CN101155912A - 显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞 - Google Patents

显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN101155912A
CN101155912A CNA2006800109281A CN200680010928A CN101155912A CN 101155912 A CN101155912 A CN 101155912A CN A2006800109281 A CNA2006800109281 A CN A2006800109281A CN 200680010928 A CN200680010928 A CN 200680010928A CN 101155912 A CN101155912 A CN 101155912A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
adas
substratum
endothelium
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800109281A
Other languages
English (en)
Inventor
詹姆斯·K·亨德里克斯
詹姆斯·B·米切尔二世
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cognate Bioservices Inc
Original Assignee
Cognate Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cognate Therapeutics Inc filed Critical Cognate Therapeutics Inc
Publication of CN101155912A publication Critical patent/CN101155912A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明包括脂肪来源的成年基质(ADAS)细胞，其显示出前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征。本发明还包括用于产生显示出前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的脂肪来源的成年基质的组合物和方法。还包括在血管移植、组织改造、血管生成的调节、血管发生和包括心脏病的多种病症的治疗中使用所述细胞的方法。

Description

显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞
发明背景
人的发育中新生儿期的特征是存在“干”细胞，其具有沿着多种分化途径发育的潜力。这些细胞的最终分化由协调器官发生和组织结构的细胞因子和激素信号决定。已经分离并在体外和体内广泛研究了来自小鼠的胚胎干(ES)细胞。使用外源体外刺激，研究人员已经诱导了ES细胞沿着多种谱系途径分化。这些途径包括神经元的、B谱系淋巴样的和脂肪细胞的途径(Dani，等人，1997，J.Cell Sci.110：1279；Remoncourt，等人，1998，Mech.Dev.79：185；O′Shea，1999，Anat.Rec.257：32)。
在成年生物的组织中也存在多能干细胞。成年干细胞的最详细表征的实例是从骨髓和外周血分离的造血祖细胞。不治疗时，致死辐射的小鼠死亡，因为它们不能补充它们的循环血细胞；然而，来自同源的供体动物的骨髓细胞的移植拯救了宿主动物。供体细胞负责恢复循环的血细胞。自那以后已经进行了研究来阐明未分化的造血干细胞能够在宿主动物中再生不同的血细胞谱系。这些研究已经提供了骨髓移植的基础：癌症和先天性代谢缺陷的广泛接受的治疗形式。
已经发现来自骨髓的细胞能够分化成其他细胞类型。骨髓含有至少两种类型的干细胞：造血干细胞和非造血组织的干细胞，其被不同地称作充质干细胞或者髓基质细胞(MSCs)或者骨髓基质细胞(BMSCs)。这些术语在本文全文同义使用。MSC是重要的，因为它们容易从骨髓的吸出物分离，并且它们容易产生单细胞来源的集落。单细胞来源的集落可以在约10周内增殖多达50群体倍增数，并且可以分化成成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(Friedenstein，等人，1970，Cell Tissue Kinet.3：393-403；Castro-Malaspina，等人，1980，Blood 56：289-301；Beresford，等人，1992，J.Cell Sci.102：341-351；Prockop，1997，Science 276：71-74)、肌细胞(Wakitani，等人，1995，Muscle Nerve 18：1417-1426)、星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元(Azizi，等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913；Kopen，等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10711-10716；Chopp，等人，2000，Neuroreport II，3001-3005；Woodbury，等人，2000，Neuroscience Res.61：364-370)。
此外，MSC产生所有三个胚层的细胞(Kopen，等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.96：10711-10716；Liechty，等人，2000，Nature Med.6：1282-1286；Kottonet，等人，2001，Development 128：5181-5188；Toma，等人，2002，Circulation 105：93-98；Jiang，等人，2002，Nature 418：41-49)。体内证据表明未分级分离的骨髓衍生的细胞以及MSC的纯群体产生上皮细胞类型，包括肺的上皮细胞类型(Krause，等人，2001，Cell 105：369-377；Petersen，等人，1999，Science 284：1168-1170)，并且几个最近的研究已经表明通过组织损伤增强MSC的移入(Ferrari，等人，1998，Science 279：1528-1530；Okamoto等人，2002，Nature Med.8：1101-1017)。因为这些原因，当前正在测试MSC在许多人类疾病的细胞和基因治疗中的潜在用途(Horwitz，等人，1999，Nat.Med.5：309-313；Caplan，等人，2000，Clin.Orthoped.379：567-570)。
MSC组成了多能干细胞的备选来源。在生理条件下，它们保持骨髓的结构并且分别在不同细胞黏附分子的帮助下调节造血作用和细胞因子的分泌(Clark，等人，1995，Ann.NY Acad.Sci.770：70-78)。通过选择性附着到组织培养塑料制品从骨髓长出的MSC可以有效扩增(Azizi，等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913；Colter，等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3213-218)并且可以在遗传上操作(Schwarz，等人，1999，Hum.Gene Ther.10：2539-2549)。
MSC也称作充质干细胞，因为它们能够分化成多种中胚层组织，包括骨(Beresford，等人，1992，J.Cell Sci.102：341-351)、软骨(Lennon，等人，1995，Exp.Cell Res.219：211-222)、脂肪(Beresford，等人，1992，J.Cell Sci.102：341-351)和肌肉(Wakitani，等人，1995，Muscle Nerve 18：1417-1426)。此外，已经报导了向表达神经元标记的神经元样细胞的分化。(Woodbury，等人，2000，J.Neurosci.Res.61：364-370；Sanchez-Ramos，等人，2000，Exp.Neurol.164：247-256；Deng，等人，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.282：148-152)，提示MSC能够克服胚层定向。基于这些发现，已经提出骨髓作为基质干细胞的来源用于再生骨、软骨、肌肉、脂肪组织、肝脏、神经元和其他组织。然而，提取骨髓基质细胞代表对供体的高水平的风险和不适。
相反，成人髓外脂肪组织衍生的基质细胞(ADAS)代表了基质干细胞来源，其可以常规地收获，对患者有最小的风险或者不适。病理学证据提示脂肪衍生的基质细胞能够沿着多种谱系途径分化。此外，已经阐明来自脂肪组织的基质细胞能够分化成多种中胚层组织。
血管发生是称作成血管细胞的原始内皮祖细胞原位分化成聚集成初级毛细血管丛的内皮细胞，负责胚胎发生期间血管系统的发育(Peichev，等人，2000，Blood 95：952-958)。相反，血管生成定义为通过从先前存在的血管萌发的过程形成新血管，在发育和出生后生命期间都发生(Peichev，等人，2000，Blood 95：952-958；Watt，等人，1995，Leuk.Lymphoma 17：229-235；Reyes，等人，2001，Blood 98：2615-2625)。直到最近都认为出生后生命中血管形成通过从现有血管的内皮细胞萌发介导。然而，最近的研究已经表明内皮干细胞可以持续到成年生命，在成年生命中，它们促进新血管形成(Nishikawa，等人，1998，Development 125：1747-1757；Gehling，等人，2000，Blood 95：3106-3112；Rafii，等人，1994，Blood 84：10-18；Asahara，等人，1997，Science 275：964-967)。这又提示由于在发育期间，成体中新血管生成至少部分依赖于血管发生过程。已经从骨髓和外周血分离了内皮细胞的前体(Peichev，等人，2000，Blood 95：952-958；Watt，等人，1995，Leuk.Lymphoma 17：229-235)。这些内皮祖细胞的个体发育还未知。
因此，需要用于可以产生内皮细胞的祖细胞的容易得到的来源的分离和增殖方法。当前的用于培养和得到大量内皮祖细胞的方法还没有成功。大量内皮祖细胞的可得性将在血管移植、组织改造、血管生成的调节、血管发生和包括心脏病的多种病症的治疗中非常有用。
因此，长期以来一直需要用于标准化培养条件的方法和组合物，其用于使得到大量用于治疗和实验目的的此类细胞的内皮祖细胞的增殖最大化。本发明满足了这些需求。
发明简述
本发明包括用于产生显示出前内皮细胞(pre-endothelial cell)和/或内皮细胞的至少一种特征的脂肪来源的成年基质(ADAS)细胞的组合物和方法。
一方面，诱导ADAS细胞在体外分化。
另一方面，诱导ADAS细胞在体内分化。
再一方面，已经改造ADAS细胞以表达外源遗传物质。
再一方面，ADAS细胞来自人。
本发明还包括被诱导以表达CD34和CD31的至少一种的ADAS细胞。
一方面，当分别与来自其他方面相同的、没有被诱导表达前内皮细胞的至少一种特征的ADAS细胞的CD34和CD31的表达水平相比时，ADAS细胞以更高水平表达CD34和CD31的至少一种。
另一方面，ADAS细胞表达CD34、CD31、CD40、CD63，或者其组合的至少一种。
再一方面，当分别与来自其他方面相同的、没有被诱导表达前内皮细胞的至少一种特征的CD34、CD31、CD40和CD63的表达水平相比时，ADAS细胞以更高水平表达CD34、CD31、CD40、CD63，或者其组合的至少一种。
本发明还包括分化ADAS细胞以表达前内皮细胞的至少一种特征的方法，该方法包括将所述细胞在MII培养基中温育，接着在MIII培养基中温育所述细胞。
一方面，该方法包括使用来自人的ADAS细胞。
另一方面，MII培养基包含N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺和成纤维细胞生长因子(FGF)。
再一方面，MII培养基中谷氨酰胺的浓度约为2.3mM。
再一方面，MII培养基中FGF的浓度约为10ng/mL。
一方面，MIII培养基包含N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺，烟酰胺和胎牛血清(FBS)。
另一方面，MIII培养基中谷氨酰胺的浓度约为2.3mM。
再一方面，MIII培养基中烟酰胺的浓度约为10mM。
再一方面，MIII培养基中FBS的浓度约为2％。
本发明还包括在动物中诱导血管发生的方法，该方法包括a)诱导分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞以表达前内皮细胞的至少一种特征；和b)对所述动物施用所述这样诱导的细胞。
一方面，ADAS细胞是动物自体的。
另一方面，ADAS细胞从同种异体供体分离。
另一方面，ADAS细胞从异种供体分离。
再一方面，ADAS细胞来自人。
本发明还包括确定化合物实现ADAS细胞分化成前内皮细胞和/或内皮细胞的能力的方法，该方法包括：
a)在基质细胞培养基中培养所述ADAS细胞一段时间；
b)将所述基质细胞培养基用包含化合物或者对照载体的分化培养基更换；
c)在包含所述化合物或所述对照载体的所述分化培养基中培养所述ADAS细胞一段时间；
d)使用来自步骤c)的包含所述化合物的所述分化培养基确定分化细胞的数目或者百分数；
e)使用来自步骤c)的仅含有所述载体的所述分化培养基确定细胞中分化细胞的百分数；
f)比较来自步骤(d)和(e)的分化细胞的数目或者百分数；
g)与来自步骤(e)的分化细胞的百分数相比，来自步骤(d)的分化细胞的更大的百分数表明所述化合物能够诱导所述ADAS细胞分化成前内皮细胞和/或内皮细胞。
一方面，ADAS细胞来自人。
附图简述
为了阐明本发明的目的，在附图中描绘了本发明的一些实施方案。然而，本发明不限于附图中描绘的实施方案的精确安排和手段。
图1包含图1A到1F，是一系列描绘未处理的和用MII/MIII处理的ADAS培养物的图像。图1A和IB分别描绘了预处理的和未处理的对照ADAS培养物。图1C和1D描绘了用MII处理的ADAS培养物。图1E和1F描绘了用MIII处理的ADAS培养物。
发明详述
本发明提供了用于诱导脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的组合物和方法。通过本发明的方法产生的细胞提供了功能细胞的来源，所述功能细胞可以用于研究、移植和开发组织改造产物用于治疗疾病和组织修复。
定义
如本文所用的，下面每一个术语具有与它在该部分中相关的含义。
本文使用的冠词“一个”和“一种”指一个或一个以上(即至少一个)该冠词的语法对象。例如，“一个组分”指一个或一个以上的组分。
术语“约”将被本领域普通技术人员理解并且将在它使用的上下文中有一定的不同。
本文使用的术语“脂肪来源的基质细胞”、“脂肪组织来源的基质细胞”或者“脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞”可以互换使用并且指来自脂肪组织的基质细胞，其可以用作到多种不同的细胞类型，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的干细胞样前体。
“脂肪”指任一种脂肪组织。脂肪组织可以是褐色或者白色的脂肪组织。优选地，脂肪是皮下白色脂肪组织。此类细胞可以包含原代细胞培养物或者永生化的细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任一种生物。优选地，脂肪组织是哺乳动物的、最优选脂肪组织是人的。人脂肪组织的方便的来源是来自脂肪抽吸外科手术。然而，脂肪组织的来源或者分离脂肪组织的方法对于本发明不是关键的。
“同种异体的”指来自相同物种的不同动物的移植物。
本文使用的“同种异体的脂肪来源的成年基质细胞”从与受体相同的物种的不同个体得到。
“同种异体抗原”是与受体表达的抗原不同的抗原。
“供体抗原”指由待移植到受体的供体组织表达的抗原。
本文使用的“效应细胞”指介导针对抗原的免疫应答的细胞。在移植物被导入受体的情况下，效应细胞可以是受体自身的细胞，其引起针对供体移植物中存在的抗原的免疫应答。在另一情况下，效应细胞可以是移植物的部分，其中移植物向受体的导入导致移植物中存在的效应细胞引起针对移植物的受体的免疫应答。
本文使用的术语“自体的”意指来自相同个体的任何物质，其以后再次被导入该个体中。
本文使用的术语“血管生成”指从现有的血管系统和组织产生新血管的过程(Folkman，1995，Nat.Med.1：37-31)。短语“修复或者重塑”指现有血管系统的再形成。组织局部缺血的减轻严重依赖于血管生成。新血管的自发生长提供了局部缺血区中和周围的侧支循环，改善了血流，并减轻了局部缺血导致的症状。
本文使用的术语“血管生成因子”或“血管生成蛋白”指能够促进从现有的血管系统生长新血管(“血管生成”)的任何已知的蛋白质。用于本发明的合适的血管生成因子包括，但不限于，胎盘生长因子、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、神经毡蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、血管生成素1、血管生成素2、红细胞生成素(EPO)、骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-7、TGF-β、IGF-1、骨桥蛋白、多效营养因子、激活蛋白、内皮缩血管肽-1和其组合。血管生成因子可以独立地作用，或者相互组合作用。当组合时，血管生成因子还可以协同作用，其中因子的组合作用大于单独施用的个体因子的作用之和。术语“血管生成因子”或者“血管生成蛋白”还包括此类因子的功能类似物。功能类似物包括例如，因子的功能部分。功能类似物还包括抗独特型抗体，其结合因子的受体并从而在促进血管生成和/或组织重塑中模拟所述因子的活性。用于产生此类抗独特型抗体的方法是本领域中公知的并且例如在WO 97/23510中描述，将其内容引入本文作为参考。
本文使用的“血管生成因子”可以从任何合适的来源产生或者得到。例如，因子可以从它们的天然来源纯化，或者合成产生或者通过重组表达产生。因子可以作为蛋白质组合物施用于患者。因子可以以编码该因子的表达质粒的形式施用。合适的表达质粒的构建是本领域中公知的。用于构建表达质粒的合适的载体包括例如，腺病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、RNA载体、脂质体、阳离子脂质、慢病毒载体和转座子。
本文使用的术语“生物相容的网格”意指可以促进形成有助于组织发育的三维结构的基质。因此，例如，可以在这种生物相容的网格上培养或接种细胞，所述网格为诸如包括细胞外基质物质、合成聚合物、细胞因子、生长因子等等的网格。该网格可以成型成希望的形式用于促进组织类型的发育。而且，至少在细胞培养期间的早期，对培养基和/或基质补充促进合适的组织类型和结构发育的因子(例如，生长因子、细胞因子、细胞外基质物质，等等)。
“分化的”在本文中用于指实现了成熟的最终状态的细胞，从而该细胞已经完全发育并且显示出生物学特化和/或适应于特定环境和/或功能。通常，分化细胞的特征是在给定细胞中表达编码分化的相关蛋白质的基因。例如，内皮细胞标志CD31和血管性血友病因子的表达和“鹅卵石”形态的形成是分化的成熟内皮细胞的典型实例。当说细胞是“分化的”时，如该术语在本文使用的，细胞处于分化的过程中。
“分化培养基”在本文用于指细胞生长培养基，其包含添加剂或者缺少添加剂，从而当在培养基中培养时不完全分化的干细胞、脂肪来源的成年基质细胞或其他此类祖细胞发育成具有分化细胞的一些或者全部特征的细胞。
“内皮ADAS细胞”在本文中用于指表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的ADAS细胞。
“可扩展性(expandability)”在本文中用于指细胞增殖的能力，例如，数目扩大或者对于细胞群体的情况，经历群体加倍。
“移植物”指用于移植的细胞、组织、器官或者任何生物相容的网格。
所谓“生长因子”意指下面的特定因子，包括但不限于，生长激素、红细胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、护骨蛋白配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)和骨形态发生蛋白，其浓度为皮克/ml到毫克/ml水平之间。
如本文使用的术语“生长培养基”意指促进细胞生长的培养基。生长培养基将通常含有动物血清。在一些情况中，生长培养基可以不含有动物血清。
如本文使用的术语“多能的”或者“多能”意指中枢神经系统的干细胞能够分化成一种以上类型的细胞。
“增殖”在本文中用于指特别是细胞的类似形式的繁殖或者增殖。即，增殖包括产生更大数目的细胞，并且可以通过特别是简单地计数细胞数、测量3H胸苷向细胞的掺入等等测量。
术语“前体细胞”、“祖细胞”和“干细胞”在本领域中和本文中可互换使用，并且指多能的或者谱系未定型(uncommitted)的祖细胞，其潜在能够不限次数进行有丝分裂以自我更新或者产生子代细胞，该子代细胞将分化成例如内皮细胞或者内皮样细胞；或者谱系定型(committed)的祖细胞和它的子代，该子代能够自我更新并且能够分化成内皮细胞或者内皮样细胞。不像多能干细胞，谱系定型的祖细胞通常被认为不能产生表型上相互不同的多种细胞类型。实际上，祖细胞产生一种或者可能两种谱系定型的细胞类型。
术语“前内皮细胞”指潜在能够不限次数有丝分裂以自我更新或者产生将分化成内皮细胞或者内皮样细胞的子代细胞的细胞。
本文使用的术语“基质细胞培养基”指用于培养ADAS细胞的培养基。通常，基质细胞培养基包含基本培养基、血清和抗生素/抗真菌剂。然而，可以用没有抗生素/抗真菌剂并且补充至少一种生长因子的基质细胞培养基培养ADAS细胞。优选地，生长因子是人表皮生长因子(hEGF)。hEGF的优选浓度为约1-50ng/ml，更优选浓度为约5ng/ml。优选的基本培养基是DMEM/F12(1∶1)。优选的血清是胎牛血清(FBS)，但是可以使用其他血清，包括胎牛血清(FCS)、马血清或者人血清。优选向上面的培养基加入多达20％FBS以便支持基质细胞的生长。然而，如果鉴定了用于基质细胞生长的FBS中的必要的生长因子、细胞因子和激素并且在生长培养基中以合适的浓度提供，那么可以使用确定成分的培养基。还认识到可以向培养基中加入额外的组分。此类组分包括但不限于，抗生素、抗真菌剂、白蛋白、生长因子、氨基酸和本领域中已知的用于细胞培养的其他组分。可以加入培养基的抗生素包括但不限于，青霉素和链霉素。培养基中青霉素的浓度为约10到约200单位/ml。培养基中链霉素的浓度为约10到约200μg/ml。然而，本发明决不应被理解为局限于用于培养基质细胞的任一种培养基。而是，可以使用能够支持组织培养中基质细胞的任何培养基。
“MII/MIII培养基方案”指将ADAS细胞用MII培养基培养，接着将细胞用MIII培养基培养。
“移植物”指将被移植的生物相容的网格或者供体组织、器官或者细胞。
本文使用的“治疗有效量”是表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的ADAS细胞的量，其足够为该细胞所施用的受试者提供有益效果。
“异源的”指来自不同物种的动物的移植物。
本文使用的“内源的”指来自或者在生物、细胞或者系统中产生的任何物质。
“外源的”指从生物、细胞或者系统外面导入或者产生的任何物质。
“编码”指多核苷酸，如基因、cDNA或者mRNA中核苷酸的特定序列的内在性质，其作为合成模板用于在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或者确定的氨基酸序列，和从其得到的生物学性质的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或者其他生物系统中产生蛋白质，那么该基因编码蛋白质。编码链，即与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的核苷酸序列和用作基因或者cDNA的转录模板的非编码链二者都可以称作编码该基因或者cDNA的蛋白质或者其他产物。
除非另外指出，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括相互为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
“分离的核酸”指核酸区段或者片段，其已经与天然存在状态下处于它的侧翼的序列分离，该序列为例如，已经从通常与该片段相邻的序列除去的DNA片段，例如，与它天然存在的基因组中与该片段相邻的序列。该术语还应用于已经从天然伴随该核酸的其他组分基本上纯化的核酸，例如，在细胞中天然伴随该核酸的RNA或者DNA或者蛋白质。因此，该术语包括例如，重组DNA，其掺入载体中、掺入自主复制的质粒或者病毒中，或者掺入原核或者真核生物的基因组DNA中，或者作为单独的分子(例如，作为cDNA或者基因组或者通过PCR或者限制酶消化产生的cDNA片段)独立于其他序列存在。它还包括作为编码额外的多肽序列的杂种基因的部分的重组DNA。
在本发明上下文中，为通常使用的核酸碱基使用下面的缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，“U”指尿苷。
“载体”是物质的组合物，其包含分离的核酸并且可以用于递送分离的核酸到细胞内部。许多载体是本领域中已知的，包括但不限于，线性多核苷酸、与离子或者两亲性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或者病毒。该术语将还可以被解释成包括非质粒和非病毒化合物，其促进核酸转移到细胞中，如例如聚赖氨酸化合物、脂质体，等等。病毒载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等等。
“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含可操作连接于待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或者在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中已知的所有那些表达载体，如掺入重组多核苷酸的黏粒、质粒(例如，裸露的或者包含在脂质体中的)和病毒。
描述
脂肪组织提供了骨髓的替代物作为干细胞的来源。脂肪组织容易获得并且在许多个体中很丰富。来自脂肪组织的干细胞可以通过脂肪抽吸法收获，所述脂肪抽吸法是相对非侵入性的过程并且可以产生大量脂肪来源的成年基质(ADAS)细胞。
本发明涉及发现ADAS细胞可以用成分确定的培养基处理以表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征。这些细胞在本文中称作“内皮ADAS细胞”。因此，基于本文的公开内容，可以产生和扩增表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征而保留它们分化成成熟内皮细胞的能力的内皮ADAS细胞的大群体。同样地，本发明包括用于产生大量用于实验/治疗目的的内皮ADAS细胞的组合物和方法。
I.ADAS的分离和培养
可以通过本领域技术人员已知的多种方法分离本发明的方法中使用的ADAS细胞。例如，此类方法在美国专利号6,153,432中描述，将该专利完整引入本文。在优选方法中，从哺乳动物受试者、优选人类受试者分离ADAS细胞。在人中，通常从脂肪抽吸法材料分离ADAS细胞。如果本发明的细胞将移植到人类受试者，那么优选从相同的受试者分离ADAS细胞以便提供自体移植物。
在本发明的另一方面，施用的ADAS细胞可以对于受体是同种异体的。同种异体的ADAS细胞从作为与受体相同物种的不同个体的供体分离。分离后，用本文公开的方法培养细胞以产生同种异体产物。本发明还包括对于受体是异源的ADAS细胞。
不以任何方式限制本发明，可以使用本文公开的方法从脂肪组织分离基质细胞。简言之，通过脂肪抽吸外科手术从皮下储存的脂肪移去人脂肪组织。然后将该脂肪组织从吸脂杯转移到500ml无菌烧杯中并允许静置约10分钟。通过抽吸除去沉淀的血液。将约125ml体积(或更少)的组织转移到250ml离心管中，并接着将管用Krebs-Ringer缓冲液充满。让组织和缓冲液静置约3分钟或者直到实现明显分离，然后通过抽吸除去缓冲液。可以将组织用Krebs-Ringer缓冲液另外洗涤4到5次或者直到组织颜色变成橙黄色和直到缓冲液颜色变成淡褐色。
使用胶原酶处理可以解离脂肪组织的基质细胞。简言之，从组织除去缓冲液并用约2mg胶原酶/ml Krebs缓冲液(Worthington，ME)溶液以1ml胶原酶溶液/ml组织的比例更换。将管在37℃水浴温育约30到35分钟，间断摇动。
通过室温下以500×g离心5分钟从脂肪组织的其他成分分离基质细胞。通过抽吸除去油和脂肪细胞层。可以将剩余的级分通过剧烈回荡重悬浮在约100ml磷酸缓冲盐水(PBS)中，分到50ml管中并以500×g离心5分钟。通过抽吸除去缓冲液，留下基质细胞。然后将基质细胞重悬浮在基质细胞培养基中，并以合适的细胞密度平板接种并在37℃下5％CO2中过夜温育。一旦附着到组织培养皿或者瓶上，可以立即使用培养的基质细胞或者保持培养一段时间或者多次传代后诱导分化成希望的细胞，例如，如实施例部分中描述的表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的细胞。然而，决不应将本发明理解为局限于任一种分离基质细胞的方法。相反，分离ADAS细胞的任一种方法都应该包括在本发明内。
能够支持细胞培养物中成纤维细胞生长的任何培养基可以用以培养ADAS。支持成纤维细胞生长的培养基制剂包括，但不限于，Eagle极限必需培养基、ADC-1、LPM(无牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有和没有Fitton-Jackson改良的)、Eagle基础培养基(BME，加入Earle盐碱)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，无血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良的Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5A培养基、培养基M199(M199E-具有Earle盐碱)、培养基M199(M199H-具有Hank盐碱)、Eagle极限必需培养基(MEM-E-具有Earle盐碱)、Eagle极限必需培养基(MEM-H-具有Hank盐碱)和Eagle极限必需培养基(MEM-NAA，具有非必需氨基酸)、等等。用于培养ADAS的优选培养基是DMEM，更优选DMEM/F12(1∶1)。
用于本发明方法中的培养基的另外的非限制性实例可以含有牛或者其他物种的胎儿血清，其浓度为至少1％到约30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％。鸡或者其他物种的胚胎提取物可以以约1％到30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％的浓度存在。
分离后，将ADAS细胞在培养装置中基质细胞培养基中培养一段时间或者直到细胞达到汇合，然后细胞进入另一个培养装置。培养装置可以是通常用于体外培养细胞的任何培养装置。优选的培养装置是培养瓶，更优选的培养装置是T-225培养瓶。ADAS细胞可以用基质细胞培养基培养，所述基质细胞培养基没有抗生素/抗真菌剂并且补充至少一种生长因子。优选地，生长因子是人表皮生长因子(hEGF)。hEGF的优选浓度为约1-50ng/ml，更优选地浓度为约5ng/ml。
可以在补充hEGF、不存在抗生素/抗真菌剂的基质细胞培养基中培养ADAS细胞一段时间或者直到细胞达到一定的汇合水平。优选地，汇合水平大于70％。更优选地，汇合水平大于90％。一段时间可以是适于在体外培养细胞的任何时间。在ADAS细胞培养期间的任何时间可以更换基质细胞培养基。优选地，每3到4天更换基质细胞培养基。然后从培养装置收获ADAS细胞，其中可以立即使用ADAS细胞或者冷藏贮存以在以后的时间使用。通过胰蛋白酶消化、EDTA处理或者用于从培养装置收获细胞的任何其他步骤收获ADAS细胞。
II.ADAS细胞的处理
本发明包括处理ADAS细胞以诱导它们表达前内皮和/或内皮细胞的至少一种特征(这些细胞称作内皮ADAS细胞)。尽管不希望被任何具体理论束缚，认为用含有血清、胚胎提取物，优选非人胚胎提取物、纯化的或者重组生长因子、细胞因子、激素、和/或化学剂的组合的确定成分培养基，在二维或者三维生物相容的网格中处理ADAS细胞以诱导ADAS细胞分化。
MII培养基：
新鲜分离的或者冷藏的ADAS细胞可以用于用分化培养基进行下面的处理以便诱导ADAS细胞来显示前内皮和/或内皮细胞的至少一种特征。在任一生长培养基，例如包含DMEM/F12(1∶1)、10％FBS、5ng/mL hEGF和1ng/mL hFGF的培养基中培养未处理的ADAS细胞以便比较用分化培养基处理其他方面相同的ADAS细胞的效果。例如，可以用包含DMEM/F12、N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺和FGF的MII培养基培养治疗组中的ADAS细胞。在本发明的一个实施方案中，MII培养基不含有血清。
优选地，MII培养基中谷氨酰胺的浓度为至少0.5mM到约25mM，优选至少约1mM到20mM，更优选地，至少约1.5mM到15mM，甚至更优选地至少约1.5mM到10mM，最优选地至少约2mM到5mM。在本发明的一方面，谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
MII培养基中hFGF的浓度为至少0.5ng/mL到约100ng/mL，优选至少约1ng/mL到75ng/mL、更优选至少约1.5ng/mL到50ng/mL、甚至更优选至少约2ng/mL到25ng/mL、最优选至少约3ng/mL到15ng/mL。在本发明的一方面，MII培养基中hFGF的浓度为约10ng/mL。
可以用MII培养基处理ADAS细胞一段时间，该段时间足以改变ADAS的表型/形态以显示出前内皮和/或内皮细胞的至少一种特征。优选地，ADAS细胞进行逐步处理方案，最初以MII培养基起始处理约6天，在第1、3和5天用MII培养基更换培养基，接着开始平板接种。基于本公开内容，本领域技术人员将明白可以用MII培养基处理ADAS细胞多于6天，例如，可以处理ADAS细胞约一周、两周、一个月、两个月、或者甚至六个月；并且在处理期间任一时间可以改变MII培养基。
将ADAS细胞在MII培养基中培养一段时间或者直到细胞达到一定的汇合水平。优选地，汇合水平大于70％。更优选地，汇合水平大于90％。细胞在MII培养基中培养的时间可以是适合在体外培养细胞的任何时间。
不希望被任何具体理论束缚，认为用MII培养基处理ADAS细胞改变ADAS细胞的表型和形态。例如，当与未处理的或者预处理的ADAS细胞比较时，用MII培养基处理ADAS细胞显示出较少的成纤维细胞形态并且形态上更圆，形成细胞一细胞连接的网络。
用MII培养基处理ADAS细胞后，可以收获ADAS细胞立即用于实验/治疗用途或者冷藏以在以后的时间使用。在本发明的一方面，用MII培养基处理的ADAS细胞用如下面更充分描述的MII培养基进一步处理。
MIII培养基：
用MII培养基处理ADAS细胞后，可以用MIII培养基进一步处理细胞，所述MIII培养基包含DMEM/F12、N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺、烟酰胺、FBS。MII后用MIII培养基处理ADAS细胞也称作MII/MIII培养基。不希望被任何具体理论束缚，认为用MII培养基处理ADAS细胞后用MIII培养基处理ADAS细胞进一步使细胞向内皮谱系分化。用MII处理和使用PBS的洗涤步骤后通常接着进行用MIII培养基处理ADAS细胞。使用PBS的洗涤步骤用于从细胞培养物除去MII培养基的组分，然后用MIII培养基培养ADAS细胞。然而，本发明将不限于用MII培养基处理ADAS后用MIII培养基处理ADAS细胞。本发明将包括在任何时间使用MIII培养基以使ADAS细胞向内皮谱系分化。
优选地，MIII培养基中谷氨酰胺的浓度为至少0.5mM到约25mM，优选至少约1mM到20mM，更优选至少约1.5mM到15mM，甚至更优选至少约1.5mM到10mM，最优选地至少约2mM到5mM。在本发明的一方面，谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
MIII培养基中烟酰胺的浓度为至少0.5mM到约100mM，更优选至少约1mM到75mM，更优选至少约1.5mM到50mM，甚至更优选至少约2mM到25mM，最优选至少约3mM到15mM。在本发明的一方面，MIII培养基中烟酰胺的浓度为约10mM。
MIII培养基中FBS的浓度为至少0.5％到约20％，优选至少约0.75％到15％，更优选至少约1％或10％，甚至更优选至少约1.5％到7.5％，更优选至少约1.75％到5％。在本发明的一方面，MIII培养基中FBS的浓度为约2％。
可以用MIII培养基处理ADAS细胞一段时间，该时间足以改变每种细胞类型的表型以显示出前内皮和/或内皮细胞的至少一种特征。优选地，ADAS细胞用MIII培养基处理约4天。基于本公开内容，本领域技术人员将理解可以用MIII培养基处理细胞任一段时间。例如，可以用MIII培养基处理细胞4天以上(即，可以处理细胞约1周、2周、1个月、2个月或者甚至6个月)。此外，可以用MIII培养基处理细胞少于4天(即，可以处理细胞约1天、2天、或者甚至3天)。可以在处理期间任何时间改变MIII培养基。
将ADAS细胞在MIII培养基中培养一段时间或者直到细胞达到一定水平的汇合。优选地，汇合水平大于70％。更优选地，汇合水平大于90％。在MIII培养基中的时间期限可以是适于体外细胞培养的任何时间。
用MIII培养基处理ADAS细胞进一步改变细胞的表型和形态以显示出前内皮和/或内皮细胞的至少一种特征。当与未处理/预处理的ADAS细胞相比时，用MII培养基接着用MIII培养基处理的ADAS细胞显示出培养细胞的总体形态的改变，例如，产生与在MII处理期间观察到的细胞相似的细胞和与培养的内皮细胞相似的形成“鹅卵石”型区域的细胞的异质混合物。
表征：
在用MII/MIII培养基方案处理细胞期间的任何时间点，可以通过胰蛋白酶消化收获本发明的细胞，并收集用于立即实验/治疗用途或者冷藏用于在以后的时间使用。如本文别处讨论的，MII/MIII培养基方案指用MII培养基培养ADAS细胞，接着用MIII培养基培养细胞。在本发明的一方面，在ADAS细胞的培养或者处理方案期间的任何步骤冷藏细胞。冷藏是本领域中常见的步骤并且如本文使用的包括当前用于冷藏细胞用于将来分析和使用的所有步骤。在另一方面，可以收获细胞并进行流式细胞术以评估细胞表面标记以评估根据治疗方案的细胞的表型的改变。
可以用本领域中多种方法和本文公开的方法的任一种表征ADAS细胞和/或内皮ADAS细胞。通过鉴定指示细胞分化以表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的表面和细胞内蛋白质、基因和/或其他标记，可以表征细胞。这些方法将包括，但不限于，(a)通过细胞表面蛋白如CD80、CD86、CD14、CD45、CD34、CD133、CD90、CD105、HLA-DR、CD63、CD166、I类MHC；CD44、CD73、CD54；CD31、CD13、CD40；CD29、CD49a、CD11、CD44、CD 146的免疫荧光测定法如流式细胞术或者原位免疫染色检测细胞表面蛋白；(b)通过免疫荧光方法，如流式细胞术或者使用特异单克隆抗体的原位免疫染色检测细胞内蛋白质；(c)通过诸如聚合酶链式反应、原位杂交和/或其他印迹分析的方法检测表达mRNAs。
目的细胞的表型标记是本领域技术人员公知的。额外的表型标记不断被公开或者可以不用过度实验鉴定。这些标记的任一种可以用于证实ADAS细胞显示出前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征。谱系特异性表型特征可以包括细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞形态和分泌产物。
内皮细胞特征包括内皮细胞标记如CD29、CD31、CD34、CD54、CD61、CD 62E、CD105、CD144、CD184/CXC4、CD202b和Mad-CAM-1的表达。
本领域普通技术人员根据本公开内容将认识到已知的量热法、荧光、免疫化学、聚合酶链式反应、化学或者放射化学方法可以容易地确定前内皮或内皮细胞特异标记的存在或不存在。
本发明包括温育根据本文公开的方案培养ADAS细胞产生的细胞群体。例如，本发明包括包含内皮ADAS细胞的细胞群体，所述内皮ADAS细胞已经根据MII/MIII培养基方案培养。
在本发明的一方面，内皮ADAS细胞在MII/MIII培养基中培养后至少对于CD34是阳性的，如使用本文公开的方法测量。在另一方面，当与来自不根据MII/MIII培养基方案培养的其他方面相同的ADAS的CD34的表达水平比较时，内皮ADAS细胞以较高水平表达至少CD34。
在本发明的另一方面，内皮ADAS细胞在MII/MIII培养基中培养后至少对于CD34和CD31之一是阳性的。在另一方面，当分别与来自不根据MII/MIII培养基方案培养的其他方面相同的ADAS的CD34和CD31的表达水平比较时，内皮ADAS细胞以较高水平表达CD34和CD31的至少一种。
在本发明的一方面，内皮ADAS细胞至少对于CD34、CD31、CD40、CD63或者其组合的一种是阳性的。在另一方面，当分别与来自不根据MII/MIII培养基方案培养的其他方面相同的ADAS的CD34、CD31、CD40、CD63或者其组合的表达水平比较时，内皮ADAS细胞以较高水平表达CD34、CD31、CD40、CD63或者其组合的至少一种。
本发明还提供了鉴定和研究增强ADAS细胞向表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的细胞分化的化合物的方法。因此，提供了确定化合物影响ADAS细胞向表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的ADAS分化的能力的方法，其包括：
a)在基质细胞培养基中培养ADAS细胞一段时间；
b)用包含化合物或者对照载体的分化培养基更换基质细胞培养基；
c)在包含化合物或者对照载体的分化培养基中培养ADAS细胞一段时间；
d)使用包含来自步骤c)的化合物的所述分化培养基确定分化的细胞的数目或者百分数；
e)使用含有仅来自步骤(c)的所述载体的所述分化培养基确定细胞中分化细胞的百分比数目；
f)比较来自步骤(d)和(e)的分化细胞的数目或者百分数；
g)与来自步骤(e)的分化细胞的百分比数目相比，来自步骤(d)的分化细胞的更大的百分比数目表明所述化合物能够诱导所述ADAS细胞分化成表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的ADAS细胞。
使用ADAS细胞的方法
在根据MII/MIII培养基方案培养ADAS细胞以诱导ADAS细胞表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征后，内皮ADAS细胞可以用于治疗患有与血管发生和/或血管生成中损伤有关的病症或者疾病的患者。本发明包括在使用内皮ADAS细胞用于细胞疗法以改善需要其的患者中血管发生和/或血管生成中的组合物和方法。根据本文的方法产生的内皮ADAS细胞可以用于修复或者替代损伤的/破坏的内皮组织，以改善现有的内皮组织、导入新的或者改变的组织，修饰人工假体，或者连接生物组织或者结构。例如，细胞可以用于替代心瓣膜细胞。此外，细胞可以用于在心肌梗塞后治疗心肌缺血。不希望被任何具体理论束缚，认为内皮ADAS细胞通过调节血管发生和肌发生、心肌细胞程序性细胞死亡和缺血心脏组织中的重塑，促进缺血心肌的再生。
本发明的细胞还可以用于治疗心血管疾病和病症。通过本发明的方法得到的细胞具有几种性质，其可以促进减轻和/或使损伤最少化并促进损伤后心肌或心血管修复和再生。这些性质包括但不限于，合成和分泌刺激新血管形成的生长因子的能力、合成和分泌血管生成因子的能力、合成和分泌刺激细胞存活和增殖的生长因子的能力、增殖和分化成直接参与新血管形成的细胞的能力，和移入损伤的心肌和抑制瘢痕形成(胶原沉积和交联)的能力。
本发明的细胞可以表达在血管形成和血管发育中起作用的多种生血管生长因子，包括但不限于，胎盘生长因子(PGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，支持缺血组织存活，诱导下肢的阻塞/再灌注损伤后的再灌注，当心脏损伤后注射到动物时返回到心脏，和分化成表达标记的细胞，与它们分化成参与血管发生和血管生成的细胞相一致。本领域技术人员将明白本发明的细胞可以在例如四肢、视网膜和心肌中组织缺血后掺入血管生成部位。
本发明还包括使用根据本发明产生的内皮ADAS细胞治疗多种疾病的方法。技术人员基于本文提供的公开内容将理解，再生性药物在治疗多种疾病，包括但不限于局部缺血、心脏病，包括动脉粥样硬化性心血管疾病、冠状动脉疾病、闭塞性动脉病、心肌缺血、周围血管闭塞病等等中的价值和潜力。本发明包括对动物，包括人施用内皮ADAS细胞以便治疗疾病的方法，其中新的、未损伤的细胞的导入将提供某种形式的治疗缓解。
技术人员将容易理解可以对动物施用内皮ADAS细胞，从而当接受来自周围环境的信号和信息时，细胞可以通过周围细胞环境的指导进一步在体内分化成成熟的内皮细胞。在体外分化ADAS细胞以表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的方法在本文中公开，并且可以以本文描述的方式对动物施用内皮ADAS细胞。备选地，内皮ADAS细胞可以进一步在体外分化成更成熟的内皮细胞并且可以对需要其的动物施用成熟的内皮细胞。
可以制备内皮ADAS细胞用于移植以确保在体内环境中长期存活。例如，在用于生长和保持细胞的合适的培养基中增殖细胞并允许其生长至汇合。使用例如，缓冲液，如含有0.05％胰蛋白酶、补充1mg/ml葡萄糖；0.1mg/ml MgCl2、0.1mg/ml CaCl2(完全PBS)加上用于失活胰蛋白酶的5％血清的磷酸缓冲盐水(PBS)，可以从培养基质释放细胞。细胞可以用PBS通过离心洗涤然后以用于注射所选的密度重悬浮在没有胰蛋白酶的完全PBS中。
除了PBS，与宿主受试者生理相容的任何渗透平衡的溶液可以用于悬浮和向宿主中注射供体细胞。适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药用载体如无菌水或者无菌等渗盐水组合的细胞。可以以适于快速浓注施用或者连续施用的形式制备、包装或者销售此类制剂。可以以单位剂型，如含有防腐剂的安瓿或者多剂量容器制备、包装或者销售可注射的制剂。
本发明还包括与其他治疗方法组合移植内皮ADAS细胞以治疗身体，包括CNS、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、胰腺等等中的疾病或者创伤。因此，本发明的内皮ADAS细胞可以与对患者发挥有益效果的其他细胞，遗传修饰的和非遗传修饰的细胞两者，共同移植。因此，如本领域技术人员根据本文提供的教导将理解的，本文公开的方法可以与其他治疗方法组合。
本发明的内皮ADAS细胞可以作为内皮ADAS细胞本身移植到患者中，使用本领域中公知的技术，如即美国专利号5,082,670和5,618,531中公开的技术，将这些专利的每一个引入本文作为参考，或者移植到身体中任何其他合适的部位。
本发明的细胞的移植可以使用本领域中公知的技术以及本文描述的或者如在将来开发的技术完成。本发明包括向哺乳动物、优选人中移植(transplanting)、移植(grafting)、灌注或者导入细胞的方法。本文中示例的是向多种哺乳动物的心血管组织中移植细胞的方法，但是本发明不限于此类解剖部位或那些哺乳动物。而且，涉及骨移植的方法是本领域中公知的并且例如在美国专利号4,678,470中描述，胰腺细胞移植物在美国专利号6,342,479和美国专利号5,571,083中描述，其教导了将细胞移植到身体中的任一解剖部位的方法。
根据已知的包封技术，包括微囊化(见，例如美国专利号4,352,883；4,353,888；和5,084,350，引入本文作为参考)，或者巨囊化(macroencapsulation)(见例如，美国专利号5,284,761；5,158,881；4,976,859；和4,968,733；和国际公布号WO 92/19195；WO 95/05452，将它们全部都引入本文作为参考)，细胞还可以被包封并用于递送生物活性分子。对于巨囊化，装置中的细胞数可以改变；优选地，每个装置含有103-109个细胞，最优选地，约105到107个细胞。可以将一些巨囊化装置植入患者中。细胞巨囊化和植入方法是本领域中公知的并且在例如美国专利6,498,018中描述。
在本发明的一方面，从供体的脂肪组织提取ADAS细胞并使用本文公开的方法培养以施用于需要其的患者以引起对患者中损伤的或变性的心肌或者其他心血管组织的治疗益处。此外，将导入个体的细胞可以来自不同的供体(同种异体的)或者它们可以是从将治疗的个体得到的细胞(自体的)。此外，将导入个体的细胞可以从完全不同的物种得到(异源的)。在优选实施方案中，从将植入的人的脂肪组织提取细胞，从而减小与对植入物的抗原性和/或免疫原性反应有关的潜在并发症。
内皮ADAS细胞的剂量可以在宽范围内改变并且可以在每个具体情况中根据个体的需要调节。使用的细胞的数目取决于受体的体重和状况、施用的数目和/或频率，和本领域技术人员已知的其他变量。
将施用于患者的内皮ADAS细胞的数目可以涉及例如脂肪组织处理后的细胞产率。细胞总数的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，递送的剂量取决于细胞递送于患者的路径。当使用心外膜或者心内递送系统时，需要较少的细胞，因为这些系统和方法可以提供用于治疗心血管疾病的最直接的途径。在本发明的一个实施方案中，将递送于患者的细胞数目预期为约5.5×104个细胞。然而，可以以数量级调节该数目以实现所希望的治疗效果。
可以对个体施用每100kg体重约105到约1013个内皮ADAS细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约1.5×106到约1.5×1012个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约1×109到约5×1011个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约4×109到约2×1011个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约5×109细胞到约1×1011个细胞。
可以对处于心肌功能受损的任何背景下的患者施用内皮ADAS细胞。此类背景的实例包括，但不限于，急性心肌梗塞(心脏病发作)、充血性心力衰竭(作为疗法或者移植物的桥)、和冠状动脉旁路搭桥术(coronaryartery bypass graft surgery)的补充。可以提前提取细胞并以冷藏方式保存或者它们可以在或者大概在确定需要的时间时提取。如本文公开的，可以将细胞施用于患者，或者直接应用于损伤的组织，或者损伤组织附近，不用进一步处理或者进行额外的步骤以进一步纯化、修饰、刺激或者改变该细胞后施用。例如，在施用于需要其的患者前，使用本文公开的方法体外培养细胞。
本发明的细胞施用于患者的方式可以取决于几种因素而变，这些因素包括治疗的疾病的类型、哺乳动物的年龄、细胞是否分化、细胞中是否导入异源DNA，等等。可以通过直接注射，或者通过本领域中使用的用于导入将施用于患有心血管疾病或者病症的患者的化合物的任何其他方法，将细胞导入目的部位。
可以以多种方法施用内皮ADAS细胞到宿主中。优选的施用方式是血管内、大脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内(intrastemal)、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心内或者肌内方式。在一些实施方案中，通过直接移植对心血管组织施用内皮ADAS细胞。在其他实施方案中，通过简单的注射对心血管组织，即血管系统施用内皮ADAS细胞。
还可以用添加剂应用内皮ADAS细胞以增强、控制或者指导预期的治疗效果。例如，在一个实施方案中，通过使用抗体介导的阳性和/或阴性细胞选择富集细胞群体可以进一步纯化细胞以增强功效、减少发病率或者促进方法的容易性。类似地，可以用生物相容的基质应用细胞，所述基质通过支持和/或指导植入的细胞的命运有利于体内组织改造。
对患者施用内皮ADAS细胞前，使用质粒、病毒或者备选的载体策略，可以用目的核酸稳定或者瞬时转染或者转导细胞。可以在遗传操作后施用细胞，使得它们表达基因产物，该产物意在促进细胞提供的治疗应答。操作的实例包括控制(增加或者减少)促进血管生成或者血管发生的因子(即VEGF)的表达、促进分化成特定细胞谱系的发育基因(即MyoD)的表达，或者刺激细胞生长和增殖的因子(即bFGF-1)的表达的操作。
内皮ADAS细胞在植入前还可以在支架材料上进行细胞培养。从而，可以在天然或者合成的基质或者支架上，在插入或者植入受体前，使用细胞合成组织改造的瓣膜、心室片、心包膜、血管和其他结构。
还可以与生血管因子组合施用本发明的细胞以诱导或者促进受试者中新毛细血管或者血管形成。表达前内皮细胞和/或内皮细胞的至少一种特征的ADAS可以在注射生血管因子之前、同时或者之后施用。此外，本发明的细胞可以在生血管因子施用部位紧邻处、相同部位或者远处施用。
此外，本发明的细胞可以用于例如在体外筛选化合物、变应原、生长/调节因子、药物化合物等等对前内皮细胞和/或内皮细胞的功效和/或细胞毒性，以通过确定细胞的生物活性的改变(例如，增殖能力、黏附、产生生血管因子)阐明某些疾病的机理，研究药物和/或生长因子借以发挥作用以调节内皮细胞生物活性的机理，诊断和监视患者中的疾病，用于基因疗法、基因递送或者蛋白质递送，和产生生物活性产物。通过分析体外活细胞数，例如，通过总细胞计数、和差异细胞计数，可以评估生长/调节因子对前内皮细胞和/或内皮细胞的影响。这可以使用标准细胞学和/或组织学技术，包括使用免疫细胞化学技术，使用确定类型特异性细胞抗原的抗体来完成。多种药物对本发明细胞的作用可以在混悬培养物或者三维系统中评估。
本发明的细胞还可以用于分离和评估与内皮细胞的分化和成熟有关的因子。从而，表达前内皮细胞的至少一种特征的ADAS细胞可以用于测定中以确定培养基，如条件培养基的活性，评价流体的细胞生长活性，参与特定谱系的贡献，等等。可以应用并且可以设计多种系统来基于多种生理胁迫诱导前内皮细胞的分化。
使用内皮ADAS细胞治疗影响心血管系统的疾病、病症或者状况提供了额外的优点，因为可以将内皮ADAS细胞导入受体中而不需要免疫抑制剂。认为细胞的成功移植需要永久移入供体细胞而不诱导受体产生的移植物排斥免疫反应。通常，为了防止宿主排斥反应，使用非特异免疫抑制剂，如环胞菌素A、甲氨蝶呤、类固醇和FK506。这些药剂每天施用并且如果停止施用，通常导致移植物排斥。然而，使用非特异免疫抑制剂的不希望的结果是它们通过抑制免疫应答的所有方面(一般性免疫抑制)起作用，从而极大地增加了受体对感染和其他疾病的易感性。
本发明通过将内皮ADAS细胞导入受体中而不需要免疫抑制剂，提供了治疗影响心血管系统的疾病、病症或者状况的方法。本发明包括向受体中施用同种异体或者异源内皮ADAS细胞，或者与受体在遗传上不同的内皮ADAS细胞，以为受体提供益处。本发明提供了当向受体施用内皮ADAS细胞时，使用内皮ADAS细胞治疗疾病、病症或者状况而不需要使用免疫抑制剂的方法。因此移植的内皮ADAS细胞引起受体对感染和其他疾病，包括和与免疫移植疗法相关的状况有关的癌症的易感性降低。
遗传修饰
本发明的细胞还可以用于表达外源蛋白或者分子用于治疗目的或者用于追踪它们在患者组织中的整合和分化的方法中。因此，本发明包括用于将外源DNA导入细胞，同时在所述细胞中表达该外源DNA的表达载体和方法，如例如在Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)，和Ausubel等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York)中所述的那些。
分离的核酸可以编码分子，一旦将它们置于患者中，所述分子用于追踪细胞的迁移、整合和存活，或者它们可以用于在患者中表达突变的、缺陷或者功能异常的蛋白质。用于追踪的蛋白质可以包括，但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、任一种其他荧光蛋白(例如，增强的绿色、蓝绿色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA))，或者本文别处公开的其他标记蛋白(例如，LacZ、FLAG-tag、Myc、His6，等等)。备选地，导入细胞中的分离的核酸可以包括，但不限于CFTR、氨基己糖苷酶、和本领域中公知的或者将在将来研发的其他基因治疗策略。
追踪本发明细胞的迁移、分化和整合不限于使用从载体或者病毒表达的可检测的分子。使用将允许定位移植的内皮ADAS细胞的一系列探针可以确定细胞的迁移、整合、和分化。此类探针包括人特异性Alu的探针，Alu是丰富的转座元件，每5000个碱基对中约存在一个，从而使得技术人员可以追踪移植细胞的进展。通过使用本文别处详述的细胞特异性标记，如，但不限于CD34、CD31、CD40、CD63等等的抗体或者核酸探针，可以进一步完成追踪移植的细胞。
本发明还包括内源ADAS细胞，当向其中导入分离的核酸，并且由希望的核酸编码的蛋白质在该细胞中表达，其中该蛋白质以前不存在于该细胞或者不在该细胞中表达或者其中它目前与导入分离的核酸之前相比以不同的水平或者在不同的环境下表达时，得到益处。这种益处可以包括这一事实，即提供了这样的系统，其中可以在实验室中在体外或者在细胞所处的哺乳动物中研究所希望的核酸的表达；这样的系统，其中包含导入的核酸的细胞可以用作研究、诊断和治疗工具，和系统，其中产生了哺乳动物模型，该模型用于开发在哺乳动物中针对所选疾病状态的新的诊断和治疗工具。
表达目的分离的核酸的细胞可以用于为另一种细胞、组织或者完整哺乳动物提供分离的核酸的产物，其中较高水平的基因产物可以用于治疗或者减轻与异常表达和/或活性有关的疾病、病症或者状况。因此，本发明包括表达目的分离核酸的内皮ADAS细胞，其中增加的目的蛋白质的表达、蛋白质水平和/或活性可以用于治疗或减轻与血管发生和/或血管生成有关的疾病、病症或者状况。
内皮ADAS细胞可以被遗传改造以表达生血管因子，例如，VEGF，然后将改造的ADAS细胞施用到受体中。改造的ADAS细胞与没有经过遗传修饰以表达这样的因子的ADAS细胞相比，以更大量表达和分泌VEGF。在疾病、病症或状况的治疗中使用影响血管发生和/或血管生成的遗传修饰的内皮ADAS细胞的益处是增强受体中存在的内皮ADAS细胞的治疗效果。增强的治疗效果归因于VEGF从改造的内皮ADAS细胞的增加的分泌。随着VEGF从被改造的内皮ADAS细胞的增加的分泌，更大量的VEGF存在于邻近细胞或者远基细胞以从VEGF受益。此外，在受体中存在增加量的VEGF允许患者接受治疗的时间范围的缩短。
将理解本文描述的方法可以以多种方式进行并且其具有本领域中公知的多种改变和更改。还理解作为细胞类型之间的作用或者相互作用方式给出的任何理论应当不被理解为以任何方式限制本发明，而是给出使得可以更充分地理解本发明的方法。
下面的实施例进一步阐明本发明的方面。然而，它们决不以任何方式限制如本文给出的本发明的教导或者公开内容。
实施例
实施例1：建立原代ADAS培养物
将来自通过吸脂得到的白色脂肪组织的基质血管级分(SVF)用含有0.5％BSA和125□g/mL I型胶原酶(终浓度)的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液在37℃消化80分钟，以10分钟间隔剧烈振动。消化后，将混悬液以1,200rpm在室温离心5分钟，剧烈振动然后再次以1,200rpm在室温离心5分钟。吸出脂质/脂肪细胞层并丢弃，不扰动SVF沉淀。将沉淀用基质细胞培养基(DMEM/F12 1∶1，10％FBS，1X抗生素/抗真菌剂)重悬浮/洗涤，并重悬浮在总体积40mL的基质细胞培养基中。将10mL该混悬液加入含有40mL基质培养基的T-225瓶中。接种后1到3天洗出非贴壁细胞，并将培养基用补充5ng/mL人EGF、不存在抗生素/抗真菌剂的基质细胞培养基替换。该培养基每3到4天更换。接种后14天收获汇合的培养物并冷藏。将这些细胞称作ADAS 0代(P0)。
实施例2：处理ADAS细胞
在两个单独的实验中，将来自单个供体的ADAS(P0)细胞以约6×103个细胞/cm2的密度接种在T-83瓶中(1代)。将对照ADAS细胞培养在包含DMEM/F12(1∶1)、10％FBS、5ng/mL hEGF和1ng/mL hFGF的扩增培养基中，每2到4天更换培养基。将处理组中的ADAS细胞进行逐步处理方案，该方案开始6天在MII培养基(DMEM/F12、N2补充物、B27补充物、2.3mM谷氨酰胺、10ng/mL hFGF)中，在接种后1、3和5天更换培养基。在第7天，将培养物用D-PBS漂洗两次，然后将ADAS细胞在MIII培养基(DMEM/F12、N2补充物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，B27补充物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，2.3mM谷氨酰胺、10mM烟酰胺、2％FBS)中培养4天。在第10天更换MIII并在第11天通过胰蛋白酶消化收获对照和处理的ADAS细胞并进行流式细胞术。
流式细胞术
对对照和MII/MIII处理的细胞进行流式细胞术以进行表型表征并鉴定对MII/MIII培养基处理方案的可能的细胞应答。对于接合的单克隆，将细胞用1mL流动洗涤缓冲液(1X DPBS，0.5％BSA和0.1％叠氮化钠)洗涤一次，并以约6000x g离心20秒。将细胞悬浮在1.3ml封闭缓冲液(含有25□g/ml小鼠Ig的洗涤缓冲液)中，在冰上温育10分钟，然后等分成100□L等分试样。向它们各自的等分试样中加入合适的单克隆抗体。包括合适的同种型对照组合以对应于实验中使用的单克隆同种型组合。每个试管包括三种单克隆抗体。实验中使用的抗体的浓度为销售商推荐的浓度。用于ADAS细胞表型的抗体包括(除非另外指出，所有抗体都来自BD-Pharmingen，San Jose，CA)：CD80(Caltag，Burlingame，CA)，CD86(Caltag)、CD 14；CD45、CD34、CD 133(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)；CD90、CD105(Caltag)、HLA-DR；CD63、CD166、I类MHC；CD44(CellSciences，Canton，MA)、CD73、CD54；CD31、CD13、CD40；CD29(Caltag)、CD49a、CD11a。所有试管都在冰上避光温育30分钟。将细胞用2mL洗涤缓冲液洗涤一次(约650x g 5分钟)，然后在200□L 1％低聚甲醛中固定。
对于未缀合的单克隆抗体，如本文别处描述的收获、洗涤和封闭ADAS细胞。加入一级抗体(VEGFR2[KDR]和血管性血友病因子)(10□g/mL)并将细胞在冰上温育约30分钟。将细胞用2mL洗涤缓冲液洗涤一次(650x g 5分钟)并重悬浮在100□L洗涤缓冲液中。向含有一级抗体以及“仅二级抗体”对照的混悬液中加入浓度为0.5□g/mL的山羊抗小鼠PE缀合的二级抗体并将细胞在冰上避光温育15分钟。进行用2mL流动洗涤缓冲液的最终洗涤(650x g 5分钟)并如上述固定细胞。
使用CELLQuest采集软件(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，在Becton Dickinson FACSCaliber流式细胞仪上设置的每种抗体获得10,000个事件(细胞)，并用Flow Jo分析软件(Tree Star，Ashland，OR)分析数据。
形态学
图1显示了未处理的和MII/MIII处理的ADAS培养物的显微照片表示。在预处理的和未处理的对照培养物中观察到纺锤形的成纤维细胞样形态(图1A和图1B)，而在开始处理后4天，在MII处理的培养物中观察到形态学改变(图1C和图1D)。MII处理的细胞在外观上较不像成纤维细胞，有许多贴壁和不贴壁的圆形的相明亮的细胞。此外，在该阶段的细胞似乎形成细胞与细胞连接的“网络”。用MIII进一步处理细胞再次改变了培养物的总体形态，得到与MII处理期间看到的细胞相像的细胞和与培养的内皮细胞相像的形成“鹅卵石”型区域的细胞的异质混合物(图1E和1F)。
表型表征
使用针对通常由基质、造血或内皮谱系的细胞表达的多种分子的抗体，对对照和MII/MIII处理的ADAS细胞在表型上表征表面标记表达。表1显示了该表征的结果(值为所列的表面标记的阳性染色细胞的百分比)。培养11天后，未处理的1代ADAS细胞表达CD13、CD29、CD31、CD40、CD44、CD49a、CD54、CD63、CD73、CD80、CD90、CD105、CD133、CD166、I类MHC、和VEGF受体2(flk-1)。当用MII/MIII方案处理时，在表达表面标记CD31(+56.5％)、CD34(+67.9％)、CD40(+27.4％)、CD63(+38.0％)、CD105(-25.3％)和CD166(-36.1％)的细胞的平均百分比中注意到显著改变(＞20％)。
表1对照和MII/MIII处理的ADAS细胞的表型表征
  实验1   实验2
  抗原   未处理的   处理的   未处理的   处理的
  CD11a   ＜0.01   ＜0.01   ND   ND
  CD13   98.3   98.2   98.1   96.8
  CD14   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01
  CD29   97.9   97.9   97.6   93
  CD31   25.4   90   22.9   71.2
  CD34   0.8   64.2   1.6   74
  CD40   46.9   80.3   60   81.3
  CD44   98.4   98.2   98.1   96.8
  CD45   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01
  CD49a   4.6   1.2   12.8   10.8
  CD54   75.2   77.1   71.8   78.1
  CD63   45.9   97.1   66.5   91.3
  CD73   98.2   97.6   97.9   96.4
  CD80   4.4   5.4   10.8   18.7
  CD86   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01   ＜0.01
  CD90   98   98.3   98.2   97.1
  CD105   23.7   ＜0.01   44.9   18.1
  CD133   9.6   3.4   4.1   6.3
  CD166   49.9   19.9   61.1   18.9
  I类MHC   96.8   97.9   88.6   89
  II类MHC   0.1   1.5   1.4   1.1
  VEGF-r2   ND   ND   44.9   30.8
  血管性血友病因子   ND   ND   2.4   2.3
  *BG＝背景
本文的公开内容阐明了使用培养基处理方案处理未分化的ADAS细胞以得到内皮ADAS细胞群体的新方法。尽管本文给出的细胞表型表征不包括所有潜在的内皮细胞表面标记，但是观察到通过本文公开的方法产生的细胞群体对于CD34(前内皮细胞和造血干细胞的标记)和CD31(成熟内皮细胞)是强阳性的，并且对于CD40和CD63是阳性的，这与对向内皮细胞类型定型的表型表征相一致。本文给出的数据表明使用本文公开的方法从容易扩增的内皮ADAS产生大量CD34+、CD31+前内皮细胞以在临床上使用。此外，本公开内容允许使用本文所述的处理诱导内皮细胞标记阳性表型在大规模环境中扩增内皮ADAS细胞和生产前内皮细胞的有吸引力的方法。此外，在处理的ADAS细胞上CD34和CD40以及CD80(程度较低)的表达提示还可以诱导造血前体细胞。
将本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容都完整引入本文作为参考。
尽管参考具体实施方案公开了本发明，显然本领域其它技术人员可以设计本发明的其他实施方案和变通方案而不背离本发明的真实精神和范围。意在理解后附权利要求包括所有此类实施方案和等价变通方案。

Claims (32)

1.分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞，其经诱导而表达前内皮细胞的至少一种特征。
2.权利要求1的细胞，其中所述细胞经诱导在体外分化。
3.权利要求1的细胞，其中所述细胞经诱导在体内分化。
4.权利要求1的细胞，其中已经向所述细胞中导入外源遗传物质。
5.权利要求1的细胞，其中所述细胞来自人。
6.权利要求1的细胞，其中所述细胞表达CD34和CD31的至少一种。
7.权利要求1的细胞，其中当与CD34和CD31各自从未经诱导以表达前内皮细胞的至少一种特征的其他方面相同的ADAS细胞的表达水平相比时，所述细胞以更高水平表达CD34和CD31的至少一种。
8.权利要求1的细胞，其中所述细胞表达CD34、CD31、CD40、CD63或其组合的至少一种。
9.权利要求1的细胞，其中当与CD34、CD31、CD40和CD63各自从未经诱导以表达前内皮细胞的至少一种特征的其他方面相同的ADAS细胞的表达水平相比时，所述细胞以更高水平表达CD34、CD31、CD40、CD63或其组合的至少一种。
10.分化分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞以表达前内皮细胞的至少一种特征的方法，该方法包括将所述细胞在MII培养基中培养，接着将所述细胞在MIII培养基中培养。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞来自人。
12.权利要求10的方法，其中所述MII培养基包含N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺和成纤维细胞生长因子(FGF)。
13.权利要求12的方法，其中所述谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
14.权利要求12的方法，其中所述FGF的浓度为约10ng/mL。
15.权利要求10的方法，其中所述MIII培养基包含N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺、烟酰胺和胎牛血清(FBS)。
16.权利要求15的方法，其中所述谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
17.权利要求15的方法，其中所述烟酰胺的浓度为约10mM。
18.权利要求15的方法，其中所述FBS的浓度为约2％。
19.用于将分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞分化成显示前内皮细胞的至少一种特征的细胞的分化培养基，其中向所述培养基补充N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺和成纤维细胞生长因子(FGF)，此外其中将所述培养基称作MII培养基。
20.权利要求19的培养基，其中所述谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
21.权利要求19的培养基，其中所述FGF的浓度为约10ng/mL。
22.用于将分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞分化成显示前内皮细胞的至少一种特征的细胞的分化培养基，其中向所述培养基补充N2补充物、B27补充物、谷氨酰胺、烟酰胺和胎牛血清(FBS)，此外其中将所述培养基称作MIII培养基。
23.权利要求22的培养基，其中所述谷氨酰胺的浓度为约2.3mM。
24.权利要求22的培养基，其中所述烟酰胺的浓度为约10mM。
25.权利要求22的培养基，其中所述FBS的浓度为约2％。
26.在动物中诱导血管发生的方法，其包括：
a)诱导分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞以表达前内皮细胞的至少一种特征；和
b)对所述动物施用这样诱导的所述细胞。
27.权利要求26的方法，其中所述ADAS细胞从所述动物分离。
28.权利要求26的方法，其中所述ADAS细胞从同种异体供体分离。
29.权利要求26的方法，其中所述ADAS细胞从异源供体分离。
30.权利要求26的方法，其中所述ADAS细胞来自人。
31.确定化合物实现分离的脂肪组织来源的成年基质(ADAS)细胞分化成前内皮细胞和/或内皮细胞的能力的方法，该方法包括：
a)在基质细胞培养基中培养所述ADAS细胞一段时间；
b)将所述基质细胞培养基用包含化合物或者对照载体的分化培养基更换；
c)在包含所述化合物或所述对照载体的所述分化培养基中培养所述ADAS细胞一段时间；
d)使用来自步骤c)的包含所述化合物的所述分化培养基确定分化细胞的数目或者百分数；
e)使用来自步骤c)的仅含有所述载体的所述分化培养基确定细胞中分化细胞的百分数；
f)比较来自步骤(d)和(e)的分化细胞的数目或百分数；
g)与来自步骤(e)的分化细胞的百分数相比，来自步骤(d)的分化细胞的更大的百分数表明所述化合物能够诱导所述ADAS细胞分化成前内皮细胞和/或内皮细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述细胞来自人。
CNA2006800109281A 2005-01-31 2006-01-27 显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞 Pending CN101155912A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64863005P 2005-01-31 2005-01-31
US60/648,630 2005-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101155912A true CN101155912A (zh) 2008-04-02

Family

ID=36778041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800109281A Pending CN101155912A (zh) 2005-01-31 2006-01-27 显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20060171932A1 (zh)
EP (1) EP1859025A4 (zh)
JP (1) JP2008528041A (zh)
KR (1) KR20070100908A (zh)
CN (1) CN101155912A (zh)
AU (1) AU2006210425A1 (zh)
BR (1) BRPI0607045A2 (zh)
CA (1) CA2596281A1 (zh)
CR (1) CR9346A (zh)
IL (1) IL184890A0 (zh)
MX (1) MX2007009173A (zh)
RU (1) RU2007132733A (zh)
TW (1) TW200637911A (zh)
WO (1) WO2006084284A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104662532A (zh) * 2011-03-28 2015-05-27 约翰·S·阿诺尼 用于从所获得的基于干细胞的生物材料收集、低温存储和分配化妆配制品的商业方法、过程和系统
CN106520691A (zh) * 2016-12-30 2017-03-22 潍坊医学院 一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2344653A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 Gamida Cell Ltd. Methods of controlling proliferation and differentiation of stem and progenitor cells
IL152904A0 (en) * 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
WO2003062404A1 (en) 2002-01-25 2003-07-31 Gamida-Cell Ltd. Methods of expanding stem and progenitor cells and expanded cell populations obtained thereby
CA2479679A1 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Gamida-Cell Ltd. Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells
US20050054097A1 (en) * 2002-11-17 2005-03-10 Tony Peled EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
WO2006030442A2 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Gamida-Cell Ltd. Methods of ex vivo progenitor and stem cell expansion by co-culture with mesenchymal cells
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
US20080199441A1 (en) * 2006-11-09 2008-08-21 Tony Peled Use of ex-vivo cultured hematopoietic cells for treatment of peripheral vascular diseases
US20080299077A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Nevada Cancer Institute Isolation and growth of stem cells from hemangiomas
WO2008151021A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Nevada Cancer Institute Isolation and growth of stem cells from hemangiomas
US9096827B2 (en) * 2008-09-02 2015-08-04 Pluristem Ltd. Adherent cells from placenta tissue and use thereof in therapy
JP2012505665A (ja) * 2008-10-17 2012-03-08 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド 脂肪組織から細胞集団を得る方法
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8834928B1 (en) 2011-05-16 2014-09-16 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissugenic implants, and methods of fabricating and using same
SG11201404608WA (en) 2012-02-13 2014-09-26 Gamida Cell Ltd Mesenchymal stem cells conditioned medium and methods of generating and using the same
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
US20150037436A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
KR101719743B1 (ko) 2015-04-06 2017-03-24 박준한 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법
US10531957B2 (en) 2015-05-21 2020-01-14 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4353888A (en) * 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4678470A (en) * 1985-05-29 1987-07-07 American Hospital Supply Corporation Bone-grafting material
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5283187A (en) * 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
DE3829766A1 (de) * 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
US4968859A (en) * 1988-10-21 1990-11-06 Westinghouse Electric Corp. Circuit breaker with low voltage contact structure
US5082670A (en) * 1988-12-15 1992-01-21 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage or the central nervous system
US5084350A (en) * 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5618531A (en) * 1990-10-19 1997-04-08 New York University Method for increasing the viability of cells which are administered to the brain or spinal cord
US5571083A (en) * 1994-02-18 1996-11-05 Lemelson; Jerome H. Method and system for cell transplantation
US6342479B1 (en) * 1997-04-08 2002-01-29 Societe De Counseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Prolonging survival of transplanted pancreatic cells
US5968829A (en) * 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6153432A (en) * 1999-01-29 2000-11-28 Zen-Bio, Inc Methods for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes
PT1261694E (pt) * 2000-02-26 2008-04-03 Artecel Inc Células estaminais pluripotentes produzidas a partir de células estromais derivadas de tecido adiposo e suas utilizações.
EP1451300A4 (en) * 2001-11-09 2007-01-10 Artecel Sciences Inc METHODS AND COMPOSITIONS IN WHICH STROMAL CELLS ARE USED TO SUPPORT EMBRYONIC AND ADULT STEM CELLS
CA2469472C (en) * 2001-12-21 2013-11-26 Immunex Corporation Endothelial stem cells, populations, methods of isolation and use thereof
AU2003220424A1 (en) * 2002-03-19 2003-10-08 Advanced Research And Technology Transfer Adipose stromal stem cells for tissue and vascular modification

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104662532A (zh) * 2011-03-28 2015-05-27 约翰·S·阿诺尼 用于从所获得的基于干细胞的生物材料收集、低温存储和分配化妆配制品的商业方法、过程和系统
CN104662532B (zh) * 2011-03-28 2018-09-07 约翰·S·阿诺尼 基于干细胞的化妆配制品及制备其的方法和系统
CN106520691A (zh) * 2016-12-30 2017-03-22 潍坊医学院 一种皮肤间充质干细胞的分离及培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006084284A2 (en) 2006-08-10
JP2008528041A (ja) 2008-07-31
IL184890A0 (en) 2007-12-03
RU2007132733A (ru) 2009-03-10
BRPI0607045A2 (pt) 2009-08-04
CA2596281A1 (en) 2006-08-10
EP1859025A4 (en) 2009-07-22
AU2006210425A1 (en) 2006-08-10
TW200637911A (en) 2006-11-01
KR20070100908A (ko) 2007-10-12
MX2007009173A (es) 2008-03-10
EP1859025A2 (en) 2007-11-28
US20060171932A1 (en) 2006-08-03
CR9346A (es) 2008-02-12
WO2006084284A3 (en) 2006-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101155912A (zh) 显示出内皮细胞特征的脂肪来源的成年基质细胞
US20210355447A1 (en) Multipotential Expanded Mesenchymal Precursor Cell Progeny (MEMP) and Uses Thereof
JP6096232B2 (ja) 血管周囲の間葉系前駆細胞に誘導される血管形成
Dazzi et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis
US10358629B2 (en) Regulating stem cells
WO2005063967A1 (ja) 哺乳動物の骨髄細胞または臍帯血由来細胞と脂肪組織を利用した心筋細胞の誘導
US20030031651A1 (en) Methods and reagents for cell transplantation
IL214373A (en) Use of tissue-derived fatty cells to prepare a preparation for the treatment of cardiovascular disease
US20080145860A1 (en) Encapsulated cell indicator system
US10232000B2 (en) Stem cells derived from basal portion of chorionic trophoblast layer and cell therapy comprising same
CN109689858A (zh) 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法
TW201920658A (zh) 幼豬由來幹細胞及其製備方法
CN101432420A (zh) 用于血管生成治疗的自体或异源祖细胞的条件培养基
KR20180092523A (ko) 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화용 무혈청 배지 첨가제 조성물 및 분화 방법
CN1901802B (zh) 用脂肪组织来源的细胞治疗心血管疾病的方法
KR20230152192A (ko) 커큐민에 의한 줄기세포의 심근전구세포로의 유도 및 심근세포로의 분화

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20080402