CN101432420A - 用于血管生成治疗的自体或异源祖细胞的条件培养基 - Google Patents

Abstract

提供了治疗组合物，其包括无细胞条件培养基，所述无细胞条件培养基含有从骨髓、外周血或脂肪组织得到的分离的血管生成祖细胞的混合分泌产物。所述组合物可以另外含有通过用促血管生成转基因转染培养中的祖细胞而获得的促血管生成蛋白。当导入患者的缺血部位中或附近例如心肌或周围肢体中，所述组合物可用于促进血管生成。也提供了使用此类无细胞条件培养基输送促血管生成蛋白至患者的方法。所述无细胞条件培养基也可以被注射入血流，以输送至缺血组织。所述细胞可以来源于自体或异源并可以被冷冻干燥或冷冻以存储。

Description

用于血管生成治疗的自体或异源祖细胞的条件培养基

相关申请

[0001]本申请要求2004年9月8日提交的美国序列第60/608,272号在35 U.S.C.§119(e)下的优先权权益，其全部内容被引入于此作为参考。

技术领域

[0002]本申请一般地涉及使用骨髓细胞治疗各种疾病的方法，并且更具体地涉及使用来源于自体和异源血管生成祖细胞的条件培养基，以增强侧支血管形成(血管生成)和组织灌注。尽管本申请表明使用骨髓细胞，其也意欲于应用于来自血管生成祖细胞的条件培养基，一般包括从外周血或其它组织包括脂肪组织分离的细胞。

背景技术

[0003]应用重组基因或生长因子增强心肌侧支血管(collateral blood vessel)功能，可能代表了治疗心血管疾病的一种新方法。Kornowski，R.等人，“Deliverystrategies for therapeutic myocardial angiogenesis，”Circulation 2000；101：454-458。此观点的证据已经在心肌缺血动物模型得到证明，并且临床试验正在进行中。Unger，E.F.等人，“Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flowin a canine model，”Am J Physiol(1994)266：H1588-1595；Banai，S.等人，“Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardiun byvascular endothelial growth factor in dogs，”Circulation(1994)83：2189；Lazarous，D.F.等人，“Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor oncollateral development in the canine heart，”Circulation(1995)91：145-153；Lazarous，D.F.等人，“Comparative effects of basic development and the arterial response toinjury，”，Circulation(1996)94：1074-1082；Giordano，F.J.等人，“Intracoronary genetransfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function inanischemic region of the heart，”Nature Med(1996)2：534-9。Guzman，R.J.等人，“Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirusvectors，”Circ Res(1993)73：1202-7；Mack，C.A.等人，“Biologic bypass with the useof adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid forVEGF-121，improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcineheart，”J Thorac Cardiovasc Surg(1998)115：168-77。

[0004]例如，在心肌缺血动物模型中，已经研究了直接术中心肌内注射(directintra-operative intramyocardial injecfion)血管生成因子(angiogenic factor)对侧支功能(collateral function)的效应。开胸、经心外膜给予腺病毒载体，导致侧支功能增强，所述腺病毒载体含有编码血管生成肽的转基因(transgene)(Mack等人，见上)。也报道，在患者的开心脏手术(open-heart surgery)期间直接心肌内注射血管生成肽或质粒载体时，发生血管生成。Schumacher，B.等人，“Induction of neoangiogenesis inischemicmyocardium by human growth factors.First clinical results of a new treatment ofcoronary heart disease，”Circulation(1998)97：645-650；Losordo，D.W.等人，“Genetherapy for myocardial angiogenesis：initial clinical results with direct myocardialinjection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia，”Circulation(1998)98：2800。

[0005]尽管治疗性血管生成(therapeutic angiogenesis)作为一种新的形式，治疗在心脏或周围肢体中患有循环疾病的患者是大有希望的，但是在本领域中仍然存在对于新的和更好的治疗策略的需求，该治疗策略以最佳的方式促进临床上相关的治疗性血管生成反应。

发明概述

[0006]本发明基于这样的前提：多种复杂的过程涉及几十个基因的差异表达，如果不是数百个基因的话，而所述多种复杂的过程对于最适的侧支发育是必要的。基于此概念，由此得出的结论是，侧支血管的最适发育和组织灌注不能通过给予单一的蛋白质或单一的基因而实现，已知所述基因的编码产物和血管生成相关；或者由于血管生成过程的复杂性，也不能通过给予血管生成相关蛋白或基因的组合而得到。本发明依赖于某些血管生成祖细胞将参与血管生成和侧支血管形成的生长因子和细胞因子分泌进入生长培养基中的能力，所述分泌是以时间和浓度依赖性的、协调的和合适的顺序进行的。

[0007]绝大多数当前处于试验中的治疗方法集中于，将单一的血管生成生长因子(例如，VEGF、FGF、血管生成素-1(angiopoietin-1))输送至缺血组织。这可以或者通过输送终产物(例如，蛋白质)或者应用不同载体通过基因转移来完成。然而，据认为，在几种生长因子体系中的复杂相互作用，对于起始和维持新血管形成可能是必需的。更具体地，据认为，用各种血管生成细胞因子(angiogenic cytokines)诱导特异定位的血管生成环境(specific localized angiogenic milieu)是重要的，所述细胞因子以协调一致的和时间适当的方式(in concert and in a time-appropriatemanner)相互作用，从而起始和维持新血管的形成和功能。

[0008]因此，在一个实施方案中，本发明提供了产生用于在需要的患者中增强侧支血管发育的组合物的方法，其通过在合适的培养条件下、在合适的培养基中培养分离的自体或异源血管生成祖细胞一段时间而进行，所述时间足以促进血管生成祖细胞产生含混合的分泌产物的条件培养基。所述条件培养基被处理成包含血管生成祖细胞的混合分泌产物的混合物的无细胞条件培养基。当注射入患者中具有受损血流(blood flow)的组织内部或邻近部位时，包括无细胞培养基的组合物促进所述组织中侧支血管的发育。

[0009]在另一个实施方案中，本发明提供了治疗组合物，当注射入供应具有受损血流的组织的发育侧支部位时，所述治疗组合物用于在患有受损血流的部位的患者中增强侧支血管发育。本发明的治疗组合物包括含细胞因子混合物的无细胞培养基，其中所述无细胞培养基通过在合适的生长培养基中，以及在适于促进祖细胞产生生长产物的混合物的条件下，培养分离的异源供体祖细胞而产生。然后对条件培养基进行处理，以从中去除细胞，产生无细胞的条件培养基。

[0010]在又一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包括包含在容器中的本发明治疗组合物；以及使用所述组合物在哺乳动物中的受损血流部位内或附近增强侧支血管发育的说明书(instruction)。

[0011]仍在又一个实施方案中，本发明提供了在患有受损血流部位的患者中增强侧支血管形成的方法，其通过直接给予侧支发育部位足以增强侧支血管形成的量的本发明组合物，所述侧支供应患者中具有受损血流的组织，例如心脏或肢体的缺血组织。

附图简述

[0012]图1是猪主动脉内皮细胞(pig aortic endothelial cells，PAECs)的增殖对条件培养基量的图。

[0013]图2是内皮细胞增殖对条件培养基量的图。

[0014]图3是经四周时间期间，条件培养基中VEGF浓度的图。

[0015]图4是经四周时间期间，条件培养基中MCP-1浓度的图。

[0016]图5是显示来自小鼠的CD34+细胞和骨髓源基质细胞(bonemarrow-derived stromal cells)的VEGF、MCP-1和bFGF体外产量的图。

[0017]图6是曲线图，显示了当被注射入小鼠缺血后肢的内收肌群(adductormuscles)时，骨髓源基质细胞对侧支血流(collateral flow)发育的影响，如激光/多普勒灌注成像所确定。血流(flow)被表示为缺血肢体中的血流和正常后肢中的血流的比值。MSC＝骨髓源基质细胞(marrow-derived stromal cell)；培养基(Media)＝非条件培养基(non-conditioned media)；MAEC＝小鼠主动脉内皮细胞(mouse aorticendothelial cells)。

[0018]图7是显示对体外VEGF和bFGF的释放的影响的图，所述VEGF和bFGF从用腺病毒转染的小鼠骨髓源基质细胞(MSCs)释放，所述腺病毒编码HIF-1I-VP16。(MSC＝单独的MSCs；缺氧＝单独的缺氧条件；HIF＝用编码融合蛋白HIF-1I-VP16的DNA转染的MSCs。数据代表了对至少3个不同的MSC群的分析。

[0019]图8是曲线图，显示了与接受1×10⁵非转导的MSCs相比，在接受注射入缺血后肢的1×10⁵HIF-1I/VP16转导的MSCs的小鼠中，改进的体内血流恢复(趋势比较p＝0.05，经ANOVA比较)。细胞在第一天被注射。

发明详述

[0020]骨髓(bone marrow)(BM)是参与调控血管生成过程的广谱的细胞因子(例如，生长因子)和细胞的天然来源。输送自体(A)BM(autologous BM，(A)BM)或从其而来的骨髓细胞，或当这些细胞培养生长时来自这些细胞的培养基——通过利用这些细胞以时间适当的方式分泌许多血管生成因子的天然能力，提供了在缺血心肌和四肢以及其它经历受损血流的组织中获得治疗性侧支发育的最佳的干预。

[0021]然而，获得并培养自体骨髓所需的时间可能过渡延迟使用骨髓治疗此类症状。在一些情况下，患者的年龄可能使自体骨髓的使用不令人满意。在心肌梗塞的情况下，时间可能是考虑的重要因素。然而，已知由于免疫应答，任何非自体细胞的使用需要找到其细胞不被患者排斥的“匹配”供体。

[0022]本发明是基于这样的发现：来源于自体或异源祖细胞——例如但不限于从骨髓获得的那些细胞——的体外培养的无细胞培养基，可以被用于代替细胞本身，这是因为该条件培养基提供输送山参与组织中侧支血管生长的祖细胞分泌的许多血管生成因子至患者的组织。用在本发明方法和组合物的合适的祖细胞可以例如从外周血或其它组织包括脂肪组织中获得。通过在合适的条件下，并在足以使所述祖细胞分泌混合的分泌产物至条件培养基中的一段时间里，培养分离的异源或自体祖细胞，产生本发明无细胞培养基。然后，处理所述条件培养基，产生含混合分泌产物的无细胞培养基。当准备供体用于输血时——其中仅对红细胞进行分型(typed)和交叉配血(cross-matched)，给予的其它细胞以及血浆被给予而无任何分型。对任何这些产物的严重过敏反应的发生率非常低。来自异源或自体来源的细胞的无细胞条件培养基可以被认为是如得自不同供体的血清或血浆一样不含过敏原。

[0023]在无细胞培养基中残余的细胞因子比起许多蛋白质的大小是相对小的分子，因此，缺乏如下特征：哺乳动物机体识别为非自身，导致免疫应答。细胞和细胞因子之间的大小差异使得容易通过过滤生长培养基或通过离心例如在10kxg下离心五分钟从生长培养基除去细胞，产生无细胞培养基。可以进一步处理所述无细胞培养基，例如通过冷冻或冷冻干燥，并置于小容器中，使得操作、储存和分配方便。本领域技术人员将理解，通过加入此类流体诸如无菌水、生理盐水和类似物，使用如适合于制备用于给予患者的其它分型的血细胞和血液产品的本领域已知技术，冷冻或冷冻干燥的无细胞培养基将容易地被重构以应用。

[0024]骨髓(bone marrow)(BM)是参与调控血管生成过程的广谱的细胞因子(例如，生长因子)、多种因子和细胞的天然来源，为方便起见，其在本文中被通称为“混合分泌产物”(mixed secretion products)。因此认为，心肌内注射自体(A)BM或从其而来的骨髓细胞，通过利用这些细胞以时间适当的方式分泌许多血管生成因子的天然能力，提供了在缺血心肌中获得治疗性侧支发育的最适干预手段。[0025]通过利用这样的发现：与血管发生进展有关的自体或异源祖细胞可以被用于制备含内源性分泌的混合分泌产物的无细胞条件培养基，本发明在本领域中代表了一个进步。此外，至少一些此类自体或异源祖细胞可以用编码一种或多种血管生产蛋白(即，增强靶组织发育侧支血液对缺血组织区域的供应的细胞因子、生长因子、或转录因子)的多核苷酸转染。此类细胞转染将大大增加所述细胞的混合分泌产物的一种或多种的浓度，或将一种或多种另外的血管生成或动脉生产蛋白质加入由所述细胞产生的条件培养基中。在转染的祖细胞的体外生长期间，这些基因产物将被加入条件培养基中，并且，因此，进一步促进通过培养自体或异源祖细胞产生的条件培养基的治疗效果。这些混合因子和培养产物的非限制性例子是，粒细胞-单核细胞集落刺激因子(Granulocyte-Monocyte Colony StimulatoryFactor(GM-CSF))、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemoattractant Protein 1(MCP-1))和缺氧诱导因子-1(Hypoxia Inducible Factor-1(HIF-1))。在产生无细胞条件培养基的处理期间，转染的祖细胞将从条件培养基除去。

[0026]可选地或另外地，如本文所述获得的此类祖细胞可以用编码一种或几种一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的基因转染。“NOS基因”或“编码NOS的多核苷酸”作为术语用于此处，是指编码任何已知的NOS异构体的基因，包括诱导型NOS(iNOS)和内皮型NOS(eNOS)，以及这样的NOS基因，其已经被突变以致于其表达量被改变，或使得它们编码改变的蛋白，这两者中的任一导致更有效的血管生成效应。

[0027]用编码NOS的多核苷酸转导至少一些所述祖细胞的原理基于下列事实：被鉴定为更有效的血管生成因子之一的VEGF，是通过NOS信号通路起作用的。例如，已经显示，在NOS基因被敲除的小鼠中，VEGF不能诱导血管生成。而且，NOS的蛋白产物一氧化氮(NO)有多重作用，所述作用是诱导血管生成和此外，诱导许多不同基因的表达，所述不同基因中的许多参与血管生成。因此，用编码NOS的多核苷酸转染祖细胞，增加了所述细胞分泌本文所述的混合分泌产物的内在能力，并且也刺激多种血管生成-相关基因的表达。

[0028]本发明描述的另一基因家族是成纤维细胞生长因子(FGF)家族，其被描述为具有增加祖细胞增强侧支血管发育潜能的能力。此基因家族包括超过十四个密切相关的基因，包括但不限于FGF1、FGF2、FGF4和FGF5。用FGF家族中的基因转导骨髓细胞的原理是，已知FGF是血管生成的有效刺激物。FGF也能够刺激多种其它基因的表达，所述多种其它基因的蛋白产物中的许多也能够诱导血管生成。

[0029]由单核细胞/巨噬细胞表达的PR39基因，也适合于转入祖细胞，如本文所描述，以增强通过祖细胞产生的无细胞条件培养基的潜能以促进侧支形成。富集含PR39的基因产物的条件培养基的原理是：此蛋白质抑制HIF-α的蛋白酶体降解(proteasomal degradation)，导致小鼠体外血管结构加速形成并且增加心肌脉管系统。通过增加HIF-1α的稳态水平，诱导了异二聚体HIF-1α/HIF-β的形成增加，所述异二聚体HIF-1α/HIF-β是诱导HIF-相关基因表达的转录因子。这些基因中的许多的蛋白产物促进血管生成的发展。此策略——增加HIF-1α的稳态水平——的原理详细描述于上文。

[0030]可以用质粒载体或腺病毒载体体外转染用于制备本发明条件培养基的祖细胞，所述载体携带血管生成细胞因子生长因子或哺乳动物血管生成促进因子转基因，如HIF-1或EPAS1转基因、或编码PR39的转基因、或NOS或FGF家族成员，用于它们表达到来自所述细胞培养的条件培养基中。对如此来源的培养基进行处理，以获得无细胞条件培养基，并注射入治疗部位以便提高如本文所述的血管生成。

[0031]所述细胞的接种发生于在一种或多种含一种或多种转基因的载体存在下培养所述细胞几小时时期之后，并且接种的细胞在大约12小时至3天之后开始产生转基因产物。可选地，通过本领域已知的任何方法，可以用编码一种或多种血管生成细胞因子、生长因子和/或哺乳动物细胞中促进血管生成的因子的载体接种所述祖细胞。所使用的载体可以选自本领域已知的任何载体，包括但不限于本文描述的那些。合适的培养条件是本领域熟知的，包括但不限于本文实施例中描述的那些培养条件。

[0032]通过培养如本文所述的转染或未转染的祖细胞而获得的无细胞培养基的有效量，可以被直接给予(即注射入)患者的期望位点，以在患者的所需位点增强侧支血管形成。用于给予本发明条件培养基的特别有效的部位包括心肌或骨骼肌，如在腿上，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注。来自这类细胞的无细胞条件培养基也可以被注射入血管系统，使得混合分泌产物和包含在其中的任选的刺激性血管生成蛋白(stimulatory angiogenic protein)经血液被输送至所需部位。

[0033]编码刺激性血管生产蛋白的多核苷酸可以“功能上附加于”(functionallyappended to)或“可操纵地结合于”(operatively associated with)信号序列，所述信号序列可以“转运”(transport)编码产物穿过细胞膜。多种这样的信号序列是已知的，和可以被本领域的技术人员应用而无需过多的试验。

[0034]预期用于这种目的的基因转移载体(也称作“表达载体”(expressionvectors))是重组的核酸分子，其被用于转运核酸进入宿主细胞，进行其表达和/或复制。表达载体可以是环状的或是线性的，并能够在其中并入多种核酸构建体。表达载体典型地以质粒的形式出现，其在导入合适的宿主细胞后，导致插入的核酸表达。

[0035]已经开发出用于基因治疗的合适病毒载体，用于特殊的宿主系统中，特别是哺乳动物系统，以及包括例如，反转录病毒载体、其它慢病毒属(lentivirus)载体如那些基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的那些载体、腺病毒载体、腺相关病毒(adeno-associated virus)载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体和类似载体(参见Miller和Rosman，BioTechniques 7：980-990，1992；Anderson等人，Nature 392：25-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389：239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.334：1185-1187(1996)，每一文献在此并入作为参考)。优选的基因转移载体是复制缺陷型腺病毒，其携带影响对象的侧支动脉发育的一种或多种转基因，该复制缺陷型腺病毒已经在遭受进行性冠状动脉闭塞(progressive coronary occlusion)的对象中成功使用(Barr等人，＂PCGT Catheter-Based Gene Transfer Into the Heart UsingReplication-Deficient Recombinant Adenoviruses，＂Journal of Cellular Biochemistry，增刊17D，195页，摘要101页(1993年3月)；Barr等人，＂Efficient catheter-mediatedgene transfer into the heart using replication-defective adenovirus，＂Gene Therapy，(1994)1：51-58)。

[00361几种不同的基因转移方法是可行的，包括非依赖于辅助病毒的复制缺陷型人腺病毒5系统(helper-independent replication deficient human adenovirus 5system)。基于人腺病毒5的重组腺病毒载体(Virology 163：614-617，1988)缺失了来自腺病毒基因组的基本上早期的基因(essential early genes)(通常是E1A/E1B)，和从而如果不生长在反式提供缺失基因的产物的允许细胞系(permissive cell lines)中，就不能复制。替代缺失的腺病毒基因组序列，所需的转基因可以在用复制缺陷型腺病毒感染的组织/细胞中被克隆和表达。尽管基于腺病毒的基因转移不导致转基因整合入宿主基因组(少于0.1％的腺病毒-介导的转染导致转基因并入宿主DNA)，并从而是不稳定的，但腺病毒载体可以以高滴度增殖并充分转染非复制型细胞(non-replicating cells)。众多研究已经显示，仅仅需要血管生成-促进转基因的瞬时表达，以实现在给予腺病毒载体的缺血心脏或骨骼肌肉中的增强的侧支发育。

[0037]然而，感兴趣的载体和转基因将在处理期间从条件培养基中除去，以获得无细胞条件培养基，从而基本上避免可能在基因治疗应用中遇到的任何问题，这是本发明的一个特别的特征。

[0038]根据已知的原则，本领域的技术人员可以改变导入至少一些血管生成祖细胞的外源性核酸的量。例如，当应用病毒载体进行基因转移时，通过改变病毒载体的噬菌斑形成单位(plaque forming units(PFU))的量，可以改变导入欲被转染的细胞的核酸的量。

[0039]自体或异源祖细胞的无细胞条件培养基，单独地或与刺激性血管生成蛋白一起，可以直接通过经心内膜或经心外膜的方法进入缺血和/或非缺血心肌，或直接进入任何其它缺血组织(包括外周肢体)而输送给患者，以增强和/或促进侧支血管形成的发展，以及，因此，侧支血流到达缺血心肌或缺血肢体。

[0040]因此，根据本发明的多种实施方案，注射来自培养生长的祖细胞——无论细胞是否已用转基因转染以进一步增强其血管生成蛋白的产生——的无细胞培养基，或是作为“单独”(stand alone)治疗组合物或是和任何合适的药理学药物或其它细胞因子相结合。例如，通过加入促进血管发展和形成的血管生成生长因子，可以对无细胞培养基进行补充。例如，已发现，在体外生长7至10(或更多)日后，骨髓源祖细胞(可能仅有几种细胞系在这段时间后生长)分泌多种细胞因子——这是一种当细胞体外暴露于缺氧或与HIF-1尤其HIF-1α或MCP-1或刺激参与对缺氧的细胞应答的细胞-信号通路的其它分子接触时，可以被加强的效应。当注射入受损血流区附近的组织，或含有发育中的供应此类缺血组织的侧支的组织中时，所述条件培养基中的这些分泌的细胞因子随后刺激血管的生长和重构。这些可以是新血管(血管生成)或在所述组织中已存在但太小以至于不能形成实质性的血流(动脉生成)的血管。因此，本发明不依赖于组织的细胞转分化，所述组织中被注射入本发明的治疗组合物，但依赖于刺激新血管的形成或已存在但非常小的血管的扩张。此概念已在实验室中被检验，并显示为正确的。

[0041]如本文所使用，术语“骨髓细胞”(bone marrow cell)是指通过在细胞生长条件下培养抽吸出的骨髓(aspirated bone marrow)而产生的任何细胞。令人惊奇地，在合适的生长条件下生长7-10(或更多)天之后，如在本文中的实施例所描述以及如在本领域中已知，已有的细胞系减少为一些祖细胞细胞系。这些骨髓源祖细胞系负责将混合分泌产物分泌进入条件培养基，以及可以如本文实施例所述而被分离，并且在本领域是已知的。可以在生长7-10天后收集条件培养基，或者移除已存在的培养基并丢弃，并可以培养细胞另外的1-7(或更多)天，然后收集新的条件培养基，进行处理，以产生无细胞培养基，并如本发明使用。

[0042]任选地，使用基于存在至少一种识别表面标记的细胞筛选技术，可以从早期细胞生长培养基中分离出骨髓源祖细胞。例如，得自骨髓的血管生成祖细胞可以从初始的培养基中分离，例如，通过分选出CD34⁺细胞进行分离。可选地，CD34-细胞可以被分选并被选择。然后，使分离出的细胞生长，产生如本文所述的条件培养基。如果所述祖细胞来源于其它组织，包括外周血和脂肪组织，可以使用类似的(但不必相同的)方法。然后，使分离出的细胞生长，产生如本文所述的条件培养基。

[0043]在培养生长期间，由祖细胞分泌的细胞因子混合物的非限制性例子是VEGF、FGF、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、巨噬细胞-特异集落刺激因子(Macrophage-specific Colony Stimulating Factor，M-CSF)和胎盘源生长因子(placenta-derived growth factor，P1GF)。分泌的细胞分子的更完整的表在下表1中找到。

表1

骨髓源基质细胞表达前血管生成/前动脉生成基因产物

MCP-1＝单核细胞趋化蛋白-1；M-CSF＝巨噬细胞特异集落刺激因子；VEGF＝血管内皮生长因子；EC＝内皮细胞；和SMC＝平滑肌细胞。

[0044]研究表明，需要血管生成以支持骨髓功能和造血细胞的发育，包括干细胞和祖细胞，其可以进入循环并靶向于创伤愈合和/或缺血部位，最终有助于新血管形成。已经显示，特异地识别从成人骨髓分离出的未分化间充质祖细胞的单克隆抗体，识别发育中的微血管的细胞表面标志，并且有证据证明，此类细胞可以在胚胎血管生成中起作用(Fleming，J.E.，Jr.，Dev Dyn(1998)212：119-32)。

[0045]因此，据认为，从供体骨髓、脂肪组织或外周血或它们的组合得到的祖细胞，提供了“混合分泌产物”的天然来源，并且通过培养此类分离的祖细胞而产生的条件培养基可以令人惊奇地被用于产生治疗性血管生成，这是因为其中存在有效的可相互作用的生长因子的混合物。此外，令人惊奇地，现已发现，培养此类分离的祖细胞的无细胞条件培养基含有混合分泌产物，包括生长因子蛋白，其产生治疗性血管生成和/或肌发生。此外，通过将无细胞培养基给予受袭组织和临近的未受袭组织，可以产生对患有受损血流，如心脏或外周肢体的缺血组织的患者的治疗效果，所述无细胞培养基如下产生：培养此分离的自体或异源祖细胞，培养时间适于所述祖细胞将混合分泌产生分泌到生长培养基中；并处理所述生长培养基，以除去细胞，产生治疗性血管生成和/或肌发生，从而导致侧支血管的发育。[0046]以前已证明，来源于人皮下脂肪组织的基质细胞将支持血细胞发生(Storms等人，Blood(2000)96：685a，和Blood(2001)98：851a)。也已知循环祖细胞可以从外周血收集。通过预处理具有造血生长因子的供体，在这些步骤中可以显著增加循环祖细胞(PBPCs)的数量。在这样的活动化(mobilization)之后，仅需要三分之一的血液分离成分(aphaereses)，以从供体获得足够的细胞，用于培养。为用于本发明的方法，通过标准的血液分离术(aphaeresis technique)或其他的标准技术收集所述PBPCs，并在液氮中低温保存。相比于骨髓收获，自体或异源PBPC收集可以在患者外的环境中进行，不需要麻醉，并且可以根据需要多次重复，以获得足够的用以培养的祖细胞，从而获得在本发明的治疗方法中使用的无细胞培养基。此外，相比于骨髓收获，来自脂肪组织的自体或异源祖细胞的收集可以更简单地进行。

[0047]DMSO是通常用在冷冻外周血祖细胞(PBPCs)的方案中的冷冻防护剂。如果在培养前冷冻PBPCs，因为当注射入患者时DMSO可以导致一些不期望的副作用，所以冻融方案包括在1250g下离心冻融的PBPCs 1.5分钟，和在相同的条件下再洗涤它们1次，以洗掉DMSO。洗涤液是NaCl-葡萄糖缓冲液+10％ACD。通过标准FACS技术确定总的具核细胞的数目和特异细胞类型的比例。

[0048]人脂肪组织(AT)作为祖细胞来源较不为人所熟知，所述脂肪组织经历与脂肪量(fatmass)发展相关的新血管形成。在人AT来源的基质血管部分中，已经鉴别出CD34⁺/CD31^-细胞群体的存在，并显示出在体外表现出干细胞的分化塑性(differentiation plasticity)。为证明此类循环祖细胞(CPCs)的血管生成潜能，后肢缺血鼠模型已经被应用(A.Miranville等人，Institut fur Kardiovaskulare Physiologie，JW Goethe Universitat，Frankfurt am Main)。在裸鼠的浅和深股动脉扎结24小时后，静脉内注射新鲜分离的CD34⁺/CD31^-细胞。2周后，相比于注射CD34^-/CD31^-细胞或未注射细胞，在注射CD34⁺/CD31^-细胞后观察到缺血肢体的相对血流在统计学上显著增加。该研究显示，来自交叉物种的AT来源的分离CPCs可以施加血管生成效应。另一项研究已经证明，分离自人皮下脂肪组织的脂肪基质细胞(ASCs)，每10⁶个细胞分泌1203+/-254pg的血管内皮生长因子(VEGF)，每10⁶个细胞分泌12280+/-2944pg的肝细胞生长因子，每10⁶个细胞分泌1247+/-346pg的转化生长因子β。当ASCs在低氧条件下培养，VEGF分泌增加5倍(p＝0.0016)。从低氧ASCs获得的条件培养基显著增加内皮细胞的生长(p<0.001)。当用人ASCs治疗时，患有缺血后肢的裸鼠表现出明显的灌注改善(P<0.05)(Rehrnan J等人，Circulation(2004)Mar 16；109(10)：1292-8)。本发明的一个方面是来源于此类非自体细胞的无细胞条件培养基也可以被用于增强哺乳动物组织中血管的侧支发育。

[0049]最可能参与应答于缺血而起始血管生成的一个血管生成促进因子是HIF-1，HIF-1是一种有效的转录因子，结合并刺激参与对缺氧的反应的几个基因的启动子。HIF-I的诱导和活化由组织pO₂紧密调控。HIF-1表达随pO₂降低而呈指数增加，从而提供了正反馈环，通过正反馈环，pO₂的降低引起基因产物表达增加，所述基因产物充当对低氧环境的适应性反应。HIF-1活化导致，例如，参与糖酵解的基因红细胞生成素的诱导，和VEGF的表达。HIF-1被认为也调节许多其它基因的表达，所述基因参与对低pO₂水平的适应性反应。通过转录调节响应于低pO₂的基因，HIF-1调节参与对低氧的反应的蛋白质的水平，这种基因在启动子或增强子区内有短DNA序列，其含有HIF-1结合位点，被称为缺氧反应元件(hypoxiaresponsive element)(HRE)。

[0050]相关的是，尽管HIF-1的表达(如在Hela细胞中所确定)与pO₂呈指数性地负相关，曲线的拐点(inflection point)在氧饱和度为5％时发生，最大活性在0.5％处，1/2最大活性在1.5-2.0％处。这些相对低的缺氧水平在存在中度水平的心肌缺血或下肢缺血——即，不存在组织坏死(例如分别是心肌梗塞，和腿部溃疡)时存在的水平——可能不发生，以便增量调节可缺氧诱导的血管生成基因的表达，导致骨髓细胞分泌血管生成因子以及在此类低缺氧组织环境中增强的侧支发育。因此，在本发明的一个实施方式中，提供了在骨髓细胞中刺激缺氧反应基因的产生的方法，该方法通过共给予下述物质而进行：1)本文所描述的发明自体或异源条件培养基，和2)用编码修饰形式的HIF-1的基因转染的祖细胞，所述HIF-1在存在较高水平的pO₂下不降解，并因此是组成型活性的。

[0051]由于HIF-1α在不存在缺氧时的不稳定性，为了确保其甚至在常氧条件下的组成型活性(constitutive activity)，构建了HIF-1α基因的嵌合(chimeric)构建体，由来自HIF-1α的DNA-结合和二聚化结构域和来自单纯疱疹病毒VP16蛋白的反式激活域构成，如下面的实施例8中所描述。VP16结构域废除了HIF-1I中的泛素化位点，从而消除了对蛋白质的经蛋白酶体介导的降解。因此，得到的稳定水平的HIF-1α导致被HIF-1靶向的基因的组成型反式激活。该HIF或功能上相关形式的HIF(例如HIF-2)，或影响HIF通路而导致功能上相似效应的因子的表达，将提供存在于骨髓源条件培养基中的许多缺氧诱导的血管生成基因的最优表达。又在其它实施方式中，在其施用前，补充性HIF-1或相关物质可以被加入祖细胞来源的条件培养基中，或HIF-1可以作为蛋白或作为基因被单独注射。如果作为后者，HIF-1可以以质粒或病毒载体或以导致存在功能上相关蛋白水平的任何其它方式被注射。

[0052]HIF-1(或HIF-1I构建体)的转录活性来源于结合于特异的DNA缺氧-反应识别元件(HRE)，所述DNA缺氧-反应识别元件存在于参与细胞对缺氧的反应的许多基因的启动子中，包括VEGF、VEGFR1、VEGFR2、Ang-2、Tie-1和一氧化氮合酶。因此，HIF-1在协调组织对缺氧的反应中起重要作用。

[0053]然而，强调的是，HIF-1被用作干预的例子，所述干预能够增强祖细胞产生血管生成物质。本发明也涵盖了其它血管生成剂的使用，其通过增强HIF-1活性(即，延长其半衰期)，或者通过产生和HIF-1相似的效应，刺激祖细胞例如得自骨髓的那些细胞，从而增加血管生成因子的表达。

[0054]在还有进一步的实施方式中，本发明的治疗性无细胞培养基通过将分离的血管生成祖细胞暴露于内皮PAS域蛋白1(endothelial PAS domain protein 1(EPAS1))而制备。EPAS1和HIF-1共享高度的结构同源性和功能同源性，也被称为HIF-2。类似于HIF-1，在注射培养基之前，补充性的EPAS1可以在离体情况下被直接加入祖细胞来源的条件培养基，以刺激培养基的血管生成活性，或者EPAS1可以根据本发明方法作为蛋白或作为基因单独注射入被治疗的对象。

[0055]在根据本发明的另一种实施方案中，为了通过HIF-1刺激VEGF启动子的活性，可以将自体或异源祖细胞在培养中离体暴露于缺氧或者其它形式的能量，例如，超声、RF或电磁能。本干预增加VEGF和其它基因的表达。

[0056]目前的数据也提示了单核细胞来源的细胞因子对于增强侧支功能的重要性。单核细胞在侧支生长期间在体内被激活，并且单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotactic protein-1，MCP-1)在体外通过剪切应力被增量调节。已经显示，在侧支血管生长(动脉血管形成(arteriogenesis))和毛细血管芽生(sprouting)(血管生成)期间，单核细胞粘附于血管壁。也已经显示，在家兔慢性后肢缺血模型中，在股动脉闭塞之后，MCP-1增强侧支生长(Ito等人，Circ Res(1997)80：829-3)。在侧支生长以及毛细血管芽生中，单核细胞活化似乎起了重要作用。在试验性动脉闭塞7天之后，单核细胞经LPS的募集增加和毛细血管密度增加以及侧支和外周传导性增加相关联(M.Arms等人，J Clin Invest(1998)101：40-50.)。

[0057]因此，本发明的又一方面涉及如本文所述在合适的培养基中生长期间MCP-1对自体或异源祖细胞的离体刺激，随后通过将含由所述细胞分泌的细胞因子混合物的无细胞培养基直接输送至缺血心肌或外周器官或骨骼肌(例如，缺血肢体)，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注和肌肉功能。可以通过将生长期间的所述细胞直接暴露于蛋白质形式的MCP-1，来刺激血管生成祖细胞。

[0058]粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)是单核细胞成熟的刺激性细胞因子并且是多能造血生长因子，它被应用在临床实践上，用于多种造血病理中，如白细胞数目减少(即，白细胞减少，粒细胞减少或者单核细胞减少)，其通常响应于免疫抑制或癌症患者的化学疗法而发生。GM-CSF也被描述为在体外诱导集落形成的多谱系生长因子，所述集落形成是从红系爆式集落形成单位(erythroid burst-forming units)、嗜伊红集落形成单位(colony-forming units(CSF))和多能(CSF)以及从粒细胞-巨噬细胞CSF和粒细胞CFU形成的(Bot F.J.，Exp Hemato(1989)17：292-5)。已经显示，离体暴露于GM-CSF诱导CD-34⁺祖细胞的快速增殖(Egeland T.等人，Blood(1991)78：3192-g.)。这些细胞具有分化为血管内皮细胞的潜能，并且可以天然地参与出生后血管生成。此外，GM-CSF在巨噬细胞/单核细胞增殖、分化、运动和存活(凋亡速度降低)中行使多重刺激效应。与对骨髓源的内皮祖细胞和单核细胞的联合的已知效应一致，本发明的另一方面是，应用GM-CSF作为注射来源于如本文所述在培养基生长血管生成细胞的无细胞条件培养基的辅助治疗，以诱导新血管在缺血心血管器官中的形成和分化。而且，GM-CSF可以进一步增强注射本发明无细胞条件培养基引起的治疗性心肌血管生成，这是通过增强试剂如HIF-1、EPAS1、缺氧或MCP-1的效应而进行，如本文所述。

[0059]因此，在一个实施方案中，本发明涉及生长期间自体或异源祖细胞的离体刺激，或通过此类细胞生长而产生的无细胞条件培养基的刺激，其通过至少一种选自HIF-1、EPAS1、MCP-1、GM-CSF的化合物而进行，或通过将用在产生本发明组合物的自体或异源祖细胞在其培养中生长时直接暴露于缺氧环境而进行。所述培养自体或异源祖细胞产生的无细胞条件培养基，被输送至缺血心肌或外周器官或骨骼肌(例如缺血肢体)，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注。

[0060]然而，当一些“处于危险(at risk)”情况占优势时，自体骨髓细胞可能不产生最佳的血管生成效应，所述自体骨髓细胞是为了增强血液输送至缺血区而被注射入需要侧支血管发育的区域的。例如，有证据证明，在高胆固醇血症存在时，血管生成受到损害，伴随着衰老(aging)其也受到损害。此外，存在许多遗传性疾病和其它疾病，它们损害天然发生的血管生成过程，包括骨髓细胞的功能，这是和发现于正常青年健康个体中的血管生成过程相比而言的。

[0061]高胆固醇血症是显性遗传的遗传性病理状态，其导致显著增加的低密度脂蛋白胆固醇水平，这在出生时开始，并且导致较早年龄时的心肌梗塞。“衰老”(aging)作为术语用于此处，它不必须用年龄来评定，而是根据机体在健康状况下维持血管系统能力的退化状态来评定。然而，机体维持血管健康的能力也趋向于随时间(即，随年龄)而退化。

[0062]试验证据表明，老年人脉管系统的侧支发育受损，老年人代表了受晚期动脉硬化和组织缺血影响的最大的患者群体。例如，骨髓祖细胞(BMPCs)和HIF-1的功能均随衰老而降低。因此，在老年患者中损害侧支发育的所有的衰老相关因子(age-related factors)也将损害自体血管生成祖细胞例如骨髓源细胞的活性，所述自体血管生成祖细胞从老年患者提取，进行处理并输送至他们的缺血组织，或用于制备根据本发明的无细胞条件培养基。

[0063]根据本发明的方法，通过给予此类患者无细胞条件培养基，可以克服这些缺点，所述无细胞条件培养基通过培养从年轻健康个体得到的分离的血管生成祖细胞(来源于骨髓细胞、外周血或脂肪组织)，并处理所述条件培养基以从中除去细胞以获得无细胞条件培养基而制备。

[0064]当从自体或异源骨髓制备时，在置入生长培养基之前任选地过滤骨髓，以去除大于大约300μ至大约200μ的颗粒。也可以从过滤的ABM中分离骨髓细胞，用于生长，导致生成祖细胞。从骨髓发展至仅含一些细胞系的组合物通常所需的生长时间是约7至10天，在所述一些细胞系中是一种或一些祖细胞系。然后，可以分离骨髓源祖细胞，并且在合适的生长培养基中另外生长合适的一段时间，例如约24小时，以分泌混合分泌产物，所述混合分泌产物增强缺血组织中的血管生成和侧支灌注的发展。含混合分泌产物的条件培养基可以通过经选择以除去细胞的滤器收集，或者如在本领域中所知地处理，以基本上除去细胞，产生无细胞培养基。两种细胞生长步骤的合适培养条件都被阐述于——但不限于本文中实施例所述的那些。如果所述祖细胞来源于其它组织，包括外周血和脂肪组织，可以使用类似的(但不必相同)方法。

[0065]含血管生成祖细胞分泌的混合分泌产物的无细胞培养基的“有效量(effective amount)”，作为在此所使用的术语，是指足以刺激经历减少的血流或缺血症状的区域中侧支血流发育的量。所述无细胞培养基可以被直接给予(即注射入)患者的缺血部位或进入患者缺血部位的附近部位，以增强患者中该部位的侧支血管形成。给予本发明无细胞培养基特别有效的部位包括心肌或骨骼肌，如在腿上，以增强心脏和/或外周缺血组织中的侧支依赖性灌注。本发明的无细胞条件培养基也可以被注射入血管系统，以经血液输送至所需部位。

[0066]如本文所使用的短语“骨髓源基质细胞(marrow-derived stromal cell)”是指CD34负型/CD45负型(minus)，其可以通过培养骨髓样品获得。类似的但不必相同的细胞可以从骨髓以外的组织获得。

[0067]根据本发明产生的无细胞培养基可以被单独输送或结合其它血管形成细胞因子输送。所述无细胞培养基可以直接经心内膜或经心外膜的方法(例如经导管)进入缺血和/或非缺血心肌或直接进入任何其它缺血组织(包括外周肢体)而输送给患者，以增强和/或促进侧支血管形成的发展，以及，因此，侧支血流到达缺血心肌或缺血肢体。经植入去分化的和/或分化的心肌细胞，通过增强将提供营养流到新发育的心肌细胞的侧支的发育，该方法也可以被用于促进和/或支持新心肌的发育(心肌形成)。

[0068]本发明包括各种策略，以增强血管生成，并从而加速新血管发育进入缺血心肌或下肢(extremities)。本发明的另一方面涉及体外祖细胞的“血管生成基因表达的优化”而产生条件培养基的策略。该策略包括编码HIF-1转录因子的寡核苷酸的共施用，或体外用编码HIF-1转录因子的寡核苷酸转染所述祖细胞，以诱导对缺氧的反应中涉及的多种基因的表达。类似的方法包括共施用本发明的无细胞培养基，或用编码内皮PAS域蛋白1(EPAS1)的多核苷酸体外转染自体或异源祖细胞。该策略还包括将自体或异源祖细胞离体暴露于缺氧，以增加血管内皮生长因子(VEGF)和其它其表达通过缺氧而增加的血管生成蛋白的产生，或者通过直接注射入心脏或任何外周缺血组织，共施用无细胞条件培养基和其它证明具有血管生成活性的细胞因子(例如MCP-1)。本发明因此包括直接心肌内(经心外膜或经心内膜)或外周肌内注射无细胞条件培养基，所述无细胞条件培养基通过生长自体或异源祖细胞、刺激的自体或异源祖细胞而产生，所述刺激的自体或异源祖细胞例如由HIF-1、EPAS1、MCP-1、GM-CSF或短暂暴露于缺氧或其它形式的能量例如超声、RF(射频)、电磁能或激光能刺激。在本发明的一些实施方式中，可以通过将自体或异源祖细胞直接暴露于蛋白质形式的血管生长因子，例如任何EGFs或VEGF，刺激所述祖细胞。

[0069]这样的发现导致本发明：从骨髓、脂肪组织或外周血得到的分离的自体或异源祖细胞可以取代自体骨髓细胞，以产生具有产生血管生成效应的条件培养基。而且，使用异源供体提供的祖细胞以产生治疗性无细胞培养基的优势具有若干个。首先，缺血或老年患者不必经历麻醉以获得自体骨髓。来自年轻健康供体的骨髓产生更具活力的祖细胞，并且，为除去细胞而对异源祖细胞条件培养基的处理，使得本发明组合物具有不高于血浆的免疫原性。此外，由异源祖细胞产生的治疗组合物可以预先生产并储存，用于病人受者的直接使用。例如，治疗组合物也可以被冷冻或冷冻干燥，以便适于储存。

[0070]在下面的实施例中，阐述了本发明的一些方面。这些实施例意欲于说明，而非限制本发明。

实施例

实施例1

培养骨髓的培养基对内皮细胞增殖的效应

[0071]进行研究，确定抽吸的猪自体骨髓细胞是否分泌VEGF和MCP-1，VEGF是一种有效的血管生成因子，MCP-1近来被鉴定为重要的血管生成辅因子。体外培养骨髓四周。向培养的猪主动脉内皮细胞(PAECs)中加入培养细胞产生的条件培养基，四天后评价增殖情况。用ELISA分析条件培养基中的VEGF和MCP-1水平。在培养四周期间，BM细胞分泌VEGF和MCP-1，以致于它们的浓度以时间相关的方式增加。得到的培养基以剂量相关的方式增强PAECs的增殖。结果显示，BM细胞能够分泌有效的血管生成细胞因子如VEGF和MCP-1，并且能够诱导血管内皮细胞增殖。

猪骨髓培养

[0072]在无菌条件下从患有慢性心肌缺血的猪采集骨髓(BM)细胞，置于无防腐剂的肝素(20单位/毫升BM细胞)中，并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器顺序过滤。然后，经Ficoll-Hypaque梯度离心分离BM细胞并将其在长期培养基(long-term culture medium(LTCM))(Stem Cell Tech，Vancouver，British Columbia，Canada)中培养，温度是330℃，T-25培养瓶中带有5％的CO₂。BMCs在每一培养物中的种植密度是7x10⁶/ml。每周去除一半培养基，替换为新鲜的LTCM。将去除的培养基过滤(0.2μ过滤器)并保存在-200℃，用于随后的酶联免疫吸附实验(ELISA)和细胞增殖分析。

分离和培养猪主动脉内皮细胞

[0073]用常规方法分离新鲜的猪主动脉内皮细胞(PAECs)。使用内皮细胞生长培养基(EGM-2培养基，Clonetics，San Diego，CA)，用于所述细胞的生长，所述培养基含有2％FBS、氢化可的松、人FGF、VEGF、人EGF、IGF、肝素和抗生素，于37℃，带有5％的CO₂。当细胞在大约7天时开始汇合时，用2.5％的胰蛋白酶将其分开，其后将其培养在带有10％FBS的培养基199中。通过典型的内皮细胞形态学和通过对因子VIII的免疫组织化学染色，证实它们的身份。传代3-10次，用于增殖研究。

条件培养基对主动脉内皮细胞的效应

[0074]细胞增殖分析：经胰蛋白酶消化作用从培养瓶中移除PAECs(传代3-10次)。将分离的细胞转移至96孔培养板上，以5,000个细胞/孔的种植密度铺板。在用于增殖和DNA合成试验之前培养细胞2-3天。在4周时收集BM细胞培养物的条件培养基，合并来自7个培养瓶的培养基，用于生物分析。将合并的条件培养基的等分试样(10μl、30μl、100μl或200μl)，或LTCM(200μl，作为对照)加入96孔板中的汇合的PAECs中，重复三次。用条件培养基或对照培养基培养四天后，胰蛋白酶消化PAECs，用细胞计数器(Coulter Counter Beckman Corporation，MiamiFL)计数细胞。

条件培养基对PAEC DNA合成的影响

[0075]将来自合并样品的条件培养基的等分试样(10μl、30μl、100μl或200μl)或对照培养基(LTCM，200μl)加入96孔板中的PAECs(和上述相同的种植密度)，重复三次。2天后，向每孔加入1μCi的氚标记的胸腺嘧啶核苷。48小时后，用细胞收集器(Mach III M Tomtec，Hamden，CT)收集PAECs中的DNA，用液体闪烁计数器(Multi-deteetor Liquid Scintillation Luminescence Counter EG&G Wallac，Turku，Finland)计数放射活性。

诵过ELASA VEGF测定条件培养基中的VEGF和MCP-1

[0076]用夹心ELISA试剂盒(Chemicon International Inc.，Temecula，CA)测定在条件培养基中VEGF的浓度。简言之，将用抗人VEGF抗体预包被的平板用于结合条件培养基中的VEGF或已知浓度的重组VEGF。通过生物素化的抗VEGF抗体检测复合物，所述生物素化抗体结合于捕获的VEGF。用链亲和素-碱性磷酸酶和显色液反过来检测生物素化的VEGF抗体。抗人VEGF抗体和猪VEGF交叉反应。

用ELISA测定条件培养基中的MCP-1

[0077]用夹心酶联免疫分析试剂盒(R & D Systems，Minneapolis，MN)分析条件培养基中的MCP-1浓度：将用抗人MCP-1抗体预包被的平板用于结合条件培养基中的MCP-1或已知浓度的重组蛋白。用生物素化的抗MCP-1抗体检测复合物，所述生物素化的抗体结合于捕获的MCP-1。用链亲和素-碱性磷酸酶和显色液反过来检测生物素化的MCP-1抗体。抗人MCP-1抗体和猪MCP-1交叉反应。

结果

[0078]在4周时收集的BM条件培养基以剂量相关方式增加PAECs的增殖(图1)。这通过直接计数细胞数量和通过测定氚标记的胸腺嘧啶核苷的吸收而证实(两种测定方法均为p<0.001)。剂量相关反应证实了降支(descending limb)；与30μl和100μl相比，200μl条件培养基的增殖被降低(两个比较均为P＝0.003)。在氚标记的胸腺嘧啶核苷的吸收研究中观察到相似的剂量相关结果(和200μl相比，30μl和100μl分别是P＝0.03)。

[0079]有限数目(5±4％)的新鲜抽吸的BM细胞对VIII因子染色呈阳性。结果在图2中列出。这对照于培养4周的BM细胞的粘附层，其值是57±14％，BM细胞粘附层中的60±23％是内皮样细胞，以及40±28％似乎是巨核细胞。

[0080]在4周时期期间，BM条件培养基中的VEGF和MCP-1浓度分别逐渐增加至第一周水平的10倍和3倍(两个比较均为P<0.001)(图3)。相较之下，未暴露于BM的对照培养基中的VEGF和MCP-1水平，分别是0和11±2pg/ml，如图4所示。

实施例2

缺氧对培养的猪骨髓细胞分泌VEGF的影响

[0081]证实了缺氧显著增加经培养的骨髓内皮细胞的VEGF表达，结果提示，离体暴露于缺氧，通过增加缺氧诱导的血管生成因子的表达，可以进一步增加欲在缺血肌肉组织中注射的骨髓细胞及其条件培养基的侧支增强效应。采集猪骨髓并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器顺序过滤。然后用Ficoll-Hypaque梯度离心分离BMCs并在33℃培养，T-75培养瓶中的CO₂是5％。当细胞在大约7天发生汇合时，它们经胰蛋白酶消化1：3分离。培养4周之后，将BMCs或是暴露于缺氧条件(放置在含有1％氧的容器内)24至120小时，或是维持在正常条件下。收集得到的条件培养基，经ELISA分析VEGF、MCP-1。

[0082]暴露于缺氧显著增加VEGF分泌：在24小时，VEGF浓度从常氧下的106±13pg/ml增加至缺氧条件下的1,600±196pg/ml(p＝0.0002)；120小时之后，其从4,163±62pg/ml增加至6,028±167pg/ml(p<0.001)。在新鲜分离的BMCs中进行了分别的研究，发现了相同的趋势。缺氧也减慢了BMCs的增殖速度。MCP-1表达不被缺氧增加，这不是出乎意料的发现，原因是已知其启动子没有HIF结合位点。

实施例3

骨髓培养基对内皮细胞管道形成的效应

[0083]证明了，用猪内皮细胞和血管平滑肌细胞共培养技术，骨髓细胞的条件培养基诱导结构血管管道在体外形成。在不暴露于骨髓条件培养基时，没有观察到对血管管道形成的这种效应。结果提示，骨髓细胞和它们分泌的因子发挥了促血管生成(pro-angiogenic)效应。

实施例4

在慢性心肌缺血模型中，

经心内膜输送自体骨髓对侧支灌注和局部功能的影响

[0084]通过在冠状动脉左回旋支周围植入渐进性缩窄器(ameroid constrictors)，在14头猪中造成慢性心肌缺血。植入4周后，7个动物经历用经心内膜(transendocardial)注射导管将新鲜抽吸的ABM经心内膜注射入缺血区(每个动物2.4ml，在12个位点注射)，7个对照动物用肝素化的盐水注射。在基线和4周之后，动物经历静息和起搏超声心动图(rest and pacing echocardiogram)以便评价局部收缩性(心肌增厚的％)，微球体研究(microsphere study)以便评价静息时和腺嘌呤核苷输注期间的侧支依赖性灌注。注射ABM4周之后，在ABM处理的猪中侧支血流(表示为缺血区/正常区的比值×100)改善，但是在对照组中不改善(ABM：静息时95±13对81±11，P＝0.017；腺嘌呤核苷输注期间85±19对72±10，P＝0.046；对照组：静息时86±14对86±14，P＝NS；腺嘌呤核苷输注期间73±17对72±14，P＝0.63)。相似地，ABM处理的猪中收缩性增加，但是在对照组中不增加(ABM：静息时83±21对60±32，P＝0.04；起搏期间91±44对35±43，P＝0.056；对照：静息时69±48对64±46，P＝0.74；起搏期间65±56对37±56，P＝0.23)。

[0085]结果提示，基于导管经心内膜注射ABM可以增加缺血心肌的侧支灌注和心肌功能，所见提示，本方法可以构成新的治疗策略，用于获得最佳的治疗性血管生成。

[0086]将14头无特殊病原体(specific-pathogen-free)的重量大约是70kg的家猪麻醉、插管，以及贯穿整个手术过程以2L/分钟接受补充的O₂和1-2％异氟醚吸入。通过右股动脉分离并插入一个8French的鞘，介入动脉。通过左侧胸廓切开术分离左回旋动脉，在动脉的极近端部分植入包有金属的(metal encased)渐进性缩窄器。渐进性缩窄器植入4周后，所有的猪经历(1)选择性的左冠状血管造影术和右冠状血管造影术，用于验证渐进性闭塞(ameroid occlusion)和评价侧支血流；(2)经胸超声心动图研究；和(3)局部心肌血流评价。

骨髓抽吸和制备以及心肌内注射

[0087]完成基线评估之后即刻，所有的动物经历用标准技术从左股骨干的BM抽吸。应用无防腐剂的肝素化玻璃注射器(20单位肝素/1ml新鲜BM)，BM获自抽吸的2个位点(每个位点3ml)。用300μ和200μ的不锈钢过滤器，立即顺序粗过滤(macro-filtered)吸出的骨髓。然后，用经心内膜注射导管在12个位点将骨髓注射入心肌(每个注射位点0.2ml，共2.4ml)，所述位点涉及缺血心肌区域及其边界区。

超声心动图研究

[0088]在基线和起搏期间，在基线和ABM植入后4周的追踪评价(follow-upevaluation)期间，记录动物在中乳头肌水平处的经胸超声心电图成像短轴和长轴视图。通过测定壁增厚百分数(收缩末期厚度减去舒张末期厚度/舒张未期厚度)×100得到短轴缩短率(fractional shortening)的测定值。这些测定值是从缺血区(外侧区(lateral area))和远部区域(隔前区(anterior-septal area))得到的。随后，经右股静脉鞘插入临时起搏器电极，并定位在右心房。使动物心率起搏为180次/分钟，持续2分钟，同时记录超声心动图成像。

局部心肌血流

[0089]用多重荧光显色微球体(multiple fluorescent coloredmicrospheres)(Interactive Medical Technologies，West Los Angeles，CA)，在静息时和最大冠脉舒张时进行局部心肌血流测定，并且通过参照样品技术(reference sampletechnique)(Heymann MA，et al.，Prog Cardiovasc Dis 1977；20：55-79)定量。经6FJudkins left 3.5诊断导管，将荧光微球体(0.8ml，5×10⁶微球体/ml，在带有0.01％吐温(Tween)80的生理盐水悬浮液中的直径是15μm)注射入左心房。最大冠脉舒张是通过输注腺嘌呤核苷诱导的，输注为恒定速度140μg/kg/分钟(Fujisawa USA，Deerfield，IL)，在6分钟期间进入左股静脉。在输注的最后2分钟期间，以与静息研究的相同方式，进行微球体注射和血液参照抽取(blood reference withdrawal)。

[0090]灌注评价完成之后，用过量的戊巴比妥钠和KCL处死动物。获取心脏，用Ringer Lactate冲洗，灌注固定10-15分钟，随后用10％缓冲的甲醛浸泡固定3天。固定完成之后，沿短轴将心脏切割为7mm厚的切片。将2个中央切片中的每一个分为8个相似大小的楔形物，进一步将其切割为心内膜和心外膜亚段。用平均8个外侧部缺血区和8个间隔正常区(septal normal zone)亚段的测定值来评价心内膜区和心外膜区的心肌血流。相对的侧支血流也被计算为缺血区/非缺血区(IZ/NIZ)血流的比值。

组织病理学

[0091]为了评价通过应用注射导管来注射BM抽吸物是否和机械性细胞损伤相关，在用和体内研究相似的注射压力推入新鲜过滤的ABM抽吸物之前和之后，制备标准的BM涂片(smears)。由独立的有经验的技术人员进行形态学评价，所述技术人员不知道本研究方案。

[0092]对样品心脏组织进行组织病理学评价。在先导研究中，在UV光下检查7mm厚的短轴切片，以鉴定荧光标记的区域。将每一被鉴定的区域切割为3个完整厚度的相邻的块(中央，右侧和左侧)，将其浸泡固定在10％的缓冲甲醛中。随后，将每一这样的块切为3个水平，其中2个用苏木精和伊红(H&E)染色，一个用PAS染色。此外，从每一动物的缺血区获得一个新鲜荧光标记的组织块，包埋入OCT化合物(Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA)并在液氮中冷冻。将这些骤冷心肌组织的冷冻切片风干，用丙酮固定。用自动Dako免疫染色仪(Dako，Carpenteria，CA)进行免疫过氧化物酶染色(Immunoperoxidase stain)。用3％过氧化氢酶和10％的卵清蛋白封闭内源性过氧化物酶和非特异性吸收。用抗CD-34的单克隆小鼠抗体(Becton Dickinson，San Jose，CA)作为一抗。连接抗体是生物素化的山羊抗小鼠IgG抗体，三抗是和马辣根过氧化物酶连接的链亲和素。用二氨基联苯胺(DAB)作为发色原，并用1％的甲基绿复染切片。脱水和清洗之后，安装切片并用Nikon Labphot显微镜检查切片。

[0093]在功效研究中，将来自缺血区和非缺血区的完整厚度的1.5平方厘米的切片进行处理获得石蜡切片。用H&E、Masson氏三色染色(Masson′s trichrome)和因子VIII相关抗原对每一样本染色。将免疫过氧化物酶染色的切片用于研究内皮细胞群的密度和血管化。后者通过存在管腔而区分于前者。用来自缺血和非缺血心肌内侧半部的5个因子VIII染色切片的显微照片样品评价血管状态。用相同显微照片的数字化成像来评价内皮细胞的密度。用阈强度法(intensity thresholdmethod)，通过Sigma-Scan Pro形态学测定软件确定内皮细胞群的密度。每一样本(sample)和每一样品(specimen)的总内皮面积随同相对的内皮面积百分数(内皮面积/研究的心肌的面积)一同获得。总内皮面积也被计算为，研究的心肌的非梗塞(能存活的)面积的相对百分数。将三色染色的切片数字化，用Sigma-Scan Pro测定蓝染胶原蛋白占有的面积以及除心外膜(其通常含有胶原蛋白)占据面积之外的切片的总面积。然后，将梗塞面积计算为蓝染占有的面积。

操作数据(Procedural Data)

[0094]用ABM或安慰剂进行的心肌内注射与平均血压、心率的任何急性变化或心律失常的导入均不相关。在两组之间，所有的血液动力学参数具有可比性(comparable)。配对比较显示了：和追踪过程相比，每一组内有相似的血液动力学参数指标；除了对照组中追踪时的较高起始平均动脉压(p＝0.03)之外，其在起搏或腺嘌呤核苷输注期间没有后续差异。

心肌功能

[0095]局部心肌功能评价显示于下面的表2中。预干预相关的梗塞壁肥厚——表示为静息时和起搏期间缺血区与非缺血区(IZ/NIZ)的比值×100，在两组间是相似的(分别是P＝0.86和0.96)。心肌内注射ABM 4周后，在静息时和起搏期间发生局部壁增厚的改善，这是由于侧支依赖的缺血侧壁的壁增厚增加了约～50％。尽管在追踪时的起搏期间在缺血区观察到了壁增厚改进的趋势，在对照动物中没有观察到显著的变化。

表2.缺血壁的局部收缩性

ABM是指自体骨髓(autologous bone marrow)

心肌灌注数据

[0096]局部心肌灌注评价显示于下面的表3中。在静息时和腺嘌呤核苷输注期间，预干预相关的透壁心肌灌注、IZ/NIZ在处理组和对照组之间没有差异(分别是P＝0.42和0.96)。ABM注射4周后，静息和起搏期间的相对局部透壁心肌灌注显著改进。这是由于静息(增加75％，P＝0.08)和腺嘌呤核苷输注期间(37％，P＝0.09)缺血区心肌灌注的绝对改善，而在静息(增加35％，P＝0.18)或腺嘌呤核苷输注期间(增加25％，P＝0.26)在非缺血区没有观察到绝对血流的显著变化。在静息时，见于缺血区的局部心肌血流增加由心内膜(73％)和心外膜(62％)的局部改善构成，在腺嘌呤核苷输注期间有一些较小的改善(两个区均为40％)。在4周时，和预干预值相比，对照组在缺血区和非缺血区的透壁、心内膜或心外膜灌注上没有差异。

表3.局部心肌灌注

ABM是指自体骨髓。

组织病理学和血管状态评价

[0097]对过滤的抽吸物通过注射导管之前和之后的BM涂片的评价揭示了正常结构，不存在大的聚集物和没有细胞碎片或扭曲细胞形状的证据。注射后第1天的组织病理学揭示了急性损害，其特征是纤维蛋白和具有分散细胞浸润的炎症通路(inflammatory tract)。浸润物被表征为单核细胞，其在形态学上无法和BM浸润物区分开来。细胞结构(cellularity)在3天和7天达到最大，随后经时间而衰退。在3周时，和0.2ml相比，0.5ml注射位点处看到更多的纤维化。在显示出最大细胞浸润的切片中进行CD-34免疫染色，该染色被设计为鉴定BM来源的祖细胞。总之，估计4-6％的细胞浸润物对CD-34显示阳性免疫活性。

[0098]占据总共>10％的经检测的缺血心肌的小面积的斑状坏死在两组中均表征了缺血范围。非缺血区显示了正常心肌结构。比较两组的组织形态学特征的变化。任意血管占据的总面积以及直径>50μm的血管数目没有差异。然而，在两组间，缺血区域对非缺血区域中，因子VIII染色阳性的总面积(带有管腔和不带有管腔的内皮细胞)的比较显示了差异。在ABM组中，缺血的侧支依赖区的内皮细胞总面积比非缺血区观察到的总面积高100％(11.6±5.0对5.7±2.3％面积，P＝0.016)，而对照组中没有显著差异(12.3±5.5对8.2±3.1％面积，P＝0.11)。然而，在两组的缺血和非缺血区，血管状态的其它参数，包括任意血管占据的面积百分数和>50μm的血管数目是相似的。

实施例5

在心肌缺血动物模型中，

诵过预给予GM-CSF体内刺激的骨髓细胞的效应

[0099]通过在冠状动脉左回旋支周围植入渐进性缩窄器，在16头猪中造成慢性心肌缺血。渐进性缩窄器植入4周减3天后，8个动物经历皮下注射GM-CSF连续3天(剂量是每日10μg)，随后(在第4天和渐进性缩窄器植入后恰好4周)用经心内膜注射导管将新鲜抽吸的ABM经心内膜注射入缺血区(每个动物2.4ml，在12个位点注射)，未用GM-CSF刺激的8个对照动物用肝素化的盐水注射。在基线和4周之后，动物经历静息和起搏超声心动图以评价局部收缩性(心肌增厚的百分数)，并经历微球体研究以评价静息时和腺嘌呤核苷输注期间的侧支依赖性灌注。注射ABM 4周之后，在ABM处理的猪中，侧支血流(表示为缺血区/正常区的比值×100)改善，但是在对照组中不改善(ABM：静息时85±11对72±16，P＝0.026；腺嘌呤核苷输注期间83±18对64±19，P＝0.06；对照组：静息时93±10对89±9，P＝0.31；腺嘌呤核苷输注期间73±17对75±8，P＝0.74)。相似地，ABM处理的猪中收缩性增加，但是在对照组中不增加(ABM：静息时93±33对63±27，P＝0.009；起搏期间84±36对51±20，P＝0.014；对照：静息时72±45对66±43，P＝0.65；起搏期间70±36对43±55，P＝0.18)。

[0100]结果提示，基于导管经心内膜注射ABM——所述ABM通过系统给予GM-CSF 3天在体内被预刺激，可以增加缺血心肌的侧支灌注和心肌功能，所见提示，本方法可以构成新的治疗策略，用于获得最佳的治疗性血管生成。

实施例6

猪骨髓培养

[0101]在无菌状态下从猪采集骨髓细胞(BMCs)，置于无防腐剂的肝素中(20单位/ml BM细胞)，并用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器顺序过滤。然后，用Ficoll-Hypaque梯度离心分离BMCs，种植在T-75烧瓶中，在长期培养基(LTCM)(Stem Cell Tech，Vancouver，British Columbia，Canada)中培养过夜，温度是33℃，T-75培养瓶中带有5％的CO₂。然后，改变培养基和洗掉非附着细胞。附着的细胞(即，“早期附着细胞”)大多数是单核细胞、内皮前体细胞或其它造血系细胞。早期附着细胞中的单核细胞中的是骨髓源基质干细胞。通过1ac-Z染色试验，通过表达标记物蛋白，这些细胞显示出对腺病毒是允许的(permissive)。

[0102]BMCs在每一培养皿中的种植密度是7×10⁶/ml。当细胞在大约7天开始汇合时，通过0.25％胰蛋白酶将它们分离为1：3。传代3-8次，用于研究。

腺病毒转染

[0103]首先在6-cm的皮氏培养皿(Petri dishes)中培养BMCs 3至14天，允许产生粘附于皮氏培养皿的早期附着细胞层。在开始种植后的一天，冲去非-黏附细胞。然后，用编码一种或多种细胞因子、生长因子或其它哺乳动物血管生成促进因子的载体接种早期附着细胞，所述其它哺乳动物血管生成促进因子如同但不限于转录因子HIP-1或HIF-2。此接种可以发生于种植后的从3至28天，例如，从3至12天或3至8天。接种后大约2小时至3天，从转染的细胞洗去病毒。随后，转染的细胞可以被注射入患者的靶组织，如心脏的肌肉或腿部的肌肉。

实施例7

MSCs具有体外分泌生物活性的侧支-增强因子(collateral-enhancingfactors)的能力

[0104]作为下面的假设的可行性的第一个试验，分离小鼠MSCs，并连续地分析条件培养基的细胞因子产量(图5)，所述假设为1)来源于骨髓源细胞的条件培养基本身可以增强侧支血流和2)MSCs的HIF-1转导增加所述细胞的血管生成潜能。

[0105]更具体地，从小鼠的股骨和胫骨采集单核骨髓细胞，并用Ficoll密度梯度分离单核成分。培养细胞10天，用双磁珠技术(double magnetic bead technique)，从异源培养细胞分离CD34负型/CD45负型细胞。此分离方法涉及，通过用经商业可得的这些标志物的抗体标记的磁珠，阴性(negatively)选择不表达细胞标记物CD34和CD45的细胞。

[0106]将MSCs从异源培养的细胞中纯化出来。CD34负型-/CD45负型-成分被分离出来，这是通过用FITC-标记的抗-CD34抗体(Pharmingen，San Diego，CA)标记，随后通过和抗-FITC及抗-CD45磁珠(Miltenyi Biotech，Sunnyvale，CA)同时温育实施的。将细胞通过磁柱，收集双阴性成分。随后，分别培养磁珠-阴性(bead-negative)和磁珠-阳性群。磁珠-阴性群显示了MSCs的典型的成纤维样形态，而磁珠-阳性群似乎主要由小的球形细胞构成，与淋巴系造血细胞(lymphohematopoietic cells)一致(图5A和5B)。进行FACS分析，证实细胞不表达淋巴系造血细胞特有的表面标记CD31、CD34、CD45、和CD117，但是确实表达骨髓源基质细胞特有的高水平的CD44(95±0.6％)和CD90(99.1±0.1％)和CD105(89±2.1％)。

[0107](这些CD34负型/CD45负型细胞在此也称为“骨髓源基质细胞(marrow-derived stromal cells)”或“MSCs”)。重新铺板分离的MSCs，随后收集条件培养基24小时。

[0108]通过ELISA分析如上制备的条件培养基中血管生成细胞因子的存在情况。用总细胞培养蛋白校正细胞因子水平。数据反映了至少3个不同的细胞群，每一细胞群含有从2个小鼠合并的细胞。结果显示(图5)，MSCs表达这样的已知的侧支增强因子如VEGF、MCP-1和bFGF(也是血管生成素-1和PDGF(未显示))。与之对照，CD34+细胞(内皮祖细胞)不表达这些因子。

[0109]也检测了分泌入培养MSCs的培养基中的细胞因子的功能，这是通过检测他们引起内皮细胞增殖的能力进行的。收集如上制备的MSC-条件培养基，发现其确实增加了培养的人脐静脉内皮细胞的增殖。将MAECs或SMC’s(1×10⁴/孔)铺板在24孔板中24小时，在带有0.1％胎牛血清的MEM中。然后，用变化的稀释度的MSC^CM或仅带有DM-10的对照孔替代培养基。持续培养72小时，其后，回收细胞，用Coulter计数器计数。数据报告为相比于对照组的增殖变化的均数百分数。

MSCs和MSCs的条件培养基增加了小鼠缺血后肢的侧支血流

[0110]用本领域的已知方法，使12周龄的Balb/C雄性小鼠经历右股动脉末端扎结(right distal femoral artery ligation)。24小时后，小鼠被随机分为3组——一组接受如上述制备的来自同系小鼠(syngeneic mice)的1×10⁶MSCs，一组接受分离自同系小鼠的1×10⁶成熟内皮细胞，以及一组接受非条件培养基，注射入缺血后肢的内收肌。在随后的28天，应用激光多普勒灌注成像(LDPI)追踪缺血后肢血流恢复(图6)。

[0111]显示于图6的这些试验的结果证实了，注射MSCs入缺血后肢的内收肌显著增加了测支血流，这种效应在注射成熟内皮细胞时未发现。更重要的是，发现了当将条件培养基本身(无细胞)注射入缺血后肢，侧支血流增加。这是第一个概念验证(first proof-of-concept)：即，通过将骨髓源细胞的条件培养基注射入发育中的侧支的区域，可能增加侧支发育。

MSCs转导后，细胞存活和基因产物表达的证实

[0112]作为确定MSCs是否为遗传改变(genetic alteration)提供了合适的靶的起始步骤，检测了用腺病毒载体离体转导后MSCs的原位存活。为此目的，进行了两个分别的试验，一个应用含有编码绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒，一个含有编码β-半乳糖苷酶的基因。如上制备的MSCs被离体转导。初步研究确定，超过90％的MSCs被成功地用含有报告转基因的腺病毒转导，MOI是150(数据未显示)。为追踪蛋白表达，用Ad.GFP或Ad.β-半乳糖苷酶温育细胞，MOI是150，温育2小时，洗涤3次，回收并立即注射入内收肌(术后24小时)。为了追踪注射的GFP+/MSCs的命运，用Nikon倒置荧光显微镜检测内收肌和小腿肌的多个切片。为了追踪β-gal+/MSCs的命运，用商业上可得的X-gal试剂盒(Invitrogen)显影切片并立即注射入小鼠的内收肌，所述内收肌在之前经历了股动脉扎结24小时。在第3天、第7天和第14天，处死小鼠。随后检测内收肌切片，或是在荧光显微镜下，或是用X-gal染色，这取决于本领域中已知的合适方案。

[0113]在第3天，很少有细胞被发现表达所需基因。然而，在第7天和持续至第14天，发现表达所需基因的许多细胞分布于整个内收肌组织。

[0114]因此，该试验不仅在转录/翻译机制上证实了细胞存活和保存，也证明了MSCs可以被用作载体，以将所需基因导入特定组织，如肌肉组织。

MSCs的体外HIF-1α/VP16转染导致侧支增强相关因子的增加大于缺氧诱导的增加

[0115]如上所述分离和铺板小鼠MSCs。比较3组MSCs。组1——MSCs培养在常氧条件下；组2——MSCs培养在1％O₂中，组3——MSCs用如上制备的编码HIF-1α/VP16的腺病毒转染。将MSCs和病毒温育2小时，感染倍数(感染复数(multiplicity of infection))是200，随后培养48小时，以留出用于基因表达的时间。

[0116]随后，从所有3组细胞收集培养物-条件培养基24小时。用商业上可得到的ELISA试剂盒，分析培养基中血管生成细胞因子VEGF和β-FGF的存在情况。用总细胞培养蛋白校正细胞因子水平。图7中显示的结果说明，HIF-1I/VP16转染增加了VEGF和βFGF由MSCs表达和分泌，达到基本上大于缺氧时得到的水平。[0117]浸泡这些培养细胞的培养基(MSC条件培养基或MSC^CM)也被加入到内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)培养物，以评价MSC^CM对细胞增殖的效应。小鼠主动脉内皮细胞(MAECs)分离如下。在无菌条件下，解剖小鼠胸主动脉(n＝10)，移除外膜，然后切成1-2mm的环状物。然后，在37℃下用0.25％胰蛋白酶温育环状物20分钟，随后冲洗和收集悬浮细胞。这些细胞培养在补充有10％FBS的极限基本培养基(Minimal Essential Media)中。细胞均一地对因子VIII呈阳性。用修改的前述方案分离平滑肌细胞(SMC’s)。简言之，如上收集MAECs后，加入溶于Hanks平衡盐溶液(1mg/ml)中的胶原酶，37℃温育达3小时，每15-30分钟轻柔搅拌。再次收集悬浮细胞，冲洗和重悬浮在补充有10％FBS的培养基199(Medium 199)中。细胞均一地对平滑肌肌动蛋白染色。两种细胞均传代3-8次，用于本研究目的。

[0118]当与来自正常氧和缺氧条件下的MSCs的MSC^CM比较时，来自HIF-1α/VP16-转导的MSCs的MSC^CM增加EC增殖(290％对31％对79％，与对照培养基中的增殖比较，p<0.001)和SMC增殖(220％对26％对58％，p<0.001)。

MSCs的HIF-1α/VP16转染导致侧支血流增加。

[0119]其后，研究了在小鼠后肢缺血模型中，MSCs的HIF-1α/VP16转导对侧支血流的影响。一组动物(如上)接受1×10⁵非转导的MSCs，一组接受HIF-1I/VP16-转导的细胞，第3组接受培养基。如上述监测缺血肢体的血流。21天间收集的结果显示(图8)，和用非转导的MSC处理的小鼠中观察到的情况相比，用转导的MSCs处理的小鼠证实了侧支血流恢复的一致的较大增加。

[0120]总之，这些实验显示了，1)当注射入缺血后肢，条件培养基本身(无细胞)增强侧支血流(概念的第一证据：通过将骨髓源细胞的条件培养基注射入发育中的侧支区可能增加侧支发育)；2)用腺病毒载体中的HIF-1α/VP16转染显著和明显地增加了MSCs的体外血管生成效应。重要的是，体内研究提示，和单独注射MSCs相比，本策略导致侧支改善效应增加。这些研究提示，用HIF-1α转导MSCs(和最可能地，也用编码其它血管生成相关细胞因子如FGF家族蛋白和NOS转导)使基于细胞策略的侧支增强效应最佳化，用于增加缺血组织的侧支血流。

人类患者的治疗

[0121]用无防腐剂的肝素化玻璃注射器(20单位肝素/1ml新鲜BM)，从髂嵴抽吸骨髓(～5ml)。立即用300μ和200μ的不锈钢网孔过滤器顺序粗过滤抽吸的骨髓。将所述骨髓保持在标准抗凝血/抗凝集液(含柠檬酸钠和EDTA)中并在无菌培养基中保持在4℃，直至其使用时。有经验的血液病学家将在无菌条件下实施该过程。评价骨髓涂片以证实骨髓制备物的正常组织形态学。

[0122]自体或异源条件培养基如下所述制备。

[0123]可以应用向心肌输送试剂的几种方法中的任意方法，以将无细胞条件培养基输送至患者。这些方法包括直接经心外膜输送，如可以用手术方法实施(例如但不限于，经胸壁切开或经胸壁插入针或其它输送设备，或通过胸腔镜)，或通过几种经皮操作中的任意一种。下面是经皮输送的一个例子。应该强调的是，下面的例子不意味着，将输送的选择限制为例子中描述的具体的基于导管的平台系统——可以应用任何基于导管的平台系统。

[0124]应用标准的经皮冠状动脉成形术操作，将至少SF的导入鞘(introducersheath)插入右股动脉或左股动脉。插入动脉鞘之后，在整个LV绘图和注射无细胞条件培养基期间，给予肝素并随需要而补充，以维持ACT200-250秒。在手术期间以不长于30分钟的间隔，以及在手术结束时，检查ACT，以检验本要求的一致性。

[0125]在标准的RAO和/或LAO视图中，进行左心室造影术以协助引导NOGA-STAR3和注射导管，用NOGA-STAR3导管得到LV电-机械图。8FINJECTION-STAR导管以倒退(retrograde)方式经股动脉鞘放置于主动脉瓣中。完全末端偏转(full tip deflection)之后，将圆形的远侧末端轻轻地穿过主动脉瓣下垂，一旦位于LV腔内，将其适当地伸直。

[0126]使导管(并入了电磁末端传感器)定向于处理区之一(例如，前部、侧部、下后部或其它部位)。利用NOGA3系统的安全性质，仅当稳定信号表明LS值<3时，允许针插入并注射。单独注射0.2cc无细胞条件培养基，将通过经心内膜途径输送至多达两个处理区的范围，在两个注射位点之间不近于5mm。注射位点的密度将取决于个体对象的LV心肌内解剖情况和在心内膜表面获得稳定定位，而没有导管移位或室性期前收缩(PVCs)的能力。

[0127]根据本发明方法，在一个实施方式中，给予有效量的获自血管生成祖细胞的自体或异源无细胞条件培养基，用于治疗。如有经验的实施者将理解，给予的量将取决于许多因素，包括但不限于，意图的疗法、被治疗的病理状态的严重程度、欲被治疗的面积的大小和范围等等。关于根据本发明的治疗，代表性的方案将是，在从大约12至大约15次注射中的每一次中，给予从大约0.2至大约0.5ml的无细胞条件培养基的量，给予的无细胞条件培养基总计是从大约2.4至大约6ml。给予的每一剂量将优选地包括从大约1至大约2体积百分比的肝素或其它血液抗凝剂，如华法林钠。当所述无细胞条件培养基被刺激和/或和本文描述的其它血管生成因子联合给予时，每次剂量中存在的无细胞条件培养基的量应大约相同，和/或给予的总无细胞条件培养基应和上述量大约相同。如上所述，通过浓缩以含有效量的无细胞条件培养基，实践者可以调节无细胞条件培养基的浓度，这取决于注射位点的数量和间隔以及被治疗的具体病症的需求。

[0128]无细胞条件培养基将被注射入心肌，即在治疗性心肌血管生成或治疗性肌生成中，所述无细胞条件培养基带有或不带有任何输送形式的刺激因子，或带有或不带有自体或异源祖细胞，所述自体或异源祖细胞用于制备条件培养基，已用携带有转基因的载体转染，所述转基因被设计为增强无细胞条件培养基的血管生成效应，这是应用任何基于导管的经心内膜注射设备或通过外科(开胸)经心外膜胸廓造口术，或允许经心外膜输送的任何其它方法实施的。在治疗肢体缺血的情形下，所述无细胞条件培养基将通过直接注射无细胞条件培养基或其要素，转移进入腿部肌肉，所述无细胞条件培养基或其要素带有或不带有其任何输送形式的离体或体内刺激。

[0129]每个治疗位点的注射量可能是在每个注射位点0.1-5.0cc范围之间，这取决于具体的无细胞条件培养基产物和缺血状态的严重程度和注射的位点。注射的总数将可能是每疗程1-50个注射位点范围之间。

[0130]在另一个实施方式中，等效量的无细胞条件培养基(考虑由于患者的血液所致其被稀释倍数)将被注射入治疗位点附近的脉管系统，所述无细胞条件培养基带有或不带有任何输送形式的刺激剂，或带有或不带有自体或异源祖细胞，所述自体或异源祖细胞用于制备条件培养基，已用携带有转基因的载体转染，所述转基因被设计为增强无细胞条件培养基的血管生成效应。在这种情况下，血流将输送无细胞条件培养基至治疗位点。

[0131]可以用其它具体形式实施本发明，而不背离其精神或主要特性。因此，对本发明的前面的描述仅仅公开了其代表性实施方案，其它变化被预期在本发明的范围内。因此，本发明不限于此处详述的具体实施方案。而是，应该参照所附的权利要求作为本发明范围和精神的指示。

[0132]前面的具体实施方案例证了本发明实践。然而，应该理解，可以应用本领域技术人员已知的或此处公开的其它方法，而不背离本发明的精神或所附权利要求的范围。

Claims (42)

1.产生可用于在需要的患者中增强侧支血管发育的组合物的方法，所述方法包括：

a)使选自骨髓、脂肪或外周血祖细胞的分离的自体或异源祖细胞在合适的生长培养基中，在合适的培养条件下生长一段时间，所述时间足以促进所述祖细胞分泌混合分泌产物，从而获得条件培养基；和

b)处理所述条件培养基，以获得基本上无细胞的条件培养基。

2.权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞被培养生长约7至10天。

3.权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞被培养生长约7至25天。

4.权利要求3所述的方法，进一步包括使所述祖细胞暴露于缺氧气氛。

5.权利要求4所述的方法，其中所述暴露进行约24至约72小时。

6.权利要求4所述的方法，其中所述缺氧气氛包括约1％至约3％的氧。

7.权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞包括祖细胞类型的混合物。

8.权利要求1所述的方法，其中所述祖细胞包括CD34⁺或CD34^-祖细胞。

9.权利要求1所述的方法，在a)之前还包括，

从人供体获得异源骨髓；和

在合适的培养条件下培养所述异源骨髓一段时间，所述时间足以促进所述骨髓中的细胞产生所述祖细胞。

10.权利要求9所述的方法，其中所述骨髓细胞的培养进行约7至25天。

11.权利要求9所述的方法，其中所述骨髓被过滤，以在所述培养之前除去大于约300μ至约200μ的、不需要的颗粒。

12.权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述祖细胞在所述生长期间经历缺氧气氛。

13.权利要求1所述的方法，进一步包括使所述祖细胞经历缺氧气氛，或与缺氧诱导因子-1(HIF-1)或单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)接触。

14.权利要求13所述的方法，其中所述HIF-1是在非缺氧条件下稳定的HIF1α/VP16构建物。

15.权利要求1所述的方法，进一步包括在b)之前，用一种或多种多核苷酸转染至少一些所述祖细胞，以及培养所述转染的细胞以在培养中产生血管生成蛋白，其中，所述一种或多种多核苷酸编码选自HIF-1、EPAS1、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、PR39、一种成纤维细胞生长因子(FGF)或一种一氧化氮合酶(NOS)的血管生产蛋白。

16.权利要求1所述的方法，进一步包括使所述无细胞条件培养基经受缺氧气氛或至少一种选自EPAS1、MCP-1、GM-CSF、PR39、一种EGF或一种NOS的血管生成蛋白的刺激。

17.权利要求1所述的方法，在a)之前进一步包括：

从供体获得血管生成脂肪组织；和

处理所述脂肪组织，以在培养所述祖细胞之前从其获得所述祖细胞。

18.权利要求1所述的方法，其中所述处理包括使用大小适于从其中除去细胞的过滤器过滤所述培养基。

19.治疗组合物，当注射入受损血流的部位时其用于在需要的患者中增强侧支血管发育，所述组合物包括：

无细胞条件培养基，其包括有效量的自体或异源血管生成祖细胞的混合分泌产物。

20.权利要求19所述的组合物，其中所述血管生成祖细胞从骨髓细胞、外周血细胞或脂肪细胞获得。

21.权利要求19所述的组合物，其中所述血管生成祖细胞包括CD34⁺/CD34^-细胞。

22.权利要求19所述的组合物，其中所述祖细胞对于所述患者是异源的。

23.权利要求22所述的组合物，其中所述组合物被冷冻干燥。

24.权利要求22所述的组合物，其中所述组合物被冷冻。

25.权利要求19所述的组合物，其中所述祖细胞对于所述患者是自体的。

26.权利要求19所述的组合物，其中所述祖细胞从来自所述供体的脂肪组织或血液获得。

27.权利要求19所述的组合物，其中所述祖细胞从抽吸自所述供体的骨髓获得。

28.权利要求19所述的组合物，进一步包括一种或多种选自HIF-1或MCP-1的血管生成蛋白。

29.权利要求19所述的组合物，进一步包括一种或多种选自EPAS1、MCP-1、GM-CSF、PR39、一种FGF或一种NOS的血管生成蛋白。

30.权利要求19所述的组合物，其中所述供体是人。

31.权利要求19所述的组合物，进一步包括含有所述无细胞培养基的容器。

32.试剂盒，包括：

包含在容器中的权利要求19所述的组合物；和

使用所述组合物在哺乳动物中受损血流部位处增强侧支血管发育的说明书。

33.权利要求32所述的试剂盒，其中所述祖细胞是人的。

34.权利要求33所述的试剂盒，其中所述祖细胞是CD34+祖细胞。

35.在需要的患者中增强侧支血管形成的方法，所述方法包括：

直接将权利要求19所述的组合物给予至患者中具有受损血流的组织或其临近组织，给予的量足以在所述组织中增强血管生成和侧支血管形成。

36.权利要求35所述的方法，其中所述组合物被给予所述组织中的两个或更多个位点。

37.权利要求35所述的方法，其中所述组织为心肌或外周肢体组织。

38.权利要求36所述的方法，其中所述给予通过直接注射入所述位点而进行。

39.权利要求37所述的方法，其中所述组织是心肌并且所述注射通过导管进行。

40.权利要求38所述的方法，其中所述组合物被直接注射入心脏或腿部肌肉中，以促进其中的血管生成。

41.权利要求35所述的方法，其中所述组合物通过导管或针进入所述血流以输送至所述组织而给予。

42.权利要求35所述的方法，其中所述患者较老，并且所述异源祖细胞从年轻健康供体获得。

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