JP2011516082A - 小分子修飾因子の使用を通して多能性遺伝子を誘発することによる細胞の再プログラミング - Google Patents

Abstract

本発明は細胞を再プログラミングするための方法、組成物、及びキットに関する。一実施形態においては、本発明は、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップを具える方法に関する。更に別の実施形態においては、本方法は、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に、細胞を曝露するステップを具える。更に別の実施形態においては、本発明はＥＳ様細胞の特徴を有することができ、様々な分化細胞型に再分化又は分化形質転換されうる再プログラミングされた細胞及び再プログラミングされた細胞の濃縮集団に関する。
【選択図】図１

Description

［関連特許出願の相互参照］
本出願は２００６年８月１日出願の米国特許出願第１１／４９７，０６４号の一部継続出願であり、２００５年８月１日出願の米国仮特許出願第６０／７０４，４６５の米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張し、更に２００８年４月７日出願の米国仮特許出願第６１／０４３，０６６号；２００８年４月７日出願の米国仮特許出願第６１／０４２，８９０号；２００８年４月７日出願の米国仮特許出願第６１／０４２，９９５号；及び、２００８年１１月１２日の米国仮特許出願第６１／１１３，９７１号；の米国特許法第１１９条（ｅ）の利益を主張し、その各々は全体として説明されたかのように引用によって本明細書に組み込まれる。

［本発明の技術分野］
本発明の実施形態は細胞生物学、幹細胞、細胞分化、体細胞核移植、及び細胞治療法の分野に関する。特に、本発明の実施形態は、細胞を再プログラミングするための方法、組成物、及びキット、ならびに細胞治療法に関する。

再生医療は、多くの人の病気の治療法として非常に有望であるが、現在の科学研究で直面する最も困難な技術的課題の一部を伴っている。再生医療び技術的課題は、低いクローニング効率と；強力な多能性組織の供給不足と；どのように細胞分化を制御するか、及び、どの胚性幹細胞型が選択された療法に用いられうるかについての一般化された知識の不足と；を含む。ＥＳ細胞は大きな可塑性を有しているが、未分化ＥＳ細胞は組織型の混合物を含む奇形腫（良性腫瘍）を形成しうる。更に、ある供給源から別の供給源へのＥＳ細胞の移植は大抵は、新しい細胞の拒絶を防止する薬剤の投与を要求する。

胎児起源ではない組織から幹細胞を産生するための新しい手段を同定するために努力がなされてきた。あるアプローチは自己成体幹細胞の処置を含む。再生医療で自己成体幹細胞を用いる利点は、同一の患者で取得及び帰還され、従って、免疫介在性の拒絶を受けないという事実である。主要な弱点は、これらの細胞がＥＳ細胞の可塑性及び多能性を欠如しており、これらの可能性が不確かであることである。別のアプローチは成体組織から体細胞を再プログラミングして、多能性のＥＳ様細胞を生成することを目的とする。しかしながら、このアプローチは、細胞が分化するか細胞周期から離脱するとすぐに固定されると考えられる固有のエピジェネティックなサインを、多細胞生物内の各細胞型が有するため、困難である。

細胞ＤＮＡは一般的には、核酸及びタンパク質を含む複合体であるクロマチンの形態で存在する。実際に、ほとんどの細胞ＲＮＡ分子は更に核タンパク複合体の形態で存在する。クロマチンの核タンパク構造は当該技術分野の当業者に既知のように、広範な研究対象である。一般的には、染色体ＤＮＡはヌクレオソームにパッケージングされる。ヌクレオソームはコアとリンカーとを含む。ヌクレオソームのコアは約１５０の染色体ＤＮＡの塩基対を周りで包むコアヒストンの八量体（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４が各２つ）を含む。更に、約５０の塩基対のリンカーＤＮＡ断片はリンカーヒストンＨ１と関連づけられる。ヌクレオソームは高次クロマチン線維に組織化され、クロマチン線維は染色体に組織化される。例えば、“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，３ｒｄ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８参照。

クロマチン構造は静的ではないが、クロマチン再構成として既知のプロセスによって集団的に修飾を受ける。クロマチン再構成は例えば、ＤＮＡの領域からヌクレオソームを除去するか；ＤＮＡの１の領域から他の領域にヌクレオソームを移動させるか；あるいは、ヌクレオソーム間の空間を変えるか；ヌクレオソームを染色体中のＤＮＡの領域に添加する；ように作用する。クロマチン再構成は更に、高次構造の変化を引き起こすことができ、これによって転写型活性クロマチン（オープンクロマチン又はユークロマチン）と、転写型不活性クロマチン（クローズクロマチ又はヘテロクロマチン）との間の平衡状態に影響を与える。

染色体タンパク質は多数の型の化学的修飾を受ける。これらのコアヒストンの翻訳後修飾のための１の機構は、高保存型の塩基であるＮ末端リジン残基の可逆性アセチル化である。ヒストンアセチル化の定常状態は、競合する１以上のヒストンアセチルトランスフェラーゼと、ＨＤＡＣと本明細書中で称される１以上のヒストン脱アセチル化酵素との間の動的平衡によって確立される。ヒストンアセチル化及び脱アセチル化は転写調節に連結している。ヒストンの可逆性アセチル化はクロマチン再構成を引き起こし、このように遺伝子転写の調節機構として作用する。一般的に、ヒストンの高アセチル化は遺伝子発現を促進する一方、ヒストン脱アセチル化は転写抑制と相関づけられる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは転写共役因子として作用することが示されてきたが、脱アセチル化酵素は転写抑制経路に属することが発見された。

ヒストンアセチル化と脱アセチル化との間の動的平衡は標準的な細胞増殖に必須である。ヒストン脱アセチル化の抑制は細胞周期停止、細胞分化、アポトーシス、形質転換表現型の反転を引き起こす。

遺伝子発現の調節に関与する別のタンパク質の群はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）であり、転写サイレンシングを引き起こすゲノムのメチル化パターンの産生に関与する。ＤＮＡメチル化は胚発生、Ｘ染色体不活性化、ゲノムインプリンティング、及び遺伝子発現の調節を含む多くの哺乳類プロセスの中心である。哺乳類におけるＤＮＡメチル化は、Ｓ−アデノシルメチオニンのメチル基のシトシンのＣ５位への移動によって得られる。この反応はＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって触媒され、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンに特異的である。ヒトゲノムにおけるＣｐＧジヌクレオチド中の総てのシトシンの７０％がメチル化され、脱アミノ化を起こし、シトシンのチミン遷移を引き起こす。このプロセスは総てのヌクレオチドの約４０％までグアニン及びシトシンの発生頻度の減少と、更に、その予期される発生頻度の約４分の１までＣｐＧジヌクレオチドの発生頻度の減少を引き起こす。

４の活性ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが哺乳類で同定された。それらはＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＤＮＭＴ３Ｂと称される。更に、ＤＮＭＴ３ＬはＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂと構造上密接に関連し、ＤＮＡメチル化に重要であるが、それ自身は不活性であると思われるタンパク質である。ＣｐＧ島を含むプロモーター領域におけるシトシンのメチル化は脊椎動物細胞の下流コード配列の転写不活性化を引き起こす。

メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ１ないし４）として知られるタンパク質のファミリーはメチル化介在性転写サイレンシングに重要な役割を果たすと考えられる。ＭｅＣＰ２は特徴づけるべきこのファミリーの第１の要素であり、メチル−ＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）及び転写抑制ドメイン（ＴＲＤ）を含み、メチル化ＤＮＡとの相互作用を促進し、Ｓｉｎ３Ａ／ＨＤＡＣ複合体をメチル化ＤＮＡに向ける。同様に、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、及びＭＢＤ３は強力な転写抑制因子であることが示されてきた。ＭＢＤ４はＤＮＡグリコシラーゼであり、Ｇ：Ｔ不整合を修復する。このファミリーの各要素はＭＢＤ３を除いて、哺乳類細胞中でメチル化ＤＮＡと複合体を形成し、ほとんどの場合、ＭＢＤ１及びＭＢＤ４は既知のクロマチン再構成複合体中に配置された。Ｍｉ−２複合体はＤＮＡメチル化をクロマチン再構成及びヒストン脱アセチル化と共役する。

エピジェネリックな調節に関与する別のタンパク質の群は、酵素であるヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）である、共同因子であるＳ−アデノシルメチオニンから、ヒストンタンパク質のリジン及びアルギニン残基への１ないし３のメチル基の移動を触媒するヒストンリジンＮ−メチルトランスフェラーゼ及びＮ−メチルトランスフェラーゼである。メチル化ヒストンはより強固にＤＮＡを結合し、転写を抑制する。

クロマチンの構造は更に、クロマチン再構成複合体として知られる巨大分子集合体の活性を通して変えられうる。例えば、Ｃａｉｒｎｓ（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：２０ ２５；Ｗｏｒｋｍａｎら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５４５−５７９；Ｋｉｎｇｓｔｏｎら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．１３：２３３９−２３５２；及びＭｕｒｃｈａｒｄｔら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：１８５−１９７参照。クロマチン再構成複合体はヌクレオソームアレイの破壊又は再形成に関係づけられて、転写、ＤＮＡ複製、及びＤＮＡ修復を引き起こす（Ｂｏｃｈａｒら（２０００）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９７（３）：１０３８−４３）。これらのクロマチン再構成複合体の多くは異なるサブユニット組成物を有するが、総ては再構成活性のためのＡＴＰアーゼ酵素に依存している。インビボでの遺伝子活性用のクロマチン再構成複合体の活性化に対する要求のいくつかの実施例が更に存在する。

多能性又は全能性細胞の分化され、特異化された表現型への発達は、発達中に発現した特定の遺伝子のセットによって決定される。遺伝子発現は陽性又は陰性のいずれかの調節を起こす遺伝子調節タンパク質の配列特異性の結合によって直接的に介在される。しかしながら、遺伝子発現を直接的に介在するこれらの調節タンパク質のうちのいずれかの能力は少なくとも部分的には、細胞ＤＮＡ内の結合部位の到達性に依存している。上述のように、細胞ＤＮＡにおける配列の到達性は多くの場合、細胞ＤＮＡがパッケージングされる細胞クロマチンの構造に依存する。

従って、多能性に要求される遺伝子の発現を誘発できる方法、組成物、及びキットを同定することは有用であり、それには、転写抑制に関与するタンパク質の活性を抑制しうる方法、組成物、及びキットが含まれる。

本発明は、細胞を再プログラミングするための方法、組成物、及びキットに関する。本発明の実施形態は、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップを具える方法に関する。更に別の実施形態においては、本発明は更に、再プログラミングされた細胞を生成することに関する。更なる別の実施形態においては、更なる別の実施形態においては、本発明は転写抑制に関与するタンパク質の活性を抑制するステップを具える方法に関する。更に別の実施形態においては、本発明は調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変えるステップを具える、細胞を再プログラミングするための方法に関する。本発明は更に、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと、細胞を再プログラミングするステップとを具える。

本発明の実施形態は更に、細胞集団、細胞培養液、細胞培養液からの細胞のサブセット、均質性細胞培養液、又は不均質性細胞培養液を、転写抑制に関連するタンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を抑制する薬剤と接触させるステップと；多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を再プログラミングするステップと；を具える、細胞を再プログラミングするための方法に関する。本方法は更に、再プログラミングされた細胞を再分化するステップを具える。

更に別の実施形態においては、本発明は、調節タンパク質の発現、活性、又は発現及び活性を変える小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を選択するステップ；とを具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。

転写抑制に関与するタンパク質、又は調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変える薬剤は、限定しないが小分子、小分子抑制因子、及び小分子活性化因子を含む。

多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する薬剤は、限定しないが小分子、小分子抑制因子、及び小分子抑制因子を含む。

転写抑制に関与する任意のタンパク質は本発明の方法によって阻害でき、限定しないがＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、メチル結合ドメインタンパク質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の成分、ＮｕＲＤ複合体の成分、及びＩＮＯ８０複合体の成分を含む。

いくつかの実施形態においては、少なくとも１の小分子抑制因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、メチル結合ドメインタンパク質、又はヒストンメチルトランスフェラーゼの活性を抑制するのに用いられうる。更なる別の実施形態においては、２以上の小分子抑制因子は転写抑制に関与する２以上のタンパク質の活性を抑制するのに用いることができ、限定しないがＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、メチル結合ドメインタンパク質、又はヒストンメチルトランスフェラーゼを含む。

更なる別の実施形態においては、本発明は、細胞を少なくとも１のＤＮＭＴの活性を抑制する小分子抑制因子と接触させるステップと；少なくとも１のＣｐＧジヌクレオチドを脱メチル化するステップと；遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を再プログラミングするステップと；を具える方法に関する。

更に別の実施形態においては、本発明は、初期の表現型を有する細胞を、少なくとも１の調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変える小分子修飾因子を曝露するステップと；細胞の初期の表現型を、細胞の小分子修飾因子への曝露後に取得される表現型と比較するステップと；再プログラミングされた、かつ多能性又は多分化能性である細胞を選択するステップと；を具える方法に関する。更に別の実施形態においては、本方法は、細胞の小分子修飾因子への曝露前の細胞の遺伝子型を、小分子修飾因子での処理後に取得される細胞の遺伝子型と比較するステップを具える。更なる別の実施形態においては、本方法は、細胞の小分子修飾因子への曝露前の細胞の表現型及び遺伝子型を、小分子修飾因子での曝露後の細胞の表現型及び遺伝子型と比較するステップを具える。

更に別の実施形態においては、本発明は、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。更に別の実施形態においては、本発明は、調節タンパク質の発現、活性、又は発現及び活性を変える小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。

更に別の実施形態においては、本方法は、選択した細胞を細胞集団に培養又は拡張するステップを具える。更に別の実施形態においては、本方法は、多能性又は多分化能性遺伝子によってコード化されたタンパク質に結合する抗体、又は、限定しないが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１を含む、多分化能性マーカー又は多能性マーカーに結合する抗体を用いて細胞を分離するステップを具える。更に別の実施形態においては、本発明は更に前記小分子修飾因子への曝露前の多能性又は多分化能性遺伝子のクロマチン構造を、前記小分子修飾因子への曝露後に取得されるクロマチン構造と比較するステップを具える。細胞は更に、限定しないが蛍光標識細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｏｒｔｅｒ）、免疫組織化学、及びＥＬＩＳＡを含む、細胞を分離するために有効な任意の方法を用いて分離してもよい。別の実施形態においては、本方法は元の細胞より僅かに分化した状態を有する細胞を選択するステップを具える。

別の実施形態においては、本発明は、初期転写パターンを有する細胞を、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に曝露するステップと；細胞の初期転写パターンを前記修飾因子への曝露後に取得される転写パターンと比較するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。別の実施形態においては、細胞を選択するステップは、元の細胞よりも僅かに分化した状態を有する細胞を選択するステップを具える。

更に別の実施形態においては、細胞を選択するステップは、胚性幹細胞の分析された転写パターンに少なくとも５ないし１０％、１０ないし２０％、２０ないし３０％、３０ないし４０％、４０ないし５０％、５０ないし６０％、６０ないし７０％、７０ないし８０％、８０ないし９０％、９０ないし９４％、９５％、又は９５ないし９９％類似する転写パターンを有する細胞を同定するステップを具える。胚性幹細胞の完全な転写パターンは、可能であるが比較する必要はない。代わりに、胚性遺伝子のサブセットは、限定しないが１ないし５、５ないし１０、１０ないし２５、２５ないし５０、５０ないし１００、１００ないし２００、２００ないし５００、５００ないし１，０００、１，０００ないし２，０００、２，０００ないし２，５００、２，５００ないし５，０００、５，０００ないし１０，０００、及び１０，０００を超える遺伝子を含んで比較される。転写パターンはバイナリ様式で比較でき、すなわち、比較は遺伝子が転写されるか否かを決定するためになされる。別の実施形態においては、各遺伝子又は遺伝子のサブセットに対する転写の速度及び／又は範囲を比較してもよい。転写パターンは限定しないがＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、サザンブロット法、及びハイブリダイゼーションを含む当該技術分野で既知の任意の方法を用いて決定できる。

更に別の実施形態においては、本発明は、第１の調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現に干渉する小分子修飾因子に、細胞を曝露するステップと；第２の調節タンパク質の活性、発現、又は発現及び活性を抑制する第２の薬剤に、前記細胞を曝露するステップであって、前記第２の調節タンパク質は第１の調節タンパク質と別個の機能を有するステップと；多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。別の実施形態においては、細胞又は細胞集団は前記第１及び第２の薬剤に同時に又は順番に曝露されうる。第２の薬剤は限定しないが、小分子、小分子抑制因子、小分子活性化因子、核酸配列、及びｓｈＲＮＡ構造を含む。

本発明の実施形態は更に、本明細書中に記載の方法によって生成された再プログラミングされた細胞を用いて様々な病気を治療するための方法を具える。更に別の実施形態においては、本発明は更に、再プログラミングされた細胞、及び再分化された再プログラミングされた細胞の治療用途に関する。

本発明の実施形態は更に、本発明の方法によって生成される再プログラミングされた細胞に関する。再プログラミングされた細胞は、単一の分化系列又は２以上の分化系列に再分化できる。再プログラミングされた細胞は多分化能性又は多能性にできる。

更に別の実施形態においては、本発明は、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；細胞を選択するステップであって、分化能が前記細胞に回復するステップと；細胞集団を生成するために選択した前記細胞を培養するステップと；を具える方法によって生成される再プログラミングされた細胞の濃縮集団に関する。更に別の実施形態においては、再プログラミングされた細胞はＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞表面マーカーを発現する。更に別の実施形態においては、再プログラミングされた細胞は、濃縮細胞集団の少なくとも５ないし１０％、１０ないし２０％、２０ないし３０％、３０ないし４０％、４０ないし５０％、５０ないし６０％、６０ないし７０％、７０ないし８０％、８０ないし９０％、９０ないし９５％、９６ないし９８％、又は少なくとも９９％を占める。

本発明の実施形態は更に、本発明の方法及び組成物を調製するためのキットに関する。このキットは特に、細胞を再プログラミングし、ＥＳ様細胞及び幹細胞様細胞を生成するために用いられうる。

図１は、ＤＮＭＴ抑制因子（５００μＭのＲＧ１０８）で処理される初代ヒト肺線維芽細胞におけるＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現増加を報告する棒グラフである。ＭＣはコントロール培地である。 図２は、いくつかの細胞型におけるＶＰＡの存在下でのいくつかの多能性遺伝子の発現の増加を報告する棒グラフである。ＨＤＦａは成体ヒト皮膚線維芽細胞を示し、ＨＤＦｆは胎児ヒト皮膚線維芽細胞を示し、ＨＤＦｎは新生児ヒト皮膚線維芽細胞を示し、ＢＪＦはＢＪ線維芽細胞（包皮）を示す。 図３は、ＶＰＡで処理される成体及び胎児ヒト皮膚線維芽細胞におけるＨＤＡＣ１１及びＨＤＡＣ９の発現の効果を報告する棒グラフである。 図４は、ニコチンアミドで４日間処理される成体ヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ−４の発現の増加を報告する棒グラフである。 図５は、フェニル酪酸ナトリウムで４日間処理される成体ヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ−４の発現の増加を報告する棒グラフである。 図６は、バルプロキサム（ｖａｌｐｒｏｘａｍ）で４日間処理される成体ヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ−４の発現の増加を報告する棒グラフである。 図７は、２−ＰＣＰＡ（ヒストン／リジン １ デメチラーゼ抑制因子）で８日間処理されるＢＪ線維芽細胞におけるＯｃｔ−４の発現の増加を報告する棒グラフである。 図８Ａは、線維芽細胞増殖培地における成体ヒト皮膚線維芽細胞の写真である。 図８Ｂは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における成体ヒト皮膚線維芽細胞の写真である。 図８Ｃは、マトリゲル上のｍＴｅＳＲ ｈＥＳ細胞培地においてＶＰＡ処理（５００μＭ）された成体ヒト皮膚線維芽細胞の写真である。 図８Ｄは、マトリゲル上のｍＴｅＳＲ ｈＥＳ細胞培地においてＶＰＡ処理（５００μＭ）された成体ヒト皮膚線維芽細胞の写真である。

［定義］
本開示における数値域は概算であり、従って、特に示されない限り範囲外の値を含んでもよい。数値域は、任意の低い数値と任意の高い数値との間に少なくとも２の単位の分離がある場合、１の単位の増分の総ての数値と、下方及び上方の数値とを含む。例として、例えば分子量、メルトインデックス、温度等といった組成上の、物理的な、あるいは他の特性が１００ないし１，０００である場合、１００、１０１、１０２等といった総ての別個の数値、及び１００ないし１４４、１５５ないし１７０、１９７ないし２００等といった部分的な範囲が明確に列挙されることを意図している。１より小さな数値、又は１より大きな小数の値（例えば、１．１、１．５など）を含む範囲については、単位が必要に応じて０．０００１、０．００１、０．０１、又は０．１となると見なされる。１０未満の一桁の数字（例えば、１ないし５）を含む範囲については、単位は一般的に０．１であると見なされる。これらは特異的に意図された単なる例であり、列挙された最小値と最大値との間の数値の総ての可能な組合せは、本開示に明確に述べられていると見なすべきである。数値域は、特に混合物中の成分の相対量、ならびに本方法で列挙される様々な温度及び他のパラメータ範囲で、本開示内で提供される。

「１以上の細胞（ｃｅｌｌ ｏｒ ｃｅｌｌｓ）」は、特に限定されない限りにおいては、任意の体細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、器官特異幹細胞、核移植（ＮＴ）ユニット、及び幹様細胞を含む。１以上の細胞は任意の器官又は組織から取得してもよい。１以上の細胞はヒト、又は他の動物であってもよい。例えば、細胞はマウス、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等であってもよい。細胞は更に、非ヒト霊長類であってもよい。

「培養培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「増殖培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）」は、細胞の増殖を支持することができる好適な培地を意味する。

「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が胚発生時に構造上及び機能上特異的になるプロセスを意味する。

「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制因子（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」及び「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの抑制因子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと相互作用し、かつその活性を抑制できる化合物を意味する。「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を抑制すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、ＣｐＧジヌクレオチド配列といった特定の基質をメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼの能力を低減させることを意味する。いくつかの実施形態においては、このようなＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の低減は少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、他の実施形態においては少なくとも約７５％、更に他の実施形態においては少なくとも約９０％である。更に別の実施形態においては、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性は少なくとも９５％まで、別の実施形態においては少なくとも９９％まで低減する。

「エピジェネティクス（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）」は、ヌクレオチド配列における変化のない、機能における遺伝性変化に関するＤＮＡの状態を意味する。エピジェネティックな変化は、ＤＮＡのヌクレオチド配列においていかなる変化もなく、メチル化及び脱メチル化といった、ＤＮＡの修飾によって生じうる。

「ヒストン（ｈｉｓｔｏｎｅ）」は、核内に適合するようにＤＮＡを十分に小型化するのに関与する、染色体に見られるタンパク質の分子クラスを意味する。

「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）」は、遺伝子特異的な様式で遺伝子の発現を抑制することを意味する。１以上の遺伝子が「ノックダウン」された細胞はノックダウン生物又は単に「ノックダウン」と称される。

「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」は、３の胚葉の細胞型、あるいは初期の組織型に分化できることを意味する。

「多能性遺伝子（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｎｅ）」は、細胞が多能性となるのに寄与する遺伝子を意味する。

「多能性細胞培養液（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、胎児又は成体起源の分化細胞から明確に区別される形態を呈する場合に、「実質的に未分化型（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」であると言われる。多能性細胞は一般的に、核／細胞質の比率が高く、顕著な核小体を有し、完全には識別不可能な細胞間結合を有する小型のコロニー形成を有し、当該技術分野の当業者によって容易に認識される。未分化細胞のコロニーが分化される隣接細胞によって包囲されうることは理解されよう。それにも拘わらず、実質的な未分化コロニーは好適な条件下で培養される場合に維持され、未分化細胞は培養細胞の開裂時に増殖する、顕著な割合の細胞を構成する。本開示に記載の有用な細胞集団は、これらの判断基準を有する、任意の割合の実質的な未分化多能性細胞を含む。実質的な未分化細胞培養液は、（集団中の細胞全体の割合において）少なくとも約２０％、４０％、６０％、又はちょうど８０％の未分化多能性細胞を含みうる。

「調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、生物学的プロセスを調節する任意のタンパク質を意味し、正及び負の方向の調節を含む。調節タンパク質は生物学的プロセスに直接的又は間接的な効果を有し、直接的に、あるいは複合体への関与を通して影響を及ぼす。

「再プログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」は、核内のエピジェネティックなマークを除去し、次いでエピジェネティックなマークの異なるセットを確立することを意味する。多細胞生物の発達時に、様々な細胞及び組織が様々な遺伝子発現プログラムを取得する。これらの別個の遺伝子発現パターンは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び他のクロマチン結合タンパク質といったエピジェネティックな修飾によって実質的に調節されるように思われる。従って、多細胞生物内の各細胞型は、細胞が分化するか細胞周期を一度離脱したすると、従来「固定的（ｆｉｘｅｄ）」及び不変であると考えられている、固有のエピジェネティックなサインを有する。しかしながら、一部の細胞は通常の発達又は特定の病状時に主要なエピジェネティックな「再プログラミング」を受ける。

「小分子修飾因子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）」は、小分子抑制因子又は小分子活性化因子となる化合物を包含することが意図されている。小分子修飾因子はいくつかの生理学的状況においては小分子抑制因子として、別の生理学的状況においては小分子活性化因子として機能しうる。小分子修飾因子はある標的に対して小分子抑制因子として、別の標的に対して小分子活性化因子として機能しうる。同一の小分子修飾因子が小分子活性化因子及び小分子抑制因子の双方として機能しうる。

「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」は、完全な胚又は器官に発達することが可能なことを意味する。

本発明の実施形態は、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップを具える方法に関する。いくつかの実施形態においては、本方法は遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発し、少なくとも１の分化系列への定方向分化を可能にする再プログラミングされた細胞を生成する。

本発明の実施形態は更に、クロマチン構造を修飾するステップと、多能性又は多分化能性となるように細胞を再プログラミングするステップとを具える方法に関する。更に別の実施形態においては、クロマチン構造を修飾するステップは、転写の調節に関与する少なくとも１の調節タンパク質の活性を変えるために小分子修飾因子を用いるステップを具える。

更に別の実施形態においては、クロマチン構造を修飾するステップは、転写抑制に関与する少なくとも１のタンパク質の活性を抑制するのに小分子抑制因子を用いるステップを具える。

本発明の実施形態は更に、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子のプロモーター領域又は上流ＤＮＡ配列を修飾するステップを具える方法に関する。更に別の実施形態においては、プロモーター構造又は上流ＤＮＡ配列を修飾するステップは、転写に関与する少なくとも１の調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変えるために小分子修飾因子を用いるステップを具える。

別の実施形態においては、本発明は、転写に関与する少なくとも１の調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変えるために小分子修飾因子を用いるステップと；遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップと；を具える方法に関する。更に別の実施形態においては、本方法は、少なくとも１のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性を抑制するステップと、再プログラミングされた細胞を生成するステップと；を具える。

更に別の実施形態においては、本方法は、少なくとも１のＤＮＡメチルトランスフェラーゼの活性を抑制するために小分子抑制因子を用いるステップと；ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１のシトシンを脱メチル化するステップと；遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップと；を具える。

更に別の実施形態においては、本方法は、細胞を小分子抑制因子と接触させるステップと；転写抑制に関与する少なくとも１のタンパク質の活性を抑制するステップと；遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、少なくとも１の遺伝子の発現を誘発するステップと；を具える。更に別の実施形態においては、本方法は更に再プログラミングされた細胞を生成するステップを具える。再プログラミングされた細胞は多能性又は多分化能性にできる。

更に別の実施形態においては、本発明は、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。更に別の実施形態においては、本発明は、少なくとも１の調節タンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変える小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復する、細胞を再プログラミングするための方法に関する。多能性又は多分化能性遺伝子は、発現の増加の任意の倍数によって誘発され、限定しないが、０．２５ないし０．５、０．５ないし１、１．０ないし２．５、２．５ないし５、５ないし１０、１０ないし１５、１５ないし２０、２０ないし４０、４０ないし５０、５０ないし１００、１００ないし２００、２００ないし５００、及び５００より大きい数を含む。別の実施形態においては、本方法は、分化細胞を播種するステップと、前記分化細胞を小分子修飾因子に曝露するステップと、前記細胞を培養するステップと、再プログラミングされた細胞を同定するステップとを具える。

別の実施形態においては、調節タンパク質の活性、発現、又は発現及び活性を変えるステップが、調節タンパク質の活性の増加、調節タンパク質の発現の増加、調節タンパク質の活性の減少、又は調節タンパク質の発現の減少を引き起こす。調節タンパク質の活性又は発現は任意の量だけ増加又は減少し、限定しないが、１ないし５％、５ないし１０％、１０ないし２０％、２０ないし３０％、３０ないし４０％、４０ないし５０％、５０ないし６０％、６０ないし７０％、７０ないし８０％、８０ないし９０％、９０ないし９５％、及び９５ないし９９％、９９ないし２００％、２００ないし３００％、３００ないし４００％、４００ないし５００％、及び５００％より大きな量を含む。

更に別の実施形態においては、本方法は更に、多能性又は多分化能性遺伝子によってコード化されたタンパク質又はタンパク質のフラグメントを対象とする抗体、あるいは多能性又は多分化能性マーカーを対象とする抗体を用いて、細胞を選択するステップを具える。任意の抗体型を用いることができ、限定しないが、モノクローナル、ポリクローナル、抗体のフラグメント、ペプチド模倣薬、活性領域に対する抗体、及びタンパク質の保存領域に対する抗体を含む。更に別の実施形態においては、本方法は細胞を選択するステップと、前記細胞を多能性細胞培養液に拡張又は培養するステップとを具える。

更に別の実施形態においては、本方法は更に、多能性又は多分化能性遺伝子、あるいは多能性又は多分化能性表面マーカーによって推進されるレポーターを用いて細胞を選択するステップを具える。任意のレポーター型を用いることができ、限定しないが、蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、細菌ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン、高感度緑色蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｄｓＲＥＤ、β−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼを含む。

更に別の実施形態においては、本方法は更に、選択可能なマーカーとして抵抗性を用いて細胞を選択するステップを具え、限定しないが抗菌剤、殺菌剤、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ、ネオマイシン抵抗性（ｎｅｏ）、Ｇ４１８抵抗性、ミコフェノール酸抵抗性（ｇｐｔ）、ゼオシン抵抗性タンパク質、及びストレプトマイシンに対する抵抗性を含む。

更に別の実施形態においては、本方法は更に、小分子修飾因子への曝露前に存在する細胞の多能性又は多分化能性遺伝子のクロマチン構造を、小分子修飾因子での処理後に取得される多能性又は多分化能性遺伝子のクロマチン構造と比較するステップを具える。任意のクロマチン構造の態様が比較され、限定しないがユークロマチン、ヘテロクロマチン、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン又はヒストン成分の有無、ヒストンの位置、ヒストンの配列、及びクロマチンと関連する調節タンパク質の有無を含む。遺伝子の任意の領域のクロマチン構造が比較され、限定しないがエンハンサー配列、アクティベーター配列、プロモーター、ＴＡＴＡボックス、転写の開始部位の上流領域、転写の開始部位の下流領域、エキソン、及びイントロンを含む。

小分子抑制因子又は「小分子化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、測定可能又は抑制的な活性を有する、本発明の方法、組成物、及びキットに有用な化合物のことである。いくつかの実施形態においては、小分子抑制因子は１０００Ｄ以下、更に他の実施形態においては５００Ｄ以下の相対分子量を有する。小分子抑制因子は、有機性又は無機性の性質となりうる。小さな有機及び無機化合物に加えて、ペプチド、抗体、環状ペプチド、及びペプチド模倣薬は開示された方法に有用であると見なされる。

小分子修飾因子は、小分子ライブラリに含まれる化合物のいずれか、あるいは小分子ライブラリに含まれる化合物から得られる修飾化合物かのいずれかとなりうる。いくつかの小分子ライブラリは限定しないが、ＢＩＯＭＯＬ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社（現在は、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含む商業的供給者から入手可能であり、限定しないがＢｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌｉｐｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ、ＩＣＣＢ Ｋｎｏｗｎ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｌｉｇａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｋｉｎａｓｅ／Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｏｒｐｈａｎ Ｌｉｇａｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ、及びＲａｒｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｉｂｒａｒｙを含む。

小分子抑制因子は、転写抑制に関与する任意のタンパク質を抑制するのに用いることができ、限定しないがヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）、メチル結合ドメインタンパク質（ＭＢＤ）、メチルアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ：ｍｅｔｈｙｌ ａｄｅｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、及びメチルサイクルの酵素を含む。

好適にはこのような抑制は特異的である。すなわち、ＤＮＭＴ小分子抑制因子については、ＤＮＭＴ抑制因子は、別の無関係の生物学的効果を生成するように要求される抑制因子の濃度よりも低い濃度で、特定の基質をメチル化するためにＤＮＡメチルトランスフェラーゼの能力を低減させるか、メチル化に要求される別の成分と相互作用させるためにＤＮＡメチルトランスフェラーゼの能力を低減させる。好適には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの抑制活性のために要求される抑制因子の濃度は、無関係な生物学的効果を生成するのに要求される濃度よりも少なくとも２倍低く、より好適には少なくとも５倍低く、更により好適には少なくとも１０倍低く、最も好適には少なくとも２０倍低い。

小分子修飾因子の任意の数、任意の組合せ及び任意の濃度は、転写調節に関与する１以上のタンパク質の活性、発現、又は活性及び発現を変えるのに用いることができ、限定しないが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ないし１５、１６ないし２０、２１ないし２５、２５ないし５０、５０ないし１００、１００ないし２５０、及び２５０より大きな数を含む。小分子修飾因子は、特異的な１以上のタンパク質、特異的な１以上のタンパク質のクラス、特異的な１以上のタンパク質のファミリー、あるいは一般的な転写成分を対象にできる。

小分子修飾因子は、作用の不可逆性機構又は作用の可逆性機構を有してもよい。小分子修飾因子は任意の結合親和性を有することができ、限定しないがミリモル（ｍＭ）、マイクロモル（μＭ）、ナノモル（ｎＭ）、ピコモル（ｐＭ）、及びフェントモル（ｆＭ：ｆｅｎｔａｍｏｌａｒ）を含む。小分子修飾因子はタンパク質の調節領域又は触媒領域に結合できる。

本発明の方法によって抑制されうるタンパク質の代表的なリストが表１で提供される。

例えば、メチル結合ドメインタンパク質、例えばＭｅＣＰ２はメチル化シトシンに結合し、ヒストンタンパク質を次いで脱アセチル化するヒストン脱アセチル化酵素を補充し、縮合されたクロマチン構造を生じ、転写を抑制する。本発明の方法は転写抑制に関与するタンパク質を抑制し、これによって多能性遺伝子の転写を誘発できる。

従って、上の抑制複合体の代表的な記載によって、小分子抑制因子はＭｅＣＰ２の活性を抑制するように用いることができ、これによってＨＤＡＣのクロマチン構造への補充を有意に低減する。このことによって、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに重要な遺伝子の発現増加が生じ、体細胞の分化能が増加する。同様に、小分子抑制因子はＤＮＭＴを抑制するように用いられ、同様に、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子の発現増加を生じる。更には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを対象とする小分子抑制因子、及びメチル結合タンパク質を対象とする小分子抑制因子は、抑制複合体に関与する少なくとも１のタンパク質の活性を低減するように、同時に、あるいは順番に用いることができ、多能性遺伝子の誘発、ひいては細胞のプログラミングを生じさせることができる。上の考察は例示の目的だけを意図し、本発明の範囲を限定するように解釈すべきではない。

ＤＮＭＴ小分子抑制因子は任意のＤＮＡメチルトランスフェラーゼと相互作用し、かつ抑制でき、限定しないがＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、及びＤＮＭＴ３Ｌを含む。ＤＮＭＴ１は恐らくは、哺乳類細胞で最も豊富なＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり、哺乳類でメチルトランスフェラーゼの維持に関与すると考えられている。ＤＮＭＴ１は優性に、哺乳類ゲノム中のヘミメチル化ＣｐＧジヌクレオチドをメチル化する。酵素は、インビトロで非メチル化基質と比較すると、ヘミメチル化ＤＮＡで７ないし２０倍活性が大きいが、他のＤＮＭＴよりも更に活性化の大きい新規のメチル化修飾である。酵素は約１６２０のアミノ酸長である。最初の１１００のアミノ酸は酵素の調節ドメインを構成し、残余の残基は触媒ドメインを構成する。これらはＧｌｙ−Ｌｙｓの反復によって結合される。双方のドメインはＤＮＭＴ１の触媒機能のために要求される。

ＤＮＭＴ２は原核生物及び真核生物の５−メチルシトシンメチルトランスフェラーゼと強い配列類似性を有する。ＤＮＭＴ２は更にアスパラギン酸トランスファーＲＮＡにおける位置３８をメチル化するのが示された。

ＤＮＭＴ３は同一速度でヘミメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとをメチル化できるＤＮＡメチルトランスフェラーゼのファミリーである。ＤＮＭＴ３酵素の構造は、触媒ドメインに付着した調節領域を有するＤＮＭＴ１と似ている。ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂは発達中にＤＮＡメチル化パターンの確立に関与する。ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂのタンパク質は胚形成の様々な段階で発現される。ＤＮＭＴ３Ｂは内部細胞塊、原外胚葉、及び胚性外胚葉細胞といった全能性胚細胞に発現するように思われるが、ＤＮＭＴ３ＡはＥ１０．５の後に広範に発現するように思われる。

ＤＮＭＴ３ＬはＤＮＡメチルトランスフェラーゼのモチーフを含み、母系性のゲノムインプリンティングを確立するのに関与する。ＤＮＭＴ３Ｌは更に転写抑制で役割を果たすと考えられる。

本発明の方法、組成物、及びキットで用いられるＤＮＭＴ小分子抑制因子は、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、又はＤＮＭＴ３Ｌと相互作用させてもよい。ＤＮＭＴ抑制因子は、１のＤＮＭＴ型、総てのＤＮＭＴ型、又は複数のＤＮＭＴ型と相互作用してもよく、限定しないがＤＮＭＴ１及びＤＮＭＴ２と；ＤＮＭＴ１及びＤＮＭＴ３Ａと；ＤＮＭＴ１及びＤＮＭＴ３Ｂと；ＤＮＭＴ１及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ２及びＤＮＭＴ３Ａと；ＤＮＭＴ２及びＤＮＭＴ３Ｂと；ＤＮＭＴ２及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｂと；ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ３Ｂ及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、及びＤＮＭＴ３Ａと；ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、及びＤＮＭＴ３Ｂと；ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＤＮＭＴ３Ｂと；ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ｂ、及びＤＮＭＴ３Ｌと；ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂと；を含む。本発明のＤＮＭＴ抑制因子は、既知の型の１つにないか、未だ分類されないＤＮＭＴと相互作用させてもよい。

別の実施形態においては、ＤＮＭＴ抑制因子は、ＤＮＭＴの調節ドメイン又は触媒ドメインに結合することによって作用させてもよい。別の実施形態においては、ＤＮＭＴ抑制因子はヌクレオシド類似体（ＤＮＡ又はＲＮＡに組み込まれる）であっても、非ヌクレオシド類似体であってもよい。別の実施形態においては、ＤＮＭＴ抑制因子はＤＮＭＴに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよく、限定しないがＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、又はＤＮＭＴ３Ｌを含む。更なる別の実施形態においては、ＤＮＭＴ抑制因子は更に、タンパク質間の相互作用をブロックすることによって作用させてもよい。

更に別の実施形態においては、ＤＮＭＴ活性及びシトシンのメチル化を抑制するために、細胞は以下の培地中で増殖させてもよい：
（ａ）ＤＮＭＴ１、２、３ａ及び／又は３ｂのｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）で処理される培地；
（ｂ）ＲＧ１０８（ルイジアナ州立大学の獣医学のＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で処理される培地；
（ｃ）５−ＡｚａｄＣｙｄ（Ｓｉｇｍａ社）で処理される培地

表２はＤＮＭＴを抑制できる小分子抑制因子の代表的なリストを提供する。本発明の方法、組成物、及びキットで用いられるＤＮＭＴ抑制因子は、本明細書中で述べたＤＮＭＴ抑制因子の誘導体及び類似体を含む。

表３は、再プログラミングに関与する遺伝子の発現を誘発するか、増加させるか、又は変えるために用いられうる小分子修飾因子の代表的なリストである。小分子修飾因子は基礎転写機構の成分、転写活性化の成分、クロマチン再構成複合体の成分、転写抑制の成分、ＤＮＡ修復の成分、ミスマッチ修復の成分、及び細胞のメチル化状態を維持するのに関与する成分を標的にできる。小分子修飾因子は限定しないが、ヒストン脱アセチル化酵素抑制因子（ＨＤＡＣｉ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ抑制因子（ＨＡＴｉ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性化因子、リジンメチルトランスフェラーゼ抑制因子（ＬＭＴｉ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制因子（ＨＭＴｉ）、トリコスタチンＡ抑制因子（ＴＳＡｉ）、ヒストン脱メチル化酵素抑制因子（ＨｄｅＭｉ）、リジンデメチラーゼ抑制因子（ＬｄｅＭｉ）、サーチュイン抑制因子（ＳＩＲＴｉ）、及びサーチュイン活性化因子（ＳＩＲＴａ）を含む。

ヒストンアセチルトランスフェラーゼ抑制因子として機能する任意の小分子修飾因子を用いることができ、限定しないがアナカルジン酸、ガルシノール、クルクミン、イソチアゾロン、ブチロラクトン、ＭＣ１６２６（２−メチル−３−カルベトキシキノリン）、ポリイソプレニル化されたベンゾフェノン、エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、及びＣＰＴＨ２（シクロペンチリデン−［４−（４’−クロロフェニル）チアゾール−２−イル］ヒドラゾン）を含む。

ヒストン脱メチル化酵素抑制因子として機能する任意の小分子修飾因子を用いることができ、限定しないがリジン特異性デメチラーゼ、ＬＳＤ１（ＫＩＡＡ０６０１又はＢＨＣ１１０）、フラビン依存性アミンオキシダーゼ、及び十文字を含む。

サーチュイン活性化因子として機能する任意の小分子修飾因子を用いることができ、限定しないがリスベラトロール、ポリフェノール、サーチュイン活性化化合物、ＳＩＲＴ１ないしＳＩＲＴ７の活性化因子、及びＳＲＴ−１７２０を含む。

一実施形態においては、ＤＮＡメチル化抑制因子ははシチジン類似体又は誘導体である。シチジン類似体又は誘導体の例は限定しないが、５−アザシチジン及び５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ＣｄＲ又はデシタビン）を含む。

５−アザ−ＣｄＲはその関連する天然ヌクレオシドであるデオキシシチジンのアンタゴニストである。これらの２の化合物間の唯一の構造上の差異は、５−アザ−ＣｄＲのシトシン環の５位で、デオキシシチジンについてはこの位置で炭素であるのと比較して、窒素が存在することである。最も有効なことには、５−アザ−ＣｄＲはＤＮＡに組み込まれ、代謝経路を通る化合物の修飾を要求できる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは５−アザシトシンを天然基質として認識し、メチル化反応を開始する。しかしながら、類似体によって共有結合反応の中間体の分解を防ぎ、ひいては酵素は捕捉及び分解される。

ゼブラリンは、１−β−リボフラノシル−１，２−ジヒドロピリミジン−２−オン及び１−β−リボフラノシル−２（１Ｈ）−ピリミジノンとしても知られており、シチジンデアミナーゼが活性を抑制するのに帰属する（例えば、Ｋｉｍら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９：１３７４−１３８０，１９８６；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：８３０−８３２，１９８０；参照）。

任意の数、任意の組合せ、及び任意の濃度のＤＮＭＴ抑制因子を限定しないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ないし１５、１６ないし２０、及び２１ないし２５を含む、１以上のタンパク質を抑制するのに用いることができる。

クロマチン再構成に関与する他の複合体におけるタンパク質は更に、本発明の方法によって抑制でき、限定しないがＳＷＩ／ＳＮＦ複合体、ＮｕＲＤ複合体、Ｓｉｎ３複合体、及びＩＮＯ８０を含む。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体は、クロマチン到達性の調節に重要な役割を果たすことが知られる多サブユニットのタンパク質複合体である。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の任意の成分は本発明の方法によって抑制でき、限定しないがＳＮＦ５／ＩＮＩ１、ＢＲＧ１、ＢＲＭ、ＢＡＦ１５５、及びＢＡＦ１７０を含む。ＳＷＩ／ＳＮＦは多様な遺伝子の活性化に対する要求に応じて、酵母中で最初に同定された。ｈＳＷＩ／ＳＮＦ複合体はいくつかの発生学的に特異的な遺伝子発現プログラムの調節に必須であることが示されている。

Ｓｉｎ３複合体の任意の成分は本発明の方法によって抑制でき、限定しないがＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＲｂＡｐ４６、ＲｂＡｐ４８、Ｓｉｎ３Ａ、ＳＡＰ３０、及びＳＡＰ１８を含む。

ＮｕＲＤ複合体の任意の成分は本発明の方法によって抑制でき、限定しないがＭｉ２、ｐ７０、及びｐ３２を含む。

ＩＮＯ８０複合体の任意の成分は本発明の方法によって抑制でき、限定しないがＴｉｐ４９Ａ、Ｔｉｐ４９Ｂ、ＳＮＦ２ファミリーのヘリカーゼＩｎｏ８０、アクチン関連タンパク質ＡＲＰ４、ＡＲＰ５、及びＡｒｐ８、ＹＥＡＴＳドメインファミリーメンバーＴａｆ１４、ＨＭＧドメインタンパク質、Ｎｈｐ１０、ならびにＩｅｓ１ないし６と命名された６の更なるタンパク質を含む。

任意の数の小分子修飾因子は遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子の発現を誘発するのに用いることができ、限定しないが１ないし５、６ないし１０、１１ないし１５、１６ないし２０、２１ないし２５、２６ないし３０、３１ないし３５、３６ないし４０、４１ないし４５、４６ないし５０、及び５１以上の小分子修飾因子を含む。

本発明は、卵、胚、胚性幹細胞、又は体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の不存在下で取得される再プログラミングされた細胞を提供する。本発明の方法によって生成された再プログラミングされた細胞は多能性又は多分化能性にできる。本発明の方法によって生成された再プログラミングされた細胞は胚性幹細胞様の特性を含む多様な異なる特性を有することができる。例えば、再プログラミングされた細胞は、未分化状態において少なくとも１０、１５、２０、又は３０以上の継代で増殖可能である。他の形態においては、再プログラミングされた細胞は、分化せずに１年超の間増殖できる。再プログラミングされた細胞は更に、増殖及び／又は分化中に正常核型を維持できる。一部の再プログラミングされた細胞は更に、未分化状態においてインビトロで不確定な増殖を可能にする細胞にできる。一部の再プログラミングされた細胞は更に、長期培養を通して正常核型を維持できる。一部の再プログラミングされた細胞は長期培養後でさえも総ての３の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の派生物に分化する能力を維持できる。一部の再プログラミングされた細胞は生物において任意の細胞型を形成できる。一部の再プログラミングされた細胞は、未分化増殖を維持しない培地上の増殖といった特定の条件下で、胚様体を形成できる。一部の再プログラミングされた細胞は例えば、胚盤胞との融合を通してキメラを形成できる。

再プログラミングされた細胞は多様なマーカーによって規定できる。例えば、一部の再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼを発現する。一部の再プログラミングされた細胞はＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及び／又はＴＲＡ−１−８１を発現する。一部の再プログラミングされた細胞はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇを発現する。一部の再プログラミングされた細胞はｍＲＮＡレベルでこれらを発現するが、他の再プログラミングされた細胞は更に、例えば細胞表面上、又は細胞内部にタンパク質レベルでこれらを発現することは理解されよう。

再プログラミングされた細胞は本明細書中で考察される、任意の再プログラミングされた細胞の１以上の特性又はカテゴリーの組合せを有していてもよい。例えば、再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼを発現し、ＳＳＥＡ−１を発現せず、少なくとも２０の継代について増殖し、任意の細胞型に分化可能にしてもよい。別の再プログラミングされた細胞は例えば、細胞表面上にＳＳＥＡ−１を発現し、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織を形成可能にし、分化せずに１年超の間、培養してもよい。

再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性、ＳＳＥＡ−１陽性、及びＳＳＥＡ−４陰性にできる。再プログラミングされた細胞は更に、Ｎａｎｏｇ陽性、Ｓｏｘ２陽性、及びＯｃｔ−４陽性にできる。再プログラミングされた細胞は更にＴｃｌ１陽性及びＴｂｘ３陽性にできる。再プログラミングされた細胞は更に、Ｃｒｉｐｔｏ陽性、Ｓｔｅｌｌａｒ陽性、及びＤａｚ１陽性であってもよい。再プログラミングされた細胞は、モノクローナル抗体の結合特異性を有する抗体ＴＲＡ−１−６０（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−４７８３）及びＴＲＡ−１−８１（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−４７８４）と結合する細胞表面抗原を発現できる。更に本明細書中に開示のように、再プログラミングされた細胞は１年超の間、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の継代について支持細胞層なしで維持できる。

再プログラミングされた細胞は、異なる分化系列の広範で多様な細胞型に分化する能力を有することができ、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋、神経系細胞、造血細胞（ｈｅｍｉｏｐｏｅｔｉｃ ｃｅｌｌ）、膵島、又は実質的に任意の身体の細胞を含む。再プログラミングされた細胞は総ての細胞の分化系列に分化する能力を有してもよい。再プログラミングされた細胞は任意の数の分化系列に分化する能力を有してもよく、１、２、３、４、５、６ないし１０、１１ないし２０、２１ないし３０、及び３０を超える分化系列を含む。

遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する、遺伝子及びその遺伝子の関連するファミリーメンバーは本発明の方法によって誘発でき、限定しないが、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（Ｇｎｍｔ）、オクタマー転写因子４（Ｏｃｔ４）、Ｎａｎｏｇ、ＧＡＢＲＢ３、ＬＥＦＴＢ、ＮＲ６Ａ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＥＮ、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２としても知られる）、Ｍｙｃ、ＲＥＸ−１（Ｚｆｐ−４２としても知られる）、インテグリンα−６、Ｒｏｘ−１、ＬＥＦ−Ｒ、ＴＤＧＦ１（ＣＲＩＰＴＯ）、ＳＡＬＬ４（ｓａｌ−ｌｉｋｅ４）、白血球細胞由来型ケモタキシン１（ＬＥＣＴｌ）、ＢＵＢ１、ＦＯＸＤ３、ＮＲ５Ａ２、ＴＥＲＴ、ＬＩＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＬＩＮ２８、ＸＩＳＴ、ならびにＫｌｆ４及びＫｌｆ５といったＫｒｉｉｐｐｅｌ様因子（Ｋｌｆ）を含む。遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する任意の数の遺伝子は、本発明の方法によって誘発でき、限定しないが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ないし２０、２１ないし３０、３１ないし４０、４１ないし５０、及び５０を超える遺伝子を含む。

更に、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，５９７（２００２））、Ｉｖａｎｏｖａら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８，６０１（２００２））、及びＦｏｒｔｕｎｅｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ３０２，３９３ｂ（２００３））（総てが全体的に引用によって組み込まれる）は、それぞれ３の細胞型を比較して、共通に発現する「厳格な（ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ）」遺伝子のリストを同定し、幹細胞の機能特性を与えるのに重要であることを提唱した。上述の研究で同定された任意の遺伝子は、本発明の方法によって誘発できる。表３は幹細胞の機能特性を与えるのに関与すると考えられる遺伝子のリストを提供する。表４（表４−１ないし４−８）に列挙された遺伝子に加えて、既知の遺伝子に対してほとんど又は全く相同性のない、９３の発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）のクラスターが更に、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓら及びＩｖａｎｏｖａらによって同定され、本発明の方法の内部に含まれる。

本発明の実施形態は更に、本明細書中の他の場所に開示された新規の方法によって生成される再プログラミングされた細胞を用いて、多様な病気を治療するための方法を具える。当該技術分野の当業者は、本明細書中の開示によって、限定しないが心臓病、糖尿病、皮膚病及び皮膚移植、脊髄損傷、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病等を含む、広範な多血症の疾患を治療する場合の再生医療の価値及び可能性を認識するであろう。本発明は、新しい非損傷細胞がいくつかの治療の軽減の形態を提供する場合に、病気を治療するためにヒトを含む動物に再プログラミングされた細胞を投与するための方法を包含する。

当該技術分野の当業者は、再プログラミングされた細胞が再分化細胞，例えばニューロンとして動物に投与でき、動物において罹患又は損傷したニューロンを置換するのに有用であることを容易に理解できよう。更に、再プログラミングされた細胞は動物に投与でき、周囲環境からのシグナル及び合図を受信するとすぐに、隣接する細胞環境によって指示される所望の細胞型に再分化できる。代替的に、細胞はインビトロで再分化してもよく、分化細胞はその必要に応じて哺乳類に投与してもよい。

再プログラミングされた細胞は、インビボ環境における長期間の生存を保証すべく移植用に調製できる。例えば、細胞は、細胞の増殖及び維持に好適な、前駆細胞培地といった培養培地で生殖でき、コンフルエンスに増殖するのを可能にする。細胞は、例えば１ｍｇ／ｍｌのグルコースを追加した、０．０５％のトリプシンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）；トリプシンを不活性化するために５％の血清を加えた０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ_２（完全ＰＢＳ）；といった緩衝液を用いて、培養基質から解放される。細胞は遠心分離を用いてＰＢＳで洗浄でき、次いでトリプシンのない、かつ、注入用に選択された密度で完全ＰＢＳに再懸濁される。

腹膜投与に好適な医薬組成物の製剤は、滅菌水又は無菌等張食塩水といった薬学的に許容可能な担体と組み合わされる有効成分を含む。このような製剤はボーラス投与又は継続投与に好適な形態で、調製、パッケージング、又は販売されうる。注入可能な製剤は、保存剤を含むアンプル又は複数用量の容器といった単位剤形で調製、パッケージング、又は販売されうる。腹膜投与用の製剤は限定しないが、懸濁剤、溶剤、油性又は水性賦形剤における乳剤、ペースト剤、及び移植可能な徐放性又は生分解性の製剤を含む。このような製剤は更に、限定しないが懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含む１以上の更なる成分を含んでもよい。

本発明は更に、ＣＮＳ、ＰＮＳ、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、及び膵臓などを含む、身体中の病気又は外傷を治療するために、他の治療手順と組合せて再プログラミングされた細胞を移植するステップを包含する。従って、本発明の再プログラミングされた細胞は、副腎からのクロム親和性細胞、胎児脳組織細胞、及び胎盤細胞といった、他の細胞と同時移植してもよく、遺伝子修飾細胞と非遺伝子修飾細胞との双方が患者に有益な効果を及ぼす。従って、本明細書中に開示される方法は、本明細書中に提供される教示を具える場合、当該技術分野の当業者によって理解されるように、他の治療手順と組み合わせることができる。

本発明の再プログラミングされた細胞は、各々は引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許第５，０８２，６７０号及び第５，６１８，５３１号に記載のような当該技術分野で既知の技術を用いて、患者に、あるいは身体の好適な部位に「ありのままに（ｎａｋｅｄ）」移植できる。

再プログラミングされた細胞は、単一細胞からなる混合物／溶液、あるいは細胞凝集体の懸濁剤を含む溶液として移植できる。このような凝集体は直径約１０ないし５００マイクロメートル、より好適には直径約４０ないし５０マイクロメートルとなりうる。再プログラミングされた細胞の凝集体は球体につき約５ないし１００、より好適には約５ないし２０の細胞を具えることができる。移植細胞の密度はマイクロリットルにつき約１０，０００ないし１，０００，０００の細胞、より好適には、マイクロリットルにつき約２５，０００ないし５００，０００の範囲にできる。

本発明の再プログラミングされた細胞の移植は、将来に開発されるものと同様に当該技術分野に公知の技術を用いてなされうる。本発明は、再プログラミングされた細胞を動物、好適にはヒトに移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ、ｇｒａｆｔｉｎｇ）するか、注入するか、そうでない場合は導入するための方法を具える。

再プログラミングされた細胞は既知のカプセル化技術によって生物学的な活性分子を送達するためにカプセル化及び使用でき、マイクロカプセル化（例えば、総てが引用によって本明細書中に組み込まれる、引用によって本明細書中に組み込まれる、米国特許第４，３５２，８８３号、第４，３５３，８８８号、及び第５，０８４，３５０号を参照）、又はマクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号、及び第４，９６８，７３３号；国際公開第９２／１９１９５号；国際公開第９５／０５４５２号参照）を含む。マクロカプセル化については、デバイス中の細胞数を変えることができ、好適には各デバイスは１０^３ないし１０^９の細胞、最も好適には約１０^５ないし１０^７の細胞を含む。いくつかのマクロカプセル化デバイスは患者中に移植してもよい。細胞のマクロカプセル化及び移植のための方法は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第６，４９８，０１８号に記載される。

本発明の再プログラミングされた細胞は更に、治療目的のために、又は患者の組織における統合及び分化を追跡する方法のために、外来性のタンパク質又は分子を発現するのに用いることができる。従って、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載のような、再プログラミングされた細胞における外来性ＤＮＡの同時発現を伴う、外来性ＤＮＡの再プログラミングされた細胞への導入のための発現ベクター及び方法を含有する。

本発明の実施形態は更に、細胞を小分子ライブラリと接触させるステップと；ゲノムの変化を測定するステップと；ゲノムの調節因子を同定するステップと；を具える、エピゲノムの調節因子を同定するための方法に関する。本方法は更に、小分子修飾因子を同定するステップを具える。更に別の実施形態においては、ゲノムの変化を測定するステップは、限定しないがアセチル化、脱アセチル化、メチル化、脱メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰリボシル化、及び脱イミノ化を含む。

本発明の実施形態は更に、本発明の方法によって生成された細胞を含む組成物に関する。別の実施形態においては、本発明は小分子抑制因子を用いて、転写抑制に関与する少なくとも１のタンパク質の活性を抑制することにより再プログラミングされた細胞を含む組成物に関する。更に別の実施形態においては、本発明は、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子の発現を誘発することによって再プログラミングされた細胞を含む組成物に関する。

本発明の実施形態は更に、細胞を少なくとも１の小分子修飾因子と接触させることによって生成された再プログラミングされた細胞に関する。更に別の実施形態においては、本発明は、限定しないがＲＧ１０８、５−アザ−２−デオキシシチジン、及びエピガロカテキン−３−ガラートを含む、少なくとも１のＤＮＭＴを抑制する小分子抑制因子と細胞を接触させることによって生成された再プログラミングされた細胞に関する。

本発明の実施形態は更に、本発明の方法及び組成物を調整するためのキットに関する。再プログラミングされた細胞を生成し、かつ、ＥＳ様細胞及び幹細胞様細胞を産生し、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子の発現を誘発し、転写抑制に関与する少なくとも１のタンパク質の活性を抑制するために用いることができる。キットは少なくとも１の小分子抑制因子を含んでもよい。キットは複数の小分子抑制因子を含んでもよい。小分子抑制因子は単一の容器又は複数の容器で提供できる。

キットは再プログラミングされたかどうかを決定するのに必要な試薬を含むことができ、限定しないが、遺伝子が多能性又は多分化能性となるのに寄与する遺伝子の誘発を試験するための試薬と、ＤＮＭＴの抑制を試験するための試薬と、ＣｐＧジヌクレオチドの脱メチル化を試験するための試薬と、クロマチン構造の再構成を試験するための試薬とを含む。

キットは、再プログラミングされた細胞を、限定しないが、神経細胞、骨芽細胞、筋細胞、上皮細胞、及び肝細胞を含む特定の分化系列又は複数の分化系列に分化するのに用いられうる試薬を具えてもよい。

キットは更に教材を含んでもよく、それはキット中に提供される成分の用途について記載する。本明細書中で用いられる場合、「教材（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、刊行物、記録、図表、又は、特に分化細胞の再プログラミングを生じさせるキットにおける本発明の方法の有効性を伝えるために用いられうるその他の表現媒体を含む。選択的又は代替的に、教材は本発明の細胞を再分化形質転換及び／又は分化形質転換する１以上の方法について記載してもよい。本発明のキットの教材は例えば、小分子抑制因子を含む容器に添付してもよい。代替的に、教材は、教材及び小分子抑制因子、あるいはその成分がレシピエントによって協同的に用いられるべきという意図を伴って、容器と別個に出荷されてもよい。

本発明は以下の実施例によって記載される。これらの実施例は例示のみの目的で提供され、本発明は決してこれらの実施例を限定するように解釈すべきではなく、むしろ本明細書中に提供される教示の結果として明らかになる任意及び総ての変形物を包含すると解釈すべきである。限定しないが、米国特許、認容された米国特許出願、又は刊行された米国特許出願を含む総ての文献は、全体の引用によって本明細書内に組み込まれる。

［実施例］
以下の実施例は例示のみであり、請求項によって規定されるように本発明の範囲を限定することを意図しない。

ヒト体細胞における多能性遺伝子を誘発又は発現増加させる小分子修飾因子の能力が試験された。この実施例においては、小分子修飾因子は少なくとも１のＤＮＭＴの活性を抑制する小分子抑制因子ＲＧ１０８であった。しかしながら、当該技術分野の当業者によって、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を誘発する任意の小分子修飾因子が用いられうることが理解されよう。

［方法］
［細胞培養液］
初代ヒト肺線維芽細胞はＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入され、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）ならびに０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを含む、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）において、９５％の水分及び５％のＣＯ_２中で３７℃で維持された。細胞は５００μＭのＲＧ１０８の存在下で５日間増殖され、未処理を維持された。

［定量ＲＴ−ＰＣＲ］
Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現は各培養条件（５００μＭのＲＧ１０８又は未処理）でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量された。簡潔に言うと、全ＲＮＡは製造者のプロトコルに従ったデオキシリボヌクレアーゼＩの消化を伴うＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて培養液から調製された。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）はオリゴ（ｄＴ）刺激された逆転写に供された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）。リアルタイムＰＣＲ反応は、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー）でＰＣＲマスターミックスを用いて行われる。各サンプルにおいて、１μｌの希釈されたｃＤＮＡ（１：１０）はＰＣＲ反応におけるテンプレートとして添加される。Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現レベルはグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）で規格化された。

［結果］
図１に示すように、５００μＭのＲＧ１０８での５日間の初代ヒト肺線維芽細胞の処理がＮａｎｏｇ遺伝子発現の有意な発現増加（ｐ＜０．０３）を引き起こした。更に、Ｏｃｔ４遺伝子発現の増加の傾向（ｐ＜０．０７）が更に観察された。多能性遺伝子Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現増加は更に、ＤＮＭＴ抑制因子のエピガロカテキン−３−ガラートの存在下で細胞を培養することによって観察された（ｐ＜０．０８、データは図示せず）。

これらの結果は、小分子抑制因子はエピゲノム、例えばＤＮＡメチル化を調節するのに用いることができることを示唆する。小分子抑制因子は、転写抑制に関与するタンパク質の活性を抑制するのに用いることができる。更に、小分子抑制因子は多能性遺伝子の発現を誘発し、体細胞における分化能を回復させうる。

多様な小分子修飾因子がいくつかの細胞型において多能性遺伝子を誘発又は発現増加するのに用いられた。本実施例においては、Ｏｃｔ−４は主要な試験遺伝子であるが、当該技術分野の当業者は、小分子修飾因子が再プログラミングに関与する任意の遺伝子の発現を誘発又は発現増加させるように用いられうることを理解するであろう。

［方法］
［細胞培養液］
成体及び新生児の初代ヒト肺線維芽細胞はＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入された。ヒト肺線維芽細胞、ＨＳＭ細胞、及びＢＪ線維芽細胞はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から購入された。

細胞は１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）ならびに０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを含む、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）において、及び線維芽細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）において、９５％の水分及び５％のＣＯ_２中で３７℃で維持された。細胞は小分子修飾因子の存在下又は不存在下で増殖された。小分子修飾因子の存在下における培養時間は各小分子修飾因子で変えた（表５参照）。

［定量ＲＴ−ＰＣＲ］
対象の、例えばＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの遺伝子の発現は各培養条件でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量された。簡潔に言うと、全ＲＮＡは製造者のプロトコルに従ったデオキシリボヌクレアーゼＩの消化を伴うＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて培養液から調製された。各サンプルからの全ＲＮＡ（１μｇ）はオリゴ（ｄＴ）刺激された逆転写に供された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）。リアルタイムＰＣＲ反応は、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティー）でＰＣＲマスターミックスを用いて行われる。各サンプルにおいて、１μｌの希釈されたｃＤＮＡ（１：１０）はＰＣＲ反応におけるテンプレートとして添加される。対象の遺伝子の発現レベルはグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）で規格化された。

［結果］
表５は試験され、Ｏｃｔ−４の発現を誘発又は発現増加させることが示された小分子修飾因子を列挙する。小分子抑制因子ＶＰＡ及びＲＧ１０８は更に、Ｎａｎｏｇを誘発することが示された（図１及び表５参照）。表５に示されるデータは、多数の小分子修飾因子が多様な濃度で用いられて、Ｏｃｔ−４といった多能性遺伝子の発現を誘発又は発現増加させうることを示す。表５に示されるように、小分子修飾因子は多様な濃度及び多様なインキュベーション時間で、成体ヒト皮膚線維芽細胞、新生児ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト肺線維芽細胞、及びＢＪ線維芽細胞（ヒト包皮）においてＯｃｔ−４発現を誘発できる。

バルプロ酸（ＶＰＡ）（５ｍＭ）は成体ヒト皮膚線維芽細胞、新生児ヒト皮膚線維芽細胞、胎児ヒト皮膚線維芽細胞、及びＢＪ線維芽細胞において、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ−２の発現を誘発した（図２参照）。細胞は４ないし６日間、ＶＰＡで処理された。発現の増加は、各遺伝子で、及び各細胞型において変化したが、データは明確に小分子抑制因子（ＶＰＡ）の存在下で多能性遺伝子の発現増加を示す。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨはｍＲＮＡの量を規格化するのに用いられた。

図３に示されるように、ＶＰＡは更に成体及び胎児ヒト皮膚線維芽細胞におけるＨＤＡＣ１１の発現を増加させた。ＨＤＡＣ９については、ＶＰＡ処理された細胞と未処理細胞との間の統計的有意差はなかった。測定可能な効果の欠如は科学機器で課せられる実験的限界によるものである。

表６はＶＰＡの存在下における、多能性遺伝子Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ−２、及びＨＤＡＣ１１の統計分析を示す。４の細胞型：成体ヒト皮膚線維芽細胞；胎児ヒト皮膚線維芽細胞；新生児ヒト皮膚線維芽細胞；及び、ＢＪ線維芽細胞；の情報が示される。各細胞型においては、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ−２の発現の変化は統計的に有意であった。複数の遺伝子の発現は、再プログラミングに関与し、ヒストン脱アセチル化酵素を抑制するように機能する小分子の存在下で増加した。

図４に示されるように、Ｏｃｔ−４の発現はヒト成体皮膚線維芽細胞がニコチンアミドで４日間処理される場合に増加した。試験された総ての３の濃度：０．０２８ｍＭ；０．２８ｍＭ；及び、１．４ｍＭ；によって、コントロール培地（ＭＣ）と比較した場合に、Ｏｃｔ−４の発現の増加を引き起こした。これらのデータは、小分子抑制因子、この場合はニコチンアミドが、Ｏｃｔ−４の発現を増加させ、分化細胞を再プログラミングするのに、及び分化能を細胞に回復させるのに関与する遺伝子であることを示す。

図５で示されるように、Ｏｃｔ−４の発現は、ヒト成体皮膚線維芽細胞がフェニル酪酸ナトリウムで処理された場合に増加した。細胞はフェニル酪酸ナトリウム（２．５ｍＭ）の存在下で４日間処理された。コントロール培地（ＭＣ）と比較される場合、処理された細胞はＯｃｔ−４の発現の増加を示した。これらのデータは、ヒストン脱アセチル化酵素を抑制するように機能する小分子抑制因子が、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を増加させ、細胞を再プログラミングするように用いられうることを示す。

図６で示されるように、多能性遺伝子Ｏｃｔ−４の発現は、ヒト成体皮膚線維芽細胞がバルプロキサムで４日間処理された場合に増加した。２の濃度：０．０５ｍＭ；及び０．５ｍＭ；のバルプロキサムで、Ｏｃｔ−４の発現は、コントロール培地（ＭＣ）と比較した場合に増加した。２．５ｍＭのバルプロキサムで、Ｏｃｔ−４の発現はベースラインレベル（コントロール培地と同様のレベル）に戻ったように見えた。このことは生存細胞の数の減少を反映しうるか、あるいは機器で課せられる実験的限界を示しうる。

図７で示されるように、Ｏｃｔ−４の発現は、ＢＪ線維芽細胞が２−ＰＣＰＡで８日間処理された場合に増加した。化合物１はヒストン／リジン １ デメチラーゼ抑制因子である。総ての３の濃度：０．１ｍＭ；０．５ｍＭ；及び１．０ｍＭ；の２−ＰＣＰＡは、コントロール培地（ＭＣ）と比較される場合に、Ｏｃｔ−４の発現の増加を引き起こす。

小分子修飾因子は、複数の標的を標的とし、限定しないがヒストン脱アセチル化酵素及びＳＩＲＴを含み、多能性又は多分化能性遺伝子の発現を増加するのに用いられ、分化細胞を再プログラミングするのに用いられうる。これらの再プログラミング方法は卵、胚、又は胚性幹細胞と独立である。更にこれらの方法は、有害な効果を有しうる、ウイルスベクターに依存しない。これらの方法は更に、ｃ−ｍｙｃ及びＫｌｆ４といった癌遺伝子と独立である。

更に、本発明の方法は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の不存在下において、分化細胞を再プログラミングするのに用いられうる。ＳＣＮＴは非常に非効率的であり、再プログラミングの分野で有意な限定を引き起こしていた。本方法はＳＣＮＴの必要性を減少させる。

本方法は、強いレポーター成分を有する人工ベクターとは対照的に、外因性Ｏｃｔ−４遺伝子の発現の増加を示した。人工ベクターは外因性遺伝子と同一のクロマチン構造を有しないか、あるいはゲノムの環強を生成する他の遺伝子及びプロモーター成分を有しない。人工ベクターは天然ゲノムの環境を再現するのに必要な天然成分の多くを有さない。本明細書中で示した結果は、ヒト細胞を処理し、外因性遺伝子の効果を測定することによって取得される効果を示す。

最後に、本明細書中で示したデータは、小分子修飾因子が、ヒストン脱アセチル化酵素といったタンパク質複合体の機能を変えるのに用いられうるのを示す。クロマチン構造を変えるステップは、分化細胞を再プログラミングするステップ及び分化能を回復させるステップにおけるステップである。

ＶＰＡへの曝露によって誘発される形態学的な変化が試験された。胚細胞は明確な形態学的特徴を有する。従って、ＶＰＡで処理された細胞を試験して、多能性遺伝子の発現の増加が、胚細胞と一致する形態学的な変化と対応するかどうかを決定した。

［方法］
ヒト成体皮膚線維芽細胞は、２４ウェルのプレートにおいて、線維芽細胞増殖培地で５日間、５００μＭのＶＰＡで処理された。細胞は日数３で５００μＭのＶＰＡで再処理された。５日目の最後に、細胞は６ウェルのプレートに移され、更に１６日間ｍＴｅＳＲ ｈＥＳ細胞培養培地（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能）で、毎日５００μＭのＶＰＡで処理され、ｍＴｅＳＲ培地は毎日交換された。日数約２１で、コロニーが懸濁剤中に観察された場合、細胞はマトリゲルに移され、播種後に撮影された。

［結果］
図８Ａないし８Ｄは未処理細胞及び５００μＭのＶＰＡで処理された細胞の写真である。図８Ａは、線維芽細胞増殖培地における未処理細胞の写真である。図８Ｂは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地における未処理細胞の写真である。図８Ｃ及び図８Ｄは、マトリゲル上のｍＴｅＳＲ ｈＥＳ細胞培地においてＶＰＡ処理された細胞の写真である。ＶＰＡで処理された細胞は胚様体様のコロニー（図８Ｃ）及び胚様体様の本体（図８Ｄ）と類似する。しかしながら、陽性の多能性タンパク質の染色は検出されなかった（データは図示せず）。これは、実験誤差又は実験型の限界の結果であろう。

小分子修飾因子で処理される細胞はＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇといった遺伝子の発現を誘発し、それらは、細胞の多能性を維持するのに関与し、分化細胞を再プログラムに関与する２の遺伝子である。更に、これらの遺伝子の発現を増加させるステップは細胞において形態学的な変化を引き起こし、形態学的な変化は胚様体様細胞と一致した。これらの結果は明確に、ヒストン脱アセチル化酵素の抑制因子といった小分子修飾因子が、分化細胞を胚様体様細胞に変換するのに用いられうることを示唆する。その結果は、細胞がＶＰＡといった小分子抑制因子に細胞を曝露することによって再プログラミングされうるという観念を支持する。

特定の実施形態が本明細書中で例示及び記載されてきたが、同一目的を得るために算出される任意の配置が、示された特定の実施形態と置換されうることは当該技術分野の当業者によって理解されよう。本出願は記載したような本発明の原理により動作する任意の構成及び変形物をカバーするように意図している。従って、本発明は特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定すべきことが意図される。本出願に引用された特許、引用文献及び刊行物の開示は、本明細書中に引用によって組み込まれる。

Claims (20)

1. 細胞を再プログラミングする方法であって、多能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復することを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、前記小分子修飾因子への曝露前後で前記細胞の表現型を比較するステップと；回復した分化能と一致する表現型で細胞を同定するステップと；を具えることを特徴とする方法。
3. 請求項１に記載の方法が、選択した前記細胞を細胞集団に拡張させるステップを更に具えることを特徴とする方法。
4. 請求項１に記載の方法において、前記小分子修飾因子が、ヒストン脱アセチル化酵素抑制因子と；メチル結合ドメインタンパク質抑制因子と；メチルアデノシルトランスフェラーゼ抑制因子と；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制因子と；ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制因子と；リジンメチルトランスフェラーゼ抑制因子と；ヒストン脱メチル化酵素抑制因子と；メチルサイクルの酵素抑制因子と；からなる群から選択されることを特徴とする方法。
5. 請求項４に記載の方法において、前記小分子修飾因子がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制因子であることを特徴とする方法。
6. 請求項５に記載の方法において、前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ抑制因子がＲＧ１０８であることを特徴とする方法。
7. 請求項１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、多能性遺伝子又は多能性マーカーから発現されるタンパク質を対象とする抗体を用いて細胞を分離するステップを具えることを特徴とする方法。
8. 請求項１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、多能性遺伝子によって駆動されるレポーター、又は選択可能なマーカーに対する抵抗性を用いて細胞を分離するステップを具えることを特徴とする方法。
9. 請求項１に記載の方法において、前記多能性遺伝子がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇからなる群から選択されることを特徴とする方法。
10. 請求項１に記載の方法が、前記小分子修飾因子への曝露前の前記細胞の多能性遺伝子のクロマチン構造を、前記小分子修飾因子への曝露後に取得されるクロマチン構造と比較するステップを更に具えることを特徴とする方法。
11. 細胞を再プログラミングする方法において、初期転写パターンを有する細胞を小分子修飾因子に曝露するステップであって、前記修飾因子が多能性遺伝子の発現を誘発するステップと；前記細胞の初期転写パターンを、前記修飾因子への曝露後に取得される転写パターンと比較するステップと；細胞を選択するステップと；を具え、分化能が前記細胞に回復することを特徴とする方法。
12. 請求項１１に記載の方法において、前記修飾因子への曝露後の前記転写パターンが胚性幹細胞の転写パターンに少なくとも５０％類似することを特徴とする方法。
13. 請求項１１に記載の方法において、前記転写パターンを比較する前に、前記小分子修飾因子への曝露前後の細胞の表現型が比較されることを特徴とする方法。
14. 請求項１１に記載の方法が、選択した前記細胞を細胞集団に拡張させるステップを更に具えることを特徴とする方法。
15. 請求項１１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、多能性遺伝子又は多能性マーカーから発現されるタンパク質を対象とする抗体を用いて細胞を分離するステップを具えることを特徴とする方法。
16. 請求項１１に記載の方法において、前記多能性遺伝子がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇからなる群から選択されることを特徴とする方法。
17. 再プログラミングされた細胞の濃縮集団であって、多能性遺伝子の発現を誘発する小分子修飾因子に細胞を曝露するステップと；細胞を選択するステップであって、分化能が前記細胞に回復するステップと；細胞集団を生成するために選択された前記細胞を培養するステップと；を具える方法によって生成されることを特徴とする、再プログラミングされた細胞の濃縮集団。
18. 請求項１７に記載の再プログラミングされた細胞の濃縮集団において、前記再プログラミングされた細胞が、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞表面マーカーを発現することを特徴とする、再プログラミングされた細胞の濃縮集団。
19. 請求項１７に記載の再プログラミングされた細胞の濃縮集団において、前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ−２からなる群から選択されることを特徴とする、再プログラミングされた細胞の濃縮集団。
20. 請求項１７に記載の再プログラミングされた細胞の濃縮集団において、前記再プログラミングされた細胞が集団の少なくとも６０％を占めることを特徴とする、再プログラミングされた細胞の濃縮集団。
    

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