KR102422175B1 - 만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약 - Google Patents
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Abstract
미분화 상태에 있는 동안 만능 줄기 세포의 분화 내성을 예측할 수 있는 마커, 및 상기 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 신속하게 평가하는 방법이 제공된다. 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용하여 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 유지시키는데 적합한 배양 조건을 검색하기 위한 수단이 또한 제공된다. 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용하여 만능 줄기 세포용 배지를 평가하는 방법이 추가로 제공된다.
인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하는 방법. 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 측정 방법.
인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하는 방법. 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 측정 방법.
Description
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화 가능성(differentiation potentia)의 예측 방법 및 이를 위한 시약(reagent) 및 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법 및 이를 위한 시약 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포의 분화 내성을 감소시키거나 제거하는 방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포(ESC) 및 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)는 다음 2개의 특징을 갖는 만능 줄기 세포(PSC)이다: 미분화 상태에서 증식하는 능력(자기 증식 능력) 및 분화 자극에 반응하여 3배엽(germ layer) 계열로 분화하는 가능성(분화 가능성). 그러나, 분화 가능성은 외부 분화 자극이 적용될 때까지 검증될 수 없다. PSC가 자기 증식을 중단하고 분화 개시로 전환하는 메카니즘 및 이의 일련의 과정이 PSC의 생물학을 이해하는데 매우 중요하지만, 그들은 완전히 설명되지 않았다.
이 문제는 PSC 유래 세포를 사용하는 세포 요법이 수행되어야 할 때 특히 중요하다. PSC 유래 분화 세포의 최종 생성물에 미분화된 세포의 포함은 종양 형성의 위험을 생성한다. 따라서, 분화 개시 과정을 이해하는 것이 임상적으로 매우 중요하다.
오카노 및 야마나카 등(Okano and Yamanaka et al.)의 그룹은 iPSC로부터 2차 신경구(SNS)를 유도하고, 상기 SNS에서 Nanog 유전자 발현을 지표로서 사용함으로써 종양 형성의 위험이 감소된 iPSC 유래 분화 세포를 선택하는 방법을 개시했(특허 문헌 1). 또한, 상기 그룹은 iPSC의 분화 내성은 분화 유도 조건으로 인한 특성보다 iPSC 클론의 고유 특성으로 간주하고, iPSC로부터 유도된 SNS에서 Nanog 유전자의 발현을 지표로서 사용하여 iPSC의 분화 내성을 평가하는 방법을 개시했다(특허 문헌 2).
그러나, 이러한 방법은 모두 분화 내성의 평가를 위해 iPSC를 일단 SNS로 분화시키기 위해 시간과 노력이 필요하다. PSC가 미분화 상태로 존재하는 동안 분화 내성을 예측할 수 있는 마커가 발견되면, 종양 형성의 위험이 없는 안전한 세포 요법제가 신속하고 쉽게 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 분화 마커는 아직 보고되지 않았다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: PCT 국제 출원 공개 번호 제2011-530273호의 일본어 번역
특허 문헌 2: PCT 국제 출원 공개 번호 제2012-527887호의 일본어 번역
본 발명의 목적은 미분화 상태에 있는 동안 만능 줄기 세포(PSC)의 분화 내성을 예측할 수 있는 마커를 제공하고, 상기 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 신속하게 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 유지하는데 적합한 배양 조건을 검색하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 배지를 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 만능 줄기 세포의 분화 내성을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
PSC는 iPSC의 경우 장기 배양 및 리프로그래밍 과정 동안 유전적 이상을 획득하면 분화에 대한 내성을 나타낸다. 유전적 이상은 최신 서열분석 기술을 사용하여 적시에 시험될 수 있으며, 세포 요법에 사용되는 PSC 및 PSC 유도체는 유전자 이상 세포를 제거하기 위해 유전자 스크리닝에 자주 적용될 수 있다. 그러나, 정상적인 핵형을 갖는 PSC도 때때로 배양 조건으로 인한 후생유전적 변형에 의해 유발된 분화 내성을 나타내고, 배아 체(EB) 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 의해 PSC의 분화 가능성을 시험함으로써 PSC의 품질을 정기적으로 확인할 필요가 있다.
PSC의 EB 형성 검정을 수행하는 과정에서, 본 발명자들은 특정 배양 조건이 ESC 및 iPSC 모두에 분화 내성을 부여한다는 것을 밝혀냈다. 즉, PSC가 시판되는 필수 8 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 이하 "Es8"로서 지칭되기도 함) 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지(교쿠토 파마세큐티컬 인더스트리얼 캄파니, 리미티드(KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.), 이하 "SPM"으로서 지칭되기도 함)(참조: Takenaka et al., PLoS One 10 (6), 2015)를 사용하여 배양될 때, EB가 형성되었다. 그러나, PSC가 시판되는 ReproFF2 배지(REPROCELL, 이하 "RFF2"로서 지칭되기도 함)로 옮기고, 5회 이상 계대 배양될 때, 그것은 분화 가능성을 손실하고 더 이상 EB를 형성하지 않았다. PSC를 Es8 또는 SPM에 다시 넣고 추가로 5회 이상 계대 배양될 때, 분화 가능성이 회복되었다. 본 발명자들은 주성분 분석(이하 PCA로서 지칭되기도 함) 및 GeneChip 분석에 의한 분석에 기초하여 PSC의 분화 가능성의 가역적 변경과 관련되는 유전자 후보 중 하나로서 크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7(이하 "CHD7"로서 지칭되기도 함)을 발견했다. CHD7 유전자의 발현에 대한 Es8 및 RFF2를 이용한 PSC 배양의 효과를 조사하여 CHD7 유전자의 발현이 RFF2로 배양함으로써 현저하게 억제된 반면, CHD7 유전자는 Es8로 배양함으로써 PSC에서 중등도의 발현 수준을 나타냈다는 것을 발견했다. CHD7 mRNA가 RFF2로 배양된 PSC에 도입되고, CHD7이 상향조절되었을 때, PSC는 자발적으로 분화를 개시하였고, 미분화된 세포 유지 배양 시스템은 분화된 세포의 증식을 지지하지 않았다. 한편, CHD7 siRNA가 Es8로 배양된 PSC에 도입되고 CHD7이 하향조절되었을 때, PSC의 분화 가능성은 부분적으로 손상되었다. 즉, PSC는 CHD7 발현이 특정 상한치를 초과하지 않으면 미분화된 상태에서 증식할 수 있음이 명백해졌지만, 발현이 임계값 수준 아래로 떨어지면 PSC는 더 이상 분화 자극에 반응하지 않으며, 상한치와 임계값 사이에 CHD7 발현 범위를 갖는 PSC는 분화 자극에 반응할 수 있는 특성을 유지한다. 상기 결과로부터, 본 발명자들은 PSC의 분화 가능성/분화 내성이 미분화 상태의 PSC에서의 CHD7의 발현 수준을 지표로서 사용하여 예측될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다.
[1] 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성의 예측 방법.
[2] [1]에 있어서, 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상의 상기 CHD7의 발현 수준을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
[3] [2]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
[4] [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
[6] 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법.
[7] [6]에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 시험 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
[8] [6] 또는 [7]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상일 때, 상기 시험 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 인간 만능 줄기 세포를 유지할 수 있는 것으로 평가되는, 방법.
[9] [8]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
[10] [6] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
[11] CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하고/하거나 인간 만능 줄기 세포용 배지를 평가하기 위한 시약 또는 키트.
[12] CHD7을 코딩하는 핵산을 포함하는 인간 만능 줄기 세포의 분화 유도제.
[13] [1]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 수준의 2배 이상인 단백질 수준인 경우 상기 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
[14] [13]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
[15] [13] 또는 [14]에 있어서, 분화 내성을 나타내는 상기 인간 만능 줄기 세포가 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
본 발명에 따라서, 인간 만능 줄기 세포(PSC)가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 분화 자극을 적용하기 전에 미분화 상태에서 예측될 수 있다. 또한, 인간 만능 줄기 세포를 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 특성을 보유하는 상태로 유지하는데 적합한 배양 조건이 발견될 수 있다. 또한, 인간 만능 줄기 세포의 배양에 적합한 배지는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 또한, 분화 내성은 인간 만능 줄기 세포, 특히 iPSC 집단에서 CHD7의 발현 수준을 상승시킴으로써(고발현 세포를 선택함으로써) 감소되거나 제거될 수 있다.
도 1은 배양 조건에 따라 변경된 PSC의 분화 가능성을 도시한다. 단일 세포 현탁액 중의 KhES-1 세포를 rhVitronectin-N(써모 피셔 사이언티픽, 이하 "VNT-N"으로 지칭되기도 함)으로 코팅된 접시에 시딩하고, 필수 8 배지(이하, "Es8"로서 지칭되기도 함)로 5회 계대 배양했다(상부 왼쪽 사진). 이어서, 세포를 배아 체(EB) 형성을 위해 수집하거나(하부 왼쪽 사진) ReproFF2 배지(RFF2)로 옮겼다(상부 중앙 사진). KhES-1 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 중앙 사진), Es8 다시 옮겼다(상부 오른쪽 사진). KhES-1 세포를 5회 계대 배양 하고, EB 형성 검정을 수행했다(하부 오른쪽 사진). 배양 1일째에 Es8 또는 RFF2 배지를 사용하는 KhES-1 배양 사진(상부) 및 14일째 EB의 사진(하부)이 도시된다. 상기한 배양 조건하에 세포의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정되고, 사진 아래에 제시되었다(스케일 바: 1.0mm).
도 2는 배양 조건에 따라 변경된 iPSC의 EB 형성 가능성을 도시한다. 단일 세포 현탁액 중의 iPSC(PFX# 9)를 VNT-N으로 코팅된 접시에 시딩하고, Es8로 5회 계대 배양하였다(상부 왼쪽 사진). 이어서, 세포를 EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 왼쪽 사진), ReproFF2 배지(RFF2)로 옮겼다(상부 중앙 사진). PFX# 9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 중앙 사진), Es8로 다시 옮겼다(상부 오른쪽 사진). PFX#9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 수행했다(하부 오른쪽 사진). 배양 1일째에 Es8 또는 RFF2 배지를 사용하여 PFX#9 배양 사진(상부) 및 EB 형성 검정에서 14일째 EB의 사진(하부)을 나타낸다. 상기한 배양 조건하에 세포의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정되고, 사진 아래에 제시되었다(스케일 바: 1.0mm).
도 3은 다양한 조건하에 배양된 PSC의 메틸화의 비교를 도시한다. A. 세포의 메틸화 상태는 Illumina 인간 메틸화 비드 칩에 의해 결정되었다. RFF2로 배양된 6개의 PSC 샘플(iPSC(PFX#9)의 3개 샘플 및 ESC(KhES-1, H9)의 3개 샘플)의 평균 메틸화 점수가 도시되어 있다. 점수는 SPM 또는 Es8을 사용하여 6개의 PSC 샘플(SPM로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, SPM으로 배양된 KhES-1의 1개 샘플, SPM으로 배양된 H9의 1개 샘플, Es8로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, Es8로 배양된 H9의 2개 샘플)의 평균을 비교하여 결정했다. RFF2 또는 SPM 및 Es8로 배양함으로써 0.2를 초과하는 메틸화 점수를 나타내는 프로모터 영역의 유전자 또는 모든 영역의 유전자 수는 벤 다이어그램(Venn diagram)으로 도시되어 있다. B. RFF2, SPM 또는 Es8로 배양된 PSC의 프로모터 영역에서 메틸화 패턴의 클러스터링을 도시한다. 레인 #1-3: RFF2 배지로 배양된 iPSC(PFX#9)의 결과, 레인 #4-6: 6개의 독립적인 실험으로부터 RFF2로 배양된 ESC(KhES-1)의 결과, 레인 #7: SPM을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #8: SPM을 이용한 KhES-1 세포의 결과, 레인 #9: SPM을 이용한 H9 ESC의 결과, 레인 #10: Es8을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #11, 12: 6개의 독립적인 실험으로부터 Es8을 이용한 H9의 결과.
도 4는 qRT-PCR에 의해 결정된 Es8(P5 및 P15) 또는 RFF2 배지(P9 및 P18)로 배양된 KhES-1에서 CHD7 및 자기 성장 인자 POU5F1, SOX2, NANOG 및 EP300의 유전자 발현을 도시한다. 상대적인 양은 Es8을 1로서 사용하여 P5에서 발현 수준을 갖는 막대 그래프로 나타낸다. (P)의 계대 수를 막대에 첨가했다.
도 5는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 mRNA 전사체의 개략도를 도시한다. A. 기능 도메인을 갖는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 PCR 프라이머 세트의 위치가 도시되어 있다. B. CHD7의 기능을 평가하기 위해 사용된 CHD7 mRNA 전사체(아이소폼 2), 우성 음성 전사체 및 siRNA의 표적 도메인이 도시되어 있다.
도 6은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 CHD7 아이소폼을 도시한다. Es8(P11) 또는 RFF2(P21)로 배양된 KhES-1 세포로부터의 전체 세포 용해물(5.3μg)이 각 레인에 적용되었다. 인간 CHD7에 대한 항체를 사용하여 CHD7 아이소폼 1(예상된 질량 336kDa), 아이소폼 2(110kDa) 및 아이소폼 X4(183kDa)를 검출했다. 신호는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 가시화되었다.
도 7은 siCHD7 형질감염에 의한 CHD7의 하향 조절을 도시한다. A. EB 형성 및 siCHD7 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 2 × 105 KhES-1 세포를 rhVitronectin-N(재조합 인간 비토로넥틴-N)(이하 "VTN-N"으로서 지칭되기도 함)으로 코팅된 6-웰 접시에 시딩하고, -1일째에 Es8로 배양하였다. 세포를 CHD7에 대한 작은 이중 가닥 간섭성 RNA(siCHD7) 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)(0일)로 형질감염시켰다. siRNA의 형질감염으로부터 24시간 후, 세포를 저부착 플레이트로 옮기고, ROCK(Rho-관련 단백질 키나제) 억제제(RI)가 보충된 필수 6(Es6)으로 24 시간 동안 배양했다. 배지를 신선한 Es6 배지로 교환하고, 세포를 72시간 동안 추가로 배양했다. B. CHD7 유전자 발현 수준에 대한 siCHD7 도입량의 의존성이 도시되어 있다. C. siRNA 도입 후 CHD7 유전자 발현 수준이 도시되어 있다. CHD7 또는 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 또는 웨스턴 블롯팅(2일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 8은 4일, 5일 및 14일째에 형질감염되지 않은 EB(상부 패널), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널), 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널)를 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 구체화된 조건하에 KhES-1 세포의 유전자 발현 프로파일은 상응하는 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1.0mm). 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 9는 CHD7의 하향조절이 영양소 고갈된 배지로 배양된 ESC의 생존을 지지한다는 것을 도시한다. A. 영양소 고갈된 Es8에 의한 분화 유도 및 siCHD7의 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 0일째에, 세포를 배지(Es8) 교환 후 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 2일 마다 교환했다(2 및 4일). 세포 계수 및 qRT-PCR에 의한 유전자 발현의 결정을 위해, 세포를 siRNA의 형질감염 후 42시간(2일), 72시간 및 96시간에 채취했다. 정상적인 배양의 경우, ESC를 Es8로 배양하였다. 배지를 매일 교환하고, 계대를 3일 마다 수행하여 미분화 상태를 유지했다. B. 0일째, 1일째, 2일째, 3일째 및 4일째에 siCHD7 또는 대조군 siRNA (모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 유전자 발현이 도시되어 있다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 qRT-PCR로 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다. C. 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(형질감염되지 않음), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(siCHD7) 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 수를 플롯팅하는 선 그래프가 도시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 10은 각각 2일째, 3일째 및 4일째 형질감염되지 않은 정기적으로 배양된 KhES-1 세포(상부 패널, 배지는 매일 교환됨), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널, 배지는 2일 마다 교환됨) 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의)(하부 패널, 배지는 2일 마다 교환됨)의 사진을 도시한다. KhES-1의 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 유전자 발현 프로파일이 각 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 11은 CHD7 아이소폼 2의 상향조절이 RFF2로 배양된 ESC에서 '자발적' 분화를 유도한다는 것을 도시한다. A. 세포 배양 및 mCHD7에 의한 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. 0일째 및 1일째에 KhES-1 세포를 mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)로 형질감염시켰다(총 2회). 2일째에 세포를 계대하고, 6-웰 플레이트에 2 × 105 세포/웰로 재시딩하고, 24시간 동안 추가로 배양했다. B. mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)(0일) 및 CHD7의 도입 후 CHD7의 유전자 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 및 웨스턴 블롯팅(3일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 RFF2 배지(NT: 형질감염되지 않은 대조군)로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 형질감염되거나 형질감염되지 않은 KhES-1 세포의 증식을 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 증식은 형질감염되지 않은 대조군(형질감염되지 않음)의 것에 필적한다. 한편, mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(mCHD7)의 증식은 2일째 및 3일째에 감소되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 12는 RFF2 배지로 배양된 각각 1일째, 2일째 및 3일째 형질감염되지 않은KhES-1 세포(상부 패널), mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 및 대조군 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포(하부 패널, 모의)의 사진을 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 그들의 유전자 발현 프로파일은 사진 아래에 제시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 13은 CHD7 우성 음성(DN) mRNA 전사체의 형질감염이 ESC에서 분화 가능성 및 세포 증식을 억제하거나 감소시킨다는 것을 도시한다. A. CHD7 DN mRNA 전사체의 형질감염 및 EB 형성 검정을 위한 프로토콜의 예시가 제시된다. CHD7 DN1은 크로모도메인 mRNA의 전사체이고, CHD7 DN2는 SANT-SLIDE 도메인 mRNA의 전사체이다(도 5b). 0일째에, 전사체를 KhES-1 세포로 형질감염시키고, 세포를 24시간 후에 저부착 플레이트로 옮긴 후 ROCK 억제제(RI)를 함유하는 Es6 배지와 함께 EB 형성을 위해 24시간 동안 배양했다. DN mRNA의 형질감염 후 3일째에 EB의 현미경 관찰 및 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의한 유전자 발현 프로파일의 분석을 수행했다. B. qRT-PCR에 의해 결정된 CHD7 DN1 및 CHD7 DN2 발현 수준을 나타내는 그래프. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포, CHD7 DN1-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN1- 및 CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포 및 모의 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포로부터 유래된 EB의 사진.
도 14는 CHD7를 과발현하는 ESC가 Es8을 사용하는 배양에서 생성될 수 없었음을 도시한다. A. 세포 배양 및 CHD7 아이소폼 2의 형질감염을 위한 프로토콜이 제시되어 있다. B. 1일째 및 2일째 CHD7 발현은 qRT-PCR로 평가했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화했다. C. 1일째 및 2일째에, 형질감염되지 않은 KhES-1 세포 및 CHD7- 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포의 수와 상태를 나타내는 사진. 하나의 웰 중 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다.
도 15는 CHD7의 하향조절이 Es8로 배양된 ESC의 증식을 방해한다는 것을 도시한다. A. siCHD7 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. KhES-1 세포를 0일째 및 1일째에 siCHD7 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 매일 교환했다(MC). 0 내지 3일째에, 세포를 세포 계수를 위해 채취하고, CHD7 발현은 qRT-PCR에 의해 결정했다. B. siCHD7- 또는 대조군 siRNA(모의)-형질감염된 KhES-1 세포, 및 형질감염되지 않은 KhES-1 세포에서 CHD7 유전자 발현은 qRT-PCR로 결정했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(상부 패널) 및 siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 또는 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널) KhES-1 세포의 사진이 도시되어 있다. 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다. D. 세포 수를 나타내는 그래프.
도 16은 GeneChip 데이터를 기반으로 하는 인간 CHD7의 유전자 발현 프로파일을 도시하고, CHD7 수준이 PSC의 분화 가능성을 매개한다는 것을 도시한다. 3가지 상이한 샘플의 초기 배아 발생 동안(이식전 배아) 평균 인간 CHD7 발현은 다양한 조건에서 배양된 인간 PSC(피더 상 또는 피더 부재 인간 PSC)의 인간 CHD7의 발현 및 14일째 EB(14일의 EB)의 인간 CHD7의 발현과 비교했다. 모든 샘플은 MAS5 방법에 의해 정규화되었다.
도 17은 EB 형성 전 PSC의 CHD7의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. ESC(H9, KhES-1) 또는 iPSC(PFX#9, 201B7, SHh#2)를 피더 세포 상에서 hPSC 배지를 사용하여 배양하거나, 시딩하고, VTN-N 상에서 Es8을 사용하여 단일 세포에서 배양했다(이후, "단일-세포 현탁 방법"으로서 지칭되기도 함). EB 형성 전 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(N: VTN-N 코팅된 접시).
도 18은 더 적은 CHD7 mRNA의 카피 수를 갖는 iPSC의 CHD7 mRNA의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. 201B7 또는 PFX#9 세포를 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양했다. CHD7 mRNA의 카피 수는 과성장 상태를 고의로 생성시킴으로써 감소시켰다. 사용된 배지는 Es8이었다. EB 형성 전 CHD7 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(P: 계대 수).
도 19는 다양한 배양 조건하에서 배양된 PSC에서 CDH7 단백질의 발현 수준을 도시한다. P1은 Es8로 17회 계대 배양된 H9이고, P2는 Es8로 10회 계대 배양된 KhES-1이고, N은 RFF2로 11회 계대 배양된 KhES-1이다. N2(음성 대조군)는 RFF2로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물이다. 모든 세포를 VTN-N으로 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양한 다음, 용해물을 1000단위/mL로서 표준(Es8로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물)으로 제조하고, 1차 항체 및 2차 항체의 농도를 교체하고, 상대적 값은 막대 그래프로 나타냈다.
도 20은 단백질 농도 및 mRNA 카피 수로부터 결정된 점근선이다.
도 2는 배양 조건에 따라 변경된 iPSC의 EB 형성 가능성을 도시한다. 단일 세포 현탁액 중의 iPSC(PFX# 9)를 VNT-N으로 코팅된 접시에 시딩하고, Es8로 5회 계대 배양하였다(상부 왼쪽 사진). 이어서, 세포를 EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 왼쪽 사진), ReproFF2 배지(RFF2)로 옮겼다(상부 중앙 사진). PFX# 9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 중앙 사진), Es8로 다시 옮겼다(상부 오른쪽 사진). PFX#9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 수행했다(하부 오른쪽 사진). 배양 1일째에 Es8 또는 RFF2 배지를 사용하여 PFX#9 배양 사진(상부) 및 EB 형성 검정에서 14일째 EB의 사진(하부)을 나타낸다. 상기한 배양 조건하에 세포의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정되고, 사진 아래에 제시되었다(스케일 바: 1.0mm).
도 3은 다양한 조건하에 배양된 PSC의 메틸화의 비교를 도시한다. A. 세포의 메틸화 상태는 Illumina 인간 메틸화 비드 칩에 의해 결정되었다. RFF2로 배양된 6개의 PSC 샘플(iPSC(PFX#9)의 3개 샘플 및 ESC(KhES-1, H9)의 3개 샘플)의 평균 메틸화 점수가 도시되어 있다. 점수는 SPM 또는 Es8을 사용하여 6개의 PSC 샘플(SPM로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, SPM으로 배양된 KhES-1의 1개 샘플, SPM으로 배양된 H9의 1개 샘플, Es8로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, Es8로 배양된 H9의 2개 샘플)의 평균을 비교하여 결정했다. RFF2 또는 SPM 및 Es8로 배양함으로써 0.2를 초과하는 메틸화 점수를 나타내는 프로모터 영역의 유전자 또는 모든 영역의 유전자 수는 벤 다이어그램(Venn diagram)으로 도시되어 있다. B. RFF2, SPM 또는 Es8로 배양된 PSC의 프로모터 영역에서 메틸화 패턴의 클러스터링을 도시한다. 레인 #1-3: RFF2 배지로 배양된 iPSC(PFX#9)의 결과, 레인 #4-6: 6개의 독립적인 실험으로부터 RFF2로 배양된 ESC(KhES-1)의 결과, 레인 #7: SPM을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #8: SPM을 이용한 KhES-1 세포의 결과, 레인 #9: SPM을 이용한 H9 ESC의 결과, 레인 #10: Es8을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #11, 12: 6개의 독립적인 실험으로부터 Es8을 이용한 H9의 결과.
도 4는 qRT-PCR에 의해 결정된 Es8(P5 및 P15) 또는 RFF2 배지(P9 및 P18)로 배양된 KhES-1에서 CHD7 및 자기 성장 인자 POU5F1, SOX2, NANOG 및 EP300의 유전자 발현을 도시한다. 상대적인 양은 Es8을 1로서 사용하여 P5에서 발현 수준을 갖는 막대 그래프로 나타낸다. (P)의 계대 수를 막대에 첨가했다.
도 5는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 mRNA 전사체의 개략도를 도시한다. A. 기능 도메인을 갖는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 PCR 프라이머 세트의 위치가 도시되어 있다. B. CHD7의 기능을 평가하기 위해 사용된 CHD7 mRNA 전사체(아이소폼 2), 우성 음성 전사체 및 siRNA의 표적 도메인이 도시되어 있다.
도 6은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 CHD7 아이소폼을 도시한다. Es8(P11) 또는 RFF2(P21)로 배양된 KhES-1 세포로부터의 전체 세포 용해물(5.3μg)이 각 레인에 적용되었다. 인간 CHD7에 대한 항체를 사용하여 CHD7 아이소폼 1(예상된 질량 336kDa), 아이소폼 2(110kDa) 및 아이소폼 X4(183kDa)를 검출했다. 신호는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 가시화되었다.
도 7은 siCHD7 형질감염에 의한 CHD7의 하향 조절을 도시한다. A. EB 형성 및 siCHD7 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 2 × 105 KhES-1 세포를 rhVitronectin-N(재조합 인간 비토로넥틴-N)(이하 "VTN-N"으로서 지칭되기도 함)으로 코팅된 6-웰 접시에 시딩하고, -1일째에 Es8로 배양하였다. 세포를 CHD7에 대한 작은 이중 가닥 간섭성 RNA(siCHD7) 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)(0일)로 형질감염시켰다. siRNA의 형질감염으로부터 24시간 후, 세포를 저부착 플레이트로 옮기고, ROCK(Rho-관련 단백질 키나제) 억제제(RI)가 보충된 필수 6(Es6)으로 24 시간 동안 배양했다. 배지를 신선한 Es6 배지로 교환하고, 세포를 72시간 동안 추가로 배양했다. B. CHD7 유전자 발현 수준에 대한 siCHD7 도입량의 의존성이 도시되어 있다. C. siRNA 도입 후 CHD7 유전자 발현 수준이 도시되어 있다. CHD7 또는 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 또는 웨스턴 블롯팅(2일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 8은 4일, 5일 및 14일째에 형질감염되지 않은 EB(상부 패널), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널), 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널)를 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 구체화된 조건하에 KhES-1 세포의 유전자 발현 프로파일은 상응하는 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1.0mm). 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 9는 CHD7의 하향조절이 영양소 고갈된 배지로 배양된 ESC의 생존을 지지한다는 것을 도시한다. A. 영양소 고갈된 Es8에 의한 분화 유도 및 siCHD7의 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 0일째에, 세포를 배지(Es8) 교환 후 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 2일 마다 교환했다(2 및 4일). 세포 계수 및 qRT-PCR에 의한 유전자 발현의 결정을 위해, 세포를 siRNA의 형질감염 후 42시간(2일), 72시간 및 96시간에 채취했다. 정상적인 배양의 경우, ESC를 Es8로 배양하였다. 배지를 매일 교환하고, 계대를 3일 마다 수행하여 미분화 상태를 유지했다. B. 0일째, 1일째, 2일째, 3일째 및 4일째에 siCHD7 또는 대조군 siRNA (모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 유전자 발현이 도시되어 있다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 qRT-PCR로 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다. C. 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(형질감염되지 않음), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(siCHD7) 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 수를 플롯팅하는 선 그래프가 도시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 10은 각각 2일째, 3일째 및 4일째 형질감염되지 않은 정기적으로 배양된 KhES-1 세포(상부 패널, 배지는 매일 교환됨), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널, 배지는 2일 마다 교환됨) 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의)(하부 패널, 배지는 2일 마다 교환됨)의 사진을 도시한다. KhES-1의 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 유전자 발현 프로파일이 각 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 11은 CHD7 아이소폼 2의 상향조절이 RFF2로 배양된 ESC에서 '자발적' 분화를 유도한다는 것을 도시한다. A. 세포 배양 및 mCHD7에 의한 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. 0일째 및 1일째에 KhES-1 세포를 mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)로 형질감염시켰다(총 2회). 2일째에 세포를 계대하고, 6-웰 플레이트에 2 × 105 세포/웰로 재시딩하고, 24시간 동안 추가로 배양했다. B. mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)(0일) 및 CHD7의 도입 후 CHD7의 유전자 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 및 웨스턴 블롯팅(3일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 RFF2 배지(NT: 형질감염되지 않은 대조군)로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 형질감염되거나 형질감염되지 않은 KhES-1 세포의 증식을 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 증식은 형질감염되지 않은 대조군(형질감염되지 않음)의 것에 필적한다. 한편, mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(mCHD7)의 증식은 2일째 및 3일째에 감소되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 12는 RFF2 배지로 배양된 각각 1일째, 2일째 및 3일째 형질감염되지 않은KhES-1 세포(상부 패널), mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 및 대조군 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포(하부 패널, 모의)의 사진을 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 그들의 유전자 발현 프로파일은 사진 아래에 제시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 13은 CHD7 우성 음성(DN) mRNA 전사체의 형질감염이 ESC에서 분화 가능성 및 세포 증식을 억제하거나 감소시킨다는 것을 도시한다. A. CHD7 DN mRNA 전사체의 형질감염 및 EB 형성 검정을 위한 프로토콜의 예시가 제시된다. CHD7 DN1은 크로모도메인 mRNA의 전사체이고, CHD7 DN2는 SANT-SLIDE 도메인 mRNA의 전사체이다(도 5b). 0일째에, 전사체를 KhES-1 세포로 형질감염시키고, 세포를 24시간 후에 저부착 플레이트로 옮긴 후 ROCK 억제제(RI)를 함유하는 Es6 배지와 함께 EB 형성을 위해 24시간 동안 배양했다. DN mRNA의 형질감염 후 3일째에 EB의 현미경 관찰 및 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의한 유전자 발현 프로파일의 분석을 수행했다. B. qRT-PCR에 의해 결정된 CHD7 DN1 및 CHD7 DN2 발현 수준을 나타내는 그래프. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포, CHD7 DN1-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN1- 및 CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포 및 모의 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포로부터 유래된 EB의 사진.
도 14는 CHD7를 과발현하는 ESC가 Es8을 사용하는 배양에서 생성될 수 없었음을 도시한다. A. 세포 배양 및 CHD7 아이소폼 2의 형질감염을 위한 프로토콜이 제시되어 있다. B. 1일째 및 2일째 CHD7 발현은 qRT-PCR로 평가했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화했다. C. 1일째 및 2일째에, 형질감염되지 않은 KhES-1 세포 및 CHD7- 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포의 수와 상태를 나타내는 사진. 하나의 웰 중 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다.
도 15는 CHD7의 하향조절이 Es8로 배양된 ESC의 증식을 방해한다는 것을 도시한다. A. siCHD7 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. KhES-1 세포를 0일째 및 1일째에 siCHD7 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 매일 교환했다(MC). 0 내지 3일째에, 세포를 세포 계수를 위해 채취하고, CHD7 발현은 qRT-PCR에 의해 결정했다. B. siCHD7- 또는 대조군 siRNA(모의)-형질감염된 KhES-1 세포, 및 형질감염되지 않은 KhES-1 세포에서 CHD7 유전자 발현은 qRT-PCR로 결정했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(상부 패널) 및 siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 또는 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널) KhES-1 세포의 사진이 도시되어 있다. 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다. D. 세포 수를 나타내는 그래프.
도 16은 GeneChip 데이터를 기반으로 하는 인간 CHD7의 유전자 발현 프로파일을 도시하고, CHD7 수준이 PSC의 분화 가능성을 매개한다는 것을 도시한다. 3가지 상이한 샘플의 초기 배아 발생 동안(이식전 배아) 평균 인간 CHD7 발현은 다양한 조건에서 배양된 인간 PSC(피더 상 또는 피더 부재 인간 PSC)의 인간 CHD7의 발현 및 14일째 EB(14일의 EB)의 인간 CHD7의 발현과 비교했다. 모든 샘플은 MAS5 방법에 의해 정규화되었다.
도 17은 EB 형성 전 PSC의 CHD7의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. ESC(H9, KhES-1) 또는 iPSC(PFX#9, 201B7, SHh#2)를 피더 세포 상에서 hPSC 배지를 사용하여 배양하거나, 시딩하고, VTN-N 상에서 Es8을 사용하여 단일 세포에서 배양했다(이후, "단일-세포 현탁 방법"으로서 지칭되기도 함). EB 형성 전 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(N: VTN-N 코팅된 접시).
도 18은 더 적은 CHD7 mRNA의 카피 수를 갖는 iPSC의 CHD7 mRNA의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. 201B7 또는 PFX#9 세포를 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양했다. CHD7 mRNA의 카피 수는 과성장 상태를 고의로 생성시킴으로써 감소시켰다. 사용된 배지는 Es8이었다. EB 형성 전 CHD7 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(P: 계대 수).
도 19는 다양한 배양 조건하에서 배양된 PSC에서 CDH7 단백질의 발현 수준을 도시한다. P1은 Es8로 17회 계대 배양된 H9이고, P2는 Es8로 10회 계대 배양된 KhES-1이고, N은 RFF2로 11회 계대 배양된 KhES-1이다. N2(음성 대조군)는 RFF2로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물이다. 모든 세포를 VTN-N으로 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양한 다음, 용해물을 1000단위/mL로서 표준(Es8로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물)으로 제조하고, 1차 항체 및 2차 항체의 농도를 교체하고, 상대적 값은 막대 그래프로 나타냈다.
도 20은 단백질 농도 및 mRNA 카피 수로부터 결정된 점근선이다.
본 발명은 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포(hPSC)의 분화 가능성의 예측 방법(이하, "본 발명의 예측 방법"으로서 지칭되기도 함)을 제공한다.
본 명세서에서, 만능 줄기 세포의 "분화 가능성(differentiation potentia)"은 만능 줄기 세포가 자발적으로 또는 특정 분화 자극에 반응하여 3배엽 계열 또는 특정 세포주로 분화될 가능성을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 분화 자극에 반응하여 특정의 특별한 분화 자극에 상응하는 세포주로 분화될 가능성을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 예측되고, 선택된다. 이러한 분화 자극은 그것이 미분화 상태로부터 PSC의 방출 및 임의의 분화 세포로의 이의 유도를 일으키는 자극이고, 분화 방향이 공지되어 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 아래 언급된 실시예 등에서 EB 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 사용되는 배양 조건이 언급될 수 있다.
본 명세서에서, 특별히 언급되지 않는 한, "CHD7의 발현 수준"은 CHD7 유전자의 임의의 발현 수준 및 CHD 단백질의 발현 수준을 의미할 수 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 미분화 상태에서 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준이 상한치를 갖지만 하한치는 갖지 않고, 상한치가 배양 조건에 따라 변한다는 발견에 기초한다. hPSC의 CHD7의 발현 수준이 상한치를 초과하면 hPSC는 PSC의 유지 배지에서도 자발적으로 분화를 개시하고, 배양 시스템은 분화된 세포의 증식을 더 이상 지지할 수 없다. 한편, hPSC의 CHD7의 발현 수준이 임계값 미만일 때, hPSC는 분화 자극에 반응하여 충분한 분화 가능성을 나타낼 수 없고, 미분화된 상태로 유지된다. 따라서, hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내기 위해서는, CHD7의 발현 수준이 PSC에서 중등도(즉, 상기 상한치 이하, 상기 임계 값 이상)인 것이 필요하다.
상기한 바와 같이, 미분화 상태로 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준의 상한치는 배양 조건에 따라 변하는 것으로 간주된다. CHD7의 발현 수준이 각 배양 조건하에서 상한치를 초과하면, hPSC는 자발적으로 분화를 개시하고, 이러한 배양 조건하에서 PSC의 유지 및 증식은 불가능해진다. hPSC가 자발적으로 분화하지 않으면, 그것은 발현 수준이 배양 조건하에서 상한치를 초과하지 않았음을 의미한다. 따라서, 다양한 배양 조건하에서 미분화 상태로 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준의 상한치를 설정할 필요는 없다.
한편, 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값이, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 이는 제한 없이, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양될 때, 이는 제한 없이, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 이것은 제한 없이, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양될 때, 그것은 제한 없이, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 그것은 제한 없이, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도과 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 측정과 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
예를 들어, 임계 값은 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값의 예는 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 및 10배 이상을 포함한다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기한 경우와 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
본 발명의 예측 방법에서, 분화 가능성이 예측 가능한 인간 만능 줄기 세포는 미분화 상태를 유지하면서 증식할 수 있는 "자기-증식 능력" 및 모든 3배엽 계열로 분화될 수 있는 "분화 가능성"을 갖는 미분화 세포이면 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 배아 줄기 세포(ES 세포), 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포), 원시 생식 세포로부터 유래되는 배아 생식(EG) 세포, 고환 조직으로부터 GS 세포의 확립 및 배양 과정에서 단리된 만능 생식계 줄기(mGS) 세포 등을 들 수 있다. ES 세포는 핵 재프로그래밍에 의해 체세포로부터 생성된 ES 세포(nt ES 세포)일 수 있다. ES 세포 또는 iPS 세포가 바람직하다. 본 발명의 예측 방법은 인간 만능 줄기 세포에서 특히 바람직하게 사용되고, 만능 줄기 세포가 확립되었거나 확립될 수 있는 임의의 포유동물에 적용 가능하다. 비-인간 포유동물로서, 예를 들어, 마우스, 원숭이, 돼지, 랫트, 개 등이 언급될 수 있다.
만능 줄기 세포는 자체 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포의 경우, 문헌[참조: WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al.(2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9 등]에 기재된 방법이 언급될 수 있다.
ES 세포는 표적 동물의 수정란의 낭포로부터 내부 세포 괴상을 제거하고, 내부 세포 괴상을 섬유아세포 피더 세포에서 배양함으로써 확립될 수 있다. 또한, 세포는 백혈병 억제 인자(LIF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 등과 같은 물질이 첨가된 배양 배지를 사용하는 계대 배양에 의해 유지될 수 있다. 인간 및 원숭이 ES 세포의 확립 및 유지 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제5,843,780호; Thomson J A, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92:7844-7848; Thomson J A, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485 등]에 기재되어 있다. 인간 ES 세포주에 관하여, 예를 들어, WA01(H1) 및 WA09(H9)는 위셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)로부터 이용 가능하고, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 프론티아 의료 과학 연구소(Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University)(일본 교토)로부터 이용 가능하다.
EG 세포는 LIF, bFGF, 줄기 세포 인자 등과 같은 물질의 존재하에서 원시 생식 세포를 배양함으로써 확립될 수 있다(참조: Y. Matsui et al. (1992), Cell 70:841-847; J. L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551).
nt ES 세포의 생산을 위해, 핵 이식 기술(참조: J. B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646) 및 ES 세포 생산 기술(상기 언급됨)의 조합이 사용된다(참조: Kiyoka Wakayama et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Suppl.), pp. 47-52). 핵 이식에서, 재프로그래밍은 체세포의 핵을 포유동물의 제핵 미수정란에 주입하고, 몇 시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
mGS 세포는 WO 2005/100548에 기재된 방법에 따라 고환 세포로부터 생성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 생성된 PSC, 바람직하게는 hPSC는 바람직하게는 CHD7의 발현 수준의 측정 전에 PSC를 유지하고 배양하는 단계를 함유할 수 있다. 배양은 현탁 배양 또는 코팅된 배양 접시를 사용하는 접착 배양일 수 있다. 이 단계에서, 접착 배양이 바람직하게 사용된다. PSC는, 예를 들어, 물리적으로 해리될 수 있거나 프로테아제 활성 및 콜라게나제 활성을 갖는 해리 용액(예: 아큐타제(Accutase)(TM) 및 아큐맥스(Accumax)(TM) 등) 또는 콜라게나제 활성만을 갖는 해리 용액, 또는 트립신/EDTA를 사용하여 해리될 수 있다. 바람직하게는, 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 해리하는 방법이 사용된다.
PSC를 분리할 경우, 배지에 Rho-관련 단백질 키나제(ROCK) 억제제를 함유하는 것이 바람직하다. ROCK 억제제는 ROCK의 기능을 억제할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, Y-27632가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 배지 중 Y-27632의 농도는 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 1μM 내지 50μM, 예를 들어, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 16μM, 17μM, 18μM, 19μM, 20μM, 25μM, 30μM, 35μM, 40μM, 45μM, 50μM이지만, 이들에 한정되지 않는다.
ROCK 억제제가 배지에 첨가되는 기간은 PSC를 배양하는 단계에서의 배양 기간, 또는 단일 분산시 세포 사멸을 억제하는 임의의 기간, 예를 들어, 적어도 1일일 수 있다.
본 명세서에서, 현탁 배양은 세포를 배양 접시에서 비접착 상태로 배양함으로써 배아 체를 형성하고, 특별히 제한되지 않는다. 그것은 세포에 대한 접착성을 향상시키기 위한 인공 처리(예: 세포외 기질 등으로의 코팅 처리)가 없는 배양 접시 또는 접착을 억제하기 위해 인공 처리(예: 폴리하이드록시에틸메타크릴산(폴리-HEMA)에 의한 코팅 처리)한 배양 접시를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 접착 배양은 피더 세포에서 배양하거나 세포외 기질로 코팅 처리된 배양 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 코팅 처리는 세포외 기질을 함유하는 용액을 배양 용기에 넣은 후 그 용액을 적절히 제거함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 피더 세포(feeder cell)는 보조 역할을 하며, 표적 세포의 배양 조건을 조정하는데 사용되는 다른 세포를 의미한다. 본 발명에서, 세포외 기질은 세포 외부에 존재하는 초분자 구조이며, 자연적으로 유래되거나 인공물(재조합체)일 수 있다. 비토로넥틴, 콜라겐, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알루론산, 테나신, 엔탁틴, 엘라스틴, 피브릴린, 라미닌 및 이들의 단편과 같은 물질을 들 수 있고, 비트로넥틴 또는 이의 단편이 바람직하다.
상기한 바와 같이 생산된 PSC, 바람직하게는 hPSC는, 예를 들어, 세포외 기질로 코팅된 배양 용기를 사용하는 접착 배양에 의해 유지될 수 있다. PSC를 배양하는 단계에 사용되는 배양 배지는 기초 배지로서 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지의 예는 IMDM 배지, 배지 199, 이글 최소 필수 배지(EMEM), αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 햄 F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지 및 이들의 혼합 배지 등을 포함한다. 시판되는 PSC 유지 배지로서, 예를 들어, 상기한 필수 8 배지(Es8, 써모 피셔 사이언티픽), SPM (Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지, 교쿠토 파마슈티칼 인더스트리얼 캄파니, 리미티드), ReproFF2 배지(RFF2, 리프로셀(REPROCELL)), StemPro34(인비트로겐(invitrogen)), RPMI-기반 배지, mTeSR1(스템셀 테크롤로지스(STEMCELL Technologies)) 등이 또한 사용될 수 있다. 본 단계에서, Es8, SPM 등은 바람직하게는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 PSC 클론을 예측하고 선택하기 위한 유지 배지로서 사용된다. RFF2 배지와 같은 PSC에 분화 내성을 부여하는 배지에서 배양될 때, PSC는 분화 자극에 반응하여 분화하는 능력을 손실한다. 그러나, 이러한 분화 내성은 PSC 클론의 고유 특성이 아니며, 분화 가능성은 때때로 배양 조건을 변화시킴으로써 가역적으로 회복될 수 있다. 따라서, PSC 클론의 품질을 검증할 때(분화 내성이 큰론의 고유 특성이거나 배양 조건에 따라 가역적인지에 관계없이), Es8, SPM 등과 같은 본 발명에서 PSC의 분화 가능성을 유지하는 것으로 확인된 배지로 PSC를 배양하는 것이 효율적이다. 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 분화 가능성이 영향을 받지 않는 한, 배지는 하나 이상의 혈청 대체물, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 녹아웃 혈청 대체물(KSR)(ES 세포 배양 동안 FBS를 위한 혈청 대체물), N2 보충제(인비트로겐), B27 보충제(인비트로겐), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올(2 ME), 티올글리셀롤 등을 함유할 수 있고, 또한 하나 이상의 물질, 예를 들어, 지질, 아미노산, L-글루타민, 글루타맥스(인비트로겐), 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 함유할 수 있다.
PSC를 배양하는 단계에서, PSC는 단일 세포에서 배양될 수 있다. 예를 들어, PSC는 피펫팅, 트립신 처리 등에 의해 단일 세포로 제조되고("단일 세포 현탁액"으로서 지칭되기도 함), VTN-N으로 코팅된 접시에 시딩되고, 피더 세포 없이 배양되고, 이에 의해 PSC는 단일 세포에서 배양될 수 있다. PSC를 배양하는 단계에서, PSC는 소세포 덩어리로 배양될 수 있다. 예를 들어, PSC는 피더 세포에서 PSC를 배양함으로써 소세포 덩어리로 배양될 수 있다("소세포 덩어리 방법"으로서 지칭되기도 함).
PSC를 배양하는 단계에서, 배양 온도는 다음으로 제한되지 않고, 예를 들어, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, 배양은 CO2 함유 공기 대기하에서 수행된다. CO2 농도는 약 2 내지 10%, 바람직하게는 5%이다.
PSC를 배양하는 단계에서, 배양 기간 동안 배지를 교환할 수 있다. 배지 교환에 사용되는 배지는 배지 교환 전의 배지와 같은 성분을 갖는 배지 또는 다른 성분을 갖는 배지일 수 있다. 바람직하게는, 동일한 성분을 갖는 배지가 사용된다. 배지 교환 시기는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 신선한 배지로 배양을 시작한 후 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다 또는 5일 마다 수행될 수 있다. 이 단계에서, 배지 교환은 바람직하게는 매일 수행된다.
hPSC의 CHD7의 발현 수준 측정은 자체로 공지된 임의의 RNA 또는 단백질 측정 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, CHD7의 발현을 RNA 수준에서 측정하는 경우, 노던 하이브리드화, RT-PCR, 디지털 PCR 등은 엄격한 조건하에 CHD7 mRNA와 하이브리드화될 수 있는 핵산(프로브) 또는 mRNA의 일부 또는 전부를 증폭시키는 프라이머로서 기능할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 수행될 수 있다. 프로브로서 사용되는 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있다. 바람직하게는, DNA가 사용된다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 이중 가닥의 경우에, 그것은 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드일 수 있다. 핵산의 길이는 그것이 표적 mRNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 약 15개 이상 염기, 바람직하게는 약 20개 이상 염기이다. 핵산은 바람직하게는 표지제로 표지화되어 표적 mRNA의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 표지제로서, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 사용된다. 방사성 동위 원소로서, 예를 들어, [32P], [3H], [14C] 등이 사용된다. 효소로서, 비활성이 큰 안정한 효소가 바람직하다. 예를 들어, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제, 말레이트 데하이드로게나제 등이 사용된다. 형광 물질로서, 예를 들어, 플루오레스카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광 물질로서, 예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 비오틴-(스트렙트)아비딘이 프로브 및 표지제의 결합에 사용될 수도 있다.
프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 세트는 그것이 CHD7을 코딩하는 mRNA의 염기 서열(센스 가닥) 및 이에 상보적인 염기 서열(안티센스 가닥) 각각에 특이적으로 어닐링될 수 있고, 그들 사이에 샌드위치된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 각각 약 15 내지 약 100개 염기, 바람직하게는 약 15 내지 50개 염기의 길이를 갖고, 약 100bp 내지 수 kbp의 DNA 단편을 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드의 세트가 언급될 수 있다. 특히, CHD7L(염기 서열은 서열번호 1에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다)로서 지칭되기도 하는 CHD7 아이소폼 1의 mRNA(NCBI 데이터베이스(GenBank 수탁번호 NM_017780.3)를 특이적으로 증폭시킬 수 있고, CHD7 아이소폼 1의 아미노산 672 내지 2620을 코딩하는 mRNA의 염기 서열 및 이에 상보적인 염기 서열로 어닐링할 수 있는 프라이머 세트가 바람직하게 사용될 수 있다.
미량의 RNA 샘플을 사용하여 CHD7의 유전자 발현을 정량적으로 분석하기 위해, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR 또는 디지털 PCR 분석을 사용하는 것이 바람직하다. 경쟁적 RT-PCR이 사용되는 경우, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되고 표적 DNA와 구별될 수 있는 증폭 생성물(예: 표적 DNA와 상이한 크기를 갖는 증폭 생성물, 제한 효소 처리에 의해 상이한 이동 패턴을 나타내는 증폭 생성물 등)을 제공하는 핵산이 프라이머 세트 이외에 추가로 함유될 수 있다. 경쟁자 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA의 경우에, PCR은 RNA 샘플로부터 역전사 반응으로 cDNA를 합성한 후 경쟁자를 첨가하여 수행될 수 있다. RNA의 경우에, RT-PCR은 처음부터 RNA 샘플에 경장자를 첨가하여 수행될 수 있다. 후자의 경우에, 역전사 반응의 효율도 고려되고, 따라서 원래 mRNA의 절대량이 추정될 수 있다.
한편, 실시간 RT-PCR이 PCR 증폭량을 실시간으로 모니터링할 수 있기 때문에, 전기영동은 필요하지 않고, CHD7 유전자 발현은 보다 신속하게 분석될 수 있다. 일반적으로, 모니터링은 다양한 형광 시약을 사용하여 수행된다. 이들 중에는 이중 가닥 DNA(삽입제), 예를 들어, SYBR Green I, 브롬화에티듐 등에 상기 프로브(핵산이 증폭 영역에서 표적 핵산으로 혼성화한다는 것을 유의함)로서 사용될 수 있고, 형광 물질(예: FAM, HEX, TET, FITC 등) 및 급냉 물질(예: TAMRA, DABCYL 등) 등으로 변형된 양 말단을 갖는 핵산을 결합함으로써 형광을 방출하는 시약이 있다.
디지털 PCR 분석은 추출된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 초-미세 구획의 물방울 또는 유중수(W/O) 에멀젼에 cDNA를 1 또는 0개의 cDNA가 함유되도록 희석하여 분산시키고, PCR 증폭을 수행하고, 양성 증폭 신호를 갖는 미소-구획의 수 및 물방울의 수를 직접 계수함으로써 샘플 중 표적 유전자의 발현 수준을 직접 측정하여 샘플 중 표적 유전자의 발현 수준을 절대적으로 측정하는 분석 방법이다. 이 방법은 특히 바람직하게 사용될 수 있다. 디지털 PCR 분석의 경우, 시판되는 디지털 PCR 분석기가 사용될 수 있으며, QuantStudio 3D 디지털 PCR 시스템(써모 피셔 사이언티픽의 상표명), BioMark HD(플루이다임(Fluidigm)의 상표명) 및 액적 디지털 PCR 방식을 채용한 바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)의 생성물 등이 사용될 수 있으며, 분석은 각 장치의 지침 메뉴얼 및 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
상기 프로브로서 사용되는 핵산은 CHD7을 코딩하는 cDNA 또는 이의 단편일 수 있거나, 염기 서열 정보(예를 들어, 인간 CHD7의 경우, NCBI 데이터베이스 (GenBank)에서 수탁 번호 NM_017780.3(서열번호 1)하에 등록된 염기 서열을 참조할 수 있다)에 기초하여 시판되는 DNA/RNA 자동 합성 장치 등을 사용하여 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 상기 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 세트는 상기 염기 서열 정보에 기초하여 시판되는 DNA/RNA 자동 합성 장치 등을 사용하여 염기 서열 및 이의 상보적 연쇄 서열의 일부를 화학적으로 합성함으로써 수득될 수 있다.
한편, CHD7의 발현이 단백질 수준에서 측정될 경우, 그것은 다양한 면역학적 방법, 예를 들어, 항-CHD7 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅, ELISA, RIA, FIA 등과 같은 다양한 면역검정을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 항-CHD7 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있고, 익히 공지된 면역학적 방법에 의해 제조될 수 있거나, 시판되는 항체가 또한 사용될 수 있다. 항체는 완전 항체 분자뿐만 아니라 이의 단편도 포함하고, 이의 예는 Fab, F(ab')2, ScFv, 미니바디 등을 포함한다. 상기 면역학적 측정 방법에 대한 세부 사항은, 예를 들어, 다음 문헌[참조: Hiroshi Irie ed., "Radioimmunoassay" (Kodansha, published 1974), Hiroshi Irie ed., "Supplementary volume of Radioimmunoassay" (Kodansha, published 1979), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (Igaku-Shoin, published 1978), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (2nd edition) (Igaku-Shoin, published 1979), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (third ed.) (Igaku-Shoin, published 1987), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibidem Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibidem Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibidem Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all above published by Academic Press) 등]을 참조할 수 있다.
CHD7의 발현이 샌드위치 ELISA에 의해 단백질 수준에서 측정될 경우, 포획 항체 및 검출 항체의 조합의 선택은 CHD7이 검출될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 예를 들어, 모노클로날 항체(마우스 IgG1)는 항원, 인간 CHD7의 Ala 263-Gln 457(서열번호 2)이 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에서 발현되고, 단백질 A 또는 B로 정제되는 폴리펩타이드를 사요하여 수득되고, 포획 항체로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 항-인간 CHD7 토끼 IgG는 토끼를 에쉐리키아 콜리에서 발현된 인간 CHD7의 Gly 25-Met 200(서열번호 2)으로 면역화함으로써 수득되고, 항원을 사용하여 친화성 정제되고, 1차 항체로서 사용될 수 있다.
CHD7의 발현 수준의 측정을 위해, CHD7의 아이소폼의 발현 수준을 측정할 수 있다. 아이소폼의 예는 아이소폼 1(NCBI 데이터베이스(GenBank) 수탁 번호 NM_017780.3(염기 서열은 서열번호 1에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다), 아이소폼 2(상동, 수탁 번호 NM_001316690.1(염기 서열은 서열번호 3에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된다)), 아이소폼 X4(상동, 수탁 번호 XM_011517560.2(염기 서열은 서열번호 5에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된다)) 등을 들 수 있다. 아이소폼 1이 바람직하다.
임의의 상기한 방법 또는 자체로 공지된 다른 방법을 사용하여, PSC의 CHD7의 발현 수준을 측정하고, 측정 값은 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값과 비교한다. 임계 값은 사용되는 CHD7 발현 수준의 측정 방법에 따라 다르다. 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양된 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준이 측정되는 경우에, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 측정과 유사할 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
예를 들어, 임계 값은 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값의 예는 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 및 10배 이상일 수 있다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포일 수 있다. 또한, 상기한 경우와 유사할 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포일 수 있다.
CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나, 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
다른 측정 방법이 사용된 경우에도, Es8 또는 SPM 배지로 배양함으로써 분화 가능성을 나타내는 것으로 EB 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 의해 확인된 PSC 클론(예: H1, H9, KhES1 등과 같은 hESC 클론)은 Es8 또는 SPM으로 배양되고, 구체적으로, 예를 들어, 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 바람직하게는 5회 이상 계대 배양된 경우의 CHD7의 발현 수준은 복수의 실험에 의해 측정되고, 예를 들어, 측정의 최대 값 또는 평균이 임계 값으로 결정될 수 있다.
비교 결과로서, CHD7의 발현 수준이 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값 이상이면, 상기 PSC는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타낸다. 따라서, 분화가 유도될 때 (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포가 잔류할 위험이 없거나 세포가 낮은 위험을 갖는다는 것이 예측될 수 있다. 반대로, CHD7의 발현 수준이 임계 값 미만이면, 상기 PSC는 분화 자극에 대한 분화 내성을 나타낸다. 따라서, 분화가 유도되는 경우, (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포가 잔류할 위험이 있거나 세포가 높은 위험을 갖는다는 것이 예측될 수 있다. 예측 결과로서, 위험이 잔류하거나 세포가 높은 위험을 갖는 경우, 분화 내성은 CHD7을 코딩하는 핵산을 도입하거나 PSC(예: Es8, SPM)의 분화 가능성을 유지할 수 있는 것으로 확인된 것으로 배지를 교환하고, 적어도 5회 계대 배양함으로써 감소되거나 제거될 수 있다. 또한, 예측 결과로서, 피더 세포와 함께 배양된 iPSC가 위험을 갖거나 세포가 높은 위험을 갖는 경우, 분화 내성은 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양함으로써 감소되거나 제거될 수 있다.
상기한 바와 같이, PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 반드시 PSC 클론의 고유 특성은 아니고, 오히려 PSC 유지 배양 조건에 따라 변경될 가능성이 높다. 즉, PSC 클론이 동일하더라고, 배양 조건이 상이하면, 그것은 분화 자극에 반응하여 분화될 수 있거나(예: Es8 또는 SPM으로 배양될 경우), 그것은 (RFF2로 배양되는 경우) 분화 내성을 종종 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 PSC의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법(이하, "본 발명의 평가 방법"으로서 지칭되기도 함)을 제공한다. 시험 배지의 예는 상기 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계 전에 PSC의 유지 배양에 사용될 수 있는 다양한 배지를 포함한다.
하기 언급된 실시예에 기재된 바와 같이, 배지를 상이한 배지로 교환하여 PSC에서 CHD7 유전자의 후성유전적 상태를 완전히 변화시키기 위해 5회 계대(약 15일)가 바람직하다. 따라서, 본 발명의 평가 방법에서, PSC는 바람직하게는 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계 전에 5회 이상의 계대 동안 시험 배지로 배양된다. 시험 배지로의 PSC의 배양은 상기한 본 발명의 예측 방법에서와 유사한 방법으로 수행될 수 있다.
상기 본 발명의 평가 방법에서 CHD7의 발현 수준의 측정은 또한 상기 본 발명의 예측 방법에서와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 수득된 측정 값은 상기 본 발명의 예측 방법에서 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값과 비교된다. 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우에, 임계 값은, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양된 경우에, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양 되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준이 측정되는 경우, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 언급된 측정과 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
또한, 임계 값은, 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 언급된 경우와 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나, 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
비교 결과로서, CHD7의 발현 수준이 hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값 이상이면, 시험 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행할 수 있다. 따라서, 분화가 유도될 때 (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포를 남길 위험이 없거나 배지가 낮은 위험을 갖는다고 평가될 수 있다. 반대로, CHD7의 발현 수준이 임계 값 미만이면, 시험 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행한다. 따라서, 분화가 유도되는 경우, (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포를 남길 위험이 있거나 배지가 높은 위험을 갖는다고 평가될 수 있다.
PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 배지가 PSC의 유지 배양을 수행하는 본 발명의 평가 방법에서 평가된 배지를 사용하여 PSC의 유지 배양이 수행되는 경우, 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행할 수 있는 동일한 평가 방법에 의해 평가된 배지로 교체되고, PSC는 바람직하게는 5회 이상 계대 배양되고, 이에 의해 PSC는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 변경될 수 있다.
하기 언급된 실시예에서 입증되는 바와 같이, 배지를 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC를 유지 배양할 수 있는 배지로 교체하는 대신 PSC에 CHD7을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 분화 자극을 가하지 않고, PSC에서 자발적 분화가 유도될 수 있다. 예를 들어, hPSC 유래 분화 세포 집단을 이식 후, 미분화 세포가 이식 세포 중에 잔류하는 경우, CHD7을 코딩하는 핵산(mRNA, 플라스미드 DNA 등)을 이식 부위에 주입하고, 핵산을 잔류하는 미분화 세포에 도입하여 이식 부위의 환경에 관계 없이 자발적인 분화를 일으킴으로써 종양 형성 위험이 감소될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 CHD7을 코딩하는 핵산을 함유하는 PSC, 특히 hPSC를 위한 분화 유도 인자, 및 분화 내성을 나타내는 PSC에 핵산을 도입하는 단계를 포함하는 PSC의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 예측 방법 및 본 발명의 평가 방법에 사용하기 위한 시약을 제공한다. 상기 시약은 CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 함유한다. 이러한 물질은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, CHD7의 발현이 RNA 수준에서 검출되는 경우, 상기 본 발명의 예측 방법에서 프로브 또는 프라이머로서 예시된 핵산 등이 인용될 수 있다. CHD7의 발현이 단백질 수준에서 검출되는 경우, 항-CHD7 항체 등이 언급될 수 있다. 상기 시약은 또한 상기한 CHD7의 발현 수준을 측정하는 다양한 방법을 실시하기 위해 필요한 다양한 시약을 추가로 함유하는 키트로서 제공될 수 있다.
본 발명은 실시예를 나타냄으로써 다음에 더욱 구체적으로 설명되지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
재료 및 방법
본 명세서에서, 본 연구에서 수행된 모든 실험은 인간 ESC 및 인간 iPSC를 사용했다. 본 연구는 고베 생물 의학 연구 및 혁신 재단(FBRI)의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
(세포 배양)
임의의 인간 ESC 주 KhES-1(Riken BRC)(참조: Navarro-Alvarez et al., Cell Transplant 2008; 17(1-2): 111-119) 및 H9(WiCell Research Institute, Levenstein et al., Stem Cell; 24(3):568-74, 2006 Mar.) 및 인간 hiPSC 주 PFX#9(참조: Nishishita et al. PLoS One 2012; 7(6): e38389), 201B7(Riken RBC) 및 SHh#2(참조: Nishishita et al., PLoS One 2012; 7(6))를 미토마이신 C-처리된 SNL76/7 세포(SIM 균주 배아 섬유아세포, ECACC; 인증된 세포 배양의 유럽 컬렉션)에서 hPSC 배양 배지(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855) 또는 rhVitronectin-N(재조합 인간 비트로넥틴-N)(써모 피셔 사이언티픽)-코팅된 접시에서 필수 8 배지(Es8, 써모 피셔 사이언티픽)(참조: Chen et al., Nat Methods 2011; 8(5): 424-429), SPM(Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지)(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)(교쿠토 파마슈티칼 캄파니 리미티드) 또는 RiproFF2 배지(RFF2, ReproCELL)로 배양했다. 세포를 완만한 세포 해리 시약(GCDR; Stem Cell Technologies)을 사용하여 덩어리로 계대시키고, iPSC의 경우 1:3의 비율로 또는 ESC의 경우에는 1:3.5의 비율로 분할했다. 대안적으로, 세포는 TrypLE Select(Life Technologies)를 사용하여 단일-세포 현탁액을 시딩하여 계대시켰다(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855). 단일 세포 현탁액 중 세포는 Es8 배지로 배양될 때 6-웰 플레이트에서 3 × 105 세포/웰로, RFF2 배지로 배양되는 경우는 1 × 105 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이터(MCO-19AIC; Panasonic)에서 5% CO2를 함유하는 대기에서 배양하였다. KhES-1, H9 및 PFX#9 세포의 핵형을 5회 계대마다 다색 형광 동일 반응계 하이브리드화(mFISH) 및 10회 계대마다 G-밴딩에 의해 조사했고; 정상 핵형을 갖는 PSC를 이 연구에 사용했다.
(siRNA 시약 및 형질감염)
달리 명시되지 않는 한, 모든 시약은 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)에서 구입했다. 각각 siCHD7 또는 대조군 siRNA (모의) 형질감염 실험을 위해 소음기 선택(Silencer Select) 사전설계된 인간 CHD7 siRNA(카탈로그 번호 4392420; ID: s31142) 및 소음기 선택 음성 대조군 번호 1(카탈로그 번호 4404021)을 사용했다. 세포는 다음과 같이 형질감염시켰다.
ESC를 VTN-N 코팅된 6-웰 플레이트에서 2 × 105 세포/웰로 시딩하고, 4mL의 Es8, SPM 또는 RFF2로 배양했다. 다음날, 배지를 교체하고, siCHD7 또는 대조군 siRNA를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMAX를 사용하여 세포로 형질감염시켰다(형질감염량 50pmol, 30pmol 또는 10pmol). 간단히, 50pmol의 siCHD7의 도입과 관련하여, 칵테일 A(4μL 리포펙타민 RNAiMAX 시약 및 150μL Opti-MEM 배지)를 칵테일 B(1μL의 50μM siCHD7(50pmol) 또는 대조군 siRNA(50pmol) 및 150μL Opti-MEM 배지)와 혼합하고, 이어서 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양했다. 혼합된 칵테일(240μL)은 siCHD7(최종 농도 10nM) 또는 대조군 siRNA(최종 농도 10nM)에 의한 ESC의 형질감염에 사용하고, 세포를 48시간 동안 배양했다. 시약의 형질감염 효율은 지정된 시점에 형질감염된 세포에서 CHD7 mRNA의 검출을 위해 qRT-PCR에 의해 평가했다.
(합성 mRNA 시약 및 형질감염)
T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 각각 CHD7 아이소폼 2(NM_001316690.1(서열번호 3))의 5 '및 3' 코딩 DNA 서열로 융합시키고, pMX 벡터로 클로닝했다. 이어서, SfiI로 pMX 벡터를 소화한 후, CHD7 아이소폼 2를 위한 합성 mRNA를 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 전사 키트를 사용하여 생성시켰다. 크로모도메인 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인(CHD7 DN1)을 모두 커버하는 합성 mRNA를 동일한 방식으로 생성시켰다. CHD7의 SANT-SLIDE 도메인 영역은 공개된 CHD1 서열과의 상동성에 기초하여 결정되었고(참조: Ryan et al., Embo j 2011; 30(13):2596-2609), 합성 mRNA(CHD7 DN2)는 동일한 방식으로 생성시켰다. 생성되는 mRNA의 양은 ND-1000(Nano Drop)으로 측정했다. 동일한 벡터 백본으로부터 수득된 향상된 그린 형광 단백질(eGFP)을 위한 mRNA를 대조군(대조군 mRNA, 모의)으로 사용했다.
(mRNA 형질감염)
ESC(3 × 105)를 VTN-N-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 5ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; Peprotech)가 보충된 RFF2로 시딩했다. mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 메신저 MAX를 사용하여 세포로 형질감염시켰다. 간단히, 칵테일 A(3.75μL 리포펙타민 메신저 MAX 형질감염 시약 및 125μL Opti-MEM 배지)를 실온에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 칵테일 B(2.5μg mCHD7 또는 대조군 mRNA 및 125μL Opti-MEM 배지)를 제조하고, 칵테일 A와 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양했다. 혼합된 칵테일(240μL)을 최종 농도 5ng/mL로 FGF2가 보충된 4mL의 RFF2에 첨가하고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 이 배지로 배양했다. 시약의 형질감염 효율은 지정된 시점에 형질감염 세포에서 qRT-PCR에 의해 CHD7 mRNA 발현을 결정함으로써 평가했다.
(메틸화 및 GeneChip 분석)
배양된 ESC 또는 iPSC의 메틸화 상태는 인피늄 인간메틸화(Infinium Human Methylation) 450 비드칩(Illumina)으로 결정했다. 프로모터 영역의 메틸화 패턴은 Cluster 3.0을 사용하여 계층적으로 클러스터링하였고, Java Tree View에서 시각화했다. 프로모터 영역에서 각 유전자의 메틸화 상태는 후보 유전자를 추출하기 위해 GeneChip(인간 게놈 U133 Plus 2.0 어레이; Affymetrix) 어레이 데이터에 의해 수득된 유전자 발현 신호와 비교하여 평가했다.
(siCHD7로 형질감염 후 EB 형성 검정)
4mL의 Es8 배지를 사용하여 VTN-N 코팅된 웰에서 배양된 세포를 siCHD7(50pmol) 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시킨 후 48시간에 PBS(-)로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 셀 스크래이퍼(Iwaki)로 스크래이핑하고, 피펫팅으로 해리시키고, 저부착성 6-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 10mM의 ROCK 억제제(Y-27632, 와코)와 함께 필수 6 배지(Es6)로 1일 동안 배양하고 EB 형성을 위해 Es6 배지만을 사용하여 13일간 배양했다. 배지를 2일 마다 교환했다. EB의 수와 형태는 현미경(Olympus IX71, Olympus)으로 관찰했다. CHD7에 대한 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 결정하고, 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 장치(QuantStudio 12K Flex)를 사용하여 TaqMan(등록 상표) 스코어카드 패널(A15870)에 의해 결정했다. CHD7에 대한 프라이머 서열은 표 1에 제시되어 있다.
[표 1a]
[표 1b]
[표 1c]
[표 1d]
(mCHD7로 형질감염 후 EB 형성 검정)
VTN-N-코팅된 웰에서 배양된 세포 및 최종 농도 5ng/mL가 되도록 FGF2로 보충된 RFF2를 mCHD7 또는 대조군 mRNA를 도입한 후 24시간에 PBS(-) 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 셀 스크레이퍼(Iwaki)로 스크래핑하고, 피펫팅으로 해리시키고, 저부착성 6-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 10mM ROCK 억제제(Y-27632, 와코)를 함유하고, FGF2를 함유하지 않는 RFF2로 1일 동안 배양하고, 배지를 매일 교환하면서 FGF2를 함유하지 않는 RFF2로 배양했다. EB의 수와 형태는 현미경(Olympus IX71, Olympus)으로 관찰했다. CHD7에 대한 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 결정되었고, 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 장치(QuantStudio 12K Flex)를 사용하여 TaqMan(등록 상표) 스코어카드 패널(A15870)에 의해 결정되었다.
(정량적 RT-PCR)
제조업체의 지침에 따라, 총 RNA는 RNeasy 마이크로 키트(74004, QIAGEN)를 사용하여 추출했다. QuantiTect 역전사 키트(205311, QIAGEN)를 사용하여 cDNA를 합성하기 위해, 1μg의 총 RNA를 사용했다. TaqMan(등록 상표) hPSC 스코어카드 패널(A15870)을 사용하여 3배엽 관련 유전자 발현 및 자기 증식을 프로파일링하기 위한 정량적 PCR(qPCR)을 수행했다. SYBR(등록 상표) Select Master Mix 및 StepOnePlus를 사용하여 cDNA를 역전사 반응에 의해 500ng의 총 RNA로부터 합성했다. 반응은 95℃에서 10분 동안, 및 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 1분 동안 및 72℃에서 15초 동안 40사이클의 조건하에 수행했다. 사용된 프라이머는 표 1에 열거되어 있다. 상대적 정량화는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)로 정규화 후 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다.
(CHD7 전사체의 카피 수의 결정)
CHD7 전사체의 카피 수는 액적 디지털 PCR 시스템(Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정되었다. 구체적으로, cDNA는 TaqMan(등록 상표) 유전자 발현 검정(Hs00215010_m1, Thermo Fisher Scientific)의 프로브를 사용하여 Es8 또는 RFF2로 배양된 KhES-1로부터 추출된 5ng의 총 RNA로부터 생성되었다. RT-PCR 반응 혼합물의 에멀젼은 사용 설명서에 따라서 QX100 시스템(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 생성되었다. 그 후, cDNA는 Applied Biosystems GeneAmp 9700 Thermalcycler을 사용하여 Es8 배양 및 RFF2 배양으로부터 각각 증폭시켰다. 각 반응 혼합물은 10μL의 ddPCR 프로브 수퍼믹스, 1000nM 프라이머, 250nM 프로브 및 주형 cDNA를 함유하는 20μL 용액으로 구성되었다. 반응은 95℃에서 10분 동안 처리한 후 94℃에서 30초 동안 변성 및 53℃에서 60초 동안 신장 반응의 40사이클 후, 최종적으로 98℃에서 10분 동안의 조건으로 수행했다. 반응 후, 각 웰의 미가공 형광 데이터를 소프트웨어 QuantaSoft ver. 1.2(Bio-Rad Laboratories)로 분석했다.
(CHD7 검출을 위한 웨스턴 블롯팅)
웨스턴 블롯팅을 위한 세포 용해물은 시딩 72시간 후에 제조했다. 단백질은 프로테아제 억제제 칵테일 정제(완전 미니; Roche)가 보충된 완전 용해-M(Roche)을 사용하여 추출시켰다. 폴리클로날 양 IgG 항-CHD7 항체(AF7350; R & D Systems) 및 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 표지된 토끼 항-양 IgG (H + L) 항체를 각각 1차 항체 및 2차 항체로서 사용했다. 신호는 Chemi-Lumi One Super 시약(Nacalai Tesque)으로 검출되었다. 총 단백질은 레인에 적용하기 전에 비신코닌산 총 단백질 검정 키트(Nacalai Tesque)로 측정했다.
(CHD7의 샌드위치 ELISA를 위한 표준 및 샘플의 제조)
ESC를 다양한 조건에서 배양했다. 구체적으로, H9는 Es8로 17회 계대 배양하고(P1), KhES-1은 Es8로 10회 계대 배양하고(P2), KhES-1은 RFF2로 11회 계대 배양했다(N). 모든 세포는 피더 세포 없이 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 배양했다. 각각 배양된 ESC를 완전 용해-M(Merck KGaA, 제품 번호: 04719956001)의 프로토콜에 따라 용해하고, 단백질 농도를 측정하고, 500μL씩 분배하고, 액체 질소로 급속하게 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. P1, P2 및 N의 총 단백질 농도는 각각 1.25mg/mL, 1.27mg/mL 및 0.84mg/mL였다. H9 세포를 Es8 또는 RFF2로 배양하고, 완전 용해-M의 프로토콜에 따라 용해시킨 다음, Amicon Ultra-4, PLTK Ultracel-PL 멤브레인, 30 kDa(Amicon(등록 상표) Ultra-4 PLTK Ultracel-PL 멤브레인, 30 kDa, 카탈로그 번호: UFC803024, Merck KGaA)를 사용하여 4000 X g, 4℃에서 농축시키고, 농축된 생성물을 각각 표준 및 음성 대조군(N2)으로 사용했다. 표준 및 대조군(N2)을 500μL씩 분배하고, 액체 질소로 급속하게 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. 표준 및 음성 대조군(N2)의 총 단백질 농도는 각각 4.06mg/mL 및 10.23mg/mL였다.
(샌드위치 ELISA를 위한 항체)
샌드위치 ELISA를 위해, 포획 (고상) 항체로서, 단백질 A 또는 단백질 G로 정제하여 수득된 항체, 항원으로서, 인간 CHD7(서열번호 2)의 Ala 263-Gln 457이 에쉐리키아 콜리에서 발현된 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 모노클로날 항체가 사용되었고; 1차 항체로서, 토끼를 에쉐리키아 콜리에서 발현된 인간 CHD7(서열번호 2)의 Gly 25-Met 200으로 면역화하고 토끼를 항원으로 친화성 정제함으로써 수득된 항-인간 CHD7 토끼 IgG가 사용되었고; 2차 항체로서, 항-토끼 IgG-HRP (SouthernBiotech, 4090-05)이 사용되었다.
(샌드위치 ELISA)
샌드위치 ELISA는 다음의 방법으로 수행했다. 샌드위치 ELISA의 최적의 조건을 결정하기 위해, 1차 및 2차 항체의 농도는 다음 표에 제시된 조건하에 조사했다. D-PBS(-)를 사용하여 3μg/mL로 희석된 포획 항체 용액 100μL를 96-웰 플레이트(MaxiSorp(등록 상표), Nunc, 44-2404-21)의 웰에 첨가하고, 플레이트 실로 밀봉하고, 4℃에서 밤새 저장했다. 그 후, 포획 항체 용액을 경사 제거하고, 0.05% Tween(등록 상표) 20(이하 "세척 용액"으로서 지칭되기도 함)을 함유하는 D-PBS(-) 200μL를 첨가하고, 혼합물을 완만하게 교반하여 5분 동안 정치시키고, 제거하고 세척했다. 이 세척 단계를 3회 반복했다. 세척 용액 제거 후, 세척 용액에 1% BSA를 첨가함으로써 수득된 차단 용액을 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양하여 차단을 수행했다. 이어서, 차단 용액으로 희석된 표준, 목적 샘플을 100μL/웰로 첨가했다. 블랭크 웰에 동일량의 차단 용액을 첨가했다. 플레이트 실을 단단히 부착하여 용액의 증발을 방지하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 배양했다. 그 후, 웰을 세정 용액으로 3회 세척하고, 차단 용액을 사용하여 1μg/mL 또는 3μg/mL로 희석된 1차 항체 100μL를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 1차 항체를 제거하고, 웰을 세척 용액으로 3회 세척했다. 이어서, 5000배 또는 10000배 희석된 2차 항체 100μL를 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 혼합물을 세정 용액으로 3회 세척하고, 100μL의 기질 용액(TMB, ScyTek Laboratories, TM4500)을 첨가하고, 혼합물을 암흑에서 20 내지 30분 배양하고, 0.5M H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450nm(Abs 450nm) 및 650nm(참조 파장, Abs 650nm)에서의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 측정하였고, 여기서 표준 스톡 용액의 CHD7 농도가 1000단위로 사용되었고, 500U/mL로부터 2배 희석된 희석 시리즈에서 8점 이상 또는 3배 희석된 희석 시리즈에서 6점 이상이 생성되었고, 측정되었다.
[표 2]
(CHD7 단백질 농도의 계산)
CHD7의 농도는 다음 단계로 계산된다.
1) ΔAbs는 측정된 흡광도로부터 화학식 1에 의해 계산된다:
2) 블랭크는 다음 화학식 2에 의해 각 샘플의 ΔAbs로부터 차감해서 ΔAbs-blk를 계산한다:
3) 분석 곡선은 유사한 4 매개변수 로지스틱 곡선으로서 다음 화학식 3에 의해 도출된다:
상기 화학식 3에서,
f(x)는 ΔAbs-blk이고,
x는 희석 후 CHD7 농도(U/mL)이고,
a는 하부 점근선이고,
b는 변곡점 경사이고,
c는 변곡점이고,
d는 상부 점근선이다.
4) 측정 샘플의 ΔAbs-blk는 하기 화학식 4에서 분석 곡선의 방적으로 치환하여 희석 후 CHD7 농도를 계산한다.
5) 측정 샘플의 희석 후 CHD7 농도는 희석 배율을 곱하여 희석 전 CHD7 농도를 계산한다.
결과
1. ESC의 분화 가능성은 배양 조건을 변화시킴으로써 변경된다:
정상적인 핵형을 나타내는 KhES-1 세포가 hrVitronectin-N(VTN-N)-코팅된 접시에서 필수 8 배지(Es8)로 배양된 경우, KhES-1 세포는 자기 증식 능력 및 분화 가능성을 모두 유지시켰다. KhES-1 세포는 ReproFF2(RFF2)로 5회 계대 배양 후 분화 가능성을 손실했지만, Es8로 배양 후 분화 가능성을 회복했다(도 1). SPM(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)으로 배양된 KhES-1 세포는 분화 가능성을 유지했지만, 상기 세포는 RFF2로 5회 계대 배양 후 분화 가능성을 손실했다. 또한, 정상적인 핵형을 나타내는 PFX#9 iPSC(참조: Nishishita et al., PLoS One 2012; 7(6): e38389)를 VTN-N-코팅된 접시에서 Es8에 이어, RFF2로 배양되는 경우, 동일한 결과가 수득되었다(도 2). 이러한 결과는, PSC의 분화 가능성이 배양 조건에 따라 가역적으로 변경될 수 있다는 것을 나타낸다. 세포의 후성유전적 상태의 변경은 이들 반응에 관련되는 것으로 생각되었다.
RFF2, Es8 또는 SPM으로 배양된 PSC의 메틸화 상태의 비교 연구는 메틸화 비드 검정을 사용하여 수행되었고, ESC의 "분화 가능성의 손실"을 초래할 수 있는 특징적인 메틸화 상태가 동정되었다. RFF2 배양, 및 SPM 및 Es8 배양에서 메틸화 유전자 수의 비교 연구 결과가 도 3a에 도시되어 있고, 프로모터 영역에서 메틸화 패턴의 클러스터링은 도 3b에 도시되어 있다. 또한, 스코어카드 패널(써모 피셔 사이언티픽)에서 표시된 자기 증식, 외배엽, 중배엽, 중내배엽 및 내배엽으로 분류되는 주요 유전자의 프로모터의 메틸화 상태를 조사했다. RFF2로 배양된 6개의 PSC 샘플(iPSC의 3개 샘플 및 ESC의 3개 샘플)(RFF2) 또는 SPM 또는 Es8로 배양된 6개의 PSC 샘플(SPM으로 배양된 iPSC의 1개 샘플과 ESC의 2개 샘플 및 Es8로 배양된 iPS의 1개 샘플과 ESC의 2개 샘플)(SPM & Es8)의 평균 메틸화 상태는 표(표 3)에 제시되어 있다. 모든 세포는 미분화 상태로 유지되었지만, 상이한 배지가 사용될 경우에도 이들 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 패턴에는 유의한 차이가 없었다. 표 3에서, 0.2 미만의 수치는 낮은 메틸화 상태를 의미하고, 0.2 이상, 0.5 미만의 수치는 중간 메틸화 상태를 의미하고, 0.5 이상의 수치는 높은 메틸화 상태를 의미한다.
[표 3a]
[표 3b]
이어서, 동일한 샘플의 GeneChip 데이터(Affymetrix)를 사용하여 RFF2 배양에서 높은 메틸화 상태 및 낮은 유전자 발현을 나타낸 유전자, 및 SPM 또는 Es8 배양에서 낮은 메틸화 및 높은 유전자 발현을 나타낸 유전자를 조사했다. 주성분 분석(PCA) 및 GeneChip 분석에 의해, 4개의 후보는 분화 가능성 손실에 대한 마커일 수 있는 후보 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 부위로서 동정되었다(표 4). 동정된 유전자 중에서, 크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7(CHD7)을 이의 기능에 주목하여 조사했다.
[표 4]
NANOG, POU5F1, SOX2 및 EP300 등과 같은 자기 증식 관련 유전자의 발현에 대한 RFF2에 의한 세포 배양의 효과는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 결정되었다. 그 결과, 자기 증식 관련 유전자의 발현 수준에 대한 유의한 효과는 없었다. 그러나, 프라이머가 모든 CHD7 아이소폼의 검출을 위한 CHD7의 3' 비번역된 영역을 표적으로 하도록 설계된 경우, CHD7 유전자의 발현은 ESC를 RFF2로 배양함으로써 상당히 억제되었다는 것이 qRT-PCR에 의해 입증되었다(도 4). CHD7의 3가지 주요 아이소폼인 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4의 구조(참조: Schnetz et al., Genome Res 2009; 19(4): 590-601, Colin et al., BMC Res Notes 2010; 3: 252) 및 프라이머의 위치는 도 5a에 도시되어 있다.
이어서, 3개의 CHD7 아이소폼의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 조사했다. 그 결과, Es8 및 RFF2 배양으로부터 유래된 세포 용해물 중 CHD7 아이소폼 2, 및 두 세포 용해물 중 CHD7 아이소폼 X4는 CHD7의 N-말단을 인식하는 항체에 의해 동일한 수준에서 각각 검출되었다. 그러나, CHD7 아이소폼 1은 RFF2 배양으로부터 유래된 세포 용해물에서 명확하게 검출되지 않았다(도 6). CHD7 아이소폼의 신호 강도는 표적 단백질의 분자 크기가 상이한 경우, 웨스턴 블롯팅에 의해 정확하게 비교되고 평가될 수 없다.
상기에 기초하여, 각 아이소폼은 아이소폼 특이적 TaqMan 프라이머를 사용하여 디지털 PCR에 의해 정량화하였다(도 5a). 디지털 PCR에 의해 결정된 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 또는 아이소폼 X4의 카피 수가 제시되어 있다(표 5). 정량화를 위해, Es8 또는 RFF2 배지로 배양된 KhES-1 세포로부터 수득된 총 RNA(5ng)를 주형으로 사용했다. 프라이머 세트 3을 사용하여 각 RNA 샘플 중 아이소폼 1의 카피 수를 계산했다. 아이소폼 X4의 카피 수는 프라이머 세트 1에 의해 생성된 카피 수로부터 프라이머 세트 3에 의해 생성된 카피 수를 차감함으로써 결정되었다(도 5a). 웨스턴 블롯팅의 결과와 일치하여, 아이소폼 1은 배양 조건에 의해 영향을 받는 주요 아이소폼 및 초기 표적인 것으로 밝혀졌다. 웨스턴 블롯팅의 결과에 기초하여, 아이소폼 2의 카피 수는 아이소폼 X4의 카피 수와 동일하거나 미만일 것으로 예상되었다. 그러나, 스플라이싱된 서열을 샌드위치시키는 Taq man 프라이머 세트 2는 프라이머 설계 문제로 인해 적절히 기능하지 않았다. CHD7 아이소폼의 구조 분석은 아이소폼 1이 단백질의 중앙에서 527에서 2576 아미노산으로 확장하는 조절 영역을 함유하다는 것을 보여 주었다. 이 영역은 ATPase/DNA 헬리카제 도메인, 염색체 결합 도메인, DNA 결합 도메인 및 BRK 도메인을 함유한다(참조: Allen et al., J Mol Biol 2007; 371(5): 1135-1140, Colin et al., BMC Res Notes 2010; 3: 252, Ryan et al., Embo j 2011; 30(13): 2596-2609). 아이소폼 2는 아이소폼 1의 조절 영역이 결여된다. 아이소폼 1의 다른 스플라이싱 변이체인 아이소폼 X4(도 5a)도 또한 배양 조건에 따라 이의 유전자 발현을 변경했다.
[표 5]
분화 가능성이 CHD7의 발현과 관련있는 것으로 나타났기 때문에, mCHD7의 발현 수준이 siRNA(도 5b)의 도입으로 하향조절되는 경우, Es8로 배양된 KhES-1 세포가 분화 가능성을 손실하는지의 여부를 조사했다. 또한, CHD7 mRNA가 도입된 경우 RFF2로 배양된 KhES-1 세포가 분화되는지의 여부를 조사했다. 그러나, 번역 영역의 길이로 인해, 전장 CHD 7 아이소폼 1 mRNA는 설계할 수 없었다. 대신, 조절 영역이 결여된 CHD7 아이소폼 2 mRNA(도 5b)를 제조하고, mRNA를 RFF2로 배양된 KhES-1 세포에 도입했다. 또한, CHD7 아이소폼 1의 기능성 영역과 경쟁하여 활성을 억제하기 위해, 조절 영역인 것으로 추정되는 DNA 결합 도메인(SANT-SLIDE 도메인)을 코딩하는 mRNA 및 크로마틴 상호작용 도메인(크로모도메인) 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인을 코딩하는 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA를 각각 설계하고, Es8로 배양된 KhES-1 세포에 도입했다.
2. CHD7의 하향조절은 분화를 교란한다:
Es8로 배양된 KhES-1 세포는 분화 가능성을 유지하고 EB를 형성한다. 먼저, siCHD7이 형질감염되는 경우, CHD7의 하향조절이 KhES-1 세포에서 발생하는지의 여부를 조사했다. 6-웰 접시의 웰당 10pmol, 30pmol 또는 50pmol의 siCHD7을 형질감염시키고, CHD7의 발현 수준을 조사했다. 그 결과, siCHD7의 도입량이 증가함에 따라 CHD7의 발현 수준은 감소되고, 도입량의 의존성이 관찰되었다(도 7b). 이어서, siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포의 3배엽으로의 분화를 조사했다. EB에서, 중배엽 분화의 교란은 5일째에 관찰되었고, 중배엽 및 내배엽의 발달이 14일째에 중간 수준으로 억제되었다(도 8). siCHD7의 단일 도입에 의한 CHD7 mRNA의 하향조절은 완료되지 않았다. siCHD7의 단일 도입은 외배엽 분화의 개시를 막지 못했지만, 배양 14일 후 중배엽 및 내배엽의 발달을 교란시켰다. 이러한 데이터는 3배엽 발달을 촉진하기 위해 CHD7의 발현 수준이 EB의 분화에 걸쳐 일정한 수준에서 유지 될 필요가 있다고 시사했다.
PSC는 VTN-N 코팅된 접시에서 높은 글루코스(3.1g/L) Es8로 효과적으로 배양될 수 있다. PSC가 영양소-고갈 Es8로 배양될 경우(즉, 매일 배지 교환 생략), PSC의 분화가 유발될 수 있다(참조: Vander Heiden et al., Science 2015; 324(5930): 1029-1033, Yanes et al., Nat Chem Biol 2010; 6(6): 411-417; Moussaieff et al., Cell Metab 2015; 21(3): 392-402). 영양소-고갈 Es8로 배양된 모의-형질감염된 KhES-1 세포는 분화되었고, VNT-N 코팅된 접시에서 Es8로 유지되지 않았다. 한편, siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포가 도입 4일 후 VNT-N 코팅된 접시에서 잔류하였고(도 9c), 비교적 미분화된 유전자 프로파일을 나타냈다(도 10). 세포는 영양소-고갈 Es8에서는 증식하지 않았지만, siCHD7을 통해 CHD7의 발현의 하향조절은 영양소 고갈로 인해 유발된 분화를 방지했다(도 10). Es8의 매일 교환으로 형질감염되지 않은 KhES-1 세포를 정상적인 배양 대조군으로 사용했다.
3. CHD7 mRNA의 도입은 3배엽 분화를 유도한다:
CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 임의의 추가의 분화 자극 없이 RFF2로 배양된 KhES-1 세포의 "자발적" 분화를 유도했다(도 12). RFF2 배지로 배양된 KhES-1 세포를 CHD7 아이소폼 2로 형질감염시키고, 1, 2 및 3일 후 KhES-1 세포에서 94개 유전자의 발현 수준은 qRT-PCR 스코어카드 패널로 결정하였다(표 6). 표에서, 배수 변화(fc)가 2.0 이상인 경우에, 그것은 상향조절을 의미하고, 0.1 이하인 경우에, 그것은 하향조절을 의미한다. PSC 배양 시스템은 분화된 세포보다는 미분화된 세포를 유지하도록 설계된다. 분화된 경우, KhES-1 세포는 VTN-N 코팅된 접시에서 배양될 수 없었고, RFF2 배양에서 KhES-1 세포의 수는 세포가 분화됨에 따라 감소되었다(도 11c 및 도 12). 특히, CHD7 아이소폼 2의 과발현은 연속적 분화 과정을 따르지 않고 3배엽 분화를 동시에 유도했다.
[표 6a]
[표 6b]
CHD7 아이소폼 1의 기능성 영역과 경쟁함으로써 CHD7 아이소폼 1 활성을 억제하거나 감소시키기 위해, 특정 메틸화 상태를 갖는 히스톤의 결합 부위를 인식하는 크로모도메인 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인을 커버하는 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA(CHD7 DN1)를 KhES-1 세포에 도입하였다(도 5b 및 도 13a, b). CHD7 DN1의 도입에 의해, 분화 가능성 및 세포 증식 모두의 억제 또는 감소가 EB 형성 검정에서 관찰되었다(도 13c). 또한, CHD7의 추정성 DNA 결합 부위인 SANT-SLID 도메인(CHD7 DN2)의 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA가 KhES-1 세포에 도입된 경우(도 5b 및 도 13a, b), 분화 가능성은 또한 EB 형성 검정에서 억제되거나 감소되어 감소된 세포 증식을 나타냈다(도 13c).
CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 또한 ESC가 미분화된 상태로 유지되는 경우 CHD7 발현의 상한치의 존재 가능성을 시사했다. 상한치는 때때로 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 사실, Es8과 함께 배양된 KhES-1 세포에 CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 Es8 배양에서 KhES-1 세포에서 CHD7 아이소폼 2를 상향조절하지 않았다(도 14). KhES-1 세포에 CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 Es8에서 KhES-1 세포의 "자발적" 분화를 유도하고, Es8 배양 시스템은 분화된 세포를 지지할 수 없다고 생각된다.
4. CHD7 발현 수준은 세포의 증식 속도를 조절한다:
CHD7의 다른 기능은 ESC의 증식을 지지하는 것이다. 6-웰 플레이트의 웰당 1 × 105개 KhES-1 세포를 시딩하고, 세포를 Es8로 배양하고, 3일 후 8 × 105개 세포를 채취했다. RFES2 배지에서 KhES-1 세포의 증식 속도는 Es8을 사용하는 것의 1/3이었지만, Es8이 사용된 경우, KhES-1 세포는 배양 3일 후 8배 확장하는 것으로 관찰되었다. CHD7 발현 수준이 농도 의존 방식으로 ESC의 증식 속도를 조절할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, CHD7은 siCHD7을 KhES-1 세포로 형질감염시킴으로써 하향조절되고, 세포를 Es8로 배양하고, 세포 수를 계수했다(도 15a, b). 그 결과, KhES-1 세포의 증식 속도는 CHD7 mRNA의 발현 수준에 의해 조절되었다(도 15c, d). 또한, 크로모도메인 및/또는 SANT-SLIDE 도메인을 커버하는 CHD7의 우성-음성 단백질을 생성하는 KhES-1 세포에 mRNA의 도입은 세포 증식 속도를 극적으로 감소시켰다(도 13).
5. CHD7의 발현 수준은 PSC의 분화 가능성을 매개한다:
CHD7 mRNA 발현 수준이 ESC의 분화 가능성과 상관되는지의 여부는 다양한 조건하에 배양된 PSC의 CHD7 mRNA의 발현 수준을 측정하여 조사했다. 먼저, GeneChip 데이터베이스를 사용하여 이식 전 다양한 배아 형성 단계에서 배아에서 CHD7 mRNA의 발현 수준, 및 PSC 및 EB의 CHD7 mRNA의 발현 수준을 조사하였다(도 16). 아이소폼 1에 상응하는 CHD7 mRNA는 2-세포 및 4-세포 단계에서 비교적 높은 수준으로 발현된 후, 상실배 단계 및 낭포 단계예서 낮은 수준으로 발현되었다(도 16, "2 세포" "4 세포", "상실배" 및 "낭포"). 배아 형성 동안, 수정란은 분화되고 증식한다. 배아는 내부 세포 괴상으로 칭명되는 발달 축 없이 동일한 세포 괴상의 증식으로 구성되는 낭포 단계에 도달한다. GeneChip 발현 신호의 측정에서, PSC는 이식 후 마우스 외체의 유전자 발현 프로파일과 유사한 유전자 발현 프로파일 및 배양 조건에 따라 CHD7 mRNA의 다양한 수준을 나타냈다. CHD7의 낮은 발현을 나타내는 PSC(도 16, "KhES-1 RFF2/N" 및 "PFX#9 RFF2/N")는 미분화 상태에서 증식능을 유지했지만 분화 가능성을 손실했다.
GeneChip 발현 신호가 정량화에 적합하지 않을 수 있기 때문에, 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 다양한 조건하에서 배양된 다양한 PSC에서 디지털 PCR로 정량화했다. 구체적으로, 사용된 세포는 H9 또는 KhES-1(각각 ESC), 또는 PFX#9,201B7 또는 SHh#2(각각 iPSC)였다. 세포는 피더 세포에서 hPSC 배지를 사용하여 소세포 덩어리 방법에 의해 배양했다. 대안적으로, 그들은 Es8, RFF2 또는 SPM과 함께 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 배양했다. 배양된 세포로부터 추출된 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 액적 디지털 PCR에 의해 결정했다. RFF2로 배양된 PSC는 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1의 카피 수가 적었고, 분화 가능성을 나타내지 않았지만, 분화 가능성은 다른 조건하에 배양된 세포에서 확인되었다. 카피 수 및 이의 계대 수(P)는 표 7에 제시되어 있다. 이러한 배양 조건하에 배양된 세포 중 일부의 분화 가능성을 구체적으로 분석한 결과는 도 17에 제시되어 있다.
[표 7]
분화 가능성을 갖는 PSC와 관련하여, CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수의 임계 값을 추가로 조사했다. 구체적으로, 정상(201B7 또는 PFX#9)보다 과성장 조건하에 배양함으로써 CHD7 mRNA의 더 적은 카피 수를 갖도록 만들어진 세포의 분화 가능성을 분석했다. 디지털 PCR에 의한 CHD7 mRNA의 카피 수의 결과를 표 8에 제시되어 있고, 분화 가능성의 결과는 도 18에 제시된다.
[표 8]
5ng의 총 RNA 중 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수가 1502 카피(201B7) 또는 1760 카피(PFX#9)인 경우에도 201B7 및 PFX#9는 분화 가능성을 갖는다는 것이 나타났다(도 18). 표 7 및 표 8 및 도 17 및 도 18의 데이터를 기준으로 하여, 5ng의 총 RNA에서 단일 세포에서 적어도 피더 세포 없이 배양된 경우, 732 이하의 카피 수를 갖는 PSC는 분화하지 않지만, 1500 이하의 카피 수를 갖는 PSC는 분화 가능성을 유지한다는 수치 기준이 제안된다. 따라서, PSC의 CHD7 아이소폼 1의 카피 수는 PSC를 미분화된 상태로 유지하면서 분화 특성의 정도를 예측하기 위한 양호한 수치 마커일 수 있다.
6. CHD7 단백질의 발현 수준은 또한 PSC의 분화 가능성의 예측 마커이다:
CHD7의 mRNA의 카피 수뿐만 아니라 CHD7 단백질의 발현 수준과 PSC의 분화 가능성 사이의 관계를 연구하기 위해, CHD7 단백질의 발현 수준의 측정을 수행하였다.
각 세포의 배양 조건, CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수 및 분화 가능성의 결과는 표 9에 제시되어 있고, 샌드위치 ELISA의 결과는 도 19에 제시되어 있다.
[표 9]
그래프는 1000단위/mL로서 표준(P1과 동일한 단백질 용액 및 30 kDa(Millipor, UFC803024)에서 아미콘(등록 상표) Ultra-4, PLTK Ultracel-PL 멤브레인을 사용하여 4.06mg/mL의 농도로 농축됨)의 CHD7 단백질 농도에 대한 값을 나타낸다. F1/S5K의 경우, P1 및 P2의 CHD7 단백질 농도는 N의 단백질 농도와 비교하여 9.2배(N은 P1의 10.9%이다) 및 7.0배(N은 P2의 14.2%이다)였다. 유사하게, F1/S10K의 경우, 그것은 각각 10.2배(N은 P1의 9.8%이다) 및 7.7배(N은 P2의 13.0%이다)였고, F3/S5K의 경우에, 그것은 각각 6.0배(N은 P1의 16.6%이다) 및 5.0배(N은 P2의 19.8%이다)였고, F3/S10K의 경우에, 그것은 각각 10.3배(N은 P1의 9.7%이다) 및 8.5배(N은 P2의 11.7%)였다. 도 19에 도시된 바와 같이, CHD7 단백질 농도 및 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수는 분화 내성 PSC에서 낮다: 분화 자극에 반응하여 양호한 분화 가능성을 나타내는 PSC는 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 높은 CHD7 단백질 농도 및 높은 카피 수를 나타내는 것으로 확인되었고, PSC에서 CHD7 단백질의 발현 수준, 및 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수 및 분화 가능성 사이에 상관관계가 발견되었다. mRNA의 카피 수뿐만 아니라 CHD7 단백질의 발현 수준은 PSC가 미분화된 상태로 유지되는 동안 분화 특성의 정도를 예측하기 위한 양호한 수치 마커일 수 있다.
CHD7 단백질 수준 및 CHD7 유전자의 발현 수준을 사용하는 분석:
CHD7 단백질 수준 및 유전자 발현 수준을 고려하고 상기한 결과를 사용하여, 임계 값을 결정하였다.
[표 10]
[표 11]
점근선은 ELISA 결과로부터 수득된 mRNA 카피 수 및 단백질 농도(단위/mL)로부터 도출되었다(도 20). 점근선을 사용하여 계산된 경우, 5ng의 총 RNA에서 카피 수(y)가 1500 카피일 때 농도(x)는 56.6단위/mL였다. 이것은 N의 농도의 2.1배였다(N은 수득된 농도의 52%였다). 유사하게, 5ng의 총 RNA에서 카피 수(y)가 2710 카피일 때 농도(x)는 102.2단위/mL였다. 이것은 N의 농도의 3.8배였다(N은 수득된 농도의 74%였다). 설명에서, 상기 언급된 것들 이외의 카피 수(y)에서도 점근선을 사용함으로써 필요한 적절한 임계 값이 수득될 수 있고, 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측될 수 있음이 이해된다.
[산업상 이용 가능성]
PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 PSC에서 CHD7의 발현 수준을 측정하여 분화 자극을 적용하기 전에 미분화된 상태로 예측될 수 있다. 또한, PSC의 유지 배양에 사용된 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 특성을 보유하는 상태로 PSC를 유지하기에 적합한지의 여부도 또한 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 분화 유도 동안 분화 내성을 나타내지 않고 종양 형성 위험이 감소된 hPSC를 제공하는 데 사용될 수 있고, hiPSC 유도 분화 세포를 사용하는 이식 요법에 매우 유용하다. 본 발명은 또한 분화 내성이 분화 유도 동안 나타나지 않도록 PSC의 유지 배양에 적합한 배지 및/또는 배양 조건을 검색하는데 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 번호 2017-120024(출원일: 2017년 6월 19일) 및 일본에서 출원된 특허 출원 번호 2017-237420(출원일: 2017년 12월 12일)을 기초로 하고, 이의 내용은 본원에 완전히 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> FOUNDATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH AND INNOVATION AT KOBE
<120> PREDICTION METHOD FOR POTENTIAL FOR DIFFERENTIATION IN
PLURIPOTENT STEM CELL AND REAGENT THEREFOR
<130> 092685
<150> JP 2017-120024
<151> 2017-06-19
<150> JP 2017-237420
<151> 2017-12-12
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11589
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (493)..(9486)
<400> 1
gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cggcggcgcg ggggttgagt 60
cgtggtggtg cggacgcgct cgtgctcggg aactatcgga ttaaacttga atcgagtgaa 120
attacacaaa ggagcgccgc ggaggaggcg gcccggggac ccggacaccc tgaaactcac 180
cagagacccg ttcgcccccg gccaactccg tgcccgtgga ttcagccccc tggccgcagc 240
tgccgagcca actccggagc ccgctctgcg ttttgttttc ccctcggcac taggcagcgg 300
aggagcccga ccgacccgga cctatatcca gactttgcct gacactgcag ggtccaagag 360
aattaaagaa atatggaatg acatgaagaa gattagttaa ggattatagg ctttgagggc 420
aaacacctca gtgaagtgaa gcacaggcaa gctcctgagc tgtggtttgg aggagccgtg 480
tgttggaaga ag atg gca gat cca gga atg atg agt ctt ttt ggc gag gat 531
Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp
1 5 10
ggg aat att ttc agt gaa ggt ctt gaa ggc ctc gga gaa tgt ggt tac 579
Gly Asn Ile Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr
15 20 25
ccg gaa aat cca gta aat cct atg ggt cag caa atg cca ata gac caa 627
Pro Glu Asn Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln
30 35 40 45
ggc ttt gcc tct tta cag cca tcc ctt cat cat cct tca act aat caa 675
Gly Phe Ala Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln
50 55 60
aat caa aca aag ctg aca cat ttt gat cac tat aat cag tat gaa caa 723
Asn Gln Thr Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln
65 70 75
caa aag atg cat ctg atg gat cag ccg aac aga atg atg agc aac acc 771
Gln Lys Met His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr
80 85 90
cct ggg aac gga ctc gcg tct ccg cac tcg cag tat cac acc cct ccc 819
Pro Gly Asn Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro
95 100 105
gtt cct cag gtg ccc cat ggt ggc agt ggt ggc ggt cag atg ggt gtc 867
Val Pro Gln Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val
110 115 120 125
tac cct ggc atg cag aat gag agg cat ggg caa tcc ttt gtg gac agc 915
Tyr Pro Gly Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser
130 135 140
agc tcc atg tgg ggc ccc agg gct gtt cag gta cca gac cag ata cga 963
Ser Ser Met Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg
145 150 155
gcc ccc tac cag cag cag cag cca cag ccg cag cca ccg cag ccg gct 1011
Ala Pro Tyr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala
160 165 170
ccg tcg ggg ccc cct gca cag ggc cac cct cag cac atg cag cag atg 1059
Pro Ser Gly Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met
175 180 185
ggc agc tat atg gca cgt ggg gat ttt tcc atg cag cag cat ggt cag 1107
Gly Ser Tyr Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln
190 195 200 205
cca cag cag agg atg agc cag ttt tcc caa ggc caa gag ggc ctc aat 1155
Pro Gln Gln Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn
210 215 220
cag gga aat cct ttt att gcc acc tca gga cct ggc cac ttg tcc cac 1203
Gln Gly Asn Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His
225 230 235
gtg ccc cag cag agt ccc agc atg gca cct tcc ttg cgt cac tcg gtg 1251
Val Pro Gln Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val
240 245 250
cag cag ttc cat cac cac ccc tct act gct ctc cat gga gaa tcc gtt 1299
Gln Gln Phe His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val
255 260 265
gcc cac agt ccc aga ttc tcc ccg aat cct ccc caa caa ggg gct gtt 1347
Ala His Ser Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val
270 275 280 285
agg ccg caa acc ctt aac ttt agt tct cgg agc cag aca gtc ccc tct 1395
Arg Pro Gln Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser
290 295 300
cct act ata aac aac tca ggg cag tat tct cga tat cct tac agt aac 1443
Pro Thr Ile Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn
305 310 315
cta aat cag gga tta gtt aac aat aca ggg atg aat caa aat tta ggc 1491
Leu Asn Gln Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly
320 325 330
ctt aca aat aat act cca atg aat cag tcc gta cca aga tac ccc aat 1539
Leu Thr Asn Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn
335 340 345
gct gta gga ttc cca tca aac agt ggt caa gga cta atg cac cag cag 1587
Ala Val Gly Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln
350 355 360 365
ccc atc cac ccc agt ggc tca ctt aac caa atg aac aca caa act atg 1635
Pro Ile His Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met
370 375 380
cat cct tca cag cct cag gga act tat gcc tct cca cct ccc atg tca 1683
His Pro Ser Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser
385 390 395
ccc atg aaa gca atg agt aat cca gca ggc act cct cct cca caa gtc 1731
Pro Met Lys Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val
400 405 410
agg ccg gga agt gct ggg ata cca atg gaa gtt ggc agt tat cca aat 1779
Arg Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn
415 420 425
atg ccc cat cct cag cca tct cac cag ccc cct ggt gcc atg gga atc 1827
Met Pro His Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile
430 435 440 445
gga cag agg aat atg ggc ccc aga aac atg cag cag tct cgt cca ttt 1875
Gly Gln Arg Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe
450 455 460
ata ggc atg tcc tcg gca cca agg gaa ttg act ggg cac atg agg cca 1923
Ile Gly Met Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro
465 470 475
aat ggt tgt cct ggt gtt ggc ctt gga gac cca caa gca atc cag gaa 1971
Asn Gly Cys Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu
480 485 490
cga ctg ata cct ggc caa caa cat cct ggt caa cag cca tct ttt cag 2019
Arg Leu Ile Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln
495 500 505
cag ttg cca acc tgt cct cca ctg cag cct cac ccg ggc ttg cac cac 2067
Gln Leu Pro Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His
510 515 520 525
cag tct tca cct cca cac cct cat cac cag cct tgg gca cag ctc cac 2115
Gln Ser Ser Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His
530 535 540
cca tca ccc cag aac acc ccg cag aaa gtg cct gtg cat cag cat tcc 2163
Pro Ser Pro Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser
545 550 555
ccg tcg gag ccc ttt cta gag aaa cca gtg ccg gat atg act cag gtt 2211
Pro Ser Glu Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val
560 565 570
agt gga ccg aat gct cag cta gtg aag agt gat gat tac ctg cca tca 2259
Ser Gly Pro Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser
575 580 585
ata gaa cag cag cca caa caa aag aag aag aaa aag aaa aac aac cac 2307
Ile Glu Gln Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His
590 595 600 605
att gta gca gag gat ccc agt aaa ggt ttt ggt aaa gat gac ttc cct 2355
Ile Val Ala Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro
610 615 620
ggt ggg gta gat aac caa gaa cta aat agg aac tca ctg gat ggg tcc 2403
Gly Gly Val Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser
625 630 635
caa gaa gaa aaa aag aaa aag aaa agg tca aag gca aaa aaa gac ccg 2451
Gln Glu Glu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro
640 645 650
aag gaa ccg aaa gaa ccc aag gag aaa aaa gag ccc aag gaa ccc aag 2499
Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys
655 660 665
acc ccg aaa gcc cct aag att ccc aaa gag cca aag gaa aag aaa gca 2547
Thr Pro Lys Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala
670 675 680 685
aaa act gcc acg cca aaa ccc aaa tcc agc aaa aag tca agt aat aag 2595
Lys Thr Ala Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys
690 695 700
aaa cct gac tca gaa gca agt gct ttg aag aaa aag gtc aac aag gga 2643
Lys Pro Asp Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly
705 710 715
aaa aca gaa ggt tct gaa aat tca gac tta gac aaa aca ccc cca cca 2691
Lys Thr Glu Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro
720 725 730
tct cct cct cct gaa gaa gat gag gac cca ggt gtt cag aag aga cgg 2739
Ser Pro Pro Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg
735 740 745
tcc agc aga cag gtg aag aga aag cgc tac act gaa gac ctg gag ttc 2787
Ser Ser Arg Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe
750 755 760 765
aag att tct gat gag gag gca gat gat gca gat gct gct ggg agg gat 2835
Lys Ile Ser Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp
770 775 780
tcc ccc tcc aac acc tcc cag tca gaa cag cag gaa tct gtt gat gca 2883
Ser Pro Ser Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala
785 790 795
gaa ggc cca gtg gta gaa aaa att atg agc agt cgt tca gta aaa aag 2931
Glu Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys
800 805 810
cag aag gaa tct gga gag gag gta gaa att gag gaa ttc tat gtg aaa 2979
Gln Lys Glu Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys
815 820 825
tac aaa aac ttc tct tat ctt cat tgt cag tgg gca tct ata gaa gat 3027
Tyr Lys Asn Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp
830 835 840 845
ctg gaa aaa gat aag aga att cag caa aaa att aaa cga ttt aag gca 3075
Leu Glu Lys Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala
850 855 860
aag cag ggc cag aac aag ttc ctt tca gag att gag gat gag ctt ttt 3123
Lys Gln Gly Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe
865 870 875
aat cca gat tat gtg gag gtt gac cgg ata atg gac ttt gca cgt agc 3171
Asn Pro Asp Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser
880 885 890
aca gat gac cgg gga gag cct gtg act cac tat ctg gtg aag tgg tgt 3219
Thr Asp Asp Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys
895 900 905
tca ctt cct tat gaa gac agc acg tgg gag cgg agg cag gac ata gat 3267
Ser Leu Pro Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp
910 915 920 925
caa gca aag atc gag gag ttt gag aaa cta atg tcc agg gag ccg gaa 3315
Gln Ala Lys Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu
930 935 940
aca gag cgt gtg gag cga cct cct gct gat gat tgg aag aaa tcg gag 3363
Thr Glu Arg Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu
945 950 955
agt tcc agg gag tat aaa aac aat aac aaa ctc agg gaa tac cag ttg 3411
Ser Ser Arg Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu
960 965 970
gag gga gta aac tgg cta ctt ttc aat tgg tac aac atg cga aac tgc 3459
Glu Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys
975 980 985
att tta gca gat gaa atg ggt ttg gga aaa act atc cag tcc att aca 3507
Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr
990 995 1000 1005
ttt ctc tat gag ata tat ttg aaa gga atc cat ggc cct ttt tta 3552
Phe Leu Tyr Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu
1010 1015 1020
gta att gcc cca ttg tcc aca atc ccc aac tgg gaa agg gaa ttc 3597
Val Ile Ala Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe
1025 1030 1035
cga acc tgg aca gag ttg aac gtg gtt gtg tat cat ggg agt caa 3642
Arg Thr Trp Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln
1040 1045 1050
gct agt cgt cgg acc att cag ttg tat gaa atg tac ttc aaa gat 3687
Ala Ser Arg Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp
1055 1060 1065
ccc cag ggt cga gtg ata aag ggg tcc tat aag ttt cat gcc atc 3732
Pro Gln Gly Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile
1070 1075 1080
atc act aca ttt gag atg att ttg act gat tgt cct gag ctg cgg 3777
Ile Thr Thr Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg
1085 1090 1095
aat att cca tgg cgc tgt gta gtc att gat gaa gcc cac agg ctg 3822
Asn Ile Pro Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu
1100 1105 1110
aag aac agg aac tgc aag ctg ttg gag gga ctc aag atg atg gac 3867
Lys Asn Arg Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp
1115 1120 1125
ttg gaa cac aaa gtg ctg ctg acg gga acc cca ctc cag aac act 3912
Leu Glu His Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr
1130 1135 1140
gtg gaa gaa ctc ttc agc ttg ctt cat ttc ttg gaa cca agt cgc 3957
Val Glu Glu Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg
1145 1150 1155
ttc cct tca gaa acc aca ttt atg caa gaa ttt ggt gat cta aaa 4002
Phe Pro Ser Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys
1160 1165 1170
aca gaa gag cag gtg caa aaa ctt caa gct att cta aag cca atg 4047
Thr Glu Glu Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met
1175 1180 1185
atg ttg aga cgt ctc aaa gag gat gta gaa aag aac ttg gcc ccc 4092
Met Leu Arg Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro
1190 1195 1200
aaa gaa gaa act att att gaa gtt gag cta aca aac att cag aag 4137
Lys Glu Glu Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys
1205 1210 1215
aaa tat tac cga gcc atc ctt gag aag aat ttc aca ttt ctt tcc 4182
Lys Tyr Tyr Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser
1220 1225 1230
aaa ggc ggt ggt caa gct aac gta cct aac cta tta aac act atg 4227
Lys Gly Gly Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met
1235 1240 1245
atg gaa ttg cgg aag tgc tgc aat cat ccg tac ctt atc aat ggt 4272
Met Glu Leu Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly
1250 1255 1260
gct gaa gag aaa att ttg gaa gag ttt aaa gaa aca cac aat gca 4317
Ala Glu Glu Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala
1265 1270 1275
gag tct cca gat ttt cag ctc cag gca atg atc cag gct gct ggc 4362
Glu Ser Pro Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly
1280 1285 1290
aag cta gtg ctg att gac aag ctg ctg cca aaa ctg aag gct ggt 4407
Lys Leu Val Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly
1295 1300 1305
ggc cac agg gtg ctt atc ttt tcc cag atg gtg cgc tgc ttg gac 4452
Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp
1310 1315 1320
ata ctg gaa gac tac ctc att caa aga cgg tac cca tat gaa agg 4497
Ile Leu Glu Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg
1325 1330 1335
atc gac ggc cga gta aga ggc aac ctc cgc cag gca gct atc gac 4542
Ile Asp Gly Arg Val Arg Gly Asn Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp
1340 1345 1350
aga ttc tcc aaa cct gat tct gat agg ttt gtt ttc ctc ctg tgt 4587
Arg Phe Ser Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys
1355 1360 1365
aca agg gca gga ggt tta ggc att aac ctc act gct gct gat acc 4632
Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr
1370 1375 1380
tgc atc atc ttt gat tca gac tgg aat ccc caa aat gac ctc cag 4677
Cys Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln
1385 1390 1395
gct cag gct aga tgt cat aga ata gga cag agc aaa tct gtg aaa 4722
Ala Gln Ala Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys
1400 1405 1410
atc tac agg ctg att aca aga aat tcc tat gaa agg gaa atg ttc 4767
Ile Tyr Arg Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe
1415 1420 1425
gac aag gct agt ttg aaa ctg ggc ctg gat aaa gct gtg cta cag 4812
Asp Lys Ala Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln
1430 1435 1440
tct atg agt gga aga gaa aat gct acc aat ggg gta caa cag ctt 4857
Ser Met Ser Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu
1445 1450 1455
tcc aag aaa gaa ata gag gat ctt cta cga aaa ggg gcc tat ggt 4902
Ser Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly
1460 1465 1470
gca ctc atg gat gag gag gat gaa ggg tct aaa ttc tgt gaa gaa 4947
Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu
1475 1480 1485
gat att gat cag atc ctc cta cgt cga acc cac acc att acc att 4992
Asp Ile Asp Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile
1490 1495 1500
gag tca gaa ggg aaa ggt tcc aca ttt gct aag gcc agt ttt gtt 5037
Glu Ser Glu Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val
1505 1510 1515
gca tct gga aat agg aca gat att tcc ttg gat gat cca aat ttc 5082
Ala Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe
1520 1525 1530
tgg caa aag tgg gct aag aag gct gaa ttg gat att gat gcc tta 5127
Trp Gln Lys Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu
1535 1540 1545
aat ggg agg aac aac ctg gtt att gat act cca aga gtg aga aag 5172
Asn Gly Arg Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys
1550 1555 1560
cag acc agg ctc tac agt gca gtg aag gaa gat gag ctg atg gag 5217
Gln Thr Arg Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu
1565 1570 1575
ttc tca gac ttg gaa agt gat tct gaa gaa aag ccc tgt gca aag 5262
Phe Ser Asp Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys
1580 1585 1590
cca cgg cgt ccc cag gat aag tca cag ggc tat gca agg agt gaa 5307
Pro Arg Arg Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu
1595 1600 1605
tgt ttc agg gtg gag aag aat ctg ctt gtc tat ggt tgg gga cgg 5352
Cys Phe Arg Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Trp Gly Arg
1610 1615 1620
tgg aca gac att ctt tcc cac gga cgc tat aaa cgc caa ctc act 5397
Trp Thr Asp Ile Leu Ser His Gly Arg Tyr Lys Arg Gln Leu Thr
1625 1630 1635
gag caa gat gta gaa acc atc tgc aga acc atc ctg gtg tac tgt 5442
Glu Gln Asp Val Glu Thr Ile Cys Arg Thr Ile Leu Val Tyr Cys
1640 1645 1650
ctt aat cat tac aaa ggg gat gag aat atc aaa agc ttc atc tgg 5487
Leu Asn His Tyr Lys Gly Asp Glu Asn Ile Lys Ser Phe Ile Trp
1655 1660 1665
gat ctg atc aca ccc aca gcg gat ggc cag act cga gcc ttg gtc 5532
Asp Leu Ile Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gln Thr Arg Ala Leu Val
1670 1675 1680
aac cat tcc ggt ttg tca gct cct gtg cca agg gga agg aag gga 5577
Asn His Ser Gly Leu Ser Ala Pro Val Pro Arg Gly Arg Lys Gly
1685 1690 1695
aag aag gtg aaa gcc cag agc aca cag ccg gtg gtg cag gat gcc 5622
Lys Lys Val Lys Ala Gln Ser Thr Gln Pro Val Val Gln Asp Ala
1700 1705 1710
gac tgg ctg gcc agc tgc aac cca gat gcc ctg ttc cag gag gac 5667
Asp Trp Leu Ala Ser Cys Asn Pro Asp Ala Leu Phe Gln Glu Asp
1715 1720 1725
agc tac aag aaa cac ctg aag cat cac tgt aac aag gtc ctg ctg 5712
Ser Tyr Lys Lys His Leu Lys His His Cys Asn Lys Val Leu Leu
1730 1735 1740
cgt gtc cgc atg ctg tac tac cta aga caa gaa gtg ata gga gac 5757
Arg Val Arg Met Leu Tyr Tyr Leu Arg Gln Glu Val Ile Gly Asp
1745 1750 1755
cag gcg gat aag atc tta gag ggt gct gac tca agt gaa gcc gat 5802
Gln Ala Asp Lys Ile Leu Glu Gly Ala Asp Ser Ser Glu Ala Asp
1760 1765 1770
gtg tgg atc cct gaa cct ttc cat gct gaa gtt cct gca gat tgg 5847
Val Trp Ile Pro Glu Pro Phe His Ala Glu Val Pro Ala Asp Trp
1775 1780 1785
tgg gat aag gaa gca gac aaa tcc ctc tta att gga gtg ttc aaa 5892
Trp Asp Lys Glu Ala Asp Lys Ser Leu Leu Ile Gly Val Phe Lys
1790 1795 1800
cat ggc tat gag aag tac aac tcc atg cga gct gac ccc gcg ctg 5937
His Gly Tyr Glu Lys Tyr Asn Ser Met Arg Ala Asp Pro Ala Leu
1805 1810 1815
tgc ttt ctg gaa cga gtc ggt atg cct gat gcc aag gcc ata gct 5982
Cys Phe Leu Glu Arg Val Gly Met Pro Asp Ala Lys Ala Ile Ala
1820 1825 1830
gcc gag caa aga gga aca gac atg cta gca gat ggt ggt gac ggg 6027
Ala Glu Gln Arg Gly Thr Asp Met Leu Ala Asp Gly Gly Asp Gly
1835 1840 1845
gga gaa ttt gat aga gaa gat gaa gac cca gaa tat aaa cca acc 6072
Gly Glu Phe Asp Arg Glu Asp Glu Asp Pro Glu Tyr Lys Pro Thr
1850 1855 1860
aga aca ccg ttc aaa gat gaa ata gat gaa ttt gca aat tct cct 6117
Arg Thr Pro Phe Lys Asp Glu Ile Asp Glu Phe Ala Asn Ser Pro
1865 1870 1875
tca gag gat aag gaa gaa tcc atg gaa ata cat gcc aca ggc aag 6162
Ser Glu Asp Lys Glu Glu Ser Met Glu Ile His Ala Thr Gly Lys
1880 1885 1890
cac agt gag agt aat gct gag tta ggc caa ctt tac tgg cct aac 6207
His Ser Glu Ser Asn Ala Glu Leu Gly Gln Leu Tyr Trp Pro Asn
1895 1900 1905
act tca acc ctg act aca cgt ctg cgc cgg ctc att act gcc tat 6252
Thr Ser Thr Leu Thr Thr Arg Leu Arg Arg Leu Ile Thr Ala Tyr
1910 1915 1920
cag cgc agc tat aaa agg caa cag atg agg caa gag gcc cta atg 6297
Gln Arg Ser Tyr Lys Arg Gln Gln Met Arg Gln Glu Ala Leu Met
1925 1930 1935
aag act gac cgg cgc aga cgg cgg cct cga gag gaa gtg aga gct 6342
Lys Thr Asp Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Glu Glu Val Arg Ala
1940 1945 1950
ctg gaa gcg gaa agg gaa gct att ata tct gag aag cgg caa aag 6387
Leu Glu Ala Glu Arg Glu Ala Ile Ile Ser Glu Lys Arg Gln Lys
1955 1960 1965
tgg aca aga aga gaa gag gct gat ttt tac cgt gtg gta tcc acc 6432
Trp Thr Arg Arg Glu Glu Ala Asp Phe Tyr Arg Val Val Ser Thr
1970 1975 1980
ttt ggg gtt att ttt gac cct gtg aaa cag caa ttt gac tgg aac 6477
Phe Gly Val Ile Phe Asp Pro Val Lys Gln Gln Phe Asp Trp Asn
1985 1990 1995
caa ttt aga gcc ttt gcc agg ctt gac aaa aaa tct gat gag agt 6522
Gln Phe Arg Ala Phe Ala Arg Leu Asp Lys Lys Ser Asp Glu Ser
2000 2005 2010
ttg gag aaa tac ttc agt tgt ttt gtg gcc atg tgt agg cga gta 6567
Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Cys Phe Val Ala Met Cys Arg Arg Val
2015 2020 2025
tgt cga atg ccc gtc aag cca gat gat gaa ccg ccc gac ctc tcc 6612
Cys Arg Met Pro Val Lys Pro Asp Asp Glu Pro Pro Asp Leu Ser
2030 2035 2040
tcc ata att gag ccg atc aca gag gag cga gcc tct cga act ctg 6657
Ser Ile Ile Glu Pro Ile Thr Glu Glu Arg Ala Ser Arg Thr Leu
2045 2050 2055
tac cgc att gag ctg cta cgg aag atc cgc gag cag gtt ctc cat 6702
Tyr Arg Ile Glu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Glu Gln Val Leu His
2060 2065 2070
cac ccc cag ctg gga gag agg ctt aag ctc tgc cag cca agc ttg 6747
His Pro Gln Leu Gly Glu Arg Leu Lys Leu Cys Gln Pro Ser Leu
2075 2080 2085
gat ctg cca gag tgg tgg gag tgt gga cgg cat gac cga gac ttg 6792
Asp Leu Pro Glu Trp Trp Glu Cys Gly Arg His Asp Arg Asp Leu
2090 2095 2100
ctg gtt ggt gct gct aaa cac ggg gtc agt cgg acg gat tat cac 6837
Leu Val Gly Ala Ala Lys His Gly Val Ser Arg Thr Asp Tyr His
2105 2110 2115
atc ctc aat gac cct gag tta tcc ttc ttg gat gca cat aaa aac 6882
Ile Leu Asn Asp Pro Glu Leu Ser Phe Leu Asp Ala His Lys Asn
2120 2125 2130
ttt gct caa aac aga ggg gca ggt aat aca tct tcc ttg aac cca 6927
Phe Ala Gln Asn Arg Gly Ala Gly Asn Thr Ser Ser Leu Asn Pro
2135 2140 2145
ctg gca gtt gga ttt gtc cag act cct cca gtc atc tca tct gct 6972
Leu Ala Val Gly Phe Val Gln Thr Pro Pro Val Ile Ser Ser Ala
2150 2155 2160
cat att caa gat gag agg gta ctg gaa caa gcc gaa ggc aaa gtg 7017
His Ile Gln Asp Glu Arg Val Leu Glu Gln Ala Glu Gly Lys Val
2165 2170 2175
gag gag cct gaa aac cca gct gcc aag gag aaa tgt gag ggc aaa 7062
Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Ala Lys Glu Lys Cys Glu Gly Lys
2180 2185 2190
gaa gag gaa gaa gaa acc gat ggc agc ggg aag gag agc aag cag 7107
Glu Glu Glu Glu Glu Thr Asp Gly Ser Gly Lys Glu Ser Lys Gln
2195 2200 2205
gaa tgt gag gca gag gcc agc tct gtg aaa aat gaa ctg aaa ggt 7152
Glu Cys Glu Ala Glu Ala Ser Ser Val Lys Asn Glu Leu Lys Gly
2210 2215 2220
gtt gag gtc ggc gca gac act ggg tcc aaa tct att tca gag aaa 7197
Val Glu Val Gly Ala Asp Thr Gly Ser Lys Ser Ile Ser Glu Lys
2225 2230 2235
ggt tcc gaa gag gat gaa gag gaa aag ctg gag gat gac gat aag 7242
Gly Ser Glu Glu Asp Glu Glu Glu Lys Leu Glu Asp Asp Asp Lys
2240 2245 2250
tcg gaa gag tct tcc cag ccc gaa gca gga gct gtc tct aga ggg 7287
Ser Glu Glu Ser Ser Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Ser Arg Gly
2255 2260 2265
aag aat ttt gat gaa gaa agc aat gct tcc atg agc act gct aga 7332
Lys Asn Phe Asp Glu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Thr Ala Arg
2270 2275 2280
gat gaa acc cga gat gga ttc tac atg gag gac gga gat cct tca 7377
Asp Glu Thr Arg Asp Gly Phe Tyr Met Glu Asp Gly Asp Pro Ser
2285 2290 2295
gta gct cag ctc ctt cat gaa aga aca ttt gcc ttc tcg ttt tgg 7422
Val Ala Gln Leu Leu His Glu Arg Thr Phe Ala Phe Ser Phe Trp
2300 2305 2310
cct aag gat aga gta atg ata aac cgc tta gac aac atc tgt gaa 7467
Pro Lys Asp Arg Val Met Ile Asn Arg Leu Asp Asn Ile Cys Glu
2315 2320 2325
gca gtg ttg aaa ggc aaa tgg cca gta aat agg cgc cag atg ttt 7512
Ala Val Leu Lys Gly Lys Trp Pro Val Asn Arg Arg Gln Met Phe
2330 2335 2340
gat ttc caa ggc ctc atc cca ggt tac aca ccc acc aca gtg gac 7557
Asp Phe Gln Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Asp
2345 2350 2355
agc ccc ttg cag aag agg agc ttt gct gag ctc tcc atg gtc ggc 7602
Ser Pro Leu Gln Lys Arg Ser Phe Ala Glu Leu Ser Met Val Gly
2360 2365 2370
caa gcc agc att agt ggg agt gag gac atc act acg tct cct cag 7647
Gln Ala Ser Ile Ser Gly Ser Glu Asp Ile Thr Thr Ser Pro Gln
2375 2380 2385
ttg tca aag gaa gat gcc ctc aac ctc tct gtc cct cgc cag cgg 7692
Leu Ser Lys Glu Asp Ala Leu Asn Leu Ser Val Pro Arg Gln Arg
2390 2395 2400
agg agg agg agg aga aaa atc gaa att gag gcc gaa aga gct gcc 7737
Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ile Glu Ile Glu Ala Glu Arg Ala Ala
2405 2410 2415
aag agg cga aat ctc atg gag atg gtt gcc cag ctt cga gag tct 7782
Lys Arg Arg Asn Leu Met Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Glu Ser
2420 2425 2430
cag gtg gtc tca gaa aat gga caa gaa aaa gtt gta gat tta tca 7827
Gln Val Val Ser Glu Asn Gly Gln Glu Lys Val Val Asp Leu Ser
2435 2440 2445
aag gcc tca aga gag gca aca agc tct acc tca aat ttt tca tct 7872
Lys Ala Ser Arg Glu Ala Thr Ser Ser Thr Ser Asn Phe Ser Ser
2450 2455 2460
ctt tct tca aag ttt atc ttg cct aat gtc tca aca cca gtg tct 7917
Leu Ser Ser Lys Phe Ile Leu Pro Asn Val Ser Thr Pro Val Ser
2465 2470 2475
gat gcc ttt aag act caa atg gaa ctg ctc caa gca ggc ctt tcg 7962
Asp Ala Phe Lys Thr Gln Met Glu Leu Leu Gln Ala Gly Leu Ser
2480 2485 2490
cgc aca ccc aca agg cat ctc ctt aat ggc tcc cta gtg gat gga 8007
Arg Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Asn Gly Ser Leu Val Asp Gly
2495 2500 2505
gag cct ccc atg aag agg agg cgg gga agg agg aaa aat gtg gag 8052
Glu Pro Pro Met Lys Arg Arg Arg Gly Arg Arg Lys Asn Val Glu
2510 2515 2520
gga ctt gat ctg ctt ttc atg agc cac aaa cgg acg tca ttg agt 8097
Gly Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser His Lys Arg Thr Ser Leu Ser
2525 2530 2535
gca gag gat gct gag gtg acc aaa gct ttt gaa gaa gat ata gag 8142
Ala Glu Asp Ala Glu Val Thr Lys Ala Phe Glu Glu Asp Ile Glu
2540 2545 2550
acc cca cca aca aga aac att cct tct ccc gga cag ctg gac cca 8187
Thr Pro Pro Thr Arg Asn Ile Pro Ser Pro Gly Gln Leu Asp Pro
2555 2560 2565
gac aca cgg atc cct gtt atc aat ctt gaa gat ggg act agg ctg 8232
Asp Thr Arg Ile Pro Val Ile Asn Leu Glu Asp Gly Thr Arg Leu
2570 2575 2580
gtg ggg gaa gat gct cct aaa aat aag gat tta gtt gaa tgg ctg 8277
Val Gly Glu Asp Ala Pro Lys Asn Lys Asp Leu Val Glu Trp Leu
2585 2590 2595
aag ctg cac cct act tac act gtt gat atg cca agt tat gta cca 8322
Lys Leu His Pro Thr Tyr Thr Val Asp Met Pro Ser Tyr Val Pro
2600 2605 2610
aag aat gca gat gtg ctg ttt tcc tca ttt cag aaa ccg aaa cag 8367
Lys Asn Ala Asp Val Leu Phe Ser Ser Phe Gln Lys Pro Lys Gln
2615 2620 2625
aaa cga cat aga tgt cga aac cct aat aaa ttg gat ata aac act 8412
Lys Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr
2630 2635 2640
ttg aca gga gaa gaa agg gtg cct gtt gtc aat aaa cga aat ggg 8457
Leu Thr Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly
2645 2650 2655
aag aag atg ggt gga gct atg gcg cct cca atg aag gat cta ccc 8502
Lys Lys Met Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro
2660 2665 2670
agg tgg ctg gaa gaa aat cct gaa ttt gca gtt gct cca gac tgg 8547
Arg Trp Leu Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp
2675 2680 2685
act gat ata gtt aag cag tct ggt ttt gtt cct gag tcg atg ttt 8592
Thr Asp Ile Val Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe
2690 2695 2700
gac cgc ctt ctc act ggg cct gta gtg cgg gga gag gga gcg agc 8637
Asp Arg Leu Leu Thr Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser
2705 2710 2715
aga aga gga aga agg ccc aaa agt gag atc gcc aga gca gcc gcg 8682
Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala
2720 2725 2730
gcc gcc gct gct gtg gcc tcc acg tca ggg atc aac cct ttg ctg 8727
Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu
2735 2740 2745
gtg aac agc ctg ttt gct gga atg gac ctg acg agc ctt cag aat 8772
Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn
2750 2755 2760
ctc cag aat ctc cag tcg ctc cag ctg gca ggc ctc atg ggc ttc 8817
Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala Gly Leu Met Gly Phe
2765 2770 2775
cct cca gga ctg gca aca gct gcc acc gcc gga ggc gat gcg aag 8862
Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asp Ala Lys
2780 2785 2790
aac cct gct gct gtg ctg ccc ctg atg ctg cca gga atg gcg ggc 8907
Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly Met Ala Gly
2795 2800 2805
ctg ccc aac gtg ttt ggc ttg ggc ggg ctg ttg aat aac cct ctg 8952
Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn Pro Leu
2810 2815 2820
tca gct gct act gga aac acc act act gct tct agt caa gga gaa 8997
Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly Glu
2825 2830 2835
ccg gaa gac agc act tca aaa gga gag gag aaa gga aat gag aat 9042
Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn
2840 2845 2850
gaa gac gag aac aaa gac tct gag aaa agc aca gat gct gtt tcg 9087
Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser
2855 2860 2865
gct gct gac tct gcg aat gga tct gtt ggt gct gct act gcc ccg 9132
Ala Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro
2870 2875 2880
gct gga ttg ccc tca aac ccg cta gcc ttc aac cct ttc ctc ctg 9177
Ala Gly Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu
2885 2890 2895
tcc aca atg gcc ccg ggc ctc ttc tac cca tcc atg ttt cta cct 9222
Ser Thr Met Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro
2900 2905 2910
cca gga ctg ggg gga ttg acg ctg cct ggg ttc cca gca ttg gca 9267
Pro Gly Leu Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala
2915 2920 2925
gga ctt cag aat gcc gtg ggc tcc agc gaa gaa aag gct gct gac 9312
Gly Leu Gln Asn Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp
2930 2935 2940
aag gct gag gga gga ccc ttt aaa gat gga gag acc ctt gaa ggc 9357
Lys Ala Glu Gly Gly Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly
2945 2950 2955
agc gat gcc gag gag agc ctg gat aag act gca gag tcc tcc ctc 9402
Ser Asp Ala Glu Glu Ser Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu
2960 2965 2970
tta gaa gac gaa ata gca cag ggt gaa gag cta gac tca ctt gat 9447
Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp
2975 2980 2985
ggg ggg gat gaa ata gaa aac aat gaa aat gat gaa taa ccagtaccag 9496
Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn Glu Asn Asp Glu
2990 2995
ttccagttca agtgtttaaa acttttgaca agtggtagtc ctactgttta cactcacagt 9556
taatgttcat acctagtttt ataagctgtt ctgtaacata gtgtagcaaa aaaaaaagtt 9616
caagtcatgt tatacaggtg tgtcaaaagg tatcttggtc attaagtatt gtgcagtgca 9676
ttatttatta tccctaggag agatgaaatt tgagaggtga tcatgtcttt ttaaggaaac 9736
ttacataatg ctctgctttt tttttttctc ttggtaccat tggtattata ataaagagca 9796
atttgtaact gagtggcact aatggaagaa agtgctgctc aaaggaagta tgaagttata 9856
tatttaattt tttaatttta atttttaatt tttttgctgt gaaggtcaag ctgaaattta 9916
ccatacatat catacttgct catttgtttc cctttttgac tgtatggggg ttcccacact 9976
cgtgcataca cacacatcca tacactctga caatctccac gctagtgtga acgcctctgt 10036
cccgaggcgc agcaataata aggcagctgt tgaatgtgaa gggtcccttt ggaaaattaa 10096
cctactggga gggttcttgc cagacagaac tacagttcca ttgtctcgtg gtcttgtaat 10156
gcactggtaa aaacaaaata aatagatgaa taaataaaga gtgagagaag agagaatcag 10216
gtaccttttt taaattaaag gactttgtta ctttagccac aaagctaaaa cagcattacc 10276
tcagctctaa actagccttg aagtttacag acatgacttt gtaaatgtat tgtttttctt 10336
tgttgtgatg tccttttatt tttttctttg aaaactgcta tcatgtaaga taaaatgtaa 10396
attgctgcca actgtagtaa tgatgctttt aataaaagtg acccatgata tgcagagatg 10456
taattataga atgtagtata tagggaaact ggtgttcact ctattttttt tgtattcgca 10516
atagatgcaa atacagcatt ctggcttttg tacagtttct tgatatatcc tcttatacta 10576
gattagcttt tggtaagaca ctaaactgtc tcgaagacta gacaggaagg aaaaccttga 10636
attactctca cataattcca ctccagatat ctcaacagaa atgcatacaa aaagctccta 10696
ttactccctc aaaagggcat ctgagaccga gaatacttag aaatgtgtgc agcgtgtgat 10756
aatgtggtac actgaagaac aaaagggcaa aagaaaaatg aggctttaac aggcacaata 10816
tctaggtcat ttatccttgg ttaatgggta gaaaaacaca atgcggtagt gtcagcaagg 10876
gacacaaagg cactctggtg tcctgcagac cagcgctcga tgccagaaac cagtgtgtgg 10936
aaaaacccat gtggaattga aacagaccca cttaagcacg cacgcgcgca cgcacggtct 10996
caggagctac tgatttgtgg accccttttt gacctttggt atttaaagta aaatataatt 11056
tgagatctac tgttttcacc tttttatgtc acctgaacca acacaaagcc atatttccat 11116
ccagttaaaa agcaggggaa gggatgtgga cgagagtgtt tcgtgtgtgt tgccttcctc 11176
cacacccttc ccccaggacg tccgcacaca gtccacctcc agccagtgtg ctgccagaca 11236
ggtggtctaa attcctccca gactgtgaga ttcagttcgt ttatgcccca agatgaaaat 11296
atgcccctta atgattctgg gaaagaaaca acctgaaccc tccaccttac agatcctgtg 11356
attgctttta tttatcatcg tcgttgtctg ctgaaagtga atgggccgtg cacactggag 11416
gaaagtgcct tgaagagaat attttttgaa agggaattat ttgaacacgg gaaagtgaaa 11476
ctaggtctgc atgaagtata ggaaatttaa gtatttaagt aacaaagatg ttagcaggga 11536
gaatttgctt aataaaatga gtcattaaag ggtgtttttt ttaaaaaaaa aaa 11589
<210> 2
<211> 2997
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile
1 5 10 15
Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn
20 25 30
Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala
35 40 45
Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr
50 55 60
Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met
65 70 75 80
His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn
85 90 95
Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln
100 105 110
Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly
115 120 125
Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met
130 135 140
Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly
165 170 175
Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr
180 185 190
Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln
195 200 205
Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn
210 215 220
Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe
245 250 255
His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser
260 265 270
Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln
275 280 285
Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile
290 295 300
Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln
305 310 315 320
Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn
325 330 335
Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly
340 345 350
Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His
355 360 365
Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser
370 375 380
Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys
385 390 395 400
Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly
405 410 415
Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His
420 425 430
Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg
435 440 445
Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met
450 455 460
Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile
485 490 495
Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro
500 505 510
Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser
515 520 525
Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro
530 535 540
Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu
545 550 555 560
Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro
565 570 575
Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln
580 585 590
Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala
595 600 605
Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val
610 615 620
Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu
625 630 635 640
Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro
645 650 655
Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys
660 665 670
Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala
675 680 685
Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp
690 695 700
Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu
705 710 715 720
Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro
725 730 735
Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg
740 745 750
Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser
755 760 765
Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser
770 775 780
Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro
785 790 795 800
Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu
805 810 815
Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn
820 825 830
Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys
835 840 845
Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly
850 855 860
Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp
865 870 875 880
Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp
885 890 895
Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro
900 905 910
Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys
915 920 925
Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg
930 935 940
Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg
945 950 955 960
Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val
965 970 975
Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala
980 985 990
Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr
995 1000 1005
Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala
1010 1015 1020
Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp
1025 1030 1035
Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg
1040 1045 1050
Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly
1055 1060 1065
Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr
1070 1075 1080
Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro
1085 1090 1095
Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg
1100 1105 1110
Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His
1115 1120 1125
Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu
1130 1135 1140
Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser
1145 1150 1155
Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu
1160 1165 1170
Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg
1175 1180 1185
Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu
1190 1195 1200
Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr
1205 1210 1215
Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly
1220 1225 1230
Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu
1235 1240 1245
Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu
1250 1255 1260
Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro
1265 1270 1275
Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val
1280 1285 1290
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg
1295 1300 1305
Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu
1310 1315 1320
Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly
1325 1330 1335
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1340 1345 1350
Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala
1355 1360 1365
Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile
1370 1375 1380
Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala
1385 1390 1395
Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg
1400 1405 1410
Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala
1415 1420 1425
Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser
1430 1435 1440
Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys
1445 1450 1455
Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met
1460 1465 1470
Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp
1475 1480 1485
Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu
1490 1495 1500
Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly
1505 1510 1515
Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys
1520 1525 1530
Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg
1535 1540 1545
Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg
1550 1555 1560
Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp
1565 1570 1575
Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg
1580 1585 1590
Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg
1595 1600 1605
Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Trp Gly Arg Trp Thr Asp
1610 1615 1620
Ile Leu Ser His Gly Arg Tyr Lys Arg Gln Leu Thr Glu Gln Asp
1625 1630 1635
Val Glu Thr Ile Cys Arg Thr Ile Leu Val Tyr Cys Leu Asn His
1640 1645 1650
Tyr Lys Gly Asp Glu Asn Ile Lys Ser Phe Ile Trp Asp Leu Ile
1655 1660 1665
Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gln Thr Arg Ala Leu Val Asn His Ser
1670 1675 1680
Gly Leu Ser Ala Pro Val Pro Arg Gly Arg Lys Gly Lys Lys Val
1685 1690 1695
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1700 1705 1710
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1715 1720 1725
Lys His Leu Lys His His Cys Asn Lys Val Leu Leu Arg Val Arg
1730 1735 1740
Met Leu Tyr Tyr Leu Arg Gln Glu Val Ile Gly Asp Gln Ala Asp
1745 1750 1755
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1940 1945 1950
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Ile Phe Asp Pro Val Lys Gln Gln Phe Asp Trp Asn Gln Phe Arg
1985 1990 1995
Ala Phe Ala Arg Leu Asp Lys Lys Ser Asp Glu Ser Leu Glu Lys
2000 2005 2010
Tyr Phe Ser Cys Phe Val Ala Met Cys Arg Arg Val Cys Arg Met
2015 2020 2025
Pro Val Lys Pro Asp Asp Glu Pro Pro Asp Leu Ser Ser Ile Ile
2030 2035 2040
Glu Pro Ile Thr Glu Glu Arg Ala Ser Arg Thr Leu Tyr Arg Ile
2045 2050 2055
Glu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Glu Gln Val Leu His His Pro Gln
2060 2065 2070
Leu Gly Glu Arg Leu Lys Leu Cys Gln Pro Ser Leu Asp Leu Pro
2075 2080 2085
Glu Trp Trp Glu Cys Gly Arg His Asp Arg Asp Leu Leu Val Gly
2090 2095 2100
Ala Ala Lys His Gly Val Ser Arg Thr Asp Tyr His Ile Leu Asn
2105 2110 2115
Asp Pro Glu Leu Ser Phe Leu Asp Ala His Lys Asn Phe Ala Gln
2120 2125 2130
Asn Arg Gly Ala Gly Asn Thr Ser Ser Leu Asn Pro Leu Ala Val
2135 2140 2145
Gly Phe Val Gln Thr Pro Pro Val Ile Ser Ser Ala His Ile Gln
2150 2155 2160
Asp Glu Arg Val Leu Glu Gln Ala Glu Gly Lys Val Glu Glu Pro
2165 2170 2175
Glu Asn Pro Ala Ala Lys Glu Lys Cys Glu Gly Lys Glu Glu Glu
2180 2185 2190
Glu Glu Thr Asp Gly Ser Gly Lys Glu Ser Lys Gln Glu Cys Glu
2195 2200 2205
Ala Glu Ala Ser Ser Val Lys Asn Glu Leu Lys Gly Val Glu Val
2210 2215 2220
Gly Ala Asp Thr Gly Ser Lys Ser Ile Ser Glu Lys Gly Ser Glu
2225 2230 2235
Glu Asp Glu Glu Glu Lys Leu Glu Asp Asp Asp Lys Ser Glu Glu
2240 2245 2250
Ser Ser Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Ser Arg Gly Lys Asn Phe
2255 2260 2265
Asp Glu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Thr Ala Arg Asp Glu Thr
2270 2275 2280
Arg Asp Gly Phe Tyr Met Glu Asp Gly Asp Pro Ser Val Ala Gln
2285 2290 2295
Leu Leu His Glu Arg Thr Phe Ala Phe Ser Phe Trp Pro Lys Asp
2300 2305 2310
Arg Val Met Ile Asn Arg Leu Asp Asn Ile Cys Glu Ala Val Leu
2315 2320 2325
Lys Gly Lys Trp Pro Val Asn Arg Arg Gln Met Phe Asp Phe Gln
2330 2335 2340
Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Asp Ser Pro Leu
2345 2350 2355
Gln Lys Arg Ser Phe Ala Glu Leu Ser Met Val Gly Gln Ala Ser
2360 2365 2370
Ile Ser Gly Ser Glu Asp Ile Thr Thr Ser Pro Gln Leu Ser Lys
2375 2380 2385
Glu Asp Ala Leu Asn Leu Ser Val Pro Arg Gln Arg Arg Arg Arg
2390 2395 2400
Arg Arg Lys Ile Glu Ile Glu Ala Glu Arg Ala Ala Lys Arg Arg
2405 2410 2415
Asn Leu Met Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Glu Ser Gln Val Val
2420 2425 2430
Ser Glu Asn Gly Gln Glu Lys Val Val Asp Leu Ser Lys Ala Ser
2435 2440 2445
Arg Glu Ala Thr Ser Ser Thr Ser Asn Phe Ser Ser Leu Ser Ser
2450 2455 2460
Lys Phe Ile Leu Pro Asn Val Ser Thr Pro Val Ser Asp Ala Phe
2465 2470 2475
Lys Thr Gln Met Glu Leu Leu Gln Ala Gly Leu Ser Arg Thr Pro
2480 2485 2490
Thr Arg His Leu Leu Asn Gly Ser Leu Val Asp Gly Glu Pro Pro
2495 2500 2505
Met Lys Arg Arg Arg Gly Arg Arg Lys Asn Val Glu Gly Leu Asp
2510 2515 2520
Leu Leu Phe Met Ser His Lys Arg Thr Ser Leu Ser Ala Glu Asp
2525 2530 2535
Ala Glu Val Thr Lys Ala Phe Glu Glu Asp Ile Glu Thr Pro Pro
2540 2545 2550
Thr Arg Asn Ile Pro Ser Pro Gly Gln Leu Asp Pro Asp Thr Arg
2555 2560 2565
Ile Pro Val Ile Asn Leu Glu Asp Gly Thr Arg Leu Val Gly Glu
2570 2575 2580
Asp Ala Pro Lys Asn Lys Asp Leu Val Glu Trp Leu Lys Leu His
2585 2590 2595
Pro Thr Tyr Thr Val Asp Met Pro Ser Tyr Val Pro Lys Asn Ala
2600 2605 2610
Asp Val Leu Phe Ser Ser Phe Gln Lys Pro Lys Gln Lys Arg His
2615 2620 2625
Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu Thr Gly
2630 2635 2640
Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys Met
2645 2650 2655
Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu
2660 2665 2670
Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile
2675 2680 2685
Val Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu
2690 2695 2700
Leu Thr Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly
2705 2710 2715
Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala
2720 2725 2730
Ala Val Ala Ser Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser
2735 2740 2745
Leu Phe Ala Gly Met Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn
2750 2755 2760
Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly
2765 2770 2775
Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala
2780 2785 2790
Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly Met Ala Gly Leu Pro Asn
2795 2800 2805
Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn Pro Leu Ser Ala Ala
2810 2815 2820
Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly Glu Pro Glu Asp
2825 2830 2835
Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn Glu Asp Glu
2840 2845 2850
Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser Ala Ala Asp
2855 2860 2865
Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly Leu
2870 2875 2880
Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr Met
2885 2890 2895
Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu
2900 2905 2910
Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln
2915 2920 2925
Asn Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu
2930 2935 2940
Gly Gly Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala
2945 2950 2955
Glu Glu Ser Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp
2960 2965 2970
Glu Ile Ala Gln Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp
2975 2980 2985
Glu Ile Glu Asn Asn Glu Asn Asp Glu
2990 2995
<210> 3
<211> 5124
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (175)..(3021)
<400> 3
gacctatatc cagactttgc ctgacactgc agggtccaag agaattaaag aaatatggaa 60
tgacatgaag aagattagtt aaggattata ggctttgagg gcaaacacct cagtgaagtg 120
aagcacaggc aagctcctga gctgtggttt ggaggagccg tgtgttggaa gaag atg 177
Met
1
gca gat cca gga atg atg agt ctt ttt ggc gag gat ggg aat att ttc 225
Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile Phe
5 10 15
agt gaa ggt ctt gaa ggc ctc gga gaa tgt ggt tac ccg gaa aat cca 273
Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn Pro
20 25 30
gta aat cct atg ggt cag caa atg cca ata gac caa ggc ttt gcc tct 321
Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala Ser
35 40 45
tta cag cca tcc ctt cat cat cct tca act aat caa aat caa aca aag 369
Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr Lys
50 55 60 65
ctg aca cat ttt gat cac tat aat cag tat gaa caa caa aag atg cat 417
Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met His
70 75 80
ctg atg gat cag ccg aac aga atg atg agc aac acc cct ggg aac gga 465
Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn Gly
85 90 95
ctc gcg tct ccg cac tcg cag tat cac acc cct ccc gtt cct cag gtg 513
Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln Val
100 105 110
ccc cat ggt ggc agt ggt ggc ggt cag atg ggt gtc tac cct ggc atg 561
Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly Met
115 120 125
cag aat gag agg cat ggg caa tcc ttt gtg gac agc agc tcc atg tgg 609
Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met Trp
130 135 140 145
ggc ccc agg gct gtt cag gta cca gac cag ata cga gcc ccc tac cag 657
Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr Gln
150 155 160
cag cag cag cca cag ccg cag cca ccg cag ccg gct ccg tcg ggg ccc 705
Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly Pro
165 170 175
cct gca cag ggc cac cct cag cac atg cag cag atg ggc agc tat atg 753
Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr Met
180 185 190
gca cgt ggg gat ttt tcc atg cag cag cat ggt cag cca cag cag agg 801
Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln Arg
195 200 205
atg agc cag ttt tcc caa ggc caa gag ggc ctc aat cag gga aat cct 849
Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn Pro
210 215 220 225
ttt att gcc acc tca gga cct ggc cac ttg tcc cac gtg ccc cag cag 897
Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln Gln
230 235 240
agt ccc agc atg gca cct tcc ttg cgt cac tcg gtg cag cag ttc cat 945
Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe His
245 250 255
cac cac ccc tct act gct ctc cat gga gaa tcc gtt gcc cac agt ccc 993
His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser Pro
260 265 270
aga ttc tcc ccg aat cct ccc caa caa ggg gct gtt agg ccg caa acc 1041
Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln Thr
275 280 285
ctt aac ttt agt tct cgg agc cag aca gtc ccc tct cct act ata aac 1089
Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile Asn
290 295 300 305
aac tca ggg cag tat tct cga tat cct tac agt aac cta aat cag gga 1137
Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln Gly
310 315 320
tta gtt aac aat aca ggg atg aat caa aat tta ggc ctt aca aat aat 1185
Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn Asn
325 330 335
act cca atg aat cag tcc gta cca aga tac ccc aat gct gta gga ttc 1233
Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly Phe
340 345 350
cca tca aac agt ggt caa gga cta atg cac cag cag ccc atc cac ccc 1281
Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His Pro
355 360 365
agt ggc tca ctt aac caa atg aac aca caa act atg cat cct tca cag 1329
Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser Gln
370 375 380 385
cct cag gga act tat gcc tct cca cct ccc atg tca ccc atg aaa gca 1377
Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys Ala
390 395 400
atg agt aat cca gca ggc act cct cct cca caa gtc agg ccg gga agt 1425
Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly Ser
405 410 415
gct ggg ata cca atg gaa gtt ggc agt tat cca aat atg ccc cat cct 1473
Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His Pro
420 425 430
cag cca tct cac cag ccc cct ggt gcc atg gga atc gga cag agg aat 1521
Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg Asn
435 440 445
atg ggc ccc aga aac atg cag cag tct cgt cca ttt ata ggc atg tcc 1569
Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met Ser
450 455 460 465
tcg gca cca agg gaa ttg act ggg cac atg agg cca aat ggt tgt cct 1617
Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys Pro
470 475 480
ggt gtt ggc ctt gga gac cca caa gca atc cag gaa cga ctg ata cct 1665
Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile Pro
485 490 495
ggc caa caa cat cct ggt caa cag cca tct ttt cag cag ttg cca acc 1713
Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro Thr
500 505 510
tgt cct cca ctg cag cct cac ccg ggc ttg cac cac cag tct tca cct 1761
Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser Pro
515 520 525
cca cac cct cat cac cag cct tgg gca cag ctc cac cca tca ccc cag 1809
Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro Gln
530 535 540 545
aac acc ccg cag aaa gtg cct gtg cat cag cat tcc ccg tcg gag ccc 1857
Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu Pro
550 555 560
ttt cta gag aaa cca gtg ccg gat atg act cag aaa ccg aaa cag aaa 1905
Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Lys Pro Lys Gln Lys
565 570 575
cga cat aga tgt cga aac cct aat aaa ttg gat ata aac act ttg aca 1953
Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu Thr
580 585 590
gga gaa gaa agg gtg cct gtt gtc aat aaa cga aat ggg aag aag atg 2001
Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys Met
595 600 605
ggt gga gct atg gcg cct cca atg aag gat cta ccc agg tgg ctg gaa 2049
Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu Glu
610 615 620 625
gaa aat cct gaa ttt gca gtt gct cca gac tgg act gat ata gtt aag 2097
Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile Val Lys
630 635 640
cag tct ggt ttt gtt cct gag tcg atg ttt gac cgc ctt ctc act ggg 2145
Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu Leu Thr Gly
645 650 655
cct gta gtg cgg gga gag gga gcg agc aga aga gga aga agg ccc aaa 2193
Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys
660 665 670
agt gag atc gcc aga gca gcc gcg gcc gcc gct gct gtg gcc tcc acg 2241
Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Thr
675 680 685
tca ggg atc aac cct ttg ctg gtg aac agc ctg ttt gct gga atg gac 2289
Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met Asp
690 695 700 705
ctg acg agc ctt cag aat ctc cag aat ctc cag tcg ctc cag ctg gca 2337
Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala
710 715 720
ggc ctc atg ggc ttc cct cca gga ctg gca aca gct gcc acc gcc gga 2385
Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly
725 730 735
ggc gat gcg aag aac cct gct gct gtg ctg ccc ctg atg ctg cca gga 2433
Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly
740 745 750
atg gcg ggc ctg ccc aac gtg ttt ggc ttg ggc ggg ctg ttg aat aac 2481
Met Ala Gly Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn
755 760 765
cct ctg tca gct gct act gga aac acc act act gct tct agt caa gga 2529
Pro Leu Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly
770 775 780 785
gaa ccg gaa gac agc act tca aaa gga gag gag aaa gga aat gag aat 2577
Glu Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn
790 795 800
gaa gac gag aac aaa gac tct gag aaa agc aca gat gct gtt tcg gct 2625
Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser Ala
805 810 815
gct gac tct gcg aat gga tct gtt ggt gct gct act gcc ccg gct gga 2673
Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly
820 825 830
ttg ccc tca aac ccg cta gcc ttc aac cct ttc ctc ctg tcc aca atg 2721
Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr Met
835 840 845
gcc ccg ggc ctc ttc tac cca tcc atg ttt cta cct cca gga ctg ggg 2769
Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu Gly
850 855 860 865
gga ttg acg ctg cct ggg ttc cca gca ttg gca gga ctt cag aat gcc 2817
Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln Asn Ala
870 875 880
gtg ggc tcc agc gaa gaa aag gct gct gac aag gct gag gga gga ccc 2865
Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu Gly Gly Pro
885 890 895
ttt aaa gat gga gag acc ctt gaa ggc agc gat gcc gag gag agc ctg 2913
Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala Glu Glu Ser Leu
900 905 910
gat aag act gca gag tcc tcc ctc tta gaa gac gaa ata gca cag ggt 2961
Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln Gly
915 920 925
gaa gag cta gac tca ctt gat ggg ggg gat gaa ata gaa aac aat gaa 3009
Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn Glu
930 935 940 945
aat gat gaa taa ccagtaccag ttccagttca agtgtttaaa acttttgaca 3061
Asn Asp Glu
agtggtagtc ctactgttta cactcacagt taatgttcat acctagtttt ataagctgtt 3121
ctgtaacata gtgtagcaaa aaaaaaagtt caagtcatgt tatacaggtg tgtcaaaagg 3181
tatcttggtc attaagtatt gtgcagtgca ttatttatta tccctaggag agatgaaatt 3241
tgagaggtga tcatgtcttt ttaaggaaac ttacataatg ctctgctttt tttttttctc 3301
ttggtaccat tggtattata ataaagagca atttgtaact gagtggcact aatggaagaa 3361
agtgctgctc aaaggaagta tgaagttata tatttaattt tttaatttta atttttaatt 3421
tttttgctgt gaaggtcaag ctgaaattta ccatacatat catacttgct catttgtttc 3481
cctttttgac tgtatggggg ttcccacact cgtgcataca cacacatcca tacactctga 3541
caatctccac gctagtgtga acgcctctgt cccgaggcgc agcaataata aggcagctgt 3601
tgaatgtgaa gggtcccttt ggaaaattaa cctactggga gggttcttgc cagacagaac 3661
tacagttcca ttgtctcgtg gtcttgtaat gcactggtaa aaacaaaata aatagatgaa 3721
taaataaaga gtgagagaag agagaatcag gtaccttttt taaattaaag gactttgtta 3781
ctttagccac aaagctaaaa cagcattacc tcagctctaa actagccttg aagtttacag 3841
acatgacttt gtaaatgtat tgtttttctt tgttgtgatg tccttttatt tttttctttg 3901
aaaactgcta tcatgtaaga taaaatgtaa attgctgcca actgtagtaa tgatgctttt 3961
aataaaagtg acccatgata tgcagagatg taattataga atgtagtata tagggaaact 4021
ggtgttcact ctattttttt tgtattcgca atagatgcaa atacagcatt ctggcttttg 4081
tacagtttct tgatatatcc tcttatacta gattagcttt tggtaagaca ctaaactgtc 4141
tcgaagacta gacaggaagg aaaaccttga attactctca cataattcca ctccagatat 4201
ctcaacagaa atgcatacaa aaagctccta ttactccctc aaaagggcat ctgagaccga 4261
gaatacttag aaatgtgtgc agcgtgtgat aatgtggtac actgaagaac aaaagggcaa 4321
aagaaaaatg aggctttaac aggcacaata tctaggtcat ttatccttgg ttaatgggta 4381
gaaaaacaca atgcggtagt gtcagcaagg gacacaaagg cactctggtg tcctgcagac 4441
cagcgctcga tgccagaaac cagtgtgtgg aaaaacccat gtggaattga aacagaccca 4501
cttaagcacg cacgcgcgca cgcacggtct caggagctac tgatttgtgg accccttttt 4561
gacctttggt atttaaagta aaatataatt tgagatctac tgttttcacc tttttatgtc 4621
acctgaacca acacaaagcc atatttccat ccagttaaaa agcaggggaa gggatgtgga 4681
cgagagtgtt tcgtgtgtgt tgccttcctc cacacccttc ccccaggacg tccgcacaca 4741
gtccacctcc agccagtgtg ctgccagaca ggtggtctaa attcctccca gactgtgaga 4801
ttcagttcgt ttatgcccca agatgaaaat atgcccctta atgattctgg gaaagaaaca 4861
acctgaaccc tccaccttac agatcctgtg attgctttta tttatcatcg tcgttgtctg 4921
ctgaaagtga atgggccgtg cacactggag gaaagtgcct tgaagagaat attttttgaa 4981
agggaattat ttgaacacgg gaaagtgaaa ctaggtctgc atgaagtata ggaaatttaa 5041
gtatttaagt aacaaagatg ttagcaggga gaatttgctt aataaaatga gtcattaaag 5101
ggtgtttttt ttaaaaaaaa aaa 5124
<210> 4
<211> 948
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile
1 5 10 15
Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn
20 25 30
Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala
35 40 45
Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr
50 55 60
Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met
65 70 75 80
His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn
85 90 95
Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln
100 105 110
Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly
115 120 125
Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met
130 135 140
Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly
165 170 175
Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr
180 185 190
Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln
195 200 205
Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn
210 215 220
Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe
245 250 255
His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser
260 265 270
Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln
275 280 285
Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile
290 295 300
Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln
305 310 315 320
Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn
325 330 335
Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly
340 345 350
Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His
355 360 365
Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser
370 375 380
Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys
385 390 395 400
Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly
405 410 415
Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His
420 425 430
Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg
435 440 445
Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met
450 455 460
Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile
485 490 495
Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro
500 505 510
Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser
515 520 525
Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro
530 535 540
Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu
545 550 555 560
Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Lys Pro Lys Gln
565 570 575
Lys Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu
580 585 590
Thr Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys
595 600 605
Met Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu
610 615 620
Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile Val
625 630 635 640
Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu Leu Thr
645 650 655
Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly Arg Arg Pro
660 665 670
Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser
675 680 685
Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met
690 695 700
Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu
705 710 715 720
Ala Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala
725 730 735
Gly Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro
740 745 750
Gly Met Ala Gly Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn
755 760 765
Asn Pro Leu Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln
770 775 780
Gly Glu Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu
785 790 795 800
Asn Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser
805 810 815
Ala Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala
820 825 830
Gly Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr
835 840 845
Met Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu
850 855 860
Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln Asn
865 870 875 880
Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu Gly Gly
885 890 895
Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala Glu Glu Ser
900 905 910
Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln
915 920 925
Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn
930 935 940
Glu Asn Asp Glu
945
<210> 5
<211> 5465
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (514)..(5379)
<400> 5
aggcgctggc gtgctggggc cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg 60
gcggcggcgc gggggttgag tcgtggtggt gcggacgcgc tcgtgctcgg gaactatcgg 120
attaaacttg aatcgagtga aattacacaa aggagcgccg cggaggaggc ggcccgggga 180
cccggacacc ctgaaactca ccagagaccc gttcgccccc ggccaactcc gtgcccgtgg 240
attcagcccc ctggccgcag ctgccgagcc aactccggag cccgctctgc gttttgtttt 300
cccctcggca ctaggcagcg gaggagcccg accgacccgg acctatatcc agactttgcc 360
tgacactgca gggtccaaga gaattaaaga aatatggaat gacatgaaga agattagtta 420
aggattatag gctttgaggg caaacacctc agtgaagtga agcacaggca agctcctgag 480
ctgtggtttg gaggagccgt gtgttggaag aag atg gca gat cca gga atg atg 534
Met Ala Asp Pro Gly Met Met
1 5
agt ctt ttt ggc gag gat ggg aat att ttc agt gaa ggt ctt gaa ggc 582
Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly
10 15 20
ctc gga gaa tgt ggt tac ccg gaa aat cca gta aat cct atg ggt cag 630
Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn Pro Val Asn Pro Met Gly Gln
25 30 35
caa atg cca ata gac caa ggc ttt gcc tct tta cag cca tcc ctt cat 678
Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala Ser Leu Gln Pro Ser Leu His
40 45 50 55
cat cct tca act aat caa aat caa aca aag ctg aca cat ttt gat cac 726
His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr Lys Leu Thr His Phe Asp His
60 65 70
tat aat cag tat gaa caa caa aag atg cat ctg atg gat cag ccg aac 774
Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met His Leu Met Asp Gln Pro Asn
75 80 85
aga atg atg agc aac acc cct ggg aac gga ctc gcg tct ccg cac tcg 822
Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn Gly Leu Ala Ser Pro His Ser
90 95 100
cag tat cac acc cct ccc gtt cct cag gtg ccc cat ggt ggc agt ggt 870
Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln Val Pro His Gly Gly Ser Gly
105 110 115
ggc ggt cag atg ggt gtc tac cct ggc atg cag aat gag agg cat ggg 918
Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly Met Gln Asn Glu Arg His Gly
120 125 130 135
caa tcc ttt gtg gac agc agc tcc atg tgg ggc ccc agg gct gtt cag 966
Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln
140 145 150
gta cca gac cag ata cga gcc ccc tac cag cag cag cag cca cag ccg 1014
Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro
155 160 165
cag cca ccg cag ccg gct ccg tcg ggg ccc cct gca cag ggc cac cct 1062
Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly Pro Pro Ala Gln Gly His Pro
170 175 180
cag cac atg cag cag atg ggc agc tat atg gca cgt ggg gat ttt tcc 1110
Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser
185 190 195
atg cag cag cat ggt cag cca cag cag agg atg agc cag ttt tcc caa 1158
Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln
200 205 210 215
ggc caa gag ggc ctc aat cag gga aat cct ttt att gcc acc tca gga 1206
Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly
220 225 230
cct ggc cac ttg tcc cac gtg ccc cag cag agt ccc agc atg gca cct 1254
Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro
235 240 245
tcc ttg cgt cac tcg gtg cag cag ttc cat cac cac ccc tct act gct 1302
Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe His His His Pro Ser Thr Ala
250 255 260
ctc cat gga gaa tcc gtt gcc cac agt ccc aga ttc tcc ccg aat cct 1350
Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro
265 270 275
ccc caa caa ggg gct gtt agg ccg caa acc ctt aac ttt agt tct cgg 1398
Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg
280 285 290 295
agc cag aca gtc ccc tct cct act ata aac aac tca ggg cag tat tct 1446
Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser
300 305 310
cga tat cct tac agt aac cta aat cag gga tta gtt aac aat aca ggg 1494
Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly
315 320 325
atg aat caa aat tta ggc ctt aca aat aat act cca atg aat cag tcc 1542
Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser
330 335 340
gta cca aga tac ccc aat gct gta gga ttc cca tca aac agt ggt caa 1590
Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln
345 350 355
gga cta atg cac cag cag ccc atc cac ccc agt ggc tca ctt aac caa 1638
Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln
360 365 370 375
atg aac aca caa act atg cat cct tca cag cct cag gga act tat gcc 1686
Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala
380 385 390
tct cca cct ccc atg tca ccc atg aaa gca atg agt aat cca gca ggc 1734
Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly
395 400 405
act cct cct cca caa gtc agg ccg gga agt gct ggg ata cca atg gaa 1782
Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu
410 415 420
gtt ggc agt tat cca aat atg ccc cat cct cag cca tct cac cag ccc 1830
Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His Pro Gln Pro Ser His Gln Pro
425 430 435
cct ggt gcc atg gga atc gga cag agg aat atg ggc ccc aga aac atg 1878
Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg Asn Met Gly Pro Arg Asn Met
440 445 450 455
cag cag tct cgt cca ttt ata ggc atg tcc tcg gca cca agg gaa ttg 1926
Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu
460 465 470
act ggg cac atg agg cca aat ggt tgt cct ggt gtt ggc ctt gga gac 1974
Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp
475 480 485
cca caa gca atc cag gaa cga ctg ata cct ggc caa caa cat cct ggt 2022
Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile Pro Gly Gln Gln His Pro Gly
490 495 500
caa cag cca tct ttt cag cag ttg cca acc tgt cct cca ctg cag cct 2070
Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro
505 510 515
cac ccg ggc ttg cac cac cag tct tca cct cca cac cct cat cac cag 2118
His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser Pro Pro His Pro His His Gln
520 525 530 535
cct tgg gca cag ctc cac cca tca ccc cag aac acc ccg cag aaa gtg 2166
Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val
540 545 550
cct gtg cat cag cat tcc ccg tcg gag ccc ttt cta gag aaa cca gtg 2214
Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val
555 560 565
ccg gat atg act cag gtt agt gga ccg aat gct cag cta gtg aag agt 2262
Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser
570 575 580
gat gat tac ctg cca tca ata gaa cag cag cca caa caa aag aag aag 2310
Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys
585 590 595
aaa aag aaa aac aac cac att gta gca gag gat ccc agt aaa ggt ttt 2358
Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe
600 605 610 615
ggt aaa gat gac ttc cct ggt ggg gta gat aac caa gaa cta aat agg 2406
Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg
620 625 630
aac tca ctg gat ggg tcc caa gaa gaa aaa aag aaa aag aaa agg tca 2454
Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser
635 640 645
aag gca aaa aaa gac ccg aag gaa ccg aaa gaa ccc aag gag aaa aaa 2502
Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys
650 655 660
gag ccc aag gaa ccc aag acc ccg aaa gcc cct aag att ccc aaa gag 2550
Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu
665 670 675
cca aag gaa aag aaa gca aaa act gcc acg cca aaa ccc aaa tcc agc 2598
Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser
680 685 690 695
aaa aag tca agt aat aag aaa cct gac tca gaa gca agt gct ttg aag 2646
Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys
700 705 710
aaa aag gtc aac aag gga aaa aca gaa ggt tct gaa aat tca gac tta 2694
Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu
715 720 725
gac aaa aca ccc cca cca tct cct cct cct gaa gaa gat gag gac cca 2742
Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro
730 735 740
ggt gtt cag aag aga cgg tcc agc aga cag gtg aag aga aag cgc tac 2790
Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr
745 750 755
act gaa gac ctg gag ttc aag att tct gat gag gag gca gat gat gca 2838
Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala
760 765 770 775
gat gct gct ggg agg gat tcc ccc tcc aac acc tcc cag tca gaa cag 2886
Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln
780 785 790
cag gaa tct gtt gat gca gaa ggc cca gtg gta gaa aaa att atg agc 2934
Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Met Ser
795 800 805
agt cgt tca gta aaa aag cag aag gaa tct gga gag gag gta gaa att 2982
Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile
810 815 820
gag gaa ttc tat gtg aaa tac aaa aac ttc tct tat ctt cat tgt cag 3030
Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln
825 830 835
tgg gca tct ata gaa gat ctg gaa aaa gat aag aga att cag caa aaa 3078
Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys
840 845 850 855
att aaa cga ttt aag gca aag cag ggc cag aac aag ttc ctt tca gag 3126
Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu
860 865 870
att gag gat gag ctt ttt aat cca gat tat gtg gag gtt gac cgg ata 3174
Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile
875 880 885
atg gac ttt gca cgt agc aca gat gac cgg gga gag cct gtg act cac 3222
Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp Arg Gly Glu Pro Val Thr His
890 895 900
tat ctg gtg aag tgg tgt tca ctt cct tat gaa gac agc acg tgg gag 3270
Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu
905 910 915
cgg agg cag gac ata gat caa gca aag atc gag gag ttt gag aaa cta 3318
Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu
920 925 930 935
atg tcc agg gag ccg gaa aca gag cgt gtg gag cga cct cct gct gat 3366
Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp
940 945 950
gat tgg aag aaa tcg gag agt tcc agg gag tat aaa aac aat aac aaa 3414
Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys
955 960 965
ctc agg gaa tac cag ttg gag gga gta aac tgg cta ctt ttc aat tgg 3462
Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp
970 975 980
tac aac atg cga aac tgc att tta gca gat gaa atg ggt ttg gga aaa 3510
Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys
985 990 995
act atc cag tcc att aca ttt ctc tat gag ata tat ttg aaa gga 3555
Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr Glu Ile Tyr Leu Lys Gly
1000 1005 1010
atc cat ggc cct ttt tta gta att gcc cca ttg tcc aca atc ccc 3600
Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala Pro Leu Ser Thr Ile Pro
1015 1020 1025
aac tgg gaa agg gaa ttc cga acc tgg aca gag ttg aac gtg gtt 3645
Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp Thr Glu Leu Asn Val Val
1030 1035 1040
gtg tat cat ggg agt caa gct agt cgt cgg acc att cag ttg tat 3690
Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg Arg Thr Ile Gln Leu Tyr
1045 1050 1055
gaa atg tac ttc aaa gat ccc cag ggt cga gtg ata aag ggg tcc 3735
Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly Arg Val Ile Lys Gly Ser
1060 1065 1070
tat aag ttt cat gcc atc atc act aca ttt gag atg att ttg act 3780
Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr Phe Glu Met Ile Leu Thr
1075 1080 1085
gat tgt cct gag ctg cgg aat att cca tgg cgc tgt gta gtc att 3825
Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro Trp Arg Cys Val Val Ile
1090 1095 1100
gat gaa gcc cac agg ctg aag aac agg aac tgc aag ctg ttg gag 3870
Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg Asn Cys Lys Leu Leu Glu
1105 1110 1115
gga ctc aag atg atg gac ttg gaa cac aaa gtg ctg ctg acg gga 3915
Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His Lys Val Leu Leu Thr Gly
1120 1125 1130
acc cca ctc cag aac act gtg gaa gaa ctc ttc agc ttg ctt cat 3960
Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu Leu Phe Ser Leu Leu His
1135 1140 1145
ttc ttg gaa cca agt cgc ttc cct tca gaa acc aca ttt atg caa 4005
Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser Glu Thr Thr Phe Met Gln
1150 1155 1160
gaa ttt ggt gat cta aaa aca gaa gag cag gtg caa aaa ctt caa 4050
Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu Gln Val Gln Lys Leu Gln
1165 1170 1175
gct att cta aag cca atg atg ttg aga cgt ctc aaa gag gat gta 4095
Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg Arg Leu Lys Glu Asp Val
1180 1185 1190
gaa aag aac ttg gcc ccc aaa gaa gaa act att att gaa gtt gag 4140
Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu Thr Ile Ile Glu Val Glu
1195 1200 1205
cta aca aac att cag aag aaa tat tac cga gcc atc ctt gag aag 4185
Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg Ala Ile Leu Glu Lys
1210 1215 1220
aat ttc aca ttt ctt tcc aaa ggc ggt ggt caa gct aac gta cct 4230
Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly Gly Gln Ala Asn Val Pro
1225 1230 1235
aac cta tta aac act atg atg gaa ttg cgg aag tgc tgc aat cat 4275
Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu Arg Lys Cys Cys Asn His
1240 1245 1250
ccg tac ctt atc aat ggt gct gaa gag aaa att ttg gaa gag ttt 4320
Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu Lys Ile Leu Glu Glu Phe
1255 1260 1265
aaa gaa aca cac aat gca gag tct cca gat ttt cag ctc cag gca 4365
Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro Asp Phe Gln Leu Gln Ala
1270 1275 1280
atg atc cag gct gct ggc aag cta gtg ctg att gac aag ctg ctg 4410
Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val Leu Ile Asp Lys Leu Leu
1285 1290 1295
cca aaa ctg aag gct ggt ggc cac agg gtg ctt atc ttt tcc cag 4455
Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln
1300 1305 1310
atg gtg cgc tgc ttg gac ata ctg gaa gac tac ctc att caa aga 4500
Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu Asp Tyr Leu Ile Gln Arg
1315 1320 1325
cgg tac cca tat gaa agg atc gac ggc cga gta aga ggc aac ctc 4545
Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly Arg Val Arg Gly Asn Leu
1330 1335 1340
cgc cag gca gct atc gac aga ttc tcc aaa cct gat tct gat agg 4590
Arg Gln Ala Ala Ile Asp Arg Phe Ser Lys Pro Asp Ser Asp Arg
1345 1350 1355
ttt gtt ttc ctc ctg tgt aca agg gca gga ggt tta ggc att aac 4635
Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn
1360 1365 1370
ctc act gct gct gat acc tgc atc atc ttt gat tca gac tgg aat 4680
Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn
1375 1380 1385
ccc caa aat gac ctc cag gct cag gct aga tgt cat aga ata gga 4725
Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala Arg Cys His Arg Ile Gly
1390 1395 1400
cag agc aaa tct gtg aaa atc tac agg ctg att aca aga aat tcc 4770
Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg Leu Ile Thr Arg Asn Ser
1405 1410 1415
tat gaa agg gaa atg ttc gac aag gct agt ttg aaa ctg ggc ctg 4815
Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala Ser Leu Lys Leu Gly Leu
1420 1425 1430
gat aaa gct gtg cta cag tct atg agt gga aga gaa aat gct acc 4860
Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser Gly Arg Glu Asn Ala Thr
1435 1440 1445
aat ggg gta caa cag ctt tcc aag aaa gaa ata gag gat ctt cta 4905
Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu Leu
1450 1455 1460
cga aaa ggg gcc tat ggt gca ctc atg gat gag gag gat gaa ggg 4950
Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Glu Gly
1465 1470 1475
tct aaa ttc tgt gaa gaa gat att gat cag atc ctc cta cgt cga 4995
Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp Gln Ile Leu Leu Arg Arg
1480 1485 1490
acc cac acc att acc att gag tca gaa ggg aaa ggt tcc aca ttt 5040
Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu Gly Lys Gly Ser Thr Phe
1495 1500 1505
gct aag gcc agt ttt gtt gca tct gga aat agg aca gat att tcc 5085
Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Ser
1510 1515 1520
ttg gat gat cca aat ttc tgg caa aag tgg gct aag aag gct gaa 5130
Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys Trp Ala Lys Lys Ala Glu
1525 1530 1535
ttg gat att gat gcc tta aat ggg agg aac aac ctg gtt att gat 5175
Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Asn Leu Val Ile Asp
1540 1545 1550
act cca aga gtg aga aag cag acc agg ctc tac agt gca gtg aag 5220
Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg Leu Tyr Ser Ala Val Lys
1555 1560 1565
gaa gat gag ctg atg gag ttc tca gac ttg gaa agt gat tct gaa 5265
Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp Leu Glu Ser Asp Ser Glu
1570 1575 1580
gaa aag ccc tgt gca aag cca cgg cgt ccc cag gat aag tca cag 5310
Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg Pro Gln Asp Lys Ser Gln
1585 1590 1595
ggc tat gca agg agt gaa tgt ttc agg gtg gag aag aat ctg ctt 5355
Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg Val Glu Lys Asn Leu Leu
1600 1605 1610
gtc tat ggt gtg aat tgt tgc tag ttttgaccca ggatttccca 5399
Val Tyr Gly Val Asn Cys Cys
1615 1620
acgctggtac ctgacttaaa gtaaagccat aaatcaaaac tcacaggcac ctctgcatgc 5459
tggata 5465
<210> 6
<211> 1621
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile
1 5 10 15
Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn
20 25 30
Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala
35 40 45
Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr
50 55 60
Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met
65 70 75 80
His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn
85 90 95
Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln
100 105 110
Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly
115 120 125
Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met
130 135 140
Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr
145 150 155 160
Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly
165 170 175
Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr
180 185 190
Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln
195 200 205
Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn
210 215 220
Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe
245 250 255
His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser
260 265 270
Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln
275 280 285
Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile
290 295 300
Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln
305 310 315 320
Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn
325 330 335
Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly
340 345 350
Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His
355 360 365
Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser
370 375 380
Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys
385 390 395 400
Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly
405 410 415
Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His
420 425 430
Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg
435 440 445
Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met
450 455 460
Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys
465 470 475 480
Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile
485 490 495
Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro
500 505 510
Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser
515 520 525
Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro
530 535 540
Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu
545 550 555 560
Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro
565 570 575
Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln
580 585 590
Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala
595 600 605
Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val
610 615 620
Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu
625 630 635 640
Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro
645 650 655
Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys
660 665 670
Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala
675 680 685
Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp
690 695 700
Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu
705 710 715 720
Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro
725 730 735
Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg
740 745 750
Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser
755 760 765
Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser
770 775 780
Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro
785 790 795 800
Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu
805 810 815
Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn
820 825 830
Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys
835 840 845
Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly
850 855 860
Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp
865 870 875 880
Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp
885 890 895
Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro
900 905 910
Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys
915 920 925
Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg
930 935 940
Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg
945 950 955 960
Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val
965 970 975
Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala
980 985 990
Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr
995 1000 1005
Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala
1010 1015 1020
Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp
1025 1030 1035
Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg
1040 1045 1050
Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly
1055 1060 1065
Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr
1070 1075 1080
Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro
1085 1090 1095
Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg
1100 1105 1110
Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His
1115 1120 1125
Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu
1130 1135 1140
Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser
1145 1150 1155
Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu
1160 1165 1170
Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg
1175 1180 1185
Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu
1190 1195 1200
Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr
1205 1210 1215
Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly
1220 1225 1230
Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu
1235 1240 1245
Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu
1250 1255 1260
Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro
1265 1270 1275
Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val
1280 1285 1290
Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg
1295 1300 1305
Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu
1310 1315 1320
Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly
1325 1330 1335
Arg Val Arg Gly Asn Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp Arg Phe Ser
1340 1345 1350
Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala
1355 1360 1365
Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile
1370 1375 1380
Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala
1385 1390 1395
Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg
1400 1405 1410
Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala
1415 1420 1425
Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser
1430 1435 1440
Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys
1445 1450 1455
Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met
1460 1465 1470
Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp
1475 1480 1485
Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu
1490 1495 1500
Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly
1505 1510 1515
Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys
1520 1525 1530
Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg
1535 1540 1545
Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg
1550 1555 1560
Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp
1565 1570 1575
Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg
1580 1585 1590
Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg
1595 1600 1605
Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Val Asn Cys Cys
1610 1615 1620
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gaaacccaca ctgcagcaga 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
ctcagctaca aacaggtgaa gac 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
tccctggtgg taggaagagt aaa 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ttgaatgtac agagtgcgga aga 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
aacagccatc acagacgaat cc 22
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ggttcccaca ctcgtgcata 20
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tgcgcctcgg gacaga 16
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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cccatgaaag caatgagtaa tcc 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 18
tccattggta tcccagcact tc 22
<210> 19
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<212> DNA
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<223> primer
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tgatggactt ggaacacaaa gtg 23
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<212> DNA
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tgaagggaag cgacttggtt 20
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<223> primer
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caaacatggc tatgagaagt acaactc 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 22
ccgactcgtt ccagaaagca 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> primer
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<212> DNA
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<223> primer
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atgaggtcca ccaccctgtt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
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tatgactcag aaaccgaaac agaaacgaca 30
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> primer
<400> 26
gccctttcta gagaaaccag tg 22
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<212> DNA
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<223> primer
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aggcaccctt tcttctcctg 20
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<212> DNA
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cacggacgct ataaacgcca actcactg 28
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<220>
<223> primer
<400> 29
gaatctgctt gtctatggtt ggg 23
<210> 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 30
aggatggttc tgcagatggt 20
Claims (16)
- 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성(differential potential)의 예측 방법으로서,
in vitro에서 배양된, 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상인 CHD7의 발현 수준을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측하는 단계를 포함하며,
상기 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포는, 자기 증식 능력 및 모든 3배엽 계열로 분화할 수 있는 분화 가능성을 보유한 세포이며,
상기 분화 가능성은, 자발적으로, 또는 분화 자극에 반응하여, 3배엽 계열, 또는 3배엽 계열 중 해당 분화 자극에 상응하는 세포주로 분화하는 능력인,
방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
- 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법으로서,
시험 배지에서 배양된, 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상인 경우, 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 인간 만능 줄기 세포를 유지할 수 있는 것으로 평가하는 단계
를 포함하며,
상기 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포는, 자기 증식 능력 및 모든 3배엽 계열로 분화할 수 있는 분화 가능성을 보유한 세포이며,
상기 분화 가능성은, 자발적으로, 또는 분화 자극에 반응하여, 3배엽 계열, 또는 3배엽 계열 중 해당 분화 자극에 상응하는 세포주로 분화하는 능력인, 방법. - 제6항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 시험 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포이고, 여기서 상기 시험 배지는 상기 인간 만능 줄기 세포의 유지 배양에 사용될 수 있는 것인, 방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
- 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
- CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성의 예측 방법, 및/또는 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법에 사용하기 위한 시약(reagent).
- 삭제
- 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성(differential potential)의 예측 방법으로서,
in vitro에서 배양된, 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계, 및
상기 CHD7의 발현 수준이 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 수준의 2배 이상의 단백질 수준일 때, 상기 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측하는 단계를 포함하며,
상기 미분화 상태를 보유한 인간 만능 줄기 세포는, 자기 증식 능력 및 모든 3배엽 계열로 분화할 수 있는 분화 가능성을 보유한 세포이며,
상기 분화 가능성은, 자발적으로, 또는 분화 자극에 반응하여, 3배엽 계열, 또는 3배엽 계열 중 해당 분화 자극에 상응하는 세포주로 분화하는 능력인, 방법. - 제13항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 분화 내성을 나타내는 상기 인간 만능 줄기 세포가 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
- CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 제1항, 제3항, 제4항, 제13항, 및 제14항 중 어느 한 항에 기재된 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성의 예측 방법 및/또는 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법에 사용하기 위한 키트(kit).
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