 내의 FBS의 농도는 약 2%이다.
ADAS 세포는, 각 세포 타입의 표현형이 변화하여 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내기에 충분한 시간 동안 MIII 배지로 처리 가능하다. 바람직하게, ADAS 세포는 MIII 배지와 약 4일간 배양 된다. 본 내용을 바탕으로, 당업자는 임의의 시간 동안 MIII 배지로 세포를 처리할 수 있음을 인식할 것이다. 일례로, 세포를 4일 초과 동안 MIII 배지로 처리할 수 있다 (일례로 ADAS 세포를 약 1주, 2주, 1개월, 2개월 또는 6개월 동안 처리 가능하다). 나아가, 세포는 MIII 배지로 4일 미만 동안 처리 가능하다 (일례로 ADAS 세포를 약 1일, 2일 또는 3일 동안 처리 가능하다). MIII 배지는 처리 기간 동안 언제나 교환 가능하다.
일정 시간 동안 또는 세포가 특정 수준의 컨플루언시에 도달할 때까지 ADAS 세포를 MIII 배지 내에서 인큐베이션한다. 바람직하게, 컨플루언시 수준은 70% 초과이다. 더 바람직하게 컨플루언시 수준은 90% 초과이다. MIII 배지 내의 시간 기간은 시험관내에서의 세포 배양에 적절한 임의의 시간이다.
MIII 배지로 ADAS 세포를 처리하는 것은 세포의 형태 및 표현형을 추가로 변화시켜, 전-내피 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내도록 한다. 미처치 또는 예비 처치된 ADAS 세포와 비교하여, MII 배지 처리 이후 MIII 배지 처리된 ADAS 세포는 배양된 세포의 전반적 형태에서 변화를 나타내며, 일례로 배양된 내피 세포를 닮은 ‘조약돌(cobblestone) 타입 영역’을 형성하는 세포에 추가하여, MII 처리 동안 관측된 세포를 닮은 세포의 이종 혼합물을 낳는다.
특정화:
본 발명의 세포는, MII/MIII 배지로 세포를 처리하는 계획 동안 임의의 시점에서 트립신화로 수확되어 즉각적 시험/치료적 사용을 위해 수확되거나 또는 후일의 사용을 위해 냉동 보존 가능하다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, MII/MIII 배지 계획은, MII 배지로 ADAS 세포를 인큐베이션하고 이어서 MIII 배지로 세포를 인큐베이션하는 것을 가리킨다. 본 발명의 한 면에서, 세포는 ADAS 세포의 배양 또는 처리 계획 동안 임의의 단계에서 냉동 보존된다. 냉동 보존은, 당업계에서 일반적인 기법으로, 미래의 분석 및 사용을 위해 세포를 냉동 보존하기 위해 사용되는 현재의 모든 방법을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 다른 면에서 세포는 수확되어 플로우 사이토메트리로 세포 표면 마커를 평가하여, 처리 계획에 따른 세포의 표현형 변화를 측정할 수 있다.
ADAS 세포 및/또는 내피 ADAS 세포는, 당업계 각종 방법 및 본원에 기재된 방법중 임의의 방법으로 특정화 가능하다. 세포는, 표면, 세포내 단백질, 유전자 및/또는 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 세포가 분화하는 것을 나타내는 기타 마커의 동정에 의해 특정화 가능하다. 이들 방법은 비제한적으로 다음을 포함한다: (a) CD8O, CD86, CD14, CD45, CD34, CD133, CD9O, CD1O5, HLA-DR, CD63, CD166, MHC 클래스 I; CD44, CD73, CD54; CD31, CD13, CD40; CD29, CD49a, CD11, CD44, CD146과 같은 세포 표면 단백질의 제자리(in situ) 면역염색 또는 플로우 사이토메트리와 같은 면역형광 어세이에 의한 세포 표면 단백질의 검출; (b) 특정 모노클로날 항체를 이용한 제자리 면역 염색 또는 플로우 사이토메트리와 같은 면역형광 방법에 의한 세포내 단백질의 검출; (c) 중합효소 연쇄 반응, 제자리 혼성화 및/또는 기타 블랏팅 분석과 같은 방법에 의한 mRNA 발현의 검출.
목적 세포의 표현형 마커는 당업자에게 공지이다. 추가의 표현형 마커가 불필요한 실험 없이 계속 발견 또는 동정 가능하다. 이들 임의의 마커는, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 ADAS 세포를 확인 하는데 사용할 수 있다. 계통 특이적 표현형 특성은, 세포 표면 단백질, 세포 골격 단백질, 세포 형태 및 분비 생성물을 모두 포함할 수 있다.
내피 특성은, CD29, CD31, CD34, CD54, CD61, CD 62E, CD1O5, CD144, CD184/CXC4, CD2O2b, 및 Mad-CAM-1과 같은 내피 마커의 발현을 포함한다. 당업자는 본 기재 내용을 바탕으로, 알려진 열량, 형광, 면역화학, 중합효소 연쇄 반응, 화학 또는 방사능 화학적 방법이, 전-내피 또는 내피 특이적 마커의 존재 또는 부재를 용이하게 확인할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명은, 본원에 기재된 계획에 따라 ADAS 세포를 인큐베이션하여 생성된 세포 군락을 포함한다. 일례로 본 발명은, MII/MIII 배지 계획에 따라 배양된 내피 ADAS 세포를 포함하는 세포 군락을 포함한다.
본 발명의 한 면에서, 본원에 기재한 방법을 사용하여 측정한 MII/MIII 배지 내에서의 배양 이후 ADAS 세포는 적어도 CD34에 대해 양성이다. 다른 면에서, 내피 ADAS 세포는, MII/MIII 배지 계획에 따라 배양되지 않고 다른 면에서는 동일한 ADAS로부터의 CD34 발현 수준과 비교하여, 적어도 CD34를 높은 수준으로 발현하는 것이다.
본 발명의 다른 면에서, 내피 ADAS 세포는, MII/MIII 배지 내에서 배양 이후 적어도 CD34 및 CD31 중 하나에 대해 양성이다. 추가의 면에서, 내피 ADAS 세포는, MII/MIII 배지 계획에 따라 배양되지 않고 다른 면에서는 동일한 ADAS로부터의 CD34 및 CD31 각각의 발현 수준과 비교하여, CD34 및 CD31 중 적어도 하나를 높은 수준으로 발현하는 것이다.
본 발명의 다른 면에서, 내피 ADAS 세포는, 적어도 CD34, CD31, CD40, CD63의 하나 또는 그 조합에 대해 양성이다. 다른 면에서, 내피 ADAS 세포는, MII/MIII 배지 계획에 따라 배양되지 않고 다른 면에서는 동일한 ADAS로부터의 CD34, CD31, CD40, CD63 또는 그 조합 각각의 발현 수준과 비교하여, CD34, CD31, CD40, CD63 중 적어도 하나 또는 그 조합을 높은 수준으로 발현하는 것이다.
본 발명은 또한 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 세포로 ADAS 세포가 분화하는 것을 제고하는 화합물의 연구 및 동정 방법을 제공한다. 따라서 하기 과정을 포함하는, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS로 ADAS 세포가 분화하도록 영향을 끼치는 화합물의 능력을 측정하는 방법이 제공된다;
a) 일정 시간 동안 스트로마 세포 배지 내에서 ADAS 세포를 배양하고;
b) 화합물 또는 대조군 부형제를 포함하는 분화 배지로 스트로마 세포 배지를 대체하고;
c) 일정 시간 동안 화합물 또는 대조군 부형제를 포함하는 분화 배지 내에서 ADAS 세포를 인큐베이션하고;
d) 단계 (c)로부터의 상기 화합물을 포함하는 상기 분화 배지를 사용하여 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
e) 단계 (c)로부터의 상기 대조군 부형제만을 포함하는 상기 분화 배지를 사용하여 세포 내에서 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
f) 단계 (d) 및 (e)의 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 비교하고;
g) 단계 (e)에서의 분화된 세포의 개수 또는 백분율과 비교하여 단계 (d)에서의 보다 큰 분화된 세포의 개수 또는 백분율이 더 큰 것은, 상기 화합물이 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS 세포로 상기 ADAS 세포를 분화 유도 가능한 것임을 나타내는 것으로 판단한다.
ADAS 세포를 사용한 방법
전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 ADAS 세포를 유도하기 위한 MII/MII 배지 계획에 따른 ADAS 세포의 인큐베이션에 이어, 내피 ADAS 세포는, 맥관신생 및/또는 혈관신생의 장애와 관련한 질환 또는 질병으로 고생하는 환자를 치료하기 위해 사용 가능하다. 본 발명은, 치료를 필요로 하는 환자에서의 맥관신생 및/또는 혈관신생을 개선하기 위한 세포 치료법을 위한 내피 ADAS 세포를 사용하는 방법 및 조성물을 포함한다. 본원의 방법에 따라 제조된 내피 ADAS 세포는, 손상/파괴된 내피 조직의 수선 및 대체, 존재하는 내피 조직의 강화, 새로운 또는 변화된 조직의 도입, 인공 보철물의 변형, 또는 생물 조직 또는 구조의 결합을 위해 사용 가능하다. 일례로, 상기 세포는, 심장 판막 세포를 대체하기 위해 사용 가능하다. 추가로, 상기 세포는, 심근 경색 이후 허혈성 심근을 치료하기 위해 사용 가능하다. 임의의 특정 이론에 묶이지 않고, 내피 ADAS 세포는, 혈관신생 및 근육신생, 심장근육세포 자멸사를 조절하고, 허혈성 심장 조직을 리모델링함에 의해 허혈성 심근을 재생하는 데 기여하는 것으로 여겨진다.
본 발명 세포는, 심혈관 질병 및 질환의 치료에 추가로 사용 가능하다. 본 발명 방법에 의해 수득한 세포는, 손상을 감소 및/또는 최소화하며, 심근 또는 심혈관 수선 및 손상에 따른 재생을 촉진하는데 기여 가능하다. 비제한적으로 이는, 새로운 혈관 형성을 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력, 혈관신생 인자를 합성 및 분비하는 능력, 세포 생존 및 증식을 자극하는 성장 인자를 합성 및 분비하는 능력, 새로운 혈관 형성에 직접 참여하는 세포로의 증식 및 분화 능력, 손상된 심근의 접목 및 상처 형성 억제 능력을 포함한다 (콜라겐 침착 및 가교).
본 발명의 세포는, 각종 혈관 신생성 성장 인자를 발현가능하며, 이는 비제한적으로, 혈관 형성 및 혈관 발달에 기능하고, 허혈성 조직 생존을 지지하고, 뒷 다리 손상의 재관류/ 막힘 이후 재관류의 유도, 심장 상처 이후 동물에게 주입시 심장으로 보내기, 및 맥관신생 및 혈관신생 관련한 세포로의 이들의 분화와 일치하는 마커를 발현하는 세포로 분화하는, 태반 성장 인자 (PGF) 및 맥관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함한다. 당업자는 일례로 사지, 망막 및 심근에서 조직 허혈 이후 혈관신생의 부위에 본 발명 세포를 혼입 가능함을 인지할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 제조된 내피 ADAS 세포를 사용하여 각종 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 당업자는 본원의 기재를 바탕으로, 비제한적으로 다음을 포함하는 광범위한 질병을 치료하기 위한 재생성 의약의 가치 및 잠재능을 용이하게 인지할 수 있다; 허혈, 동맥경화성 심혈관 질환, 심장 동맥 질환, 폐색성 동맥 질환, 심근 허혈, 말초 혈관 폐색 질환 등을 포함하는 심장 질환. 본 발명은, 새로운 미손상 세포의 공급에 의해 일정 형태의 치료적 완화를 제공하는 질병 치료를 위한, 인간을 포함한 동물에게 내피 ADAS 세포를 투여하는 방법을 포함한다.
당업자는, 동물에게 내피 ADAS 세포를 투여 가능하고, 주변 환경으로부터의 신호 및 지시를 접수함에 따라 세포가 인접 세포 환경에 의해 지배되는 생체 내에서 성숙 내피 세포로 추가로 분화 가능함을 용이하게 인지할 수 있다. ADAS 세포를 시험관내에서 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 분화하는 방법은 본원에 기재되었고, 내피 ADAS 세포는 본원에 기재된 방식에 따라 동물에 투여 가능하다. 이와 다르게, 내피 ADAS 세포는, 시험관내에서 보다 성숙한 내피 세포로 추가 분화되고, 성숙한 내피 세포를 치료가 필요한 동물에게 투여 가능하다.
내피 ADAS 세포는, 생체내 환경에서 장기간 생존을 위한 그래프팅을 위해 제조 가능하다. 일례로, 세포의 성장 및 유지에 적절한 성장 배지 내에서 세포를 전파시켜, 컨플루언시까지 성장시킬 수 있다. 일례로 인산염 완충 식염수 (PBS; 1 mg/mL 글루코스; 0.1 mg/ml MgC12, 0.1 mg/ml CaCl2가 보충된 0.05% 트립신 을 함유함(완전 PBS))과 같은 완충액과 트립신을 불활성화시키기 위한 5% 혈청을 이용하여 배양 기질로부터 세포를 분리할 수 있다. 원심 분리를 사용하여 PBS로 세포를 세척하고 트립신 없이 이후 완전 PBS로 주사를 위하여 선택된 밀도에서 재현탁 가능하다.
PBS에 추가하여, 숙주 대상과 생리적으로 적합한 임의의 삼투압적으로 조절된 용액을, 공여자 세포의 현탁 및 숙주 내 주사를 위해 사용 가능하다. 비경구 투여를 위해 적합한 약학 조성물 제형은, 멸균수 또는 멸균 등장 식염수와 같은 약학 허용 담체와 조합된 세포를 포함한다. 그러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여를 위해 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매 가능하다. 주사 가능한 제형은, 보존제를 포함한 다중 투여 용기 또는 앰퓰과 같은 단위 투여 형태로 제조, 포장 또는 판매 가능하다.
본 발명은 또한, CNS, 피부, 간, 신장, 심장, 췌장 등을 포함하는 신체 내 질병 또는 외상을 치료하기 위해 기타 치료적 방법과 조합된 내피 ADAS 세포의 그래프팅을 포함한다. 따라서 본 발명의 내피 ADAS 세포는, 환자에게 유익한 효과를 나타내는 유전자 변형 및 유전자 비변형 세포 모두인 기타 세포와 함께 공동 그래프팅 가능하다. 따라서 본원에 기재된 방법은, 일단 본원에 기재된 내용을 인지한 당업자에 의해 기타 치료 방법과 조합 가능하다.
본 발명의 내피 ADAS 세포는, 여기에 그 전체가 참조로 편입된 미국 특허 제 5,082,670 호 및 제 5,618,531 호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지인 기법으로 환자에게 내피 ADAS 세포를 바로 이식하거나, 신체의 기타 적절한 부위로 이식 가능하다.
본 발명 세포의 이식은, 당업계 공지의 기법 및 본원 기재의 기법 또는 미래 개발되는 기법에 의해 달성 가능하다. 본 발명은, 이식, 그래프팅, 주입 또는 바람직하게 인간인 동물에게 세포를 도입하는 기타 방법을 포함한다. 본원에 예시된 것은 각종 동물의 심혈관 조직에 세포를 이식하는 방법이지만, 본 발명이 그러한 해부학적 부위 및 그들 동물에 제한되는 것은 아니다. 또한 일례로 미국 특허 제 4,678,470 호에 기재된 골이식 및 미국 특허 제 6,342,479 호 및 제 5,571,083 호에 기재된 췌장 세포 이식 관련 방법은 신체의 임의의 해부학적 부위에 세포를 이식하는 방법을 개시한다.
세포는 또한 캡슐화 가능하고 다음을 포함하는 공지의 캡슐화 기법에 따라 생물 활성 분자를 전달하는데 사용 가능하다; 마이크로캡슐화 (일례로, 미국 특허 제 4,352,883 호; 제 4,353,888 호 및 제 5,084,350 호; 참조로 본원에 편입됨) 또는 마크로캡슐화 (일례로, 미국 특허 제 5,284,761 호; 제 5,158,881 호; 제 4,976,859 호; 및 제 4,968,733 호; 및 국제 출원 WO 92/19195; WO 95/05452호; 이들 모두는 참조로 본원에 편입됨). 마크로 캡슐화를 위해, 장치내의 세포 개수는 가변이다; 바람직하게 각 장치는 103-109 개, 가장 바람직하게는 105-107 개의 세포를 포함한다. 환자에게 다수의 마크로캡슐화 장치를 임플랜트 가능하다. 마크로캡슐화 및 세포 임플랜트 방법은 당업계 공지이며, 일례로 미국 특허 제 6,498,018 호에 기재되어 있다.
본 발명의 한 면에서, ADAS 세포를 공여자의 지방 조직에서 추출하여 본원에 기재한 방법으로 배양하여 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써, 환자 내의 손상 또는 퇴화된 심근 또는 기타 심혈관 조직에 치료 효과를 유도한다. 추가로, 개인에게 도입되는 세포는, 상이한 공여자 (동종)에게서 유래된 것이거나, 치료할 개인으로부터 수득한 세포일 수 있다 (자가). 나아가, 개인에게 도입할 세포는, 완전 상이한 종으로부터 수득 가능하다 (이종). 바람직한 구현에서, 세포를 임플랜트할 사람의 지방 조직으로부터 추출함으로써, 이식편에 따른 항원성 및/또는 면역성 반응 관련 잠정적 부작용을 감소시킬 수 있다.
내피 ADAS 세포의 투여량은, 광범위한 한도 내에서 가변이며, 각 특정 경우에서의 개인적 필요에 따라 조절 가능하다. 사용한 세포의 개수는, 수용자의 체중 및 상태, 투여의 횟수 및/또는 빈도, 및 기타 당업자에게 공지인 변수에 의존하다.
환자에게 투여하는 내피 ADAS 세포의 개수는, 일례로 지방 조직 처리 이후 세포 수율에 관련될 수 있다. 세포 전체 개수의 일부는 후일의 사용을 위해 남겨지거나 냉동 보존 가능하다. 추가로, 전달되는 투여량은, 환자에게 세포를 투여하는 경로에 의존한다. 심외막 또는 심내막 전달 시스템을 사용 시에는 적은 개수의 세포가 필요한데, 이는 이들 시스템 및 방법이 심근 증상 치료를 위해 가장 직접적인 경로를 제공 가능하기 때문이다. 본 발명 한 구현에서, 환자에게 전달될 세포 개수는 약 5.5 x 104 개일 것으로 기대된다. 그러나 이러한 숫자는 목적 치료 효과를 달성하기 위해 수십 배 단위로 조절 가능하다.
100kg 체중 당 약 105 내지 약 1013 개의 내피 ADAS 세포를 개인에게 투여 가능하다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 1.5 x 106 내지 약 1.5 x 1012 개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 1 x 109 내지 약 5 x 1011 개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 4 x 109 내지 약 2 x 1011 개의 세포를 투여한다. 일부 구현에서, 100kg 체중 당 약 5 x 109 내지 약 1 x 1011 개의 세포를 투여한다.
내피 ADAS 세포는, 심근 기능이 위태롭게 되는 임의의 상황에서 환자에게 투여 가능하다. 그러한 비제한적인 상황의 예는, 급성 심근 경색 (심장 마비), 울혈성 심장 기능 상실 (치료 또는 이식에 대한 연결로서), 및 심장 동맥 우회 그래프팅 수술 보충을 포함한다. 세포는 미리 추출하여 냉동 보존 방식으로 보관하거나 또는 결정된 필요 시기 시점 및 또는 그 부근에서 추출 가능하다. 본원에 개시된 바와 같이, 추가로 정제, 변형, 자극 또는 기타 세포를 변화시키는 추가의 처리 또는 연이은 부가 처리 없이, 손상된 조직 또는 손상된 조직 부근에 세포를 직접 적용 또는 환자에게 투여 가능하다. 일례로, 치료가 필요한 환자에게 투여 이전에, 본원에 개시한 방법으로 시험관내에서 세포를 배양한다.
본 발명의 세포를 환자에게 투여하는 방식은, 치료할 질병 타입, 포유류의 연령, 세포의 분화 여부, 세포가 그 안에 이종 유래의 DNA를 포함하는지의 여부를 포함하는 각종 인자에 따라 가변이다. 세포는, 직접 주사 또는, 심혈관 질병 또는 질환으로 고생하는 환자에게 투여하는 화합물 도입에 있어 당업계에서 사용되는 기타 방법에 의해, 목적 부위에 도입 가능하다.
내피 ADAS 세포는 다양한 방식으로 숙주에게 투여 가능하다. 투여에 바람직한 방식은, 혈관내, 뇌내, 비경구, 복막내, 정맥내, 경막외, 척수내, 인트라스테말 (intrastemal), 관절내, 활액내, 경막내, 동맥내, 심장내 또는 근육내이다. 일부 구현에서, 내피 ADAS 세포는, 직접 이식에 의해 심혈관 조직에 투여된다. 다른 구현에서 내피 ADAS 세포는 혈관계와 같은 심혈관 조직에 단순 주사에 의해 투여 가능하다.
내피 ADAS 세포는 또한, 목적 치료 효과를 증가, 조절 또는 다르게는 안내하기 위한 첨가제와 함께 적용 가능하다. 일례로 한 구현에서, 효능을 증가시키고, 이환률을 감소시키거나 방법의 용이성을 촉진하기 위한 세포 군락의 풍부화를 위한, 항체 매개 양성 및/또는 음성 세포 선별의 사용에 의해 세포를 추가로 정제할 수 있다. 유사하게, 임플랜트된 세포를 지지 및/또는 그 운명을 결정함에 의해 생체내 조직 조작을 촉진하는 생물적합성 격자와 함께 세포를 적용 가능하다.
환자에게 내피 ADAS 세포 투여 이전에, 세포는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 벡터 전략에 의해 관심 핵산으로 안정적으로 또는 일시 형질감염 또는 트랜스덕션시킬 수 있다. 세포는 유전자 조작 이후 투여 가능하며, 이에 따라 세포에 의해 제공되는 치료 반응 (들)을 도모하는 유전자 산물을 발현하게 된다. 조작의 예는, 혈관신생 또는 맥관신생 촉진 인자 (예로서 VEGF) 발현, 특정 세포 계통으로의 분화를 촉진 (일례로 MyoD) 또는 세포 성장 및 증식을 자극하는 발달 유전자의 발현 (일례로 bFGF-1)의 조절 (증가 또는 감소)을 포함한다.
임플랜트 이전에 골격 물질 상에서 내피 ADAS 세포를 또한 세포 배양할 수 있다. 따라서 조직 조작된 판막, 심실 패치, 심낭, 혈관 및 기타 구조물을, 수용자에게 삽입 또는 임플랜트 이전에 세포를 이용하여 천연 또는 합성 매트릭스 또는 골격 상에서 합성 가능하다.
본 발명의 세포는 또한 대상에서의 새로운 모세관 또는 혈관 형성을 유도 또는 촉진하기 위해 혈관신생 인자와 조합으로 투여 가능하다. 전-내피 세포 및/또는 내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS는, 혈관신생 인자 주입 이전, 동시, 또는 이후에 투여 가능하다. 추가로, 본 발명의 세포는 혈관신생 인자 투여 부위의 바로 옆, 동일 부위 또는 떨어진 곳에 투여 가능하다.
나아가, 본 발명의 세포는, 세포의 생물 활성상 변화를 측정함에 의해 특정 질병의 기작 규명 (일례로, 증식 활성, 부착, 혈관신생 인자의 생성), 내피 세포 생물 활성을 조절하기 위해 작동하는 약물 및/또는 성장 인자에 의한 기작 연구, 환자의 질병 진단 및 모니터링, 유전자 치료, 유전자 전달 또는 단백질 전달, 및 생물 활성 제품의 생산을 위한, 화합물, 알러겐, 성장/조절 인자, 약학 화합물 등의 전-내피 세포 및/또는 내피 세포에 대한 효능을 시험관내에서 스크리닝하기 위해 사용 가능하다. 전-내피 세포 및/또는 내피 세포에 대한 성장/조절 인자 효과는, 일례로 총 세포 개수인 시험관내 생존 세포의 개수 및 차이 나는 세포 개수를 분석함에 의해 평가 가능하다. 이는 표준의 세포 및/또는 조직학적 기법에 의해 달성 가능하며, 타입 특이적인 세포 항원을 규명하는 항체를 사용하는 면역세포화학 기법의 사용을 포함한다. 본 발명 세포에 대한 각종 약물의 효과는 현탁액 배양 또는 3차원 시스템에 의해 평가 가능하다.
본 발명 세포는 또한 내피 세포의 분화 및 성숙 관련 인자의 단리 및 평가에 사용 가능하다. 따라서 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하는 ADAS 세포는, 조절된 배지와 같은 배지의 활성을 측정하는 어세이, 세포 성장 활성에 대한 액체의 평가, 특정 계통에 대한 공헌 관련 등을 평가에 사용할 수 있다. 각종 시스템이 적용 가능하며, 각종 생리적 스트레스에 기초한 전-내피 세포의 분화를 유도하기 위해 고안될 수 있다.
질병, 질환 또는 심혈관 시스템에 영향을 줄 수 있는 증상의 치료를 위한 내피 ADAS 세포의 사용은, 면역 억제제의 필요 없이 수용자에게 내피 ADAS 세포를 도입할 수 있다는 추가의 장점을 제공한다. 성공적인 세포 이식은, 수용자에 의해 생성되는 이식물 거부 면역 반응을 유도하지 않으면서 공여자 세포의 영구적 그래프팅을 필요로 하는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 숙주 거부 반응을 방지하기 위해, 시클로스포린, 메토트릭세이트, 스테로이드 및 FK506과 같은 비특이적 면역억제제가 사용된다. 이들 시약은 매일 투여되며, 투여가 중단되면 이식물 거부가 보통 발생한다. 그러나 비특이적 면역억제제를 사용하는 경우 부적절한 결과는, 이들이 면역 반응의 전반적인 면을 억제함으로써 (일반 면역 억제), 수용자의 감염 및 기타 질병에 대한 민감도를 크게 증가시킨다.
본 발명은 면역억제제를 필요로 하지 않으면서 수용자에게 내피 ADAS 세포를 도입함에 의해 질병, 질환 또는 심혈관 시스템에 영향을 줄 수 있는 증상의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 수용자에게 이익을 제공하기 위해, 동종 또는 이종 내피 ADAS 세포 또는 수용자와는 유전적으로 별도인 내피 ADAS 세포를 수용자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은, 수용자에게 내피 ADAS 세포를 투여시, 면역억제제를 필요로 하지 않으면서 질병, 질환 또는 증상을 치료하기 위한 내피 ADAS 세포 사용 방법을 제공한다. 따라서 수용자는, 면역억제 치료 수반 암 관련 증상을 포함하여 감염 및 기타 질병을 발생하는, 이식된 내피 ADAS 세포에 대한 민감성이 감소하게 된다.
유전자 변형
본 발명의 세포는 또한, 환자의 조직 내에서 혼입 및 분화를 추적하기 위한 방법 또는 치료 목적을 위한 외래 단백질 또는 분자를 발현하기 위해 사용 가능하다. 따라서 본 발명은 일례로 문헌에 기재된 바와 같이 외래 DNA를 세포 내에서 동시에 발현하는 세포내로 외래 DNA를 도입하는 발현 벡터 및 방법을 포함한다 (Sambrook 등, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 및 Ausubel 등, 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
단리된 핵산은 환자에게 일단 도입된 세포의 이동, 혼입 및 생존을 추적하기 위해 사용되는 분자를 코딩 가능하며 또한 환자 내에서 변이, 결여 또는 기타 오작동하는 단백질을 발현하기 위해 사용 가능하다. 추적용 단백질은 비제한적으로, 초록 형광 단백질 9GFP), 임의의 기타 형광 단백질 (일례로, 증가된 초록, 남색, 황색, 청색, 및 적색 형광 단백질; Clontech, Palo Alto, CA) 또는 본원 다른 곳에 기재된 기타 태깅 단백질 (일례로 LacZ, FLAG-tag, Myc, His6, 등)을 포함한다. 이와 다르게, 세포에 도입되는 단리된 핵산은 비제한적으로, CFTR, 헥소스아미니다제, 및 기타 당업계 공지의 유전자 치료 기법 및 장래에 개발될 것을 포함한다.
본 발명 세포의 이동, 분화 및 혼입을 추적하는 것은, 벡터 또는 바이러스로부터 발현된 검출 가능 분자를 사용하는 것에 제한되지 않는다. 세포의 이동, 분화 및 혼입은, 이식된 내피 ADAS 세포의 위치 결정을 가능하게 하는 일련의 프로브를 사용하여 검출 가능하다. 그러한 프로브는 인간 특이적 Alu에 대한 것을 포함하며, Alu는 5000 염기쌍마다 약 하나 존재하는 풍부한 트랜스포존성 성분으로, 따라서 당업자가 이식된 세포의 추적을 가능하게 한다. 이식된 세포의 추적은 나아가 비제한적으로 CD34, CD31, CD40, CD63 등을 포함하는 본원에 상세히 기재된 세포 특이적 마커용 핵산 프로브 또는 항체를 이용하여 달성 가능하다.
본 발명은 또한, 세포 내에 이전에 존재 또는 발현하지 않았거나 단리된 핵산이 도입되기 이전과 비교하여 환경상 상이하게 또는 한 수준으로 이제 발현될 때, 단리된 핵산이 그 안에 도입되어 있고, 목적 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 그로부터 발현됨으로써, 장점을 수득하는 것을 포함한다. 그러한 장점은, 목적 핵산의 발현이 실험실에서 시험관내 또는 세포가 존재하는 포유류 내에서 연구 가능한 시스템을 제공하는 사실을 포함하며, 이는, 도입된 핵산을 포함하는 세포가 연구, 진단 및 치료 수단으로 사용 가능하고, 포유류의 선택된 질병 상태의 새로운 진단 및 치료 수단의 개발을 위해 유용한 포유류 모델이 제공되는 시스템이다.
목적하는 단리된 핵산 발현 세포는, 비정상적인 발현 및/또는 활성을 수반하는 질병, 질환 또는 증상을 치료 또는 경감하기 위하여 높은 수준의 유전자 산물이 유용한, 기타 세포, 조직 또는 전체 포유류에게 단리된 핵산의 산물을 제공하기 위해 사용 가능하다. 따라서 본 발명은 목적 단백질의 증가된 발현, 단백질 수준 및/또는 활성이 맥관신생 및/또는 혈관신생과 관련한 질병, 질환 또는 증상을 치료 또는 경감하기에 유용한, 목적하는 단리된 핵산을 발현하는 내피 ADAS 세포를 포함한다.
내피 ADAS 세포는, 일례로 VEGF인 혈관신생 인자를 발현하기 위해, 조작된 ADAS 세포를 수용자에게 투여하기 이전에 유전자 조작 가능하다. 조작된 ADAS 세포는 그러한 인자를 발현하도록 유전자 변형되지 않은 ADAS 세포에 비해 다량의 VEGF를 발현 및 분비한다. 맥관신생 및/또는 혈관신생에 영향을 미치는 질병, 질환 또는 증상 치료에 유전자 변형된 내피 ADAS 세포를 사용하는 것은, 수용자 내에 내피 ADAS 세포를 존재하도록 하는 치료 효과를 증가시키는 장점이 있다. 증가된 치료 효과는, 조작된 내피 ADAS 세포로부터의 증가된 VEGF 분비에 기인한 것이다. 조작된 내피 ADAS 세포로부터의 증가된 VEGF 분비에 관련하여, 다량의 VEGF가 인접 세포 또는 떨어진 세포에 존재하며 VEGF 효과를 입게 된다. 나아가, 수용자 내에 존재하는 VEGF의 양이 증가하면, 환자가 치료받는 시간 구간이 줄어들 수 있다.
본원에 기재된 방법은, 당업계 공지의 각종 방식 및 각종 변형 그리고 그 조합으로 실시 가능함을 이해하여야한다. 또한, 세포 타입간 상호 작용 또는 작용 방식에 관해 기재한 임의의 이론은 본 발명을 어느 방식으로나 제한하지 않고, 본 발명 방법이 보다 잘 이해되도록 하는 면에서 제시됨을 알아야한다.
하기의 실시예는 본 발명의 면들을 추가로 예시한다. 그러나 절대로 이들이 본원에 기재된 본 발명 내용 또는 교시를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1: 1차 ADAS 배양의 성립
지방흡입으로 수득한 백색 지방 조직의 스트로마 맥관 분획 (SVF)을, 10분 간격으로 격렬히 진탕하면서 80분 동안 37℃에서 0.5% BSA 및 125 μg/mL 콜라게나제 타입 I (최종 농도)를 포함한 Krebs-Ringer 중탄산 완충액으로 소화시켰다. 소화 이후, 현탁액을 5분간 실온에서 1200 rpm으로 원심분리하고 격렬하게 진탕하고, 다시 실온에서 5분간 1200 rpm으로 원심 분리하였다. SVF 펠릿을 교란하지 않으면서, 지방/지방세포 층을 흡입 제거하였다. 펠릿을 스트로마 세포 배지 (DMEM/F12 1:1, 10% FBS, 1X 항생제/항진균제) 내에 재현탁/세척하고, 총 40mL 부피의 스트로마 세포 배지 내에 재현탁하였다. 상기 현탁액 10mL를 40mL 스트로마 배지 함유 T-225 플라스크에 가하였다. 도말 1-3일 이후 미부착 세포를 세척해 버리고, 항생제/항진균제가 없고 인간 EGF 5ng/mL이 보충된 스트로마 세포 배 지로 배지를 교체하였다. 상기 배지는 3-4일마다 교체하였다. 도말 14일 이후 컨플루언트한 배양을 수확하여 냉동 보존하였다. 상기 세포를 ADAS 계대 0으로 명명하였다 (P0).
실시예 2: ADAS 세포 처리
2개의 별도의 실험에서, 단일 공여자로부터의 ADAS (P0) 세포를 약 6 x 103 세포/cm2의 밀도로 T-83 플라스크에 도말하였다 (계대 1). 대조군 ADAS 세포를 DMEM/F12 (1:1), 10% FBS, 5 ng/mL hEGF 및 1 ng/mL hFGF를 포함하는 팽창 배지 내에서 배양하고, 2-4일 마다 배지를 교환하였다. 처리군의 ADAS 세포는 MII 배지 (DMEM/F12, N2 보충제, B27 보충제, 2.3 mM 글루타민, 10 ng/mL hFGF) 내에서 6일간으로 시작하며 도말 이후 1, 3 및 5 일에 배지를 교환하는 단계적 처리 계획을 실시하였다. 7일째에 배양을 D-PBS로 2회 린스하고 이후 ADAS 세포를 MIII 배지(DMEM/F12, N2 보충제; Invitrogen, Carlsbad, CA, B27 보충제; Invitrogen, Carlsbad, CA, 2.3 mM 글루타민, 10 mM 니코틴아미드, 2% FBS)로 4일간 인큐베이션하였다. MIII를 10일째에 대체하고 대조군 및 처리된 ADAS 세포 모두를 11일째에 트립신화로 수확하여, 플로우 사이토메트리를 실시하였다.
플로우 사이토메트리
플로우 사이토메트리를 대조군 및 MII/MIII 처리된 세포에 대해 실시하여, 표현형 특정화 및 MII/MIII 배지 처리 계획에 대한 잠정적 세포 반응을 동정하였다. 공액 모노클로날을 위해, 세포를 플로우 세척 완충액 1mL로 1회 세척하고 (1X DPBS, 0.5% BSA 및 0.1% 소듐 아자이드), 20초간 약 6000 x g에서 원심 분리하였다. 1.3mL 블라킹 완충액에 세포를 현탁하고 (25μg/mL 마우스 Ig를 가진 세척 완충액), 10분간 얼음 상에서 인큐베이션한 후, 100μL 분액으로 분액하였다. 각 분획에 적절한 모노클로날 항체를 첨가하였다. 적절한 동형 대조군 조합을 포함시켜, 실험에서 사용한 모노클로날 동형 조합에 대응하도록 하였다. 튜브 1개당 3개의 모노클로날 항체를 포함시켰다. 본 실험에서 사용한 항체의 농도는 공급자가 추천한 농도이다. ADAS 표현형 결정을 위해 사용한 항체는 다음을 포함한다; (모든 항체는 달리 표시하지 않는 한 BD-Pharmingen, San Jose, CA에서 구입함): CD8O (Caltag, Burlingame, CA), CD86 (Caltag), CD14; CD45, CD34, CD133 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA); CD9O, CD1O5 (Caltag), HLA-DR; CD63, CD166, MHC 클래스 I; CD44 (Cell Sciences, Canton, MA), CD73, CD54; CD31, CD13, CD40; CD29 (Caltag), CD49a, CD11a. 모든 튜브를 얼음 상에 인큐베이션하고, 30분간 빛으로부터 보호한다. 세포를 2mL 세척 완충액으로 1회 세척하고 (5분간 약 650 x g), 이후 1% 파라포름알데히드 200μL으로 고정하였다.
비공액 모노클로날 항체에 대해서는, 본원의 다른 곳에 기재한 바와 같이 ADAS 세포를 수확, 세척 및 블라킹하였다. 1차 항체 (VEGFR2 [KDR] 및 von Willebrand 인자)를 가하고 (10μg/mL), 세포를 얼음 상에서 약 30분간 인큐베이션하였다. 세포를 2mL 세척 완충액으로 1회 세척하고 (5분간 650 x g), 100μL 세척 완충액으로 재현탁하였다. 염소 항-마우스 PE 공액 2차 항체 (0.5μg/mL 농도)를 1차 항체를 함유한 현탁액에 가하고, “2차 항체 단독” 대조군 및 세포를 얼음 상에서 인큐베이션하고 15분간 빛으로부터 보호하였다. 2mL의 플로우 세척 완충액으로 최종 세척 (5분간 650 x g)하여, 세포를 상기한 바와 같이 고정하였다.
Cell Quest 획득 소프트웨어를 사용한 Becton Dickinson FACSCaliber 플로우 사이토메터의 분석 상에서 항체당 약 10,000 개의 이벤트 (세포)를 수득하고, Flow Jo 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다 (Tree Star, Ashland, OR).
형태
도 1은 미처리 및 MII/MIII 처리된 ADAS 배양의 대표 사진을 나타낸다. 스핀들 형상의, 섬유아세포 유사 형태가 선처리 및 미처리 대조군 배양에서 관측되고 (도 1A 및 도 1B), 처리 개시 이후 4일간 MII 처리한 배양한 경우에는 형태학적 변화가 관측되었다 (도 1C 및 도 1D). MII 처리된 세포는 그 외관상 섬유아세포적 특성이 적고, 부착 및 미부착 모두가 둥글고 상이 밝은 (phase bright) 세포가 상당히 많았다. 또한, 이 단계의 세포는 세포 대 세포 연결의 “네트워크”를 형성하는 것으로 보인다. MIII로 세포를 추가로 처리하면, 배양의 전반적 형태가 다시 변화하며, 배양된 내피 세포를 닮은 “조약돌” 타입 영역을 형성하는 세포에 추가하여 MII 처리 동안 보여지는 것을 닮은 세포의 이종성 혼합물을 낳는다 (도 1E 및 도 1F).
표현형 특정화
대조군 및 MII/MIII 처리된 ADAS 세포를, 스트로마, 조혈성 또는 내피 계통의 세포에 의해 보통 발현되는 각종 분자에 대항한 항체를 사용하여, 표면 마커 발현에 대하여 표현형적으로 특정화하였다. 표 1은, 상기 특정화의 결과를 개시한다 (그 값은, 나열된 표면 마커에 대해 양성 염색되는 세포의 백분율임). 배양 11일 이후 미처리 계대 1 ADAS 세포는 CD13, CD29, CD31, CD40, CD44, CD49a, CD54, CD63, CD73, CD8O, CD9O, CD1O5, CD133, CD166, MHC 클래스 I, 및 VEGF 수용체 2 (flk-1)를 발현하였다. MII/MIII 배지 계획으로 처리시, CD31 (+56.5%), CD34 (+67.9%), CD40 (+27.4%), CD63 (+38.0%), CD1O5 (-25.3%), 및 CD166 (-36.1%)의 표면 마커를 발현하는 세포의 평균 백분율의 현저한 변화가 (> 20%) 관측되었다.
표 1
대조군 및 MII/MIII 처리된 ADAS 세포의 표현형 특정화
Figure 112007063426046-PCT00001
본원에 기재된 내용은, 미분화된 ADAS 세포를 처리하여 내피 ADAS 세포의 군락으로 도달하도록 하는 배지 처리 계획의 새로운 사용 방법을 개시한다. 본원에 개시된 세포의 표현형 특정화가 잠정적인 내피 세포 표면 마커 모두를 포함하지는 않지만, 본원에 기재된 방법으로 생성된 세포 군락은 CD34 (전-내피 세포 및 조 혈 줄기 세포의 마커) 및 CD31 (성숙 내피 세포)에 대해 강력한 양성을 나타내며 또한 CD40 및 CD63에 대해서 양성으로서, 이는, 내피 세포 타입으로 결정된 표현형 특정화와 일치한다. 본원에 개시된 데이터는, 임상적 사용을 위해 용이하게 팽창된 내피 ADAS로부터 CD34+, CD31+ 전-내피 세포 다수를 생성하기 위한, 본원에 개시된 방법의 사용 가능성을 제시한다. 또한 본원의 발견은, 내피 세포 마커 양성인 표현형을 유도하기 위해 본원에 기재한 처리법을 사용하여 대규모 환경에서 내피 ADAS 세포를 팽창하고 전-내피 세포를 제조함에 있어 매력적인 접근을 가능하게 한다. 나아가, CD40 및 CD80 (보다 적은 양으로)과 함께 CD34가, 처리된 ADAS 세포 상에서 발현되는 것은 조혈 전구체를 또한 유도 가능함을 시사한다.
본원에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개물의 내용은, 그 전체가 본원에 참조로 편입된다.
본 발명이 특정 구현을 참조로 기술되었으나, 본 발명의 다른 구현 및 변형이, 본 발명의 참 정신 및 범위를 벗어나지 않고도 당업자에 의해 고안 가능함이 명백하다. 첨부된 청구항들은, 그러한 구현 및 균등 변형 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (32)

  1. 전(pre)-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도된 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 시험관내에서 분화하도록 유도된 세포.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 생체내에서 분화하도록 유도된 세포.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 내로 외래 유전 물질이 도입된 세포.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 인간으로부터 유래된 세포.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가 CD34 및 CD31 중 하나 이상을 발현하는 세포.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가, 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도되지 않았으나 다른 면에서는 동일한 ADAS 세포의 CD34 및 CD31 각각의 발현 수준과 비교하여, CD34 및 CD31 하나 이상을 높은 수준으로 발현하는 세포.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가, CD34, CD31, CD40, CD63의 하나 이상 또는 그 조합을 발현하는 세포.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포가, 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 유도되지 않았으나 다른 면에서는 동일한 ADAS 세포의 CD34, CD31, CD40 및 CD63 각각의 발현 수준과 비교하여 CD34, CD31, CD40, CD63의 하나 이상 또는 그 조합을 높은 수준으로 발현하는 세포.
  10. 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 분화하는 방법으로, 상기 세포를 MII 배지 내에서 인큐베이션하고 이후 상기 세포를 MIII 배지에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 세포가 인간으로부터 유래된 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 MII 배지가 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF)를 포함하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 글루타민 농도가 약 2.3 mM인 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 FGF 농도가 약 10 ng/mL인 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 MIII 배지가 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민, 니코틴아미드 및 소 태아 혈청 (FBS)를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 글루타민 농도가 약 2.3 mM인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 니코틴아미드 농도가 약 10 mM인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 FBS 농도가 약 2%인 방법.
  19. 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 세포로 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 분화시키기 위한 분화 배지로, 상기 배지가 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민 및 섬유아세포 성장 인자 (FGF)로 보충되며, 나아가 상기 배지가 MII 배지로 표시되는 분화 배지.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 글루타민 농도가 약 2.3 mM인 배지.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 FGF 농도가 약 10 ng/mL인 배지.
  22. 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 나타내는 세포로 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 분화시키기 위한 분화 배지로, 상기 배지가 N2 보충제, B27 보충제, 글루타민, 니코틴아미드 및 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충되며, 나아가 상기 배지가 MIII 배지로 표시되는 분화 배지.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 글루타민 농도가 약 2.3 mM인 배지.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 니코틴아미드 농도가 약 10 mM인 배지.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 FBS 농도가 약 2%인 배지.
  26. a) 전-내피 세포의 특성 하나 이상을 발현하도록, 단리된 지방 조직 유래 성인 스트로마 (ADAS) 세포를 유도하고; 그리고
    b) 상기 유도된 세포를 동물에게 투여하는,
    과정을 포함하는 동물 내에서의 맥관신생을 유도하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 상기 동물로부터 단리되는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 동종 공여자로부터 단리되는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 이종 공여자로부터 단리되는 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 ADAS 세포가 인간으로부터 유래된 방법.
  31. 하기 과정을 포함하는, 전-내피 세포 및/또는 내피 세포로의 단리된 지방 조직 유래 스트로마 (ADAS) 세포의 분화에 영향을 미치는 화합물의 능력을 측정하는 방법:
    a) 상기 ADAS 세포를 일정 시간 동안 스트로마 세포 배지 내에서 배양하고;
    b) 상기 스트로마 세포 배지를 화합물 또는 대조군 부형제 함유 분화 배지로 대체하고;
    c) 일정 시간 동안 상기 화합물 또는 상기 대조군 부형제 함유 상기 분화 배지 내에서 상기 ADAS 세포를 인큐베이션하고;
    d) 단계 (c)로부터의 상기 화합물 함유 상기 분화 배지를 사용하여 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
    e) 단계 (c)로부터의 상기 부형제만을 함유한 상기 분화 배지를 사용하여 세포 중 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 측정하고;
    f) 단계 (d) 및 (e)로부터의 분화된 세포의 개수 또는 백분율을 비교하고;
    g) 단계 (e)에서 분화된 세포의 개수 또는 백분율과 비교하여 단계 (d)에서 분화된 세포의 개수 또는 백분율이 더 큰 것은, 상기 화합물이 상기 ADAS 세포를 전-내피 세포 및/또는 내피 세포로 분화 유도 가능함을 나타내는 것으로 판단한다.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 세포가 인간으로부터 유래된 방법.
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