KR20200015731A - 만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약 - Google Patents

만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약 Download PDF

Info

Publication number
KR20200015731A
KR20200015731A KR1020207000609A KR20207000609A KR20200015731A KR 20200015731 A KR20200015731 A KR 20200015731A KR 1020207000609 A KR1020207000609 A KR 1020207000609A KR 20207000609 A KR20207000609 A KR 20207000609A KR 20200015731 A KR20200015731 A KR 20200015731A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pro
ser
leu
glu
gly
Prior art date
Application number
KR1020207000609A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102422175B1 (ko
Inventor
신 카와마타
타카오 야마모토
치에미 타케나카
Original Assignee
고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코 filed Critical 고에키 자이단 호징 고베 이료 산교 도시 스이신 기코
Publication of KR20200015731A publication Critical patent/KR20200015731A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102422175B1 publication Critical patent/KR102422175B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

미분화 상태에 있는 동안 만능 줄기 세포의 분화 내성을 예측할 수 있는 마커, 및 상기 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 신속하게 평가하는 방법이 제공된다. 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용하여 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 유지시키는데 적합한 배양 조건을 검색하기 위한 수단이 또한 제공된다. 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용하여 만능 줄기 세포용 배지를 평가하는 방법이 추가로 제공된다.
인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하는 방법. 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 측정 방법.

Description

만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약
본 발명은 만능 줄기 세포의 분화 가능성(differentiation potentia)의 예측 방법 및 이를 위한 시약(reagent) 및 키트(kit)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법 및 이를 위한 시약 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 만능 줄기 세포의 분화 내성을 감소시키거나 제거하는 방법에 관한 것이다.
배아 줄기 세포(ESC) 및 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)는 다음 2개의 특징을 갖는 만능 줄기 세포(PSC)이다: 미분화 상태에서 증식하는 능력(자기 증식 능력) 및 분화 자극에 반응하여 3배엽(germ layer) 계열로 분화하는 가능성(분화 가능성). 그러나, 분화 가능성은 외부 분화 자극이 적용될 때까지 검증될 수 없다. PSC가 자기 증식을 중단하고 분화 개시로 전환하는 메카니즘 및 이의 일련의 과정이 PSC의 생물학을 이해하는데 매우 중요하지만, 그들은 완전히 설명되지 않았다.
이 문제는 PSC 유래 세포를 사용하는 세포 요법이 수행되어야 할 때 특히 중요하다. PSC 유래 분화 세포의 최종 생성물에 미분화된 세포의 포함은 종양 형성의 위험을 생성한다. 따라서, 분화 개시 과정을 이해하는 것이 임상적으로 매우 중요하다.
오카노 및 야마나카 등(Okano and Yamanaka et al.)의 그룹은 iPSC로부터 2차 신경구(SNS)를 유도하고, 상기 SNS에서 Nanog 유전자 발현을 지표로서 사용함으로써 종양 형성의 위험이 감소된 iPSC 유래 분화 세포를 선택하는 방법을 개시했(특허 문헌 1). 또한, 상기 그룹은 iPSC의 분화 내성은 분화 유도 조건으로 인한 특성보다 iPSC 클론의 고유 특성으로 간주하고, iPSC로부터 유도된 SNS에서 Nanog 유전자의 발현을 지표로서 사용하여 iPSC의 분화 내성을 평가하는 방법을 개시했다(특허 문헌 2).
그러나, 이러한 방법은 모두 분화 내성의 평가를 위해 iPSC를 일단 SNS로 분화시키기 위해 시간과 노력이 필요하다. PSC가 미분화 상태로 존재하는 동안 분화 내성을 예측할 수 있는 마커가 발견되면, 종양 형성의 위험이 없는 안전한 세포 요법제가 신속하고 쉽게 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 분화 마커는 아직 보고되지 않았다.
[문헌 목록]
[특허 문헌]
특허 문헌 1: PCT 국제 출원 공개 번호 제2011-530273호의 일본어 번역
특허 문헌 2: PCT 국제 출원 공개 번호 제2012-527887호의 일본어 번역
본 발명의 목적은 미분화 상태에 있는 동안 만능 줄기 세포(PSC)의 분화 내성을 예측할 수 있는 마커를 제공하고, 상기 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 신속하게 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 유지하는데 적합한 배양 조건을 검색하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 분화 내성 예측 마커의 발현을 지표로서 사용함으로써 만능 줄기 세포의 배지를 평가하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 만능 줄기 세포의 분화 내성을 감소시키거나 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
PSC는 iPSC의 경우 장기 배양 및 리프로그래밍 과정 동안 유전적 이상을 획득하면 분화에 대한 내성을 나타낸다. 유전적 이상은 최신 서열분석 기술을 사용하여 적시에 시험될 수 있으며, 세포 요법에 사용되는 PSC 및 PSC 유도체는 유전자 이상 세포를 제거하기 위해 유전자 스크리닝에 자주 적용될 수 있다. 그러나, 정상적인 핵형을 갖는 PSC도 때때로 배양 조건으로 인한 후생유전적 변형에 의해 유발된 분화 내성을 나타내고, 배아 체(EB) 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 의해 PSC의 분화 가능성을 시험함으로써 PSC의 품질을 정기적으로 확인할 필요가 있다.
PSC의 EB 형성 검정을 수행하는 과정에서, 본 발명자들은 특정 배양 조건이 ESC 및 iPSC 모두에 분화 내성을 부여한다는 것을 밝혀냈다. 즉, PSC가 시판되는 필수 8 배지(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 이하 "Es8"로서 지칭되기도 함) 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지(교쿠토 파마세큐티컬 인더스트리얼 캄파니, 리미티드(KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.), 이하 "SPM"으로서 지칭되기도 함)(참조: Takenaka et al., PLoS One 10 (6), 2015)를 사용하여 배양될 때, EB가 형성되었다. 그러나, PSC가 시판되는 ReproFF2 배지(REPROCELL, 이하 "RFF2"로서 지칭되기도 함)로 옮기고, 5회 이상 계대 배양될 때, 그것은 분화 가능성을 손실하고 더 이상 EB를 형성하지 않았다. PSC를 Es8 또는 SPM에 다시 넣고 추가로 5회 이상 계대 배양될 때, 분화 가능성이 회복되었다. 본 발명자들은 주성분 분석(이하 PCA로서 지칭되기도 함) 및 GeneChip 분석에 의한 분석에 기초하여 PSC의 분화 가능성의 가역적 변경과 관련되는 유전자 후보 중 하나로서 크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7(이하 "CHD7"로서 지칭되기도 함)을 발견했다. CHD7 유전자의 발현에 대한 Es8 및 RFF2를 이용한 PSC 배양의 효과를 조사하여 CHD7 유전자의 발현이 RFF2로 배양함으로써 현저하게 억제된 반면, CHD7 유전자는 Es8로 배양함으로써 PSC에서 중등도의 발현 수준을 나타냈다는 것을 발견했다. CHD7 mRNA가 RFF2로 배양된 PSC에 도입되고, CHD7이 상향조절되었을 때, PSC는 자발적으로 분화를 개시하였고, 미분화된 세포 유지 배양 시스템은 분화된 세포의 증식을 지지하지 않았다. 한편, CHD7 siRNA가 Es8로 배양된 PSC에 도입되고 CHD7이 하향조절되었을 때, PSC의 분화 가능성은 부분적으로 손상되었다. 즉, PSC는 CHD7 발현이 특정 상한치를 초과하지 않으면 미분화된 상태에서 증식할 수 있음이 명백해졌지만, 발현이 임계값 수준 아래로 떨어지면 PSC는 더 이상 분화 자극에 반응하지 않으며, 상한치와 임계값 사이에 CHD7 발현 범위를 갖는 PSC는 분화 자극에 반응할 수 있는 특성을 유지한다. 상기 결과로부터, 본 발명자들은 PSC의 분화 가능성/분화 내성이 미분화 상태의 PSC에서의 CHD7의 발현 수준을 지표로서 사용하여 예측될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다.
[1] 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성의 예측 방법.
[2] [1]에 있어서, 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상의 상기 CHD7의 발현 수준을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
[3] [2]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
[4] [2] 또는 [3]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
[6] 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법.
[7] [6]에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 시험 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
[8] [6] 또는 [7]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상일 때, 상기 시험 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 인간 만능 줄기 세포를 유지할 수 있는 것으로 평가되는, 방법.
[9] [8]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
[10] [6] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
[11] CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하고/하거나 인간 만능 줄기 세포용 배지를 평가하기 위한 시약 또는 키트.
[12] CHD7을 코딩하는 핵산을 포함하는 인간 만능 줄기 세포의 분화 유도제.
[13] [1]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 수준의 2배 이상인 단백질 수준인 경우 상기 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
[14] [13]에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
[15] [13] 또는 [14]에 있어서, 분화 내성을 나타내는 상기 인간 만능 줄기 세포가 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
본 발명에 따라서, 인간 만능 줄기 세포(PSC)가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 분화 자극을 적용하기 전에 미분화 상태에서 예측될 수 있다. 또한, 인간 만능 줄기 세포를 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 특성을 보유하는 상태로 유지하는데 적합한 배양 조건이 발견될 수 있다. 또한, 인간 만능 줄기 세포의 배양에 적합한 배지는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 또한, 분화 내성은 인간 만능 줄기 세포, 특히 iPSC 집단에서 CHD7의 발현 수준을 상승시킴으로써(고발현 세포를 선택함으로써) 감소되거나 제거될 수 있다.
도 1은 배양 조건에 따라 변경된 PSC의 분화 가능성을 도시한다. 단일 세포 현탁액 중의 KhES-1 세포를 rhVitronectin-N(써모 피셔 사이언티픽, 이하 "VNT-N"으로 지칭되기도 함)으로 코팅된 접시에 시딩하고, 필수 8 배지(이하, "Es8"로서 지칭되기도 함)로 5회 계대 배양했다(상부 왼쪽 사진). 이어서, 세포를 배아 체(EB) 형성을 위해 수집하거나(하부 왼쪽 사진) ReproFF2 배지(RFF2)로 옮겼다(상부 중앙 사진). KhES-1 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 중앙 사진), Es8 다시 옮겼다(상부 오른쪽 사진). KhES-1 세포를 5회 계대 배양 하고, EB 형성 검정을 수행했다(하부 오른쪽 사진). 배양 1일째에 Es8 또는 RFF2 배지를 사용하는 KhES-1 배양 사진(상부) 및 14일째 EB의 사진(하부)이 도시된다. 상기한 배양 조건하에 세포의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정되고, 사진 아래에 제시되었다(스케일 바: 1.0mm).
도 2는 배양 조건에 따라 변경된 iPSC의 EB 형성 가능성을 도시한다. 단일 세포 현탁액 중의 iPSC(PFX# 9)를 VNT-N으로 코팅된 접시에 시딩하고, Es8로 5회 계대 배양하였다(상부 왼쪽 사진). 이어서, 세포를 EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 왼쪽 사진), ReproFF2 배지(RFF2)로 옮겼다(상부 중앙 사진). PFX# 9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 위해 수집하거나(하부 중앙 사진), Es8로 다시 옮겼다(상부 오른쪽 사진). PFX#9 세포를 5회 계대 배양하고, EB 형성 검정을 수행했다(하부 오른쪽 사진). 배양 1일째에 Es8 또는 RFF2 배지를 사용하여 PFX#9 배양 사진(상부) 및 EB 형성 검정에서 14일째 EB의 사진(하부)을 나타낸다. 상기한 배양 조건하에 세포의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정되고, 사진 아래에 제시되었다(스케일 바: 1.0mm).
도 3은 다양한 조건하에 배양된 PSC의 메틸화의 비교를 도시한다. A. 세포의 메틸화 상태는 Illumina 인간 메틸화 비드 칩에 의해 결정되었다. RFF2로 배양된 6개의 PSC 샘플(iPSC(PFX#9)의 3개 샘플 및 ESC(KhES-1, H9)의 3개 샘플)의 평균 메틸화 점수가 도시되어 있다. 점수는 SPM 또는 Es8을 사용하여 6개의 PSC 샘플(SPM로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, SPM으로 배양된 KhES-1의 1개 샘플, SPM으로 배양된 H9의 1개 샘플, Es8로 배양된 PFX#9의 1개 샘플, Es8로 배양된 H9의 2개 샘플)의 평균을 비교하여 결정했다. RFF2 또는 SPM 및 Es8로 배양함으로써 0.2를 초과하는 메틸화 점수를 나타내는 프로모터 영역의 유전자 또는 모든 영역의 유전자 수는 벤 다이어그램(Venn diagram)으로 도시되어 있다. B. RFF2, SPM 또는 Es8로 배양된 PSC의 프로모터 영역에서 메틸화 패턴의 클러스터링을 도시한다. 레인 #1-3: RFF2 배지로 배양된 iPSC(PFX#9)의 결과, 레인 #4-6: 6개의 독립적인 실험으로부터 RFF2로 배양된 ESC(KhES-1)의 결과, 레인 #7: SPM을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #8: SPM을 이용한 KhES-1 세포의 결과, 레인 #9: SPM을 이용한 H9 ESC의 결과, 레인 #10: Es8을 이용한 PFX#9 세포의 결과, 레인 #11, 12: 6개의 독립적인 실험으로부터 Es8을 이용한 H9의 결과.
도 4는 qRT-PCR에 의해 결정된 Es8(P5 및 P15) 또는 RFF2 배지(P9 및 P18)로 배양된 KhES-1에서 CHD7 및 자기 성장 인자 POU5F1, SOX2, NANOG 및 EP300의 유전자 발현을 도시한다. 상대적인 양은 Es8을 1로서 사용하여 P5에서 발현 수준을 갖는 막대 그래프로 나타낸다. (P)의 계대 수를 막대에 첨가했다.
도 5는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 mRNA 전사체의 개략도를 도시한다. A. 기능 도메인을 갖는 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4 및 PCR 프라이머 세트의 위치가 도시되어 있다. B. CHD7의 기능을 평가하기 위해 사용된 CHD7 mRNA 전사체(아이소폼 2), 우성 음성 전사체 및 siRNA의 표적 도메인이 도시되어 있다.
도 6은 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 CHD7 아이소폼을 도시한다. Es8(P11) 또는 RFF2(P21)로 배양된 KhES-1 세포로부터의 전체 세포 용해물(5.3μg)이 각 레인에 적용되었다. 인간 CHD7에 대한 항체를 사용하여 CHD7 아이소폼 1(예상된 질량 336kDa), 아이소폼 2(110kDa) 및 아이소폼 X4(183kDa)를 검출했다. 신호는 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 가시화되었다.
도 7은 siCHD7 형질감염에 의한 CHD7의 하향 조절을 도시한다. A. EB 형성 및 siCHD7 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 2 × 105 KhES-1 세포를 rhVitronectin-N(재조합 인간 비토로넥틴-N)(이하 "VTN-N"으로서 지칭되기도 함)으로 코팅된 6-웰 접시에 시딩하고, -1일째에 Es8로 배양하였다. 세포를 CHD7에 대한 작은 이중 가닥 간섭성 RNA(siCHD7) 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)(0일)로 형질감염시켰다. siRNA의 형질감염으로부터 24시간 후, 세포를 저부착 플레이트로 옮기고, ROCK(Rho-관련 단백질 키나제) 억제제(RI)가 보충된 필수 6(Es6)으로 24 시간 동안 배양했다. 배지를 신선한 Es6 배지로 교환하고, 세포를 72시간 동안 추가로 배양했다. B. CHD7 유전자 발현 수준에 대한 siCHD7 도입량의 의존성이 도시되어 있다. C. siRNA 도입 후 CHD7 유전자 발현 수준이 도시되어 있다. CHD7 또는 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 또는 웨스턴 블롯팅(2일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 8은 4일, 5일 및 14일째에 형질감염되지 않은 EB(상부 패널), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널), 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널)를 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 구체화된 조건하에 KhES-1 세포의 유전자 발현 프로파일은 상응하는 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1.0mm). 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 9는 CHD7의 하향조절이 영양소 고갈된 배지로 배양된 ESC의 생존을 지지한다는 것을 도시한다. A. 영양소 고갈된 Es8에 의한 분화 유도 및 siCHD7의 형질감염에 대한 프로토콜의 예시. 0일째에, 세포를 배지(Es8) 교환 후 siCHD7 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 2일 마다 교환했다(2 및 4일). 세포 계수 및 qRT-PCR에 의한 유전자 발현의 결정을 위해, 세포를 siRNA의 형질감염 후 42시간(2일), 72시간 및 96시간에 채취했다. 정상적인 배양의 경우, ESC를 Es8로 배양하였다. 배지를 매일 교환하고, 계대를 3일 마다 수행하여 미분화 상태를 유지했다. B. 0일째, 1일째, 2일째, 3일째 및 4일째에 siCHD7 또는 대조군 siRNA (모의)로 형질감염된 KhES-1 세포 또는 형질감염되지 않은 세포에서 CHD7의 유전자 발현이 도시되어 있다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 qRT-PCR로 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다. C. 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(형질감염되지 않음), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(siCHD7) 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 수를 플롯팅하는 선 그래프가 도시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 10은 각각 2일째, 3일째 및 4일째 형질감염되지 않은 정기적으로 배양된 KhES-1 세포(상부 패널, 배지는 매일 교환됨), siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널, 배지는 2일 마다 교환됨) 및 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의)(하부 패널, 배지는 2일 마다 교환됨)의 사진을 도시한다. KhES-1의 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 유전자 발현 프로파일이 각 사진 아래에 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 11은 CHD7 아이소폼 2의 상향조절이 RFF2로 배양된 ESC에서 '자발적' 분화를 유도한다는 것을 도시한다. A. 세포 배양 및 mCHD7에 의한 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. 0일째 및 1일째에 KhES-1 세포를 mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)로 형질감염시켰다(총 2회). 2일째에 세포를 계대하고, 6-웰 플레이트에 2 × 105 세포/웰로 재시딩하고, 24시간 동안 추가로 배양했다. B. mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)(0일) 및 CHD7의 도입 후 CHD7의 유전자 발현은 qRT-PCR(시간 경과 샘플링, 왼쪽) 및 웨스턴 블롯팅(3일째 샘플링, 오른쪽)에 의해 결정되었다. CHD7의 유전자 발현은 RFF2 배지(NT: 형질감염되지 않은 대조군)로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 형질감염되거나 형질감염되지 않은 KhES-1 세포의 증식을 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 모의-형질감염된 KhES-1 세포(모의)의 증식은 형질감염되지 않은 대조군(형질감염되지 않음)의 것에 필적한다. 한편, mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(mCHD7)의 증식은 2일째 및 3일째에 감소되었다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 도시되어 있다.
도 12는 RFF2 배지로 배양된 각각 1일째, 2일째 및 3일째 형질감염되지 않은KhES-1 세포(상부 패널), mCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 및 대조군 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포(하부 패널, 모의)의 사진을 도시한다. qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정된 그들의 유전자 발현 프로파일은 사진 아래에 제시되어 있다. 3개의 독립적인 실험으로부터 수득된 대표적인 데이터세트가 제시되어 있다(스케일 바: 1mm).
도 13은 CHD7 우성 음성(DN) mRNA 전사체의 형질감염이 ESC에서 분화 가능성 및 세포 증식을 억제하거나 감소시킨다는 것을 도시한다. A. CHD7 DN mRNA 전사체의 형질감염 및 EB 형성 검정을 위한 프로토콜의 예시가 제시된다. CHD7 DN1은 크로모도메인 mRNA의 전사체이고, CHD7 DN2는 SANT-SLIDE 도메인 mRNA의 전사체이다(도 5b). 0일째에, 전사체를 KhES-1 세포로 형질감염시키고, 세포를 24시간 후에 저부착 플레이트로 옮긴 후 ROCK 억제제(RI)를 함유하는 Es6 배지와 함께 EB 형성을 위해 24시간 동안 배양했다. DN mRNA의 형질감염 후 3일째에 EB의 현미경 관찰 및 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의한 유전자 발현 프로파일의 분석을 수행했다. B. qRT-PCR에 의해 결정된 CHD7 DN1 및 CHD7 DN2 발현 수준을 나타내는 그래프. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포, CHD7 DN1-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포, CHD7 DN1- 및 CHD7 DN2-형질감염된 KhES-1 세포 및 모의 mRNA-형질감염된 KhES-1 세포로부터 유래된 EB의 사진.
도 14는 CHD7를 과발현하는 ESC가 Es8을 사용하는 배양에서 생성될 수 없었음을 도시한다. A. 세포 배양 및 CHD7 아이소폼 2의 형질감염을 위한 프로토콜이 제시되어 있다. B. 1일째 및 2일째 CHD7 발현은 qRT-PCR로 평가했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화했다. C. 1일째 및 2일째에, 형질감염되지 않은 KhES-1 세포 및 CHD7- 또는 모의-형질감염된 KhES-1 세포의 수와 상태를 나타내는 사진. 하나의 웰 중 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다.
도 15는 CHD7의 하향조절이 Es8로 배양된 ESC의 증식을 방해한다는 것을 도시한다. A. siCHD7 형질감염을 위한 프로토콜이 도시되어 있다. KhES-1 세포를 0일째 및 1일째에 siCHD7 또는 비특이적 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시켰다. 배지는 매일 교환했다(MC). 0 내지 3일째에, 세포를 세포 계수를 위해 채취하고, CHD7 발현은 qRT-PCR에 의해 결정했다. B. siCHD7- 또는 대조군 siRNA(모의)-형질감염된 KhES-1 세포, 및 형질감염되지 않은 KhES-1 세포에서 CHD7 유전자 발현은 qRT-PCR로 결정했다. CHD7의 유전자 발현은 Es8로 배양된 KhES-1 세포에서 독립적으로 3회 측정된 CHD7 발현의 평균에 의해 정규화되었다. C. 3일째에 형질감염되지 않은 KhES-1 세포(상부 패널) 및 siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포(중앙 패널) 또는 대조군 siRNA-형질감염된 KhES-1 세포(모의, 하부 패널) KhES-1 세포의 사진이 도시되어 있다. 세포 수는 사진의 상부 오른쪽 코너에 제시되어 있다. D. 세포 수를 나타내는 그래프.
도 16은 GeneChip 데이터를 기반으로 하는 인간 CHD7의 유전자 발현 프로파일을 도시하고, CHD7 수준이 PSC의 분화 가능성을 매개한다는 것을 도시한다. 3가지 상이한 샘플의 초기 배아 발생 동안(이식전 배아) 평균 인간 CHD7 발현은 다양한 조건에서 배양된 인간 PSC(피더 상 또는 피더 부재 인간 PSC)의 인간 CHD7의 발현 및 14일째 EB(14일의 EB)의 인간 CHD7의 발현과 비교했다. 모든 샘플은 MAS5 방법에 의해 정규화되었다.
도 17은 EB 형성 전 PSC의 CHD7의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. ESC(H9, KhES-1) 또는 iPSC(PFX#9, 201B7, SHh#2)를 피더 세포 상에서 hPSC 배지를 사용하여 배양하거나, 시딩하고, VTN-N 상에서 Es8을 사용하여 단일 세포에서 배양했다(이후, "단일-세포 현탁 방법"으로서 지칭되기도 함). EB 형성 전 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(N: VTN-N 코팅된 접시).
도 18은 더 적은 CHD7 mRNA의 카피 수를 갖는 iPSC의 CHD7 mRNA의 카피 수 및 14일째 EB의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. 201B7 또는 PFX#9 세포를 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양했다. CHD7 mRNA의 카피 수는 과성장 상태를 고의로 생성시킴으로써 감소시켰다. 사용된 배지는 Es8이었다. EB 형성 전 CHD7 mRNA의 카피 수는 디지털 PCR로 검출되었다. 14일째에 각각의 세포로부터 유래된 EB의 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 스코어카드 패널에 의해 결정하여 막대 그래프로 나타냈다(P: 계대 수).
도 19는 다양한 배양 조건하에서 배양된 PSC에서 CDH7 단백질의 발현 수준을 도시한다. P1은 Es8로 17회 계대 배양된 H9이고, P2는 Es8로 10회 계대 배양된 KhES-1이고, N은 RFF2로 11회 계대 배양된 KhES-1이다. N2(음성 대조군)는 RFF2로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물이다. 모든 세포를 VTN-N으로 코팅된 접시에서 단일 세포에서 피더 세포 없이 배양한 다음, 용해물을 1000단위/mL로서 표준(Es8로 17회 계대 배양된 H9 세포의 농축된 용해물)으로 제조하고, 1차 항체 및 2차 항체의 농도를 교체하고, 상대적 값은 막대 그래프로 나타냈다.
도 20은 단백질 농도 및 mRNA 카피 수로부터 결정된 점근선이다.
본 발명은 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포(hPSC)의 분화 가능성의 예측 방법(이하, "본 발명의 예측 방법"으로서 지칭되기도 함)을 제공한다.
　본 명세서에서, 만능 줄기 세포의 "분화 가능성(differentiation potentia)"은 만능 줄기 세포가 자발적으로 또는 특정 분화 자극에 반응하여 3배엽 계열 또는 특정 세포주로 분화될 가능성을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 분화 자극에 반응하여 특정의 특별한 분화 자극에 상응하는 세포주로 분화될 가능성을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 예측되고, 선택된다. 이러한 분화 자극은 그것이 미분화 상태로부터 PSC의 방출 및 임의의 분화 세포로의 이의 유도를 일으키는 자극이고, 분화 방향이 공지되어 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 아래 언급된 실시예 등에서 EB 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 사용되는 배양 조건이 언급될 수 있다.
본 명세서에서, 특별히 언급되지 않는 한, "CHD7의 발현 수준"은 CHD7 유전자의 임의의 발현 수준 및 CHD 단백질의 발현 수준을 의미할 수 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 미분화 상태에서 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준이 상한치를 갖지만 하한치는 갖지 않고, 상한치가 배양 조건에 따라 변한다는 발견에 기초한다. hPSC의 CHD7의 발현 수준이 상한치를 초과하면 hPSC는 PSC의 유지 배지에서도 자발적으로 분화를 개시하고, 배양 시스템은 분화된 세포의 증식을 더 이상 지지할 수 없다. 한편, hPSC의 CHD7의 발현 수준이 임계값 미만일 때, hPSC는 분화 자극에 반응하여 충분한 분화 가능성을 나타낼 수 없고, 미분화된 상태로 유지된다. 따라서, hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내기 위해서는, CHD7의 발현 수준이 PSC에서 중등도(즉, 상기 상한치 이하, 상기 임계 값 이상)인 것이 필요하다.
상기한 바와 같이, 미분화 상태로 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준의 상한치는 배양 조건에 따라 변하는 것으로 간주된다. CHD7의 발현 수준이 각 배양 조건하에서 상한치를 초과하면, hPSC는 자발적으로 분화를 개시하고, 이러한 배양 조건하에서 PSC의 유지 및 증식은 불가능해진다. hPSC가 자발적으로 분화하지 않으면, 그것은 발현 수준이 배양 조건하에서 상한치를 초과하지 않았음을 의미한다. 따라서, 다양한 배양 조건하에서 미분화 상태로 hPSC를 유지하는데 필요한 CHD7 발현 수준의 상한치를 설정할 필요는 없다.
한편, 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값이, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 이는 제한 없이, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양될 때, 이는 제한 없이, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 이것은 제한 없이, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양될 때, 그것은 제한 없이, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양될 때, 그것은 제한 없이, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도과 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 측정과 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
예를 들어, 임계 값은 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값의 예는 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 및 10배 이상을 포함한다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기한 경우와 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
　CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
본 발명의 예측 방법에서, 분화 가능성이 예측 가능한 인간 만능 줄기 세포는 미분화 상태를 유지하면서 증식할 수 있는 "자기-증식 능력" 및 모든 3배엽 계열로 분화될 수 있는 "분화 가능성"을 갖는 미분화 세포이면 특별히 제한되지 않는다. 이의 예는 배아 줄기 세포(ES 세포), 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포), 원시 생식 세포로부터 유래되는 배아 생식(EG) 세포, 고환 조직으로부터 GS 세포의 확립 및 배양 과정에서 단리된 만능 생식계 줄기(mGS) 세포 등을 들 수 있다. ES 세포는 핵 재프로그래밍에 의해 체세포로부터 생성된 ES 세포(nt ES 세포)일 수 있다. ES 세포 또는 iPS 세포가 바람직하다. 본 발명의 예측 방법은 인간 만능 줄기 세포에서 특히 바람직하게 사용되고, 만능 줄기 세포가 확립되었거나 확립될 수 있는 임의의 포유동물에 적용 가능하다. 비-인간 포유동물로서, 예를 들어, 마우스, 원숭이, 돼지, 랫트, 개 등이 언급될 수 있다.
만능 줄기 세포는 자체 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포의 경우, 문헌[참조: WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203, R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74, Han J, et al.(2010), Nature. 463:1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9 등]에 기재된 방법이 언급될 수 있다.
　ES 세포는 표적 동물의 수정란의 낭포로부터 내부 세포 괴상을 제거하고, 내부 세포 괴상을 섬유아세포 피더 세포에서 배양함으로써 확립될 수 있다. 또한, 세포는 백혈병 억제 인자(LIF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 등과 같은 물질이 첨가된 배양 배지를 사용하는 계대 배양에 의해 유지될 수 있다. 인간 및 원숭이 ES 세포의 확립 및 유지 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제5,843,780호; Thomson J A, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92:7844-7848; Thomson J A, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485 등]에 기재되어 있다. 인간 ES 세포주에 관하여, 예를 들어, WA01(H1) 및 WA09(H9)는 위셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute)로부터 이용 가능하고, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 프론티아 의료 과학 연구소(Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University)(일본 교토)로부터 이용 가능하다.
　EG 세포는 LIF, bFGF, 줄기 세포 인자 등과 같은 물질의 존재하에서 원시 생식 세포를 배양함으로써 확립될 수 있다(참조: Y. Matsui et al. (1992), Cell 70:841-847; J. L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551).
　nt ES 세포의 생산을 위해, 핵 이식 기술(참조: J. B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646) 및 ES 세포 생산 기술(상기 언급됨)의 조합이 사용된다(참조: Kiyoka Wakayama et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Suppl.), pp. 47-52). 핵 이식에서, 재프로그래밍은 체세포의 핵을 포유동물의 제핵 미수정란에 주입하고, 몇 시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
mGS 세포는 WO 2005/100548에 기재된 방법에 따라 고환 세포로부터 생성될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 생성된 PSC, 바람직하게는 hPSC는 바람직하게는 CHD7의 발현 수준의 측정 전에 PSC를 유지하고 배양하는 단계를 함유할 수 있다. 배양은 현탁 배양 또는 코팅된 배양 접시를 사용하는 접착 배양일 수 있다. 이 단계에서, 접착 배양이 바람직하게 사용된다. PSC는, 예를 들어, 물리적으로 해리될 수 있거나 프로테아제 활성 및 콜라게나제 활성을 갖는 해리 용액(예: 아큐타제(Accutase)(TM) 및 아큐맥스(Accumax)(TM) 등) 또는 콜라게나제 활성만을 갖는 해리 용액, 또는 트립신/EDTA를 사용하여 해리될 수 있다. 바람직하게는, 트립신/EDTA를 사용하여 세포를 해리하는 방법이 사용된다.
PSC를 분리할 경우, 배지에 Rho-관련 단백질 키나제(ROCK) 억제제를 함유하는 것이 바람직하다. ROCK 억제제는 ROCK의 기능을 억제할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, Y-27632가 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있다. 배지 중 Y-27632의 농도는 특별히 제한되지 않고, 바람직하게는 1μM 내지 50μM, 예를 들어, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM, 5μM, 6μM, 7μM, 8μM, 9μM, 10μM, 11μM, 12μM, 13μM, 14μM, 15μM, 16μM, 17μM, 18μM, 19μM, 20μM, 25μM, 30μM, 35μM, 40μM, 45μM, 50μM이지만, 이들에 한정되지 않는다.
ROCK 억제제가 배지에 첨가되는 기간은 PSC를 배양하는 단계에서의 배양 기간, 또는 단일 분산시 세포 사멸을 억제하는 임의의 기간, 예를 들어, 적어도 1일일 수 있다.
본 명세서에서, 현탁 배양은 세포를 배양 접시에서 비접착 상태로 배양함으로써 배아 체를 형성하고, 특별히 제한되지 않는다. 그것은 세포에 대한 접착성을 향상시키기 위한 인공 처리(예: 세포외 기질 등으로의 코팅 처리)가 없는 배양 접시 또는 접착을 억제하기 위해 인공 처리(예: 폴리하이드록시에틸메타크릴산(폴리-HEMA)에 의한 코팅 처리)한 배양 접시를 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 접착 배양은 피더 세포에서 배양하거나 세포외 기질로 코팅 처리된 배양 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 코팅 처리는 세포외 기질을 함유하는 용액을 배양 용기에 넣은 후 그 용액을 적절히 제거함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 피더 세포(feeder cell)는 보조 역할을 하며, 표적 세포의 배양 조건을 조정하는데 사용되는 다른 세포를 의미한다. 본 발명에서, 세포외 기질은 세포 외부에 존재하는 초분자 구조이며, 자연적으로 유래되거나 인공물(재조합체)일 수 있다. 비토로넥틴, 콜라겐, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알루론산, 테나신, 엔탁틴, 엘라스틴, 피브릴린, 라미닌 및 이들의 단편과 같은 물질을 들 수 있고, 비트로넥틴 또는 이의 단편이 바람직하다.
상기한 바와 같이 생산된 PSC, 바람직하게는 hPSC는, 예를 들어, 세포외 기질로 코팅된 배양 용기를 사용하는 접착 배양에 의해 유지될 수 있다. PSC를 배양하는 단계에 사용되는 배양 배지는 기초 배지로서 동물 세포를 배양하는데 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기초 배지의 예는 IMDM 배지, 배지 199, 이글 최소 필수 배지(EMEM), αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 햄 F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지 및 이들의 혼합 배지 등을 포함한다. 시판되는 PSC 유지 배지로서, 예를 들어, 상기한 필수 8 배지(Es8, 써모 피셔 사이언티픽), SPM (Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지, 교쿠토 파마슈티칼 인더스트리얼 캄파니, 리미티드), ReproFF2 배지(RFF2, 리프로셀(REPROCELL)), StemPro34(인비트로겐(invitrogen)), RPMI-기반 배지, mTeSR1(스템셀 테크롤로지스(STEMCELL Technologies)) 등이 또한 사용될 수 있다. 본 단계에서, Es8, SPM 등은 바람직하게는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 PSC 클론을 예측하고 선택하기 위한 유지 배지로서 사용된다. RFF2 배지와 같은 PSC에 분화 내성을 부여하는 배지에서 배양될 때, PSC는 분화 자극에 반응하여 분화하는 능력을 손실한다. 그러나, 이러한 분화 내성은 PSC 클론의 고유 특성이 아니며, 분화 가능성은 때때로 배양 조건을 변화시킴으로써 가역적으로 회복될 수 있다. 따라서, PSC 클론의 품질을 검증할 때(분화 내성이 큰론의 고유 특성이거나 배양 조건에 따라 가역적인지에 관계없이), Es8, SPM 등과 같은 본 발명에서 PSC의 분화 가능성을 유지하는 것으로 확인된 배지로 PSC를 배양하는 것이 효율적이다. 배지는 혈청을 함유할 수 있거나 무혈청일 수 있다. 필요한 경우, 분화 가능성이 영향을 받지 않는 한, 배지는 하나 이상의 혈청 대체물, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 녹아웃 혈청 대체물(KSR)(ES 세포 배양 동안 FBS를 위한 혈청 대체물), N2 보충제(인비트로겐), B27 보충제(인비트로겐), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올(2 ME), 티올글리셀롤 등을 함유할 수 있고, 또한 하나 이상의 물질, 예를 들어, 지질, 아미노산, L-글루타민, 글루타맥스(인비트로겐), 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 산화방지제, 피루브산, 완충제, 무기 염 등을 함유할 수 있다.
PSC를 배양하는 단계에서, PSC는 단일 세포에서 배양될 수 있다. 예를 들어, PSC는 피펫팅, 트립신 처리 등에 의해 단일 세포로 제조되고("단일 세포 현탁액"으로서 지칭되기도 함), VTN-N으로 코팅된 접시에 시딩되고, 피더 세포 없이 배양되고, 이에 의해 PSC는 단일 세포에서 배양될 수 있다. PSC를 배양하는 단계에서, PSC는 소세포 덩어리로 배양될 수 있다. 예를 들어, PSC는 피더 세포에서 PSC를 배양함으로써 소세포 덩어리로 배양될 수 있다("소세포 덩어리 방법"으로서 지칭되기도 함).
PSC를 배양하는 단계에서, 배양 온도는 다음으로 제한되지 않고, 예를 들어, 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, 배양은 CO2 함유 공기 대기하에서 수행된다. CO2 농도는 약 2 내지 10%, 바람직하게는 5%이다.
PSC를 배양하는 단계에서, 배양 기간 동안 배지를 교환할 수 있다. 배지 교환에 사용되는 배지는 배지 교환 전의 배지와 같은 성분을 갖는 배지 또는 다른 성분을 갖는 배지일 수 있다. 바람직하게는, 동일한 성분을 갖는 배지가 사용된다. 배지 교환 시기는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 신선한 배지로 배양을 시작한 후 매일, 2일 마다, 3일 마다, 4일 마다 또는 5일 마다 수행될 수 있다. 이 단계에서, 배지 교환은 바람직하게는 매일 수행된다.
hPSC의 CHD7의 발현 수준 측정은 자체로 공지된 임의의 RNA 또는 단백질 측정 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, CHD7의 발현을 RNA 수준에서 측정하는 경우, 노던 하이브리드화, RT-PCR, 디지털 PCR 등은 엄격한 조건하에 CHD7 mRNA와 하이브리드화될 수 있는 핵산(프로브) 또는 mRNA의 일부 또는 전부를 증폭시키는 프라이머로서 기능할 수 있는 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 수행될 수 있다. 프로브로서 사용되는 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있다. 바람직하게는, DNA가 사용된다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 이중 가닥의 경우에, 그것은 이중 가닥 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 DNA:RNA 하이브리드일 수 있다. 핵산의 길이는 그것이 표적 mRNA와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 약 15개 이상 염기, 바람직하게는 약 20개 이상 염기이다. 핵산은 바람직하게는 표지제로 표지화되어 표적 mRNA의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 표지제로서, 예를 들어, 방사성 동위 원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질 등이 사용된다. 방사성 동위 원소로서, 예를 들어, [32P], [3H], [14C] 등이 사용된다. 효소로서, 비활성이 큰 안정한 효소가 바람직하다. 예를 들어, β-갈락토시다제, β-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제, 말레이트 데하이드로게나제 등이 사용된다. 형광 물질로서, 예를 들어, 플루오레스카민, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등이 사용된다. 발광 물질로서, 예를 들어, 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용된다. 또한, 비오틴-(스트렙트)아비딘이 프로브 및 표지제의 결합에 사용될 수도 있다.
프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 세트는 그것이 CHD7을 코딩하는 mRNA의 염기 서열(센스 가닥) 및 이에 상보적인 염기 서열(안티센스 가닥) 각각에 특이적으로 어닐링될 수 있고, 그들 사이에 샌드위치된 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 각각 약 15 내지 약 100개 염기, 바람직하게는 약 15 내지 50개 염기의 길이를 갖고, 약 100bp 내지 수 kbp의 DNA 단편을 증폭시키도록 설계된 올리고뉴클레오티드의 세트가 언급될 수 있다. 특히, CHD7L(염기 서열은 서열번호 1에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다)로서 지칭되기도 하는 CHD7 아이소폼 1의 mRNA(NCBI 데이터베이스(GenBank 수탁번호 NM_017780.3)를 특이적으로 증폭시킬 수 있고, CHD7 아이소폼 1의 아미노산 672 내지 2620을 코딩하는 mRNA의 염기 서열 및 이에 상보적인 염기 서열로 어닐링할 수 있는 프라이머 세트가 바람직하게 사용될 수 있다.
미량의 RNA 샘플을 사용하여 CHD7의 유전자 발현을 정량적으로 분석하기 위해, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR 또는 디지털 PCR 분석을 사용하는 것이 바람직하다. 경쟁적 RT-PCR이 사용되는 경우, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되고 표적 DNA와 구별될 수 있는 증폭 생성물(예: 표적 DNA와 상이한 크기를 갖는 증폭 생성물, 제한 효소 처리에 의해 상이한 이동 패턴을 나타내는 증폭 생성물 등)을 제공하는 핵산이 프라이머 세트 이외에 추가로 함유될 수 있다. 경쟁자 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. DNA의 경우에, PCR은 RNA 샘플로부터 역전사 반응으로 cDNA를 합성한 후 경쟁자를 첨가하여 수행될 수 있다. RNA의 경우에, RT-PCR은 처음부터 RNA 샘플에 경장자를 첨가하여 수행될 수 있다. 후자의 경우에, 역전사 반응의 효율도 고려되고, 따라서 원래 mRNA의 절대량이 추정될 수 있다.
한편, 실시간 RT-PCR이 PCR 증폭량을 실시간으로 모니터링할 수 있기 때문에, 전기영동은 필요하지 않고, CHD7 유전자 발현은 보다 신속하게 분석될 수 있다. 일반적으로, 모니터링은 다양한 형광 시약을 사용하여 수행된다. 이들 중에는 이중 가닥 DNA(삽입제), 예를 들어, SYBR Green I, 브롬화에티듐 등에 상기 프로브(핵산이 증폭 영역에서 표적 핵산으로 혼성화한다는 것을 유의함)로서 사용될 수 있고, 형광 물질(예: FAM, HEX, TET, FITC 등) 및 급냉 물질(예: TAMRA, DABCYL 등) 등으로 변형된 양 말단을 갖는 핵산을 결합함으로써 형광을 방출하는 시약이 있다.
디지털 PCR 분석은 추출된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 초-미세 구획의 물방울 또는 유중수(W/O) 에멀젼에 cDNA를 1 또는 0개의 cDNA가 함유되도록 희석하여 분산시키고, PCR 증폭을 수행하고, 양성 증폭 신호를 갖는 미소-구획의 수 및 물방울의 수를 직접 계수함으로써 샘플 중 표적 유전자의 발현 수준을 직접 측정하여 샘플 중 표적 유전자의 발현 수준을 절대적으로 측정하는 분석 방법이다. 이 방법은 특히 바람직하게 사용될 수 있다. 디지털 PCR 분석의 경우, 시판되는 디지털 PCR 분석기가 사용될 수 있으며, QuantStudio 3D 디지털 PCR 시스템(써모 피셔 사이언티픽의 상표명), BioMark HD(플루이다임(Fluidigm)의 상표명) 및 액적 디지털 PCR 방식을 채용한 바이오-라드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)의 생성물 등이 사용될 수 있으며, 분석은 각 장치의 지침 메뉴얼 및 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.
상기 프로브로서 사용되는 핵산은 CHD7을 코딩하는 cDNA 또는 이의 단편일 수 있거나, 염기 서열 정보(예를 들어, 인간 CHD7의 경우, NCBI 데이터베이스 (GenBank)에서 수탁 번호 NM_017780.3(서열번호 1)하에 등록된 염기 서열을 참조할 수 있다)에 기초하여 시판되는 DNA/RNA 자동 합성 장치 등을 사용하여 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 상기 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드 세트는 상기 염기 서열 정보에 기초하여 시판되는 DNA/RNA 자동 합성 장치 등을 사용하여 염기 서열 및 이의 상보적 연쇄 서열의 일부를 화학적으로 합성함으로써 수득될 수 있다.
한편, CHD7의 발현이 단백질 수준에서 측정될 경우, 그것은 다양한 면역학적 방법, 예를 들어, 항-CHD7 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅, ELISA, RIA, FIA 등과 같은 다양한 면역검정을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 항-CHD7 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있고, 익히 공지된 면역학적 방법에 의해 제조될 수 있거나, 시판되는 항체가 또한 사용될 수 있다. 항체는 완전 항체 분자뿐만 아니라 이의 단편도 포함하고, 이의 예는 Fab, F(ab')2, ScFv, 미니바디 등을 포함한다. 상기 면역학적 측정 방법에 대한 세부 사항은, 예를 들어, 다음 문헌[참조: Hiroshi Irie ed., "Radioimmunoassay" (Kodansha, published 1974), Hiroshi Irie ed., "Supplementary volume of Radioimmunoassay" (Kodansha, published 1979), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (Igaku-Shoin, published 1978), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (2nd edition) (Igaku-Shoin, published 1979), Eiji Ishikawa et al. ed., "enzyme immunoassay" (third ed.) (Igaku-Shoin, published 1987), "Methods in ENZYMOLOGY" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibidem Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibidem Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibidem Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (all above published by Academic Press) 등]을 참조할 수 있다.
CHD7의 발현이 샌드위치 ELISA에 의해 단백질 수준에서 측정될 경우, 포획 항체 및 검출 항체의 조합의 선택은 CHD7이 검출될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 예를 들어, 모노클로날 항체(마우스 IgG1)는 항원, 인간 CHD7의 Ala 263-Gln 457(서열번호 2)이 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에서 발현되고, 단백질 A 또는 B로 정제되는 폴리펩타이드를 사요하여 수득되고, 포획 항체로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 항-인간 CHD7 토끼 IgG는 토끼를 에쉐리키아 콜리에서 발현된 인간 CHD7의 Gly 25-Met 200(서열번호 2)으로 면역화함으로써 수득되고, 항원을 사용하여 친화성 정제되고, 1차 항체로서 사용될 수 있다.
CHD7의 발현 수준의 측정을 위해, CHD7의 아이소폼의 발현 수준을 측정할 수 있다. 아이소폼의 예는 아이소폼 1(NCBI 데이터베이스(GenBank) 수탁 번호 NM_017780.3(염기 서열은 서열번호 1에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다), 아이소폼 2(상동, 수탁 번호 NM_001316690.1(염기 서열은 서열번호 3에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 4에 제시된다)), 아이소폼 X4(상동, 수탁 번호 XM_011517560.2(염기 서열은 서열번호 5에 제시되고, 아미노산 서열은 서열번호 6에 제시된다)) 등을 들 수 있다. 아이소폼 1이 바람직하다.
임의의 상기한 방법 또는 자체로 공지된 다른 방법을 사용하여, PSC의 CHD7의 발현 수준을 측정하고, 측정 값은 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값과 비교한다. 임계 값은 사용되는 CHD7 발현 수준의 측정 방법에 따라 다르다. 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양된 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준이 측정되는 경우에, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 측정과 유사할 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
예를 들어, 임계 값은 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값의 예는 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 및 10배 이상일 수 있다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포일 수 있다. 또한, 상기한 경우와 유사할 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하 또는 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포일 수 있다.
CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나, 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
다른 측정 방법이 사용된 경우에도, Es8 또는 SPM 배지로 배양함으로써 분화 가능성을 나타내는 것으로 EB 형성 검정 또는 사이토카인 유도 분화 검정에 의해 확인된 PSC 클론(예: H1, H9, KhES1 등과 같은 hESC 클론)은 Es8 또는 SPM으로 배양되고, 구체적으로, 예를 들어, 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 바람직하게는 5회 이상 계대 배양된 경우의 CHD7의 발현 수준은 복수의 실험에 의해 측정되고, 예를 들어, 측정의 최대 값 또는 평균이 임계 값으로 결정될 수 있다.
비교 결과로서, CHD7의 발현 수준이 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값 이상이면, 상기 PSC는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타낸다. 따라서, 분화가 유도될 때 (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포가 잔류할 위험이 없거나 세포가 낮은 위험을 갖는다는 것이 예측될 수 있다. 반대로, CHD7의 발현 수준이 임계 값 미만이면, 상기 PSC는 분화 자극에 대한 분화 내성을 나타낸다. 따라서, 분화가 유도되는 경우, (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포가 잔류할 위험이 있거나 세포가 높은 위험을 갖는다는 것이 예측될 수 있다. 예측 결과로서, 위험이 잔류하거나 세포가 높은 위험을 갖는 경우, 분화 내성은 CHD7을 코딩하는 핵산을 도입하거나 PSC(예: Es8, SPM)의 분화 가능성을 유지할 수 있는 것으로 확인된 것으로 배지를 교환하고, 적어도 5회 계대 배양함으로써 감소되거나 제거될 수 있다. 또한, 예측 결과로서, 피더 세포와 함께 배양된 iPSC가 위험을 갖거나 세포가 높은 위험을 갖는 경우, 분화 내성은 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양함으로써 감소되거나 제거될 수 있다.
상기한 바와 같이, PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 반드시 PSC 클론의 고유 특성은 아니고, 오히려 PSC 유지 배양 조건에 따라 변경될 가능성이 높다. 즉, PSC 클론이 동일하더라고, 배양 조건이 상이하면, 그것은 분화 자극에 반응하여 분화될 수 있거나(예: Es8 또는 SPM으로 배양될 경우), 그것은 (RFF2로 배양되는 경우) 분화 내성을 종종 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 PSC의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법(이하, "본 발명의 평가 방법"으로서 지칭되기도 함)을 제공한다. 시험 배지의 예는 상기 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계 전에 PSC의 유지 배양에 사용될 수 있는 다양한 배지를 포함한다.
하기 언급된 실시예에 기재된 바와 같이, 배지를 상이한 배지로 교환하여 PSC에서 CHD7 유전자의 후성유전적 상태를 완전히 변화시키기 위해 5회 계대(약 15일)가 바람직하다. 따라서, 본 발명의 평가 방법에서, PSC는 바람직하게는 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계 전에 5회 이상의 계대 동안 시험 배지로 배양된다. 시험 배지로의 PSC의 배양은 상기한 본 발명의 예측 방법에서와 유사한 방법으로 수행될 수 있다.
상기 본 발명의 평가 방법에서 CHD7의 발현 수준의 측정은 또한 상기 본 발명의 예측 방법에서와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 수득된 측정 값은 상기 본 발명의 예측 방법에서 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값과 비교된다. 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 CHD7 유전자의 발현 수준을 측정하는 경우에, 임계 값은, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상이다. 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양된 경우에, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 5ng의 총 RNA에서 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다. hPSC가 ESC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 2710 카피 이상 또는 2120 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3280 카피 이상이고; hPSC가 iPSC이며, 소세포 덩어리 방법에 의해 피더 세포와 함께 배양되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 3080 카피 이상 또는 2280 카피 이상이고; 세포외 기질로 코팅된 접시에서 피더 세포 없이 단일 세포에서 배양 되는 경우, 그것은 비제한적으로, 예를 들어, 1502 카피 이상 또는 1500 카피 이상이다.
CHD7 단백질의 발현 수준이 측정되는 경우, 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2.0배 이상, 3.0배 이상, 4.0배 이상, 5.0배 이상, 6.0배 이상, 7.0배 이상, 7.7배 이상, 8.0배 이상, 8.5배 이상, 9.0배 이상, 9.2배 이상, 10배 이상, 10.2배 이상 또는 10.3배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 언급된 측정과 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 90.3% 이하, 90.2% 이하, 90% 이하, 89.1% 이하, 88.3% 이하, 87.0% 이하, 85.8% 이하, 85% 이하, 83.4% 이하, 80.2% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 50% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
또한, 임계 값은, 예를 들어, 정량적 디지털 PCR 분석에 의해 측정된 CHD7 유전자의 발현 수준을 고려하여 결정될 수 있다. CHD7 유전자의 발현 수준을 고려한 임계 값은, 예를 들어, 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상이다. 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다. 또한, 상기 언급된 경우와 유사한 경우, 임계 값은, 예를 들어, 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 농도와 비교하여 50% 이하, 70% 이하, 75% 이하, 80% 이하, 90% 이하이다. 정상적인 분화 가능성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 예는 Es8 또는 SPM 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포를 포함한다.
CHD7 단백질 농도는 배양된 세포의 용해물의 CHD7 단백질 농도를 직접 측정함으로써 수득된 값일 수 있거나, 표준으로서 배양된 세포의 용해물에 대한 값일 수 있다. 배양된 세포는 분화 내성을 나타내는 줄기 세포 또는 정상적인 분화 가능성을 나타내는 줄기 세포일 수 있고, 용해물은 농축될 수 있거나 농축되지 않을 수 있다.
비교 결과로서, CHD7의 발현 수준이 hPSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는데 필요한 CHD7 발현 수준의 임계 값 이상이면, 시험 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행할 수 있다. 따라서, 분화가 유도될 때 (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포를 남길 위험이 없거나 배지가 낮은 위험을 갖는다고 평가될 수 있다. 반대로, CHD7의 발현 수준이 임계 값 미만이면, 시험 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행한다. 따라서, 분화가 유도되는 경우, (종양 형성을 야기하는) 미분화 세포를 남길 위험이 있거나 배지가 높은 위험을 갖는다고 평가될 수 있다.
PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 배지가 PSC의 유지 배양을 수행하는 본 발명의 평가 방법에서 평가된 배지를 사용하여 PSC의 유지 배양이 수행되는 경우, 배지는 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC의 유지 배양을 수행할 수 있는 동일한 평가 방법에 의해 평가된 배지로 교체되고, PSC는 바람직하게는 5회 이상 계대 배양되고, 이에 의해 PSC는 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 변경될 수 있다.
하기 언급된 실시예에서 입증되는 바와 같이, 배지를 PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내도록 PSC를 유지 배양할 수 있는 배지로 교체하는 대신 PSC에 CHD7을 코딩하는 핵산을 도입함으로써 분화 자극을 가하지 않고, PSC에서 자발적 분화가 유도될 수 있다. 예를 들어, hPSC 유래 분화 세포 집단을 이식 후, 미분화 세포가 이식 세포 중에 잔류하는 경우, CHD7을 코딩하는 핵산(mRNA, 플라스미드 DNA 등)을 이식 부위에 주입하고, 핵산을 잔류하는 미분화 세포에 도입하여 이식 부위의 환경에 관계 없이 자발적인 분화를 일으킴으로써 종양 형성 위험이 감소될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 CHD7을 코딩하는 핵산을 함유하는 PSC, 특히 hPSC를 위한 분화 유도 인자, 및 분화 내성을 나타내는 PSC에 핵산을 도입하는 단계를 포함하는 PSC의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 예측 방법 및 본 발명의 평가 방법에 사용하기 위한 시약을 제공한다. 상기 시약은 CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 함유한다. 이러한 물질은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, CHD7의 발현이 RNA 수준에서 검출되는 경우, 상기 본 발명의 예측 방법에서 프로브 또는 프라이머로서 예시된 핵산 등이 인용될 수 있다. CHD7의 발현이 단백질 수준에서 검출되는 경우, 항-CHD7 항체 등이 언급될 수 있다. 상기 시약은 또한 상기한 CHD7의 발현 수준을 측정하는 다양한 방법을 실시하기 위해 필요한 다양한 시약을 추가로 함유하는 키트로서 제공될 수 있다.
본 발명은 실시예를 나타냄으로써 다음에 더욱 구체적으로 설명되지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
재료 및 방법
본 명세서에서, 본 연구에서 수행된 모든 실험은 인간 ESC 및 인간 iPSC를 사용했다. 본 연구는 고베 생물 의학 연구 및 혁신 재단(FBRI)의 윤리 위원회의 승인을 받았다.
(세포 배양)
임의의 인간 ESC 주 KhES-1(Riken BRC)(참조: Navarro-Alvarez et al., Cell Transplant 2008; 17(1-2): 111-119) 및 H9(WiCell Research Institute, Levenstein et al., Stem Cell; 24(3):568-74, 2006 Mar.) 및 인간 hiPSC 주 PFX#9(참조: Nishishita et al. PLoS One 2012; 7(6): e38389), 201B7(Riken RBC) 및 SHh#2(참조: Nishishita et al., PLoS One 2012; 7(6))를 미토마이신 C-처리된 SNL76/7 세포(SIM 균주 배아 섬유아세포, ECACC; 인증된 세포 배양의 유럽 컬렉션)에서 hPSC 배양 배지(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855) 또는 rhVitronectin-N(재조합 인간 비트로넥틴-N)(써모 피셔 사이언티픽)-코팅된 접시에서 필수 8 배지(Es8, 써모 피셔 사이언티픽)(참조: Chen et al., Nat Methods 2011; 8(5): 424-429), SPM(Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지)(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)(교쿠토 파마슈티칼 캄파니 리미티드) 또는 RiproFF2 배지(RFF2, ReproCELL)로 배양했다. 세포를 완만한 세포 해리 시약(GCDR; Stem Cell Technologies)을 사용하여 덩어리로 계대시키고, iPSC의 경우 1:3의 비율로 또는 ESC의 경우에는 1:3.5의 비율로 분할했다. 대안적으로, 세포는 TrypLE Select(Life Technologies)를 사용하여 단일-세포 현탁액을 시딩하여 계대시켰다(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855). 단일 세포 현탁액 중 세포는 Es8 배지로 배양될 때 6-웰 플레이트에서 3 × 105 세포/웰로, RFF2 배지로 배양되는 경우는 1 × 105 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이터(MCO-19AIC; Panasonic)에서 5% CO2를 함유하는 대기에서 배양하였다. KhES-1, H9 및 PFX#9 세포의 핵형을 5회 계대마다 다색 형광 동일 반응계 하이브리드화(mFISH) 및 10회 계대마다 G-밴딩에 의해 조사했고; 정상 핵형을 갖는 PSC를 이 연구에 사용했다.
(siRNA 시약 및 형질감염)
달리　명시되지 않는 한, 모든 시약은 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)에서 구입했다. 각각 siCHD7 또는 대조군 siRNA (모의) 형질감염 실험을 위해 소음기 선택(Silencer Select) 사전설계된 인간 CHD7 siRNA(카탈로그 번호 4392420; ID: s31142) 및 소음기 선택 음성 대조군 번호 1(카탈로그 번호 4404021)을 사용했다. 세포는 다음과 같이 형질감염시켰다.
　ESC를 VTN-N 코팅된 6-웰 플레이트에서 2 × 105 세포/웰로 시딩하고, 4mL의 Es8, SPM 또는 RFF2로 배양했다. 다음날, 배지를 교체하고, siCHD7 또는 대조군 siRNA를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMAX를 사용하여 세포로 형질감염시켰다(형질감염량 50pmol, 30pmol 또는 10pmol). 간단히, 50pmol의 siCHD7의 도입과 관련하여, 칵테일 A(4μL 리포펙타민 RNAiMAX 시약 및 150μL Opti-MEM 배지)를 칵테일 B(1μL의 50μM siCHD7(50pmol) 또는 대조군 siRNA(50pmol) 및 150μL Opti-MEM 배지)와 혼합하고, 이어서 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양했다. 혼합된 칵테일(240μL)은 siCHD7(최종 농도 10nM) 또는 대조군 siRNA(최종 농도 10nM)에 의한 ESC의 형질감염에 사용하고, 세포를 48시간 동안 배양했다. 시약의 형질감염 효율은 지정된 시점에 형질감염된 세포에서 CHD7 mRNA의 검출을 위해 qRT-PCR에 의해 평가했다.
(합성 mRNA 시약 및 형질감염)
T7 프로모터 및 T7 터미네이터를 각각 CHD7 아이소폼 2(NM_001316690.1(서열번호 3))의 5 '및 3' 코딩 DNA 서열로 융합시키고, pMX 벡터로 클로닝했다. 이어서, SfiI로 pMX 벡터를 소화한 후, CHD7 아이소폼 2를 위한 합성 mRNA를 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 전사 키트를 사용하여 생성시켰다. 크로모도메인 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인(CHD7 DN1)을 모두 커버하는 합성 mRNA를 동일한 방식으로 생성시켰다. CHD7의 SANT-SLIDE 도메인 영역은 공개된 CHD1 서열과의 상동성에 기초하여 결정되었고(참조: Ryan et al., Embo j 2011; 30(13):2596-2609), 합성 mRNA(CHD7 DN2)는 동일한 방식으로 생성시켰다. 생성되는 mRNA의 양은 ND-1000(Nano Drop)으로 측정했다. 동일한 벡터 백본으로부터 수득된 향상된 그린 형광 단백질(eGFP)을 위한 mRNA를 대조군(대조군 mRNA, 모의)으로 사용했다.
(mRNA 형질감염)
ESC(3 × 105)를 VTN-N-코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 5ng/mL의 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2; Peprotech)가 보충된 RFF2로 시딩했다. mCHD7 또는 대조군 mRNA(모의)를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 메신저 MAX를 사용하여 세포로 형질감염시켰다. 간단히, 칵테일 A(3.75μL 리포펙타민 메신저 MAX 형질감염 시약 및 125μL Opti-MEM 배지)를 실온에서 10분 동안 배양했다. 이어서, 칵테일 B(2.5μg mCHD7 또는 대조군 mRNA 및 125μL Opti-MEM 배지)를 제조하고, 칵테일 A와 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양했다. 혼합된 칵테일(240μL)을 최종 농도 5ng/mL로 FGF2가 보충된 4mL의 RFF2에 첨가하고, 세포를 37℃에서 24시간 동안 이 배지로 배양했다. 시약의 형질감염 효율은 지정된 시점에 형질감염 세포에서 qRT-PCR에 의해 CHD7 mRNA 발현을 결정함으로써 평가했다.
(메틸화 및 GeneChip 분석)
배양된 ESC 또는 iPSC의 메틸화 상태는 인피늄 인간메틸화(Infinium Human Methylation) 450 비드칩(Illumina)으로 결정했다. 프로모터 영역의 메틸화 패턴은 Cluster 3.0을 사용하여 계층적으로 클러스터링하였고, Java Tree View에서 시각화했다. 프로모터 영역에서 각 유전자의 메틸화 상태는 후보 유전자를 추출하기 위해 GeneChip(인간 게놈 U133 Plus 2.0 어레이; Affymetrix) 어레이 데이터에 의해 수득된 유전자 발현 신호와 비교하여 평가했다.
(siCHD7로 형질감염 후 EB 형성 검정)
4mL의 Es8 배지를 사용하여 VTN-N 코팅된 웰에서 배양된 세포를 siCHD7(50pmol) 또는 대조군 siRNA(모의)로 형질감염시킨 후 48시간에 PBS(-)로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 셀 스크래이퍼(Iwaki)로 스크래이핑하고, 피펫팅으로 해리시키고, 저부착성 6-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 10mM의 ROCK 억제제(Y-27632, 와코)와 함께 필수 6 배지(Es6)로 1일 동안 배양하고 EB 형성을 위해 Es6 배지만을 사용하여 13일간 배양했다. 배지를 2일 마다 교환했다. EB의 수와 형태는 현미경(Olympus IX71, Olympus)으로 관찰했다. CHD7에 대한 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 결정하고, 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 장치(QuantStudio 12K Flex)를 사용하여 TaqMan(등록 상표) 스코어카드 패널(A15870)에 의해 결정했다. CHD7에 대한 프라이머 서열은 표 1에 제시되어 있다.
[표 1a]
Figure pct00001
[표 1b]
Figure pct00002
[표 1c]
Figure pct00003
[표 1d]
Figure pct00004
(mCHD7로 형질감염 후 EB 형성 검정)
VTN-N-코팅된 웰에서 배양된 세포 및 최종 농도 5ng/mL가 되도록 FGF2로 보충된 RFF2를 mCHD7 또는 대조군 mRNA를 도입한 후 24시간에 PBS(-) 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 셀 스크레이퍼(Iwaki)로 스크래핑하고, 피펫팅으로 해리시키고, 저부착성 6-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 10mM ROCK 억제제(Y-27632, 와코)를 함유하고, FGF2를 함유하지 않는 RFF2로 1일 동안 배양하고, 배지를 매일 교환하면서 FGF2를 함유하지 않는 RFF2로 배양했다. EB의 수와 형태는 현미경(Olympus IX71, Olympus)으로 관찰했다. CHD7에 대한 유전자 발현은 qRT-PCR에 의해 결정되었고, 유전자 발현 프로파일은 qRT-PCR 장치(QuantStudio 12K Flex)를 사용하여 TaqMan(등록 상표) 스코어카드 패널(A15870)에 의해 결정되었다.
(정량적 RT-PCR)
제조업체의 지침에 따라, 총 RNA는 RNeasy 마이크로 키트(74004, QIAGEN)를 사용하여 추출했다. QuantiTect 역전사 키트(205311, QIAGEN)를 사용하여 cDNA를 합성하기 위해, 1μg의 총 RNA를 사용했다. TaqMan(등록 상표) hPSC 스코어카드 패널(A15870)을 사용하여 3배엽 관련 유전자 발현 및 자기 증식을 프로파일링하기 위한 정량적 PCR(qPCR)을 수행했다. SYBR(등록 상표) Select Master Mix 및 StepOnePlus를 사용하여 cDNA를 역전사 반응에 의해 500ng의 총 RNA로부터 합성했다. 반응은 95℃에서 10분 동안, 및 95℃에서 15초 동안, 60℃에서 1분 동안 및 72℃에서 15초 동안 40사이클의 조건하에 수행했다. 사용된 프라이머는 표 1에 열거되어 있다. 상대적 정량화는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)로 정규화 후 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다.
(CHD7 전사체의 카피 수의 결정)
CHD7 전사체의 카피 수는 액적 디지털 PCR 시스템(Bio-Rad Laboratories)에 의해 결정되었다. 구체적으로, cDNA는 TaqMan(등록 상표) 유전자 발현 검정(Hs00215010_m1, Thermo Fisher Scientific)의 프로브를 사용하여 Es8 또는 RFF2로 배양된 KhES-1로부터 추출된 5ng의 총 RNA로부터 생성되었다. RT-PCR 반응 혼합물의 에멀젼은 사용 설명서에 따라서 QX100 시스템(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 생성되었다. 그 후, cDNA는 Applied Biosystems GeneAmp 9700 Thermalcycler을 사용하여 Es8 배양 및 RFF2 배양으로부터 각각 증폭시켰다. 각 반응 혼합물은 10μL의 ddPCR 프로브 수퍼믹스, 1000nM 프라이머, 250nM 프로브 및 주형 cDNA를 함유하는 20μL 용액으로 구성되었다. 반응은 95℃에서 10분 동안 처리한 후 94℃에서 30초 동안 변성 및 53℃에서 60초 동안 신장 반응의 40사이클 후, 최종적으로 98℃에서 10분 동안의 조건으로 수행했다. 반응 후, 각 웰의 미가공 형광 데이터를 소프트웨어 QuantaSoft ver. 1.2(Bio-Rad Laboratories)로 분석했다.
(CHD7 검출을 위한 웨스턴 블롯팅)
웨스턴 블롯팅을 위한 세포 용해물은 시딩 72시간 후에 제조했다. 단백질은 프로테아제 억제제 칵테일 정제(완전 미니; Roche)가 보충된 완전 용해-M(Roche)을 사용하여 추출시켰다. 폴리클로날 양 IgG 항-CHD7 항체(AF7350; R & D Systems) 및 서양 고추냉이 퍼옥시다아제로 표지된 토끼 항-양 IgG (H + L) 항체를 각각 1차 항체 및 2차 항체로서 사용했다. 신호는 Chemi-Lumi One Super 시약(Nacalai Tesque)으로 검출되었다. 총 단백질은 레인에 적용하기 전에 비신코닌산 총 단백질 검정 키트(Nacalai Tesque)로 측정했다.
(CHD7의 샌드위치 ELISA를 위한 표준 및 샘플의 제조)
ESC를 다양한 조건에서 배양했다. 구체적으로, H9는 Es8로 17회 계대 배양하고(P1), KhES-1은 Es8로 10회 계대 배양하고(P2), KhES-1은 RFF2로 11회 계대 배양했다(N). 모든 세포는 피더 세포 없이 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 배양했다. 각각 배양된 ESC를 완전 용해-M(Merck KGaA, 제품 번호: 04719956001)의 프로토콜에 따라 용해하고, 단백질 농도를 측정하고, 500μL씩 분배하고, 액체 질소로 급속하게 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. P1, P2 및 N의 총 단백질 농도는 각각 1.25mg/mL, 1.27mg/mL 및 0.84mg/mL였다. H9 세포를 Es8 또는 RFF2로 배양하고, 완전 용해-M의 프로토콜에 따라 용해시킨 다음, Amicon Ultra-4, PLTK Ultracel-PL 멤브레인, 30 kDa(Amicon(등록 상표) Ultra-4 PLTK Ultracel-PL 멤브레인, 30 kDa, 카탈로그 번호: UFC803024, Merck KGaA)를 사용하여 4000 X g, 4℃에서 농축시키고, 농축된 생성물을 각각 표준 및 음성 대조군(N2)으로 사용했다. 표준 및 대조군(N2)을 500μL씩 분배하고, 액체 질소로 급속하게 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장했다. 표준 및 음성 대조군(N2)의 총 단백질 농도는 각각 4.06mg/mL 및 10.23mg/mL였다.
(샌드위치 ELISA를 위한 항체)
샌드위치 ELISA를 위해, 포획 (고상) 항체로서, 단백질 A 또는 단백질 G로 정제하여 수득된 항체, 항원으로서, 인간 CHD7(서열번호 2)의 Ala 263-Gln 457이 에쉐리키아 콜리에서 발현된 폴리펩타이드를 사용하여 수득된 모노클로날 항체가 사용되었고; 1차 항체로서, 토끼를 에쉐리키아 콜리에서 발현된 인간 CHD7(서열번호 2)의 Gly 25-Met 200으로 면역화하고 토끼를 항원으로 친화성 정제함으로써 수득된 항-인간 CHD7 토끼 IgG가 사용되었고; 2차 항체로서, 항-토끼 IgG-HRP (SouthernBiotech, 4090-05)이 사용되었다.
(샌드위치 ELISA)
샌드위치 ELISA는 다음의 방법으로 수행했다. 샌드위치 ELISA의 최적의 조건을 결정하기 위해, 1차 및 2차 항체의 농도는 다음 표에 제시된 조건하에 조사했다. D-PBS(-)를 사용하여 3μg/mL로 희석된 포획 항체 용액 100μL를 96-웰 플레이트(MaxiSorp(등록 상표), Nunc, 44-2404-21)의 웰에 첨가하고, 플레이트 실로 밀봉하고, 4℃에서 밤새 저장했다. 그 후, 포획 항체 용액을 경사 제거하고, 0.05% Tween(등록 상표) 20(이하 "세척 용액"으로서 지칭되기도 함)을 함유하는 D-PBS(-) 200μL를 첨가하고, 혼합물을 완만하게 교반하여 5분 동안 정치시키고, 제거하고 세척했다. 이 세척 단계를 3회 반복했다. 세척 용액 제거 후, 세척 용액에 1% BSA를 첨가함으로써 수득된 차단 용액을 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양하여 차단을 수행했다. 이어서, 차단 용액으로 희석된 표준, 목적 샘플을 100μL/웰로 첨가했다. 블랭크 웰에 동일량의 차단 용액을 첨가했다. 플레이트 실을 단단히 부착하여 용액의 증발을 방지하고, 혼합물을 4℃에서 밤새 배양했다. 그 후, 웰을 세정 용액으로 3회 세척하고, 차단 용액을 사용하여 1μg/mL 또는 3μg/mL로 희석된 1차 항체 100μL를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 1차 항체를 제거하고, 웰을 세척 용액으로 3회 세척했다. 이어서, 5000배 또는 10000배 희석된 2차 항체 100μL를 웰에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양했다. 그 후, 혼합물을 세정 용액으로 3회 세척하고, 100μL의 기질 용액(TMB, ScyTek Laboratories, TM4500)을 첨가하고, 혼합물을 암흑에서 20 내지 30분 배양하고, 0.5M H2SO4를 100μL/웰로 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450nm(Abs 450nm) 및 650nm(참조 파장, Abs 650nm)에서의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 측정하였고, 여기서 표준 스톡 용액의 CHD7 농도가 1000단위로 사용되었고, 500U/mL로부터 2배 희석된 희석 시리즈에서 8점 이상 또는 3배 희석된 희석 시리즈에서 6점 이상이 생성되었고, 측정되었다.
[표 2]
Figure pct00005
(CHD7 단백질 농도의 계산)
CHD7의 농도는 다음 단계로 계산된다.
1) ΔAbs는 측정된 흡광도로부터 화학식 1에 의해 계산된다:
Figure pct00006
2) 블랭크는 다음 화학식 2에 의해 각 샘플의 ΔAbs로부터 차감해서 ΔAbs-blk를 계산한다:
Figure pct00007
3) 분석 곡선은 유사한 4 매개변수 로지스틱 곡선으로서 다음 화학식 3에 의해 도출된다:
Figure pct00008
상기 화학식 3에서,
f(x)는 ΔAbs-blk이고,
x는 희석 후 CHD7 농도(U/mL)이고,
a는 하부 점근선이고,
b는 변곡점 경사이고,
c는 변곡점이고,
d는 상부 점근선이다.
4) 측정 샘플의 ΔAbs-blk는 하기 화학식 4에서 분석 곡선의 방적으로 치환하여 희석 후 CHD7 농도를 계산한다.
Figure pct00009
5) 측정 샘플의 희석 후 CHD7 농도는 희석 배율을 곱하여 희석 전 CHD7 농도를 계산한다.　　　　
결과
1. ESC의 분화 가능성은 배양 조건을 변화시킴으로써 변경된다:
정상적인 핵형을 나타내는 KhES-1 세포가 hrVitronectin-N(VTN-N)-코팅된 접시에서 필수 8 배지(Es8)로 배양된 경우, KhES-1 세포는 자기 증식 능력 및 분화 가능성을 모두 유지시켰다. KhES-1 세포는 ReproFF2(RFF2)로 5회 계대 배양 후 분화 가능성을 손실했지만, Es8로 배양 후 분화 가능성을 회복했다(도 1). SPM(참조: Takenaka et al., PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)으로 배양된 KhES-1 세포는 분화 가능성을 유지했지만, 상기 세포는 RFF2로 5회 계대 배양 후 분화 가능성을 손실했다. 또한, 정상적인 핵형을 나타내는 PFX#9 iPSC(참조: Nishishita et al., PLoS One 2012; 7(6): e38389)를 VTN-N-코팅된 접시에서 Es8에 이어, RFF2로 배양되는 경우, 동일한 결과가 수득되었다(도 2). 이러한 결과는, PSC의 분화 가능성이 배양 조건에 따라 가역적으로 변경될 수 있다는 것을 나타낸다. 세포의 후성유전적 상태의 변경은 이들 반응에 관련되는 것으로 생각되었다.
RFF2, Es8 또는 SPM으로 배양된 PSC의 메틸화 상태의 비교 연구는 메틸화 비드 검정을 사용하여 수행되었고, ESC의 "분화 가능성의 손실"을 초래할 수 있는 특징적인 메틸화 상태가 동정되었다. RFF2 배양, 및 SPM 및 Es8 배양에서 메틸화 유전자 수의 비교 연구 결과가 도 3a에 도시되어 있고, 프로모터 영역에서 메틸화 패턴의 클러스터링은 도 3b에 도시되어 있다. 또한, 스코어카드 패널(써모 피셔 사이언티픽)에서 표시된 자기 증식, 외배엽, 중배엽, 중내배엽 및 내배엽으로 분류되는 주요 유전자의 프로모터의 메틸화 상태를 조사했다. RFF2로 배양된 6개의 PSC 샘플(iPSC의 3개 샘플 및 ESC의 3개 샘플)(RFF2) 또는 SPM 또는 Es8로 배양된 6개의 PSC 샘플(SPM으로 배양된 iPSC의 1개 샘플과 ESC의 2개 샘플 및 Es8로 배양된 iPS의 1개 샘플과 ESC의 2개 샘플)(SPM & Es8)의 평균 메틸화 상태는 표(표 3)에 제시되어 있다. 모든 세포는 미분화 상태로 유지되었지만, 상이한 배지가 사용될 경우에도 이들 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 패턴에는 유의한 차이가 없었다. 표 3에서, 0.2 미만의 수치는 낮은 메틸화 상태를 의미하고, 0.2 이상, 0.5 미만의 수치는 중간 메틸화 상태를 의미하고, 0.5 이상의 수치는 높은 메틸화 상태를 의미한다.
[표 3a]
Figure pct00010
[표 3b]
Figure pct00011
이어서, 동일한 샘플의 GeneChip 데이터(Affymetrix)를 사용하여 RFF2 배양에서 높은 메틸화 상태 및 낮은 유전자 발현을 나타낸 유전자, 및 SPM 또는 Es8 배양에서 낮은 메틸화 및 높은 유전자 발현을 나타낸 유전자를 조사했다. 주성분 분석(PCA) 및 GeneChip 분석에 의해, 4개의 후보는 분화 가능성 손실에 대한 마커일 수 있는 후보 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 부위로서 동정되었다(표 4). 동정된 유전자 중에서, 크로모도메인 헬리카제 DNA 결합 단백질 7(CHD7)을 이의 기능에 주목하여 조사했다.
[표 4]
Figure pct00012
NANOG, POU5F1, SOX2 및 EP300 등과 같은 자기 증식 관련 유전자의 발현에 대한 RFF2에 의한 세포 배양의 효과는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 결정되었다. 그 결과, 자기 증식 관련 유전자의 발현 수준에 대한 유의한 효과는 없었다. 그러나, 프라이머가 모든 CHD7 아이소폼의 검출을 위한 CHD7의 3' 비번역된 영역을 표적으로 하도록 설계된 경우, CHD7 유전자의 발현은 ESC를 RFF2로 배양함으로써 상당히 억제되었다는 것이 qRT-PCR에 의해 입증되었다(도 4). CHD7의 3가지 주요 아이소폼인 아이소폼 1, 아이소폼 2 및 아이소폼 X4의 구조(참조: Schnetz et al., Genome Res 2009; 19(4): 590-601, Colin et al., BMC Res Notes 2010; 3: 252) 및 프라이머의 위치는 도 5a에 도시되어 있다.
이어서, 3개의 CHD7 아이소폼의 발현은 웨스턴 블롯팅에 의해 조사했다. 그 결과, Es8 및 RFF2 배양으로부터 유래된 세포 용해물 중 CHD7 아이소폼 2, 및 두 세포 용해물 중 CHD7 아이소폼 X4는 CHD7의 N-말단을 인식하는 항체에 의해 동일한 수준에서 각각 검출되었다. 그러나, CHD7 아이소폼 1은 RFF2 배양으로부터 유래된 세포 용해물에서 명확하게 검출되지 않았다(도 6). CHD7 아이소폼의 신호 강도는 표적 단백질의 분자 크기가 상이한 경우, 웨스턴 블롯팅에 의해 정확하게 비교되고 평가될 수 없다.
상기에 기초하여, 각 아이소폼은 아이소폼 특이적 TaqMan 프라이머를 사용하여 디지털 PCR에 의해 정량화하였다(도 5a). 디지털 PCR에 의해 결정된 CHD7 아이소폼 1, 아이소폼 2 또는 아이소폼 X4의 카피 수가 제시되어 있다(표 5). 정량화를 위해, Es8 또는 RFF2 배지로 배양된 KhES-1 세포로부터 수득된 총 RNA(5ng)를 주형으로 사용했다. 프라이머 세트 3을 사용하여 각 RNA 샘플 중 아이소폼 1의 카피 수를 계산했다. 아이소폼 X4의 카피 수는 프라이머 세트 1에 의해 생성된 카피 수로부터 프라이머 세트 3에 의해 생성된 카피 수를 차감함으로써 결정되었다(도 5a). 웨스턴 블롯팅의 결과와 일치하여, 아이소폼 1은 배양 조건에 의해 영향을 받는 주요 아이소폼 및 초기 표적인 것으로 밝혀졌다. 웨스턴 블롯팅의 결과에 기초하여, 아이소폼 2의 카피 수는 아이소폼 X4의 카피 수와 동일하거나 미만일 것으로 예상되었다. 그러나, 스플라이싱된 서열을 샌드위치시키는 Taq man 프라이머 세트 2는 프라이머 설계 문제로 인해 적절히 기능하지 않았다. CHD7 아이소폼의 구조 분석은 아이소폼 1이 단백질의 중앙에서 527에서 2576 아미노산으로 확장하는 조절 영역을 함유하다는 것을 보여 주었다. 이 영역은 ATPase/DNA 헬리카제 도메인, 염색체 결합 도메인, DNA 결합 도메인 및 BRK 도메인을 함유한다(참조: Allen et al., J Mol Biol 2007; 371(5): 1135-1140, Colin et al., BMC Res Notes 2010; 3: 252, Ryan et al., Embo j 2011; 30(13): 2596-2609). 아이소폼 2는 아이소폼 1의 조절 영역이 결여된다. 아이소폼 1의 다른 스플라이싱 변이체인 아이소폼 X4(도 5a)도 또한 배양 조건에 따라 이의 유전자 발현을 변경했다.
[표 5]
Figure pct00013
분화 가능성이 CHD7의 발현과 관련있는 것으로 나타났기 때문에, mCHD7의 발현 수준이 siRNA(도 5b)의 도입으로 하향조절되는 경우, Es8로 배양된 KhES-1 세포가 분화 가능성을 손실하는지의 여부를 조사했다. 또한, CHD7 mRNA가 도입된 경우 RFF2로 배양된 KhES-1 세포가 분화되는지의 여부를 조사했다. 그러나, 번역 영역의 길이로 인해, 전장 CHD 7 아이소폼 1 mRNA는 설계할 수 없었다. 대신, 조절 영역이 결여된 CHD7 아이소폼 2 mRNA(도 5b)를 제조하고, mRNA를 RFF2로 배양된 KhES-1 세포에 도입했다. 또한, CHD7 아이소폼 1의 기능성 영역과 경쟁하여 활성을 억제하기 위해, 조절 영역인 것으로 추정되는 DNA 결합 도메인(SANT-SLIDE 도메인)을 코딩하는 mRNA 및 크로마틴 상호작용 도메인(크로모도메인) 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인을 코딩하는 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA를 각각 설계하고, Es8로 배양된 KhES-1 세포에 도입했다.
2. CHD7의 하향조절은 분화를 교란한다:
Es8로 배양된 KhES-1 세포는 분화 가능성을 유지하고 EB를 형성한다. 먼저, siCHD7이 형질감염되는 경우, CHD7의 하향조절이 KhES-1 세포에서 발생하는지의 여부를 조사했다. 6-웰 접시의 웰당 10pmol, 30pmol 또는 50pmol의 siCHD7을 형질감염시키고, CHD7의 발현 수준을 조사했다. 그 결과, siCHD7의 도입량이 증가함에 따라 CHD7의 발현 수준은 감소되고, 도입량의 의존성이 관찰되었다(도 7b). 이어서, siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포의 3배엽으로의 분화를 조사했다. EB에서, 중배엽 분화의 교란은 5일째에 관찰되었고, 중배엽 및 내배엽의 발달이 14일째에 중간 수준으로 억제되었다(도 8). siCHD7의 단일 도입에 의한 CHD7 mRNA의 하향조절은 완료되지 않았다. siCHD7의 단일 도입은 외배엽 분화의 개시를 막지 못했지만, 배양 14일 후 중배엽 및 내배엽의 발달을 교란시켰다. 이러한 데이터는 3배엽 발달을 촉진하기 위해 CHD7의 발현 수준이 EB의 분화에 걸쳐 일정한 수준에서 유지 될 필요가 있다고 시사했다.
PSC는 VTN-N 코팅된 접시에서 높은 글루코스(3.1g/L) Es8로 효과적으로 배양될 수 있다. PSC가 영양소-고갈 Es8로 배양될 경우(즉, 매일 배지 교환 생략), PSC의 분화가 유발될 수 있다(참조: Vander Heiden et al., Science 2015; 324(5930): 1029-1033, Yanes et al., Nat Chem Biol 2010; 6(6): 411-417; Moussaieff et al., Cell Metab 2015; 21(3): 392-402). 영양소-고갈 Es8로 배양된 모의-형질감염된 KhES-1 세포는 분화되었고, VNT-N 코팅된 접시에서 Es8로 유지되지 않았다. 한편, siCHD7-형질감염된 KhES-1 세포가 도입 4일 후 VNT-N 코팅된 접시에서 잔류하였고(도 9c), 비교적 미분화된 유전자 프로파일을 나타냈다(도 10). 세포는 영양소-고갈 Es8에서는 증식하지 않았지만, siCHD7을 통해 CHD7의 발현의 하향조절은 영양소 고갈로 인해 유발된 분화를 방지했다(도 10). Es8의 매일 교환으로 형질감염되지 않은 KhES-1 세포를 정상적인 배양 대조군으로 사용했다.
3. CHD7 mRNA의 도입은 3배엽 분화를 유도한다:
CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 임의의 추가의 분화 자극 없이 RFF2로 배양된 KhES-1 세포의 "자발적" 분화를 유도했다(도 12). RFF2 배지로 배양된 KhES-1 세포를 CHD7 아이소폼 2로 형질감염시키고, 1, 2 및 3일 후 KhES-1 세포에서 94개 유전자의 발현 수준은 qRT-PCR 스코어카드 패널로 결정하였다(표 6). 표에서, 배수 변화(fc)가 2.0 이상인 경우에, 그것은 상향조절을 의미하고, 0.1 이하인 경우에, 그것은 하향조절을 의미한다. PSC 배양 시스템은 분화된 세포보다는 미분화된 세포를 유지하도록 설계된다. 분화된 경우, KhES-1 세포는 VTN-N 코팅된 접시에서 배양될 수 없었고, RFF2 배양에서 KhES-1 세포의 수는 세포가 분화됨에 따라 감소되었다(도 11c 및 도 12). 특히, CHD7 아이소폼 2의 과발현은 연속적 분화 과정을 따르지 않고 3배엽 분화를 동시에 유도했다.
[표 6a]
Figure pct00014
[표 6b]
Figure pct00015
CHD7 아이소폼 1의 기능성 영역과 경쟁함으로써 CHD7 아이소폼 1 활성을 억제하거나 감소시키기 위해, 특정 메틸화 상태를 갖는 히스톤의 결합 부위를 인식하는 크로모도메인 및 SNF2-유사 ATPase/헬리카제 도메인을 커버하는 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA(CHD7 DN1)를 KhES-1 세포에 도입하였다(도 5b 및 도 13a, b). CHD7 DN1의 도입에 의해, 분화 가능성 및 세포 증식 모두의 억제 또는 감소가 EB 형성 검정에서 관찰되었다(도 13c). 또한, CHD7의 추정성 DNA 결합 부위인 SANT-SLID 도메인(CHD7 DN2)의 우성 음성 단백질을 생성하는 mRNA가 KhES-1 세포에 도입된 경우(도 5b 및 도 13a, b), 분화 가능성은 또한 EB 형성 검정에서 억제되거나 감소되어 감소된 세포 증식을 나타냈다(도 13c).
CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 또한 ESC가 미분화된 상태로 유지되는 경우 CHD7 발현의 상한치의 존재 가능성을 시사했다. 상한치는 때때로 배양 조건에 따라 달라질 수 있다. 사실, Es8과 함께 배양된 KhES-1 세포에 CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 Es8 배양에서 KhES-1 세포에서 CHD7 아이소폼 2를 상향조절하지 않았다(도 14). KhES-1 세포에 CHD7 아이소폼 2 mRNA의 도입은 Es8에서 KhES-1 세포의 "자발적" 분화를 유도하고, Es8 배양 시스템은 분화된 세포를 지지할 수 없다고 생각된다.
4. CHD7 발현 수준은 세포의 증식 속도를 조절한다:
CHD7의 다른 기능은 ESC의 증식을 지지하는 것이다. 6-웰 플레이트의 웰당 1 × 105개 KhES-1 세포를 시딩하고, 세포를 Es8로 배양하고, 3일 후 8 × 105개 세포를 채취했다. RFES2 배지에서 KhES-1 세포의 증식 속도는 Es8을 사용하는 것의 1/3이었지만, Es8이 사용된 경우, KhES-1 세포는 배양 3일 후 8배 확장하는 것으로 관찰되었다. CHD7 발현 수준이 농도 의존 방식으로 ESC의 증식 속도를 조절할 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, CHD7은 siCHD7을 KhES-1 세포로 형질감염시킴으로써 하향조절되고, 세포를 Es8로 배양하고, 세포 수를 계수했다(도 15a, b). 그 결과, KhES-1 세포의 증식 속도는 CHD7 mRNA의 발현 수준에 의해 조절되었다(도 15c, d). 또한, 크로모도메인 및/또는 SANT-SLIDE 도메인을 커버하는 CHD7의 우성-음성 단백질을 생성하는 KhES-1 세포에 mRNA의 도입은 세포 증식 속도를 극적으로 감소시켰다(도 13).
5. CHD7의 발현 수준은 PSC의 분화 가능성을 매개한다:
CHD7 mRNA 발현 수준이 ESC의 분화 가능성과 상관되는지의 여부는 다양한 조건하에 배양된 PSC의 CHD7 mRNA의 발현 수준을 측정하여 조사했다. 먼저, GeneChip 데이터베이스를 사용하여 이식 전 다양한 배아 형성 단계에서 배아에서 CHD7 mRNA의 발현 수준, 및 PSC 및 EB의 CHD7 mRNA의 발현 수준을 조사하였다(도 16). 아이소폼 1에 상응하는 CHD7 mRNA는 2-세포 및 4-세포 단계에서 비교적 높은 수준으로 발현된 후, 상실배 단계 및 낭포 단계예서 낮은 수준으로 발현되었다(도 16, "2 세포" "4 세포", "상실배" 및 "낭포"). 배아 형성 동안, 수정란은 분화되고 증식한다. 배아는 내부 세포 괴상으로 칭명되는 발달 축 없이 동일한 세포 괴상의 증식으로 구성되는 낭포 단계에 도달한다. GeneChip 발현 신호의 측정에서, PSC는 이식 후 마우스 외체의 유전자 발현 프로파일과 유사한 유전자 발현 프로파일 및 배양 조건에 따라 CHD7 mRNA의 다양한 수준을 나타냈다. CHD7의 낮은 발현을 나타내는 PSC(도 16, "KhES-1 RFF2/N" 및 "PFX#9 RFF2/N")는 미분화 상태에서 증식능을 유지했지만 분화 가능성을 손실했다.
GeneChip 발현 신호가 정량화에 적합하지 않을 수 있기 때문에, 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 다양한 조건하에서 배양된 다양한 PSC에서 디지털 PCR로 정량화했다. 구체적으로, 사용된 세포는 H9 또는 KhES-1(각각 ESC), 또는 PFX#9,201B7 또는 SHh#2(각각 iPSC)였다. 세포는 피더 세포에서 hPSC 배지를 사용하여 소세포 덩어리 방법에 의해 배양했다. 대안적으로, 그들은 Es8, RFF2 또는 SPM과 함께 VTN-N 코팅된 접시에서 단일 세포에서 배양했다. 배양된 세포로부터 추출된 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수는 액적 디지털 PCR에 의해 결정했다. RFF2로 배양된 PSC는 5ng의 총 RNA에서 CHD7 아이소폼 1의 카피 수가 적었고, 분화 가능성을 나타내지 않았지만, 분화 가능성은 다른 조건하에 배양된 세포에서 확인되었다. 카피 수 및 이의 계대 수(P)는 표 7에 제시되어 있다. 이러한 배양 조건하에 배양된 세포 중 일부의 분화 가능성을 구체적으로 분석한 결과는 도 17에 제시되어 있다.
[표 7]
Figure pct00016
분화 가능성을 갖는 PSC와 관련하여, CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수의 임계 값을 추가로 조사했다. 구체적으로, 정상(201B7 또는 PFX#9)보다 과성장 조건하에 배양함으로써 CHD7 mRNA의 더 적은 카피 수를 갖도록 만들어진 세포의 분화 가능성을 분석했다. 디지털 PCR에 의한 CHD7 mRNA의 카피 수의 결과를 표 8에 제시되어 있고, 분화 가능성의 결과는 도 18에 제시된다.
[표 8]
Figure pct00017
5ng의 총 RNA 중 CHD7 아이소폼 1 mRNA의 카피 수가 1502 카피(201B7) 또는 1760 카피(PFX#9)인 경우에도 201B7 및 PFX#9는 분화 가능성을 갖는다는 것이 나타났다(도 18). 표 7 및 표 8 및 도 17 및 도 18의 데이터를 기준으로 하여, 5ng의 총 RNA에서 단일 세포에서 적어도 피더 세포 없이 배양된 경우, 732 이하의 카피 수를 갖는 PSC는 분화하지 않지만, 1500 이하의 카피 수를 갖는 PSC는 분화 가능성을 유지한다는 수치 기준이 제안된다. 따라서, PSC의 CHD7 아이소폼 1의 카피 수는 PSC를 미분화된 상태로 유지하면서 분화 특성의 정도를 예측하기 위한 양호한 수치 마커일 수 있다.
6. CHD7 단백질의 발현 수준은 또한 PSC의 분화 가능성의 예측 마커이다:
CHD7의 mRNA의 카피 수뿐만 아니라 CHD7 단백질의 발현 수준과 PSC의 분화 가능성 사이의 관계를 연구하기 위해, CHD7 단백질의 발현 수준의 측정을 수행하였다.
각 세포의 배양 조건, CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수 및 분화 가능성의 결과는 표 9에 제시되어 있고, 샌드위치 ELISA의 결과는 도 19에 제시되어 있다.
[표 9]
Figure pct00018
그래프는 1000단위/mL로서 표준(P1과 동일한 단백질 용액 및 30 kDa(Millipor, UFC803024)에서 아미콘(등록 상표) Ultra-4, PLTK Ultracel-PL 멤브레인을 사용하여 4.06mg/mL의 농도로 농축됨)의 CHD7 단백질 농도에 대한 값을 나타낸다. F1/S5K의 경우, P1 및 P2의 CHD7 단백질 농도는 N의 단백질 농도와 비교하여 9.2배(N은 P1의 10.9%이다) 및 7.0배(N은 P2의 14.2%이다)였다. 유사하게, F1/S10K의 경우, 그것은 각각 10.2배(N은 P1의 9.8%이다) 및 7.7배(N은 P2의 13.0%이다)였고, F3/S5K의 경우에, 그것은 각각 6.0배(N은 P1의 16.6%이다) 및 5.0배(N은 P2의 19.8%이다)였고, F3/S10K의 경우에, 그것은 각각 10.3배(N은 P1의 9.7%이다) 및 8.5배(N은 P2의 11.7%)였다. 도 19에 도시된 바와 같이, CHD7 단백질 농도 및 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수는 분화 내성 PSC에서 낮다: 분화 자극에 반응하여 양호한 분화 가능성을 나타내는 PSC는 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 높은 CHD7 단백질 농도 및 높은 카피 수를 나타내는 것으로 확인되었고, PSC에서 CHD7 단백질의 발현 수준, 및 CHD7 아이소폼 1의 mRNA의 카피 수 및 분화 가능성 사이에 상관관계가 발견되었다. mRNA의 카피 수뿐만 아니라 CHD7 단백질의 발현 수준은 PSC가 미분화된 상태로 유지되는 동안 분화 특성의 정도를 예측하기 위한 양호한 수치 마커일 수 있다.
CHD7 단백질 수준 및 CHD7 유전자의 발현 수준을 사용하는 분석:
CHD7 단백질 수준 및 유전자 발현 수준을 고려하고 상기한 결과를 사용하여, 임계 값을 결정하였다.
[표 10]
Figure pct00019
[표 11]
Figure pct00020
점근선은 ELISA 결과로부터 수득된 mRNA 카피 수 및 단백질 농도(단위/mL)로부터 도출되었다(도 20). 점근선을 사용하여 계산된 경우, 5ng의 총 RNA에서 카피 수(y)가 1500 카피일 때 농도(x)는 56.6단위/mL였다. 이것은 N의 농도의 2.1배였다(N은 수득된 농도의 52%였다). 유사하게, 5ng의 총 RNA에서 카피 수(y)가 2710 카피일 때 농도(x)는 102.2단위/mL였다. 이것은 N의 농도의 3.8배였다(N은 수득된 농도의 74%였다). 설명에서, 상기 언급된 것들 이외의 카피 수(y)에서도 점근선을 사용함으로써 필요한 적절한 임계 값이 수득될 수 있고, 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측될 수 있음이 이해된다.
[산업상 이용 가능성]
PSC가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는지의 여부는 PSC에서 CHD7의 발현 수준을 측정하여 분화 자극을 적용하기 전에 미분화된 상태로 예측될 수 있다. 또한, PSC의 유지 배양에 사용된 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 특성을 보유하는 상태로 PSC를 유지하기에 적합한지의 여부도 또한 평가될 수 있다. 따라서, 본 발명은 분화 유도 동안 분화 내성을 나타내지 않고 종양 형성 위험이 감소된 hPSC를 제공하는 데 사용될 수 있고, hiPSC 유도 분화 세포를 사용하는 이식 요법에 매우 유용하다. 본 발명은 또한 분화 내성이 분화 유도 동안 나타나지 않도록 PSC의 유지 배양에 적합한 배지 및/또는 배양 조건을 검색하는데 유용하다.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 번호 2017-120024(출원일: 2017년 6월 19일) 및 일본에서 출원된 특허 출원 번호 2017-237420(출원일: 2017년 12월 12일)을 기초로 하고, 이의 내용은 본원에 완전히 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> FOUNDATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH AND INNOVATION AT KOBE <120> PREDICTION METHOD FOR POTENTIAL FOR DIFFERENTIATION IN PLURIPOTENT STEM CELL AND REAGENT THEREFOR <130> 092685 <150> JP 2017-120024 <151> 2017-06-19 <150> JP 2017-237420 <151> 2017-12-12 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11589 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (493)..(9486) <400> 1 gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcagcg gcggcggcgg cggcggcgcg ggggttgagt 60 cgtggtggtg cggacgcgct cgtgctcggg aactatcgga ttaaacttga atcgagtgaa 120 attacacaaa ggagcgccgc ggaggaggcg gcccggggac ccggacaccc tgaaactcac 180 cagagacccg ttcgcccccg gccaactccg tgcccgtgga ttcagccccc tggccgcagc 240 tgccgagcca actccggagc ccgctctgcg ttttgttttc ccctcggcac taggcagcgg 300 aggagcccga ccgacccgga cctatatcca gactttgcct gacactgcag ggtccaagag 360 aattaaagaa atatggaatg acatgaagaa gattagttaa ggattatagg ctttgagggc 420 aaacacctca gtgaagtgaa gcacaggcaa gctcctgagc tgtggtttgg aggagccgtg 480 tgttggaaga ag atg gca gat cca gga atg atg agt ctt ttt ggc gag gat 531 Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp 1 5 10 ggg aat att ttc agt gaa ggt ctt gaa ggc ctc gga gaa tgt ggt tac 579 Gly Asn Ile Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr 15 20 25 ccg gaa aat cca gta aat cct atg ggt cag caa atg cca ata gac caa 627 Pro Glu Asn Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln 30 35 40 45 ggc ttt gcc tct tta cag cca tcc ctt cat cat cct tca act aat caa 675 Gly Phe Ala Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln 50 55 60 aat caa aca aag ctg aca cat ttt gat cac tat aat cag tat gaa caa 723 Asn Gln Thr Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln 65 70 75 caa aag atg cat ctg atg gat cag ccg aac aga atg atg agc aac acc 771 Gln Lys Met His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr 80 85 90 cct ggg aac gga ctc gcg tct ccg cac tcg cag tat cac acc cct ccc 819 Pro Gly Asn Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro 95 100 105 gtt cct cag gtg ccc cat ggt ggc agt ggt ggc ggt cag atg ggt gtc 867 Val Pro Gln Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val 110 115 120 125 tac cct ggc atg cag aat gag agg cat ggg caa tcc ttt gtg gac agc 915 Tyr Pro Gly Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser 130 135 140 agc tcc atg tgg ggc ccc agg gct gtt cag gta cca gac cag ata cga 963 Ser Ser Met Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg 145 150 155 gcc ccc tac cag cag cag cag cca cag ccg cag cca ccg cag ccg gct 1011 Ala Pro Tyr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala 160 165 170 ccg tcg ggg ccc cct gca cag ggc cac cct cag cac atg cag cag atg 1059 Pro Ser Gly Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met 175 180 185 ggc agc tat atg gca cgt ggg gat ttt tcc atg cag cag cat ggt cag 1107 Gly Ser Tyr Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln 190 195 200 205 cca cag cag agg atg agc cag ttt tcc caa ggc caa gag ggc ctc aat 1155 Pro Gln Gln Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn 210 215 220 cag gga aat cct ttt att gcc acc tca gga cct ggc cac ttg tcc cac 1203 Gln Gly Asn Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His 225 230 235 gtg ccc cag cag agt ccc agc atg gca cct tcc ttg cgt cac tcg gtg 1251 Val Pro Gln Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val 240 245 250 cag cag ttc cat cac cac ccc tct act gct ctc cat gga gaa tcc gtt 1299 Gln Gln Phe His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val 255 260 265 gcc cac agt ccc aga ttc tcc ccg aat cct ccc caa caa ggg gct gtt 1347 Ala His Ser Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val 270 275 280 285 agg ccg caa acc ctt aac ttt agt tct cgg agc cag aca gtc ccc tct 1395 Arg Pro Gln Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser 290 295 300 cct act ata aac aac tca ggg cag tat tct cga tat cct tac agt aac 1443 Pro Thr Ile Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn 305 310 315 cta aat cag gga tta gtt aac aat aca ggg atg aat caa aat tta ggc 1491 Leu Asn Gln Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly 320 325 330 ctt aca aat aat act cca atg aat cag tcc gta cca aga tac ccc aat 1539 Leu Thr Asn Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn 335 340 345 gct gta gga ttc cca tca aac agt ggt caa gga cta atg cac cag cag 1587 Ala Val Gly Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln 350 355 360 365 ccc atc cac ccc agt ggc tca ctt aac caa atg aac aca caa act atg 1635 Pro Ile His Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met 370 375 380 cat cct tca cag cct cag gga act tat gcc tct cca cct ccc atg tca 1683 His Pro Ser Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser 385 390 395 ccc atg aaa gca atg agt aat cca gca ggc act cct cct cca caa gtc 1731 Pro Met Lys Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val 400 405 410 agg ccg gga agt gct ggg ata cca atg gaa gtt ggc agt tat cca aat 1779 Arg Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn 415 420 425 atg ccc cat cct cag cca tct cac cag ccc cct ggt gcc atg gga atc 1827 Met Pro His Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile 430 435 440 445 gga cag agg aat atg ggc ccc aga aac atg cag cag tct cgt cca ttt 1875 Gly Gln Arg Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe 450 455 460 ata ggc atg tcc tcg gca cca agg gaa ttg act ggg cac atg agg cca 1923 Ile Gly Met Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro 465 470 475 aat ggt tgt cct ggt gtt ggc ctt gga gac cca caa gca atc cag gaa 1971 Asn Gly Cys Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu 480 485 490 cga ctg ata cct ggc caa caa cat cct ggt caa cag cca tct ttt cag 2019 Arg Leu Ile Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln 495 500 505 cag ttg cca acc tgt cct cca ctg cag cct cac ccg ggc ttg cac cac 2067 Gln Leu Pro Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His 510 515 520 525 cag tct tca cct cca cac cct cat cac cag cct tgg gca cag ctc cac 2115 Gln Ser Ser Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His 530 535 540 cca tca ccc cag aac acc ccg cag aaa gtg cct gtg cat cag cat tcc 2163 Pro Ser Pro Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser 545 550 555 ccg tcg gag ccc ttt cta gag aaa cca gtg ccg gat atg act cag gtt 2211 Pro Ser Glu Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val 560 565 570 agt gga ccg aat gct cag cta gtg aag agt gat gat tac ctg cca tca 2259 Ser Gly Pro Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser 575 580 585 ata gaa cag cag cca caa caa aag aag aag aaa aag aaa aac aac cac 2307 Ile Glu Gln Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His 590 595 600 605 att gta gca gag gat ccc agt aaa ggt ttt ggt aaa gat gac ttc cct 2355 Ile Val Ala Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro 610 615 620 ggt ggg gta gat aac caa gaa cta aat agg aac tca ctg gat ggg tcc 2403 Gly Gly Val Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser 625 630 635 caa gaa gaa aaa aag aaa aag aaa agg tca aag gca aaa aaa gac ccg 2451 Gln Glu Glu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro 640 645 650 aag gaa ccg aaa gaa ccc aag gag aaa aaa gag ccc aag gaa ccc aag 2499 Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys 655 660 665 acc ccg aaa gcc cct aag att ccc aaa gag cca aag gaa aag aaa gca 2547 Thr Pro Lys Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala 670 675 680 685 aaa act gcc acg cca aaa ccc aaa tcc agc aaa aag tca agt aat aag 2595 Lys Thr Ala Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys 690 695 700 aaa cct gac tca gaa gca agt gct ttg aag aaa aag gtc aac aag gga 2643 Lys Pro Asp Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly 705 710 715 aaa aca gaa ggt tct gaa aat tca gac tta gac aaa aca ccc cca cca 2691 Lys Thr Glu Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro 720 725 730 tct cct cct cct gaa gaa gat gag gac cca ggt gtt cag aag aga cgg 2739 Ser Pro Pro Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg 735 740 745 tcc agc aga cag gtg aag aga aag cgc tac act gaa gac ctg gag ttc 2787 Ser Ser Arg Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe 750 755 760 765 aag att tct gat gag gag gca gat gat gca gat gct gct ggg agg gat 2835 Lys Ile Ser Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp 770 775 780 tcc ccc tcc aac acc tcc cag tca gaa cag cag gaa tct gtt gat gca 2883 Ser Pro Ser Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala 785 790 795 gaa ggc cca gtg gta gaa aaa att atg agc agt cgt tca gta aaa aag 2931 Glu Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys 800 805 810 cag aag gaa tct gga gag gag gta gaa att gag gaa ttc tat gtg aaa 2979 Gln Lys Glu Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys 815 820 825 tac aaa aac ttc tct tat ctt cat tgt cag tgg gca tct ata gaa gat 3027 Tyr Lys Asn Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp 830 835 840 845 ctg gaa aaa gat aag aga att cag caa aaa att aaa cga ttt aag gca 3075 Leu Glu Lys Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala 850 855 860 aag cag ggc cag aac aag ttc ctt tca gag att gag gat gag ctt ttt 3123 Lys Gln Gly Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe 865 870 875 aat cca gat tat gtg gag gtt gac cgg ata atg gac ttt gca cgt agc 3171 Asn Pro Asp Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser 880 885 890 aca gat gac cgg gga gag cct gtg act cac tat ctg gtg aag tgg tgt 3219 Thr Asp Asp Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys 895 900 905 tca ctt cct tat gaa gac agc acg tgg gag cgg agg cag gac ata gat 3267 Ser Leu Pro Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp 910 915 920 925 caa gca aag atc gag gag ttt gag aaa cta atg tcc agg gag ccg gaa 3315 Gln Ala Lys Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu 930 935 940 aca gag cgt gtg gag cga cct cct gct gat gat tgg aag aaa tcg gag 3363 Thr Glu Arg Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu 945 950 955 agt tcc agg gag tat aaa aac aat aac aaa ctc agg gaa tac cag ttg 3411 Ser Ser Arg Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu 960 965 970 gag gga gta aac tgg cta ctt ttc aat tgg tac aac atg cga aac tgc 3459 Glu Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys 975 980 985 att tta gca gat gaa atg ggt ttg gga aaa act atc cag tcc att aca 3507 Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr 990 995 1000 1005 ttt ctc tat gag ata tat ttg aaa gga atc cat ggc cct ttt tta 3552 Phe Leu Tyr Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu 1010 1015 1020 gta att gcc cca ttg tcc aca atc ccc aac tgg gaa agg gaa ttc 3597 Val Ile Ala Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe 1025 1030 1035 cga acc tgg aca gag ttg aac gtg gtt gtg tat cat ggg agt caa 3642 Arg Thr Trp Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln 1040 1045 1050 gct agt cgt cgg acc att cag ttg tat gaa atg tac ttc aaa gat 3687 Ala Ser Arg Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp 1055 1060 1065 ccc cag ggt cga gtg ata aag ggg tcc tat aag ttt cat gcc atc 3732 Pro Gln Gly Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile 1070 1075 1080 atc act aca ttt gag atg att ttg act gat tgt cct gag ctg cgg 3777 Ile Thr Thr Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg 1085 1090 1095 aat att cca tgg cgc tgt gta gtc att gat gaa gcc cac agg ctg 3822 Asn Ile Pro Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu 1100 1105 1110 aag aac agg aac tgc aag ctg ttg gag gga ctc aag atg atg gac 3867 Lys Asn Arg Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp 1115 1120 1125 ttg gaa cac aaa gtg ctg ctg acg gga acc cca ctc cag aac act 3912 Leu Glu His Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr 1130 1135 1140 gtg gaa gaa ctc ttc agc ttg ctt cat ttc ttg gaa cca agt cgc 3957 Val Glu Glu Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg 1145 1150 1155 ttc cct tca gaa acc aca ttt atg caa gaa ttt ggt gat cta aaa 4002 Phe Pro Ser Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys 1160 1165 1170 aca gaa gag cag gtg caa aaa ctt caa gct att cta aag cca atg 4047 Thr Glu Glu Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met 1175 1180 1185 atg ttg aga cgt ctc aaa gag gat gta gaa aag aac ttg gcc ccc 4092 Met Leu Arg Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro 1190 1195 1200 aaa gaa gaa act att att gaa gtt gag cta aca aac att cag aag 4137 Lys Glu Glu Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys 1205 1210 1215 aaa tat tac cga gcc atc ctt gag aag aat ttc aca ttt ctt tcc 4182 Lys Tyr Tyr Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser 1220 1225 1230 aaa ggc ggt ggt caa gct aac gta cct aac cta tta aac act atg 4227 Lys Gly Gly Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met 1235 1240 1245 atg gaa ttg cgg aag tgc tgc aat cat ccg tac ctt atc aat ggt 4272 Met Glu Leu Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly 1250 1255 1260 gct gaa gag aaa att ttg gaa gag ttt aaa gaa aca cac aat gca 4317 Ala Glu Glu Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala 1265 1270 1275 gag tct cca gat ttt cag ctc cag gca atg atc cag gct gct ggc 4362 Glu Ser Pro Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly 1280 1285 1290 aag cta gtg ctg att gac aag ctg ctg cca aaa ctg aag gct ggt 4407 Lys Leu Val Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly 1295 1300 1305 ggc cac agg gtg ctt atc ttt tcc cag atg gtg cgc tgc ttg gac 4452 Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp 1310 1315 1320 ata ctg gaa gac tac ctc att caa aga cgg tac cca tat gaa agg 4497 Ile Leu Glu Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg 1325 1330 1335 atc gac ggc cga gta aga ggc aac ctc cgc cag gca gct atc gac 4542 Ile Asp Gly Arg Val Arg Gly Asn Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp 1340 1345 1350 aga ttc tcc aaa cct gat tct gat agg ttt gtt ttc ctc ctg tgt 4587 Arg Phe Ser Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys 1355 1360 1365 aca agg gca gga ggt tta ggc att aac ctc act gct gct gat acc 4632 Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr 1370 1375 1380 tgc atc atc ttt gat tca gac tgg aat ccc caa aat gac ctc cag 4677 Cys Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln 1385 1390 1395 gct cag gct aga tgt cat aga ata gga cag agc aaa tct gtg aaa 4722 Ala Gln Ala Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys 1400 1405 1410 atc tac agg ctg att aca aga aat tcc tat gaa agg gaa atg ttc 4767 Ile Tyr Arg Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe 1415 1420 1425 gac aag gct agt ttg aaa ctg ggc ctg gat aaa gct gtg cta cag 4812 Asp Lys Ala Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln 1430 1435 1440 tct atg agt gga aga gaa aat gct acc aat ggg gta caa cag ctt 4857 Ser Met Ser Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu 1445 1450 1455 tcc aag aaa gaa ata gag gat ctt cta cga aaa ggg gcc tat ggt 4902 Ser Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly 1460 1465 1470 gca ctc atg gat gag gag gat gaa ggg tct aaa ttc tgt gaa gaa 4947 Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu 1475 1480 1485 gat att gat cag atc ctc cta cgt cga acc cac acc att acc att 4992 Asp Ile Asp Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile 1490 1495 1500 gag tca gaa ggg aaa ggt tcc aca ttt gct aag gcc agt ttt gtt 5037 Glu Ser Glu Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val 1505 1510 1515 gca tct gga aat agg aca gat att tcc ttg gat gat cca aat ttc 5082 Ala Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe 1520 1525 1530 tgg caa aag tgg gct aag aag gct gaa ttg gat att gat gcc tta 5127 Trp Gln Lys Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu 1535 1540 1545 aat ggg agg aac aac ctg gtt att gat act cca aga gtg aga aag 5172 Asn Gly Arg Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys 1550 1555 1560 cag acc agg ctc tac agt gca gtg aag gaa gat gag ctg atg gag 5217 Gln Thr Arg Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu 1565 1570 1575 ttc tca gac ttg gaa agt gat tct gaa gaa aag ccc tgt gca aag 5262 Phe Ser Asp Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys 1580 1585 1590 cca cgg cgt ccc cag gat aag tca cag ggc tat gca agg agt gaa 5307 Pro Arg Arg Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu 1595 1600 1605 tgt ttc agg gtg gag aag aat ctg ctt gtc tat ggt tgg gga cgg 5352 Cys Phe Arg Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Trp Gly Arg 1610 1615 1620 tgg aca gac att ctt tcc cac gga cgc tat aaa cgc caa ctc act 5397 Trp Thr Asp Ile Leu Ser His Gly Arg Tyr Lys Arg Gln Leu Thr 1625 1630 1635 gag caa gat gta gaa acc atc tgc aga acc atc ctg gtg tac tgt 5442 Glu Gln Asp Val Glu Thr Ile Cys Arg Thr Ile Leu Val Tyr Cys 1640 1645 1650 ctt aat cat tac aaa ggg gat gag aat atc aaa agc ttc atc tgg 5487 Leu Asn His Tyr Lys Gly Asp Glu Asn Ile Lys Ser Phe Ile Trp 1655 1660 1665 gat ctg atc aca ccc aca gcg gat ggc cag act cga gcc ttg gtc 5532 Asp Leu Ile Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gln Thr Arg Ala Leu Val 1670 1675 1680 aac cat tcc ggt ttg tca gct cct gtg cca agg gga agg aag gga 5577 Asn His Ser Gly Leu Ser Ala Pro Val Pro Arg Gly Arg Lys Gly 1685 1690 1695 aag aag gtg aaa gcc cag agc aca cag ccg gtg gtg cag gat gcc 5622 Lys Lys Val Lys Ala Gln Ser Thr Gln Pro Val Val Gln Asp Ala 1700 1705 1710 gac tgg ctg gcc agc tgc aac cca gat gcc ctg ttc cag gag gac 5667 Asp Trp Leu Ala Ser Cys Asn Pro Asp Ala Leu Phe Gln Glu Asp 1715 1720 1725 agc tac aag aaa cac ctg aag cat cac tgt aac aag gtc ctg ctg 5712 Ser Tyr Lys Lys His Leu Lys His His Cys Asn Lys Val Leu Leu 1730 1735 1740 cgt gtc cgc atg ctg tac tac cta aga caa gaa gtg ata gga gac 5757 Arg Val Arg Met Leu Tyr Tyr Leu Arg Gln Glu Val Ile Gly Asp 1745 1750 1755 cag gcg gat aag atc tta gag ggt gct gac tca agt gaa gcc gat 5802 Gln Ala Asp Lys Ile Leu Glu Gly Ala Asp Ser Ser Glu Ala Asp 1760 1765 1770 gtg tgg atc cct gaa cct ttc cat gct gaa gtt cct gca gat tgg 5847 Val Trp Ile Pro Glu Pro Phe His Ala Glu Val Pro Ala Asp Trp 1775 1780 1785 tgg gat aag gaa gca gac aaa tcc ctc tta att gga gtg ttc aaa 5892 Trp Asp Lys Glu Ala Asp Lys Ser Leu Leu Ile Gly Val Phe Lys 1790 1795 1800 cat ggc tat gag aag tac aac tcc atg cga gct gac ccc gcg ctg 5937 His Gly Tyr Glu Lys Tyr Asn Ser Met Arg Ala Asp Pro Ala Leu 1805 1810 1815 tgc ttt ctg gaa cga gtc ggt atg cct gat gcc aag gcc ata gct 5982 Cys Phe Leu Glu Arg Val Gly Met Pro Asp Ala Lys Ala Ile Ala 1820 1825 1830 gcc gag caa aga gga aca gac atg cta gca gat ggt ggt gac ggg 6027 Ala Glu Gln Arg Gly Thr Asp Met Leu Ala Asp Gly Gly Asp Gly 1835 1840 1845 gga gaa ttt gat aga gaa gat gaa gac cca gaa tat aaa cca acc 6072 Gly Glu Phe Asp Arg Glu Asp Glu Asp Pro Glu Tyr Lys Pro Thr 1850 1855 1860 aga aca ccg ttc aaa gat gaa ata gat gaa ttt gca aat tct cct 6117 Arg Thr Pro Phe Lys Asp Glu Ile Asp Glu Phe Ala Asn Ser Pro 1865 1870 1875 tca gag gat aag gaa gaa tcc atg gaa ata cat gcc aca ggc aag 6162 Ser Glu Asp Lys Glu Glu Ser Met Glu Ile His Ala Thr Gly Lys 1880 1885 1890 cac agt gag agt aat gct gag tta ggc caa ctt tac tgg cct aac 6207 His Ser Glu Ser Asn Ala Glu Leu Gly Gln Leu Tyr Trp Pro Asn 1895 1900 1905 act tca acc ctg act aca cgt ctg cgc cgg ctc att act gcc tat 6252 Thr Ser Thr Leu Thr Thr Arg Leu Arg Arg Leu Ile Thr Ala Tyr 1910 1915 1920 cag cgc agc tat aaa agg caa cag atg agg caa gag gcc cta atg 6297 Gln Arg Ser Tyr Lys Arg Gln Gln Met Arg Gln Glu Ala Leu Met 1925 1930 1935 aag act gac cgg cgc aga cgg cgg cct cga gag gaa gtg aga gct 6342 Lys Thr Asp Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Glu Glu Val Arg Ala 1940 1945 1950 ctg gaa gcg gaa agg gaa gct att ata tct gag aag cgg caa aag 6387 Leu Glu Ala Glu Arg Glu Ala Ile Ile Ser Glu Lys Arg Gln Lys 1955 1960 1965 tgg aca aga aga gaa gag gct gat ttt tac cgt gtg gta tcc acc 6432 Trp Thr Arg Arg Glu Glu Ala Asp Phe Tyr Arg Val Val Ser Thr 1970 1975 1980 ttt ggg gtt att ttt gac cct gtg aaa cag caa ttt gac tgg aac 6477 Phe Gly Val Ile Phe Asp Pro Val Lys Gln Gln Phe Asp Trp Asn 1985 1990 1995 caa ttt aga gcc ttt gcc agg ctt gac aaa aaa tct gat gag agt 6522 Gln Phe Arg Ala Phe Ala Arg Leu Asp Lys Lys Ser Asp Glu Ser 2000 2005 2010 ttg gag aaa tac ttc agt tgt ttt gtg gcc atg tgt agg cga gta 6567 Leu Glu Lys Tyr Phe Ser Cys Phe Val Ala Met Cys Arg Arg Val 2015 2020 2025 tgt cga atg ccc gtc aag cca gat gat gaa ccg ccc gac ctc tcc 6612 Cys Arg Met Pro Val Lys Pro Asp Asp Glu Pro Pro Asp Leu Ser 2030 2035 2040 tcc ata att gag ccg atc aca gag gag cga gcc tct cga act ctg 6657 Ser Ile Ile Glu Pro Ile Thr Glu Glu Arg Ala Ser Arg Thr Leu 2045 2050 2055 tac cgc att gag ctg cta cgg aag atc cgc gag cag gtt ctc cat 6702 Tyr Arg Ile Glu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Glu Gln Val Leu His 2060 2065 2070 cac ccc cag ctg gga gag agg ctt aag ctc tgc cag cca agc ttg 6747 His Pro Gln Leu Gly Glu Arg Leu Lys Leu Cys Gln Pro Ser Leu 2075 2080 2085 gat ctg cca gag tgg tgg gag tgt gga cgg cat gac cga gac ttg 6792 Asp Leu Pro Glu Trp Trp Glu Cys Gly Arg His Asp Arg Asp Leu 2090 2095 2100 ctg gtt ggt gct gct aaa cac ggg gtc agt cgg acg gat tat cac 6837 Leu Val Gly Ala Ala Lys His Gly Val Ser Arg Thr Asp Tyr His 2105 2110 2115 atc ctc aat gac cct gag tta tcc ttc ttg gat gca cat aaa aac 6882 Ile Leu Asn Asp Pro Glu Leu Ser Phe Leu Asp Ala His Lys Asn 2120 2125 2130 ttt gct caa aac aga ggg gca ggt aat aca tct tcc ttg aac cca 6927 Phe Ala Gln Asn Arg Gly Ala Gly Asn Thr Ser Ser Leu Asn Pro 2135 2140 2145 ctg gca gtt gga ttt gtc cag act cct cca gtc atc tca tct gct 6972 Leu Ala Val Gly Phe Val Gln Thr Pro Pro Val Ile Ser Ser Ala 2150 2155 2160 cat att caa gat gag agg gta ctg gaa caa gcc gaa ggc aaa gtg 7017 His Ile Gln Asp Glu Arg Val Leu Glu Gln Ala Glu Gly Lys Val 2165 2170 2175 gag gag cct gaa aac cca gct gcc aag gag aaa tgt gag ggc aaa 7062 Glu Glu Pro Glu Asn Pro Ala Ala Lys Glu Lys Cys Glu Gly Lys 2180 2185 2190 gaa gag gaa gaa gaa acc gat ggc agc ggg aag gag agc aag cag 7107 Glu Glu Glu Glu Glu Thr Asp Gly Ser Gly Lys Glu Ser Lys Gln 2195 2200 2205 gaa tgt gag gca gag gcc agc tct gtg aaa aat gaa ctg aaa ggt 7152 Glu Cys Glu Ala Glu Ala Ser Ser Val Lys Asn Glu Leu Lys Gly 2210 2215 2220 gtt gag gtc ggc gca gac act ggg tcc aaa tct att tca gag aaa 7197 Val Glu Val Gly Ala Asp Thr Gly Ser Lys Ser Ile Ser Glu Lys 2225 2230 2235 ggt tcc gaa gag gat gaa gag gaa aag ctg gag gat gac gat aag 7242 Gly Ser Glu Glu Asp Glu Glu Glu Lys Leu Glu Asp Asp Asp Lys 2240 2245 2250 tcg gaa gag tct tcc cag ccc gaa gca gga gct gtc tct aga ggg 7287 Ser Glu Glu Ser Ser Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Ser Arg Gly 2255 2260 2265 aag aat ttt gat gaa gaa agc aat gct tcc atg agc act gct aga 7332 Lys Asn Phe Asp Glu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Thr Ala Arg 2270 2275 2280 gat gaa acc cga gat gga ttc tac atg gag gac gga gat cct tca 7377 Asp Glu Thr Arg Asp Gly Phe Tyr Met Glu Asp Gly Asp Pro Ser 2285 2290 2295 gta gct cag ctc ctt cat gaa aga aca ttt gcc ttc tcg ttt tgg 7422 Val Ala Gln Leu Leu His Glu Arg Thr Phe Ala Phe Ser Phe Trp 2300 2305 2310 cct aag gat aga gta atg ata aac cgc tta gac aac atc tgt gaa 7467 Pro Lys Asp Arg Val Met Ile Asn Arg Leu Asp Asn Ile Cys Glu 2315 2320 2325 gca gtg ttg aaa ggc aaa tgg cca gta aat agg cgc cag atg ttt 7512 Ala Val Leu Lys Gly Lys Trp Pro Val Asn Arg Arg Gln Met Phe 2330 2335 2340 gat ttc caa ggc ctc atc cca ggt tac aca ccc acc aca gtg gac 7557 Asp Phe Gln Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Asp 2345 2350 2355 agc ccc ttg cag aag agg agc ttt gct gag ctc tcc atg gtc ggc 7602 Ser Pro Leu Gln Lys Arg Ser Phe Ala Glu Leu Ser Met Val Gly 2360 2365 2370 caa gcc agc att agt ggg agt gag gac atc act acg tct cct cag 7647 Gln Ala Ser Ile Ser Gly Ser Glu Asp Ile Thr Thr Ser Pro Gln 2375 2380 2385 ttg tca aag gaa gat gcc ctc aac ctc tct gtc cct cgc cag cgg 7692 Leu Ser Lys Glu Asp Ala Leu Asn Leu Ser Val Pro Arg Gln Arg 2390 2395 2400 agg agg agg agg aga aaa atc gaa att gag gcc gaa aga gct gcc 7737 Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ile Glu Ile Glu Ala Glu Arg Ala Ala 2405 2410 2415 aag agg cga aat ctc atg gag atg gtt gcc cag ctt cga gag tct 7782 Lys Arg Arg Asn Leu Met Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Glu Ser 2420 2425 2430 cag gtg gtc tca gaa aat gga caa gaa aaa gtt gta gat tta tca 7827 Gln Val Val Ser Glu Asn Gly Gln Glu Lys Val Val Asp Leu Ser 2435 2440 2445 aag gcc tca aga gag gca aca agc tct acc tca aat ttt tca tct 7872 Lys Ala Ser Arg Glu Ala Thr Ser Ser Thr Ser Asn Phe Ser Ser 2450 2455 2460 ctt tct tca aag ttt atc ttg cct aat gtc tca aca cca gtg tct 7917 Leu Ser Ser Lys Phe Ile Leu Pro Asn Val Ser Thr Pro Val Ser 2465 2470 2475 gat gcc ttt aag act caa atg gaa ctg ctc caa gca ggc ctt tcg 7962 Asp Ala Phe Lys Thr Gln Met Glu Leu Leu Gln Ala Gly Leu Ser 2480 2485 2490 cgc aca ccc aca agg cat ctc ctt aat ggc tcc cta gtg gat gga 8007 Arg Thr Pro Thr Arg His Leu Leu Asn Gly Ser Leu Val Asp Gly 2495 2500 2505 gag cct ccc atg aag agg agg cgg gga agg agg aaa aat gtg gag 8052 Glu Pro Pro Met Lys Arg Arg Arg Gly Arg Arg Lys Asn Val Glu 2510 2515 2520 gga ctt gat ctg ctt ttc atg agc cac aaa cgg acg tca ttg agt 8097 Gly Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser His Lys Arg Thr Ser Leu Ser 2525 2530 2535 gca gag gat gct gag gtg acc aaa gct ttt gaa gaa gat ata gag 8142 Ala Glu Asp Ala Glu Val Thr Lys Ala Phe Glu Glu Asp Ile Glu 2540 2545 2550 acc cca cca aca aga aac att cct tct ccc gga cag ctg gac cca 8187 Thr Pro Pro Thr Arg Asn Ile Pro Ser Pro Gly Gln Leu Asp Pro 2555 2560 2565 gac aca cgg atc cct gtt atc aat ctt gaa gat ggg act agg ctg 8232 Asp Thr Arg Ile Pro Val Ile Asn Leu Glu Asp Gly Thr Arg Leu 2570 2575 2580 gtg ggg gaa gat gct cct aaa aat aag gat tta gtt gaa tgg ctg 8277 Val Gly Glu Asp Ala Pro Lys Asn Lys Asp Leu Val Glu Trp Leu 2585 2590 2595 aag ctg cac cct act tac act gtt gat atg cca agt tat gta cca 8322 Lys Leu His Pro Thr Tyr Thr Val Asp Met Pro Ser Tyr Val Pro 2600 2605 2610 aag aat gca gat gtg ctg ttt tcc tca ttt cag aaa ccg aaa cag 8367 Lys Asn Ala Asp Val Leu Phe Ser Ser Phe Gln Lys Pro Lys Gln 2615 2620 2625 aaa cga cat aga tgt cga aac cct aat aaa ttg gat ata aac act 8412 Lys Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr 2630 2635 2640 ttg aca gga gaa gaa agg gtg cct gtt gtc aat aaa cga aat ggg 8457 Leu Thr Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly 2645 2650 2655 aag aag atg ggt gga gct atg gcg cct cca atg aag gat cta ccc 8502 Lys Lys Met Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro 2660 2665 2670 agg tgg ctg gaa gaa aat cct gaa ttt gca gtt gct cca gac tgg 8547 Arg Trp Leu Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp 2675 2680 2685 act gat ata gtt aag cag tct ggt ttt gtt cct gag tcg atg ttt 8592 Thr Asp Ile Val Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe 2690 2695 2700 gac cgc ctt ctc act ggg cct gta gtg cgg gga gag gga gcg agc 8637 Asp Arg Leu Leu Thr Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser 2705 2710 2715 aga aga gga aga agg ccc aaa agt gag atc gcc aga gca gcc gcg 8682 Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala 2720 2725 2730 gcc gcc gct gct gtg gcc tcc acg tca ggg atc aac cct ttg ctg 8727 Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu 2735 2740 2745 gtg aac agc ctg ttt gct gga atg gac ctg acg agc ctt cag aat 8772 Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn 2750 2755 2760 ctc cag aat ctc cag tcg ctc cag ctg gca ggc ctc atg ggc ttc 8817 Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala Gly Leu Met Gly Phe 2765 2770 2775 cct cca gga ctg gca aca gct gcc acc gcc gga ggc gat gcg aag 8862 Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asp Ala Lys 2780 2785 2790 aac cct gct gct gtg ctg ccc ctg atg ctg cca gga atg gcg ggc 8907 Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly Met Ala Gly 2795 2800 2805 ctg ccc aac gtg ttt ggc ttg ggc ggg ctg ttg aat aac cct ctg 8952 Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn Pro Leu 2810 2815 2820 tca gct gct act gga aac acc act act gct tct agt caa gga gaa 8997 Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly Glu 2825 2830 2835 ccg gaa gac agc act tca aaa gga gag gag aaa gga aat gag aat 9042 Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn 2840 2845 2850 gaa gac gag aac aaa gac tct gag aaa agc aca gat gct gtt tcg 9087 Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser 2855 2860 2865 gct gct gac tct gcg aat gga tct gtt ggt gct gct act gcc ccg 9132 Ala Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro 2870 2875 2880 gct gga ttg ccc tca aac ccg cta gcc ttc aac cct ttc ctc ctg 9177 Ala Gly Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu 2885 2890 2895 tcc aca atg gcc ccg ggc ctc ttc tac cca tcc atg ttt cta cct 9222 Ser Thr Met Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro 2900 2905 2910 cca gga ctg ggg gga ttg acg ctg cct ggg ttc cca gca ttg gca 9267 Pro Gly Leu Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala 2915 2920 2925 gga ctt cag aat gcc gtg ggc tcc agc gaa gaa aag gct gct gac 9312 Gly Leu Gln Asn Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp 2930 2935 2940 aag gct gag gga gga ccc ttt aaa gat gga gag acc ctt gaa ggc 9357 Lys Ala Glu Gly Gly Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly 2945 2950 2955 agc gat gcc gag gag agc ctg gat aag act gca gag tcc tcc ctc 9402 Ser Asp Ala Glu Glu Ser Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu 2960 2965 2970 tta gaa gac gaa ata gca cag ggt gaa gag cta gac tca ctt gat 9447 Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp 2975 2980 2985 ggg ggg gat gaa ata gaa aac aat gaa aat gat gaa taa ccagtaccag 9496 Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn Glu Asn Asp Glu 2990 2995 ttccagttca agtgtttaaa acttttgaca agtggtagtc ctactgttta cactcacagt 9556 taatgttcat acctagtttt ataagctgtt ctgtaacata gtgtagcaaa aaaaaaagtt 9616 caagtcatgt tatacaggtg tgtcaaaagg tatcttggtc attaagtatt gtgcagtgca 9676 ttatttatta tccctaggag agatgaaatt tgagaggtga tcatgtcttt ttaaggaaac 9736 ttacataatg ctctgctttt tttttttctc ttggtaccat tggtattata ataaagagca 9796 atttgtaact gagtggcact aatggaagaa agtgctgctc aaaggaagta tgaagttata 9856 tatttaattt tttaatttta atttttaatt tttttgctgt gaaggtcaag ctgaaattta 9916 ccatacatat catacttgct catttgtttc cctttttgac tgtatggggg ttcccacact 9976 cgtgcataca cacacatcca tacactctga caatctccac gctagtgtga acgcctctgt 10036 cccgaggcgc agcaataata aggcagctgt tgaatgtgaa gggtcccttt ggaaaattaa 10096 cctactggga gggttcttgc cagacagaac tacagttcca ttgtctcgtg gtcttgtaat 10156 gcactggtaa aaacaaaata aatagatgaa taaataaaga gtgagagaag agagaatcag 10216 gtaccttttt taaattaaag gactttgtta ctttagccac aaagctaaaa cagcattacc 10276 tcagctctaa actagccttg aagtttacag acatgacttt gtaaatgtat tgtttttctt 10336 tgttgtgatg tccttttatt tttttctttg aaaactgcta tcatgtaaga taaaatgtaa 10396 attgctgcca actgtagtaa tgatgctttt aataaaagtg acccatgata tgcagagatg 10456 taattataga atgtagtata tagggaaact ggtgttcact ctattttttt tgtattcgca 10516 atagatgcaa atacagcatt ctggcttttg tacagtttct tgatatatcc tcttatacta 10576 gattagcttt tggtaagaca ctaaactgtc tcgaagacta gacaggaagg aaaaccttga 10636 attactctca cataattcca ctccagatat ctcaacagaa atgcatacaa aaagctccta 10696 ttactccctc aaaagggcat ctgagaccga gaatacttag aaatgtgtgc agcgtgtgat 10756 aatgtggtac actgaagaac aaaagggcaa aagaaaaatg aggctttaac aggcacaata 10816 tctaggtcat ttatccttgg ttaatgggta gaaaaacaca atgcggtagt gtcagcaagg 10876 gacacaaagg cactctggtg tcctgcagac cagcgctcga tgccagaaac cagtgtgtgg 10936 aaaaacccat gtggaattga aacagaccca cttaagcacg cacgcgcgca cgcacggtct 10996 caggagctac tgatttgtgg accccttttt gacctttggt atttaaagta aaatataatt 11056 tgagatctac tgttttcacc tttttatgtc acctgaacca acacaaagcc atatttccat 11116 ccagttaaaa agcaggggaa gggatgtgga cgagagtgtt tcgtgtgtgt tgccttcctc 11176 cacacccttc ccccaggacg tccgcacaca gtccacctcc agccagtgtg ctgccagaca 11236 ggtggtctaa attcctccca gactgtgaga ttcagttcgt ttatgcccca agatgaaaat 11296 atgcccctta atgattctgg gaaagaaaca acctgaaccc tccaccttac agatcctgtg 11356 attgctttta tttatcatcg tcgttgtctg ctgaaagtga atgggccgtg cacactggag 11416 gaaagtgcct tgaagagaat attttttgaa agggaattat ttgaacacgg gaaagtgaaa 11476 ctaggtctgc atgaagtata ggaaatttaa gtatttaagt aacaaagatg ttagcaggga 11536 gaatttgctt aataaaatga gtcattaaag ggtgtttttt ttaaaaaaaa aaa 11589 <210> 2 <211> 2997 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile 1 5 10 15 Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn 20 25 30 Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala 35 40 45 Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr 50 55 60 Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met 65 70 75 80 His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn 85 90 95 Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln 100 105 110 Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly 115 120 125 Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met 130 135 140 Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly 165 170 175 Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr 180 185 190 Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln 195 200 205 Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn 210 215 220 Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln 225 230 235 240 Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe 245 250 255 His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser 260 265 270 Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln 275 280 285 Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile 290 295 300 Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln 305 310 315 320 Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn 325 330 335 Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly 340 345 350 Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His 355 360 365 Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser 370 375 380 Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys 385 390 395 400 Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly 405 410 415 Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His 420 425 430 Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg 435 440 445 Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met 450 455 460 Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys 465 470 475 480 Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile 485 490 495 Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro 500 505 510 Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser 515 520 525 Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro 530 535 540 Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu 545 550 555 560 Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro 565 570 575 Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln 580 585 590 Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala 595 600 605 Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val 610 615 620 Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu 625 630 635 640 Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro 645 650 655 Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys 660 665 670 Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala 675 680 685 Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp 690 695 700 Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu 705 710 715 720 Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro 725 730 735 Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg 740 745 750 Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser 755 760 765 Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser 770 775 780 Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro 785 790 795 800 Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu 805 810 815 Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn 820 825 830 Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys 835 840 845 Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly 850 855 860 Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp 865 870 875 880 Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp 885 890 895 Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro 900 905 910 Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys 915 920 925 Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg 930 935 940 Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg 945 950 955 960 Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val 965 970 975 Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala 980 985 990 Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr 995 1000 1005 Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala 1010 1015 1020 Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp 1025 1030 1035 Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg 1040 1045 1050 Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly 1055 1060 1065 Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr 1070 1075 1080 Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro 1085 1090 1095 Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg 1100 1105 1110 Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His 1115 1120 1125 Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu 1130 1135 1140 Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser 1145 1150 1155 Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu 1160 1165 1170 Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg 1175 1180 1185 Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu 1190 1195 1200 Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr 1205 1210 1215 Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly 1220 1225 1230 Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu 1235 1240 1245 Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu 1250 1255 1260 Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro 1265 1270 1275 Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val 1280 1285 1290 Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg 1295 1300 1305 Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu 1310 1315 1320 Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly 1325 1330 1335 Arg Val Arg Gly Asn Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp Arg Phe Ser 1340 1345 1350 Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala 1355 1360 1365 Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile 1370 1375 1380 Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala 1385 1390 1395 Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg 1400 1405 1410 Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala 1415 1420 1425 Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser 1430 1435 1440 Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys 1445 1450 1455 Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met 1460 1465 1470 Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp 1475 1480 1485 Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu 1490 1495 1500 Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly 1505 1510 1515 Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys 1520 1525 1530 Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg 1535 1540 1545 Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg 1550 1555 1560 Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp 1565 1570 1575 Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg 1580 1585 1590 Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg 1595 1600 1605 Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Trp Gly Arg Trp Thr Asp 1610 1615 1620 Ile Leu Ser His Gly Arg Tyr Lys Arg Gln Leu Thr Glu Gln Asp 1625 1630 1635 Val Glu Thr Ile Cys Arg Thr Ile Leu Val Tyr Cys Leu Asn His 1640 1645 1650 Tyr Lys Gly Asp Glu Asn Ile Lys Ser Phe Ile Trp Asp Leu Ile 1655 1660 1665 Thr Pro Thr Ala Asp Gly Gln Thr Arg Ala Leu Val Asn His Ser 1670 1675 1680 Gly Leu Ser Ala Pro Val Pro Arg Gly Arg Lys Gly Lys Lys Val 1685 1690 1695 Lys Ala Gln Ser Thr Gln Pro Val Val Gln Asp Ala Asp Trp Leu 1700 1705 1710 Ala Ser Cys Asn Pro Asp Ala Leu Phe Gln Glu Asp Ser Tyr Lys 1715 1720 1725 Lys His Leu Lys His His Cys Asn Lys Val Leu Leu Arg Val Arg 1730 1735 1740 Met Leu Tyr Tyr Leu Arg Gln Glu Val Ile Gly Asp Gln Ala Asp 1745 1750 1755 Lys Ile Leu Glu Gly Ala Asp Ser Ser Glu Ala Asp Val Trp Ile 1760 1765 1770 Pro Glu Pro Phe His Ala Glu Val Pro Ala Asp Trp Trp Asp Lys 1775 1780 1785 Glu Ala Asp Lys Ser Leu Leu Ile Gly Val Phe Lys His Gly Tyr 1790 1795 1800 Glu Lys Tyr Asn Ser Met Arg Ala Asp Pro Ala Leu Cys Phe Leu 1805 1810 1815 Glu Arg Val Gly Met Pro Asp Ala Lys Ala Ile Ala Ala Glu Gln 1820 1825 1830 Arg Gly Thr Asp Met Leu Ala Asp Gly Gly Asp Gly Gly Glu Phe 1835 1840 1845 Asp Arg Glu Asp Glu Asp Pro Glu Tyr Lys Pro Thr Arg Thr Pro 1850 1855 1860 Phe Lys Asp Glu Ile Asp Glu Phe Ala Asn Ser Pro Ser Glu Asp 1865 1870 1875 Lys Glu Glu Ser Met Glu Ile His Ala Thr Gly Lys His Ser Glu 1880 1885 1890 Ser Asn Ala Glu Leu Gly Gln Leu Tyr Trp Pro Asn Thr Ser Thr 1895 1900 1905 Leu Thr Thr Arg Leu Arg Arg Leu Ile Thr Ala Tyr Gln Arg Ser 1910 1915 1920 Tyr Lys Arg Gln Gln Met Arg Gln Glu Ala Leu Met Lys Thr Asp 1925 1930 1935 Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Glu Glu Val Arg Ala Leu Glu Ala 1940 1945 1950 Glu Arg Glu Ala Ile Ile Ser Glu Lys Arg Gln Lys Trp Thr Arg 1955 1960 1965 Arg Glu Glu Ala Asp Phe Tyr Arg Val Val Ser Thr Phe Gly Val 1970 1975 1980 Ile Phe Asp Pro Val Lys Gln Gln Phe Asp Trp Asn Gln Phe Arg 1985 1990 1995 Ala Phe Ala Arg Leu Asp Lys Lys Ser Asp Glu Ser Leu Glu Lys 2000 2005 2010 Tyr Phe Ser Cys Phe Val Ala Met Cys Arg Arg Val Cys Arg Met 2015 2020 2025 Pro Val Lys Pro Asp Asp Glu Pro Pro Asp Leu Ser Ser Ile Ile 2030 2035 2040 Glu Pro Ile Thr Glu Glu Arg Ala Ser Arg Thr Leu Tyr Arg Ile 2045 2050 2055 Glu Leu Leu Arg Lys Ile Arg Glu Gln Val Leu His His Pro Gln 2060 2065 2070 Leu Gly Glu Arg Leu Lys Leu Cys Gln Pro Ser Leu Asp Leu Pro 2075 2080 2085 Glu Trp Trp Glu Cys Gly Arg His Asp Arg Asp Leu Leu Val Gly 2090 2095 2100 Ala Ala Lys His Gly Val Ser Arg Thr Asp Tyr His Ile Leu Asn 2105 2110 2115 Asp Pro Glu Leu Ser Phe Leu Asp Ala His Lys Asn Phe Ala Gln 2120 2125 2130 Asn Arg Gly Ala Gly Asn Thr Ser Ser Leu Asn Pro Leu Ala Val 2135 2140 2145 Gly Phe Val Gln Thr Pro Pro Val Ile Ser Ser Ala His Ile Gln 2150 2155 2160 Asp Glu Arg Val Leu Glu Gln Ala Glu Gly Lys Val Glu Glu Pro 2165 2170 2175 Glu Asn Pro Ala Ala Lys Glu Lys Cys Glu Gly Lys Glu Glu Glu 2180 2185 2190 Glu Glu Thr Asp Gly Ser Gly Lys Glu Ser Lys Gln Glu Cys Glu 2195 2200 2205 Ala Glu Ala Ser Ser Val Lys Asn Glu Leu Lys Gly Val Glu Val 2210 2215 2220 Gly Ala Asp Thr Gly Ser Lys Ser Ile Ser Glu Lys Gly Ser Glu 2225 2230 2235 Glu Asp Glu Glu Glu Lys Leu Glu Asp Asp Asp Lys Ser Glu Glu 2240 2245 2250 Ser Ser Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Ser Arg Gly Lys Asn Phe 2255 2260 2265 Asp Glu Glu Ser Asn Ala Ser Met Ser Thr Ala Arg Asp Glu Thr 2270 2275 2280 Arg Asp Gly Phe Tyr Met Glu Asp Gly Asp Pro Ser Val Ala Gln 2285 2290 2295 Leu Leu His Glu Arg Thr Phe Ala Phe Ser Phe Trp Pro Lys Asp 2300 2305 2310 Arg Val Met Ile Asn Arg Leu Asp Asn Ile Cys Glu Ala Val Leu 2315 2320 2325 Lys Gly Lys Trp Pro Val Asn Arg Arg Gln Met Phe Asp Phe Gln 2330 2335 2340 Gly Leu Ile Pro Gly Tyr Thr Pro Thr Thr Val Asp Ser Pro Leu 2345 2350 2355 Gln Lys Arg Ser Phe Ala Glu Leu Ser Met Val Gly Gln Ala Ser 2360 2365 2370 Ile Ser Gly Ser Glu Asp Ile Thr Thr Ser Pro Gln Leu Ser Lys 2375 2380 2385 Glu Asp Ala Leu Asn Leu Ser Val Pro Arg Gln Arg Arg Arg Arg 2390 2395 2400 Arg Arg Lys Ile Glu Ile Glu Ala Glu Arg Ala Ala Lys Arg Arg 2405 2410 2415 Asn Leu Met Glu Met Val Ala Gln Leu Arg Glu Ser Gln Val Val 2420 2425 2430 Ser Glu Asn Gly Gln Glu Lys Val Val Asp Leu Ser Lys Ala Ser 2435 2440 2445 Arg Glu Ala Thr Ser Ser Thr Ser Asn Phe Ser Ser Leu Ser Ser 2450 2455 2460 Lys Phe Ile Leu Pro Asn Val Ser Thr Pro Val Ser Asp Ala Phe 2465 2470 2475 Lys Thr Gln Met Glu Leu Leu Gln Ala Gly Leu Ser Arg Thr Pro 2480 2485 2490 Thr Arg His Leu Leu Asn Gly Ser Leu Val Asp Gly Glu Pro Pro 2495 2500 2505 Met Lys Arg Arg Arg Gly Arg Arg Lys Asn Val Glu Gly Leu Asp 2510 2515 2520 Leu Leu Phe Met Ser His Lys Arg Thr Ser Leu Ser Ala Glu Asp 2525 2530 2535 Ala Glu Val Thr Lys Ala Phe Glu Glu Asp Ile Glu Thr Pro Pro 2540 2545 2550 Thr Arg Asn Ile Pro Ser Pro Gly Gln Leu Asp Pro Asp Thr Arg 2555 2560 2565 Ile Pro Val Ile Asn Leu Glu Asp Gly Thr Arg Leu Val Gly Glu 2570 2575 2580 Asp Ala Pro Lys Asn Lys Asp Leu Val Glu Trp Leu Lys Leu His 2585 2590 2595 Pro Thr Tyr Thr Val Asp Met Pro Ser Tyr Val Pro Lys Asn Ala 2600 2605 2610 Asp Val Leu Phe Ser Ser Phe Gln Lys Pro Lys Gln Lys Arg His 2615 2620 2625 Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu Thr Gly 2630 2635 2640 Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys Met 2645 2650 2655 Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu 2660 2665 2670 Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile 2675 2680 2685 Val Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu 2690 2695 2700 Leu Thr Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly 2705 2710 2715 Arg Arg Pro Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala 2720 2725 2730 Ala Val Ala Ser Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser 2735 2740 2745 Leu Phe Ala Gly Met Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn 2750 2755 2760 Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly 2765 2770 2775 Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala 2780 2785 2790 Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly Met Ala Gly Leu Pro Asn 2795 2800 2805 Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn Pro Leu Ser Ala Ala 2810 2815 2820 Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly Glu Pro Glu Asp 2825 2830 2835 Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn Glu Asp Glu 2840 2845 2850 Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser Ala Ala Asp 2855 2860 2865 Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly Leu 2870 2875 2880 Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr Met 2885 2890 2895 Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu 2900 2905 2910 Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln 2915 2920 2925 Asn Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu 2930 2935 2940 Gly Gly Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala 2945 2950 2955 Glu Glu Ser Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp 2960 2965 2970 Glu Ile Ala Gln Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp 2975 2980 2985 Glu Ile Glu Asn Asn Glu Asn Asp Glu 2990 2995 <210> 3 <211> 5124 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (175)..(3021) <400> 3 gacctatatc cagactttgc ctgacactgc agggtccaag agaattaaag aaatatggaa 60 tgacatgaag aagattagtt aaggattata ggctttgagg gcaaacacct cagtgaagtg 120 aagcacaggc aagctcctga gctgtggttt ggaggagccg tgtgttggaa gaag atg 177 Met 1 gca gat cca gga atg atg agt ctt ttt ggc gag gat ggg aat att ttc 225 Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile Phe 5 10 15 agt gaa ggt ctt gaa ggc ctc gga gaa tgt ggt tac ccg gaa aat cca 273 Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn Pro 20 25 30 gta aat cct atg ggt cag caa atg cca ata gac caa ggc ttt gcc tct 321 Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala Ser 35 40 45 tta cag cca tcc ctt cat cat cct tca act aat caa aat caa aca aag 369 Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr Lys 50 55 60 65 ctg aca cat ttt gat cac tat aat cag tat gaa caa caa aag atg cat 417 Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met His 70 75 80 ctg atg gat cag ccg aac aga atg atg agc aac acc cct ggg aac gga 465 Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn Gly 85 90 95 ctc gcg tct ccg cac tcg cag tat cac acc cct ccc gtt cct cag gtg 513 Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln Val 100 105 110 ccc cat ggt ggc agt ggt ggc ggt cag atg ggt gtc tac cct ggc atg 561 Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly Met 115 120 125 cag aat gag agg cat ggg caa tcc ttt gtg gac agc agc tcc atg tgg 609 Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met Trp 130 135 140 145 ggc ccc agg gct gtt cag gta cca gac cag ata cga gcc ccc tac cag 657 Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr Gln 150 155 160 cag cag cag cca cag ccg cag cca ccg cag ccg gct ccg tcg ggg ccc 705 Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly Pro 165 170 175 cct gca cag ggc cac cct cag cac atg cag cag atg ggc agc tat atg 753 Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr Met 180 185 190 gca cgt ggg gat ttt tcc atg cag cag cat ggt cag cca cag cag agg 801 Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln Arg 195 200 205 atg agc cag ttt tcc caa ggc caa gag ggc ctc aat cag gga aat cct 849 Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn Pro 210 215 220 225 ttt att gcc acc tca gga cct ggc cac ttg tcc cac gtg ccc cag cag 897 Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln Gln 230 235 240 agt ccc agc atg gca cct tcc ttg cgt cac tcg gtg cag cag ttc cat 945 Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe His 245 250 255 cac cac ccc tct act gct ctc cat gga gaa tcc gtt gcc cac agt ccc 993 His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser Pro 260 265 270 aga ttc tcc ccg aat cct ccc caa caa ggg gct gtt agg ccg caa acc 1041 Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln Thr 275 280 285 ctt aac ttt agt tct cgg agc cag aca gtc ccc tct cct act ata aac 1089 Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile Asn 290 295 300 305 aac tca ggg cag tat tct cga tat cct tac agt aac cta aat cag gga 1137 Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln Gly 310 315 320 tta gtt aac aat aca ggg atg aat caa aat tta ggc ctt aca aat aat 1185 Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn Asn 325 330 335 act cca atg aat cag tcc gta cca aga tac ccc aat gct gta gga ttc 1233 Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly Phe 340 345 350 cca tca aac agt ggt caa gga cta atg cac cag cag ccc atc cac ccc 1281 Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His Pro 355 360 365 agt ggc tca ctt aac caa atg aac aca caa act atg cat cct tca cag 1329 Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser Gln 370 375 380 385 cct cag gga act tat gcc tct cca cct ccc atg tca ccc atg aaa gca 1377 Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys Ala 390 395 400 atg agt aat cca gca ggc act cct cct cca caa gtc agg ccg gga agt 1425 Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly Ser 405 410 415 gct ggg ata cca atg gaa gtt ggc agt tat cca aat atg ccc cat cct 1473 Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His Pro 420 425 430 cag cca tct cac cag ccc cct ggt gcc atg gga atc gga cag agg aat 1521 Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg Asn 435 440 445 atg ggc ccc aga aac atg cag cag tct cgt cca ttt ata ggc atg tcc 1569 Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met Ser 450 455 460 465 tcg gca cca agg gaa ttg act ggg cac atg agg cca aat ggt tgt cct 1617 Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys Pro 470 475 480 ggt gtt ggc ctt gga gac cca caa gca atc cag gaa cga ctg ata cct 1665 Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile Pro 485 490 495 ggc caa caa cat cct ggt caa cag cca tct ttt cag cag ttg cca acc 1713 Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro Thr 500 505 510 tgt cct cca ctg cag cct cac ccg ggc ttg cac cac cag tct tca cct 1761 Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser Pro 515 520 525 cca cac cct cat cac cag cct tgg gca cag ctc cac cca tca ccc cag 1809 Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro Gln 530 535 540 545 aac acc ccg cag aaa gtg cct gtg cat cag cat tcc ccg tcg gag ccc 1857 Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu Pro 550 555 560 ttt cta gag aaa cca gtg ccg gat atg act cag aaa ccg aaa cag aaa 1905 Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Lys Pro Lys Gln Lys 565 570 575 cga cat aga tgt cga aac cct aat aaa ttg gat ata aac act ttg aca 1953 Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu Thr 580 585 590 gga gaa gaa agg gtg cct gtt gtc aat aaa cga aat ggg aag aag atg 2001 Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys Met 595 600 605 ggt gga gct atg gcg cct cca atg aag gat cta ccc agg tgg ctg gaa 2049 Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu Glu 610 615 620 625 gaa aat cct gaa ttt gca gtt gct cca gac tgg act gat ata gtt aag 2097 Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile Val Lys 630 635 640 cag tct ggt ttt gtt cct gag tcg atg ttt gac cgc ctt ctc act ggg 2145 Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu Leu Thr Gly 645 650 655 cct gta gtg cgg gga gag gga gcg agc aga aga gga aga agg ccc aaa 2193 Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly Arg Arg Pro Lys 660 665 670 agt gag atc gcc aga gca gcc gcg gcc gcc gct gct gtg gcc tcc acg 2241 Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Thr 675 680 685 tca ggg atc aac cct ttg ctg gtg aac agc ctg ttt gct gga atg gac 2289 Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met Asp 690 695 700 705 ctg acg agc ctt cag aat ctc cag aat ctc cag tcg ctc cag ctg gca 2337 Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu Ala 710 715 720 ggc ctc atg ggc ttc cct cca gga ctg gca aca gct gcc acc gcc gga 2385 Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala Gly 725 730 735 ggc gat gcg aag aac cct gct gct gtg ctg ccc ctg atg ctg cca gga 2433 Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro Gly 740 745 750 atg gcg ggc ctg ccc aac gtg ttt ggc ttg ggc ggg ctg ttg aat aac 2481 Met Ala Gly Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn Asn 755 760 765 cct ctg tca gct gct act gga aac acc act act gct tct agt caa gga 2529 Pro Leu Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln Gly 770 775 780 785 gaa ccg gaa gac agc act tca aaa gga gag gag aaa gga aat gag aat 2577 Glu Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu Asn 790 795 800 gaa gac gag aac aaa gac tct gag aaa agc aca gat gct gtt tcg gct 2625 Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser Ala 805 810 815 gct gac tct gcg aat gga tct gtt ggt gct gct act gcc ccg gct gga 2673 Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala Gly 820 825 830 ttg ccc tca aac ccg cta gcc ttc aac cct ttc ctc ctg tcc aca atg 2721 Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr Met 835 840 845 gcc ccg ggc ctc ttc tac cca tcc atg ttt cta cct cca gga ctg ggg 2769 Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu Gly 850 855 860 865 gga ttg acg ctg cct ggg ttc cca gca ttg gca gga ctt cag aat gcc 2817 Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln Asn Ala 870 875 880 gtg ggc tcc agc gaa gaa aag gct gct gac aag gct gag gga gga ccc 2865 Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu Gly Gly Pro 885 890 895 ttt aaa gat gga gag acc ctt gaa ggc agc gat gcc gag gag agc ctg 2913 Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala Glu Glu Ser Leu 900 905 910 gat aag act gca gag tcc tcc ctc tta gaa gac gaa ata gca cag ggt 2961 Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln Gly 915 920 925 gaa gag cta gac tca ctt gat ggg ggg gat gaa ata gaa aac aat gaa 3009 Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn Glu 930 935 940 945 aat gat gaa taa ccagtaccag ttccagttca agtgtttaaa acttttgaca 3061 Asn Asp Glu agtggtagtc ctactgttta cactcacagt taatgttcat acctagtttt ataagctgtt 3121 ctgtaacata gtgtagcaaa aaaaaaagtt caagtcatgt tatacaggtg tgtcaaaagg 3181 tatcttggtc attaagtatt gtgcagtgca ttatttatta tccctaggag agatgaaatt 3241 tgagaggtga tcatgtcttt ttaaggaaac ttacataatg ctctgctttt tttttttctc 3301 ttggtaccat tggtattata ataaagagca atttgtaact gagtggcact aatggaagaa 3361 agtgctgctc aaaggaagta tgaagttata tatttaattt tttaatttta atttttaatt 3421 tttttgctgt gaaggtcaag ctgaaattta ccatacatat catacttgct catttgtttc 3481 cctttttgac tgtatggggg ttcccacact cgtgcataca cacacatcca tacactctga 3541 caatctccac gctagtgtga acgcctctgt cccgaggcgc agcaataata aggcagctgt 3601 tgaatgtgaa gggtcccttt ggaaaattaa cctactggga gggttcttgc cagacagaac 3661 tacagttcca ttgtctcgtg gtcttgtaat gcactggtaa aaacaaaata aatagatgaa 3721 taaataaaga gtgagagaag agagaatcag gtaccttttt taaattaaag gactttgtta 3781 ctttagccac aaagctaaaa cagcattacc tcagctctaa actagccttg aagtttacag 3841 acatgacttt gtaaatgtat tgtttttctt tgttgtgatg tccttttatt tttttctttg 3901 aaaactgcta tcatgtaaga taaaatgtaa attgctgcca actgtagtaa tgatgctttt 3961 aataaaagtg acccatgata tgcagagatg taattataga atgtagtata tagggaaact 4021 ggtgttcact ctattttttt tgtattcgca atagatgcaa atacagcatt ctggcttttg 4081 tacagtttct tgatatatcc tcttatacta gattagcttt tggtaagaca ctaaactgtc 4141 tcgaagacta gacaggaagg aaaaccttga attactctca cataattcca ctccagatat 4201 ctcaacagaa atgcatacaa aaagctccta ttactccctc aaaagggcat ctgagaccga 4261 gaatacttag aaatgtgtgc agcgtgtgat aatgtggtac actgaagaac aaaagggcaa 4321 aagaaaaatg aggctttaac aggcacaata tctaggtcat ttatccttgg ttaatgggta 4381 gaaaaacaca atgcggtagt gtcagcaagg gacacaaagg cactctggtg tcctgcagac 4441 cagcgctcga tgccagaaac cagtgtgtgg aaaaacccat gtggaattga aacagaccca 4501 cttaagcacg cacgcgcgca cgcacggtct caggagctac tgatttgtgg accccttttt 4561 gacctttggt atttaaagta aaatataatt tgagatctac tgttttcacc tttttatgtc 4621 acctgaacca acacaaagcc atatttccat ccagttaaaa agcaggggaa gggatgtgga 4681 cgagagtgtt tcgtgtgtgt tgccttcctc cacacccttc ccccaggacg tccgcacaca 4741 gtccacctcc agccagtgtg ctgccagaca ggtggtctaa attcctccca gactgtgaga 4801 ttcagttcgt ttatgcccca agatgaaaat atgcccctta atgattctgg gaaagaaaca 4861 acctgaaccc tccaccttac agatcctgtg attgctttta tttatcatcg tcgttgtctg 4921 ctgaaagtga atgggccgtg cacactggag gaaagtgcct tgaagagaat attttttgaa 4981 agggaattat ttgaacacgg gaaagtgaaa ctaggtctgc atgaagtata ggaaatttaa 5041 gtatttaagt aacaaagatg ttagcaggga gaatttgctt aataaaatga gtcattaaag 5101 ggtgtttttt ttaaaaaaaa aaa 5124 <210> 4 <211> 948 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile 1 5 10 15 Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn 20 25 30 Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala 35 40 45 Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr 50 55 60 Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met 65 70 75 80 His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn 85 90 95 Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln 100 105 110 Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly 115 120 125 Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met 130 135 140 Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly 165 170 175 Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr 180 185 190 Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln 195 200 205 Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn 210 215 220 Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln 225 230 235 240 Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe 245 250 255 His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser 260 265 270 Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln 275 280 285 Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile 290 295 300 Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln 305 310 315 320 Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn 325 330 335 Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly 340 345 350 Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His 355 360 365 Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser 370 375 380 Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys 385 390 395 400 Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly 405 410 415 Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His 420 425 430 Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg 435 440 445 Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met 450 455 460 Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys 465 470 475 480 Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile 485 490 495 Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro 500 505 510 Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser 515 520 525 Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro 530 535 540 Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu 545 550 555 560 Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Lys Pro Lys Gln 565 570 575 Lys Arg His Arg Cys Arg Asn Pro Asn Lys Leu Asp Ile Asn Thr Leu 580 585 590 Thr Gly Glu Glu Arg Val Pro Val Val Asn Lys Arg Asn Gly Lys Lys 595 600 605 Met Gly Gly Ala Met Ala Pro Pro Met Lys Asp Leu Pro Arg Trp Leu 610 615 620 Glu Glu Asn Pro Glu Phe Ala Val Ala Pro Asp Trp Thr Asp Ile Val 625 630 635 640 Lys Gln Ser Gly Phe Val Pro Glu Ser Met Phe Asp Arg Leu Leu Thr 645 650 655 Gly Pro Val Val Arg Gly Glu Gly Ala Ser Arg Arg Gly Arg Arg Pro 660 665 670 Lys Ser Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser 675 680 685 Thr Ser Gly Ile Asn Pro Leu Leu Val Asn Ser Leu Phe Ala Gly Met 690 695 700 Asp Leu Thr Ser Leu Gln Asn Leu Gln Asn Leu Gln Ser Leu Gln Leu 705 710 715 720 Ala Gly Leu Met Gly Phe Pro Pro Gly Leu Ala Thr Ala Ala Thr Ala 725 730 735 Gly Gly Asp Ala Lys Asn Pro Ala Ala Val Leu Pro Leu Met Leu Pro 740 745 750 Gly Met Ala Gly Leu Pro Asn Val Phe Gly Leu Gly Gly Leu Leu Asn 755 760 765 Asn Pro Leu Ser Ala Ala Thr Gly Asn Thr Thr Thr Ala Ser Ser Gln 770 775 780 Gly Glu Pro Glu Asp Ser Thr Ser Lys Gly Glu Glu Lys Gly Asn Glu 785 790 795 800 Asn Glu Asp Glu Asn Lys Asp Ser Glu Lys Ser Thr Asp Ala Val Ser 805 810 815 Ala Ala Asp Ser Ala Asn Gly Ser Val Gly Ala Ala Thr Ala Pro Ala 820 825 830 Gly Leu Pro Ser Asn Pro Leu Ala Phe Asn Pro Phe Leu Leu Ser Thr 835 840 845 Met Ala Pro Gly Leu Phe Tyr Pro Ser Met Phe Leu Pro Pro Gly Leu 850 855 860 Gly Gly Leu Thr Leu Pro Gly Phe Pro Ala Leu Ala Gly Leu Gln Asn 865 870 875 880 Ala Val Gly Ser Ser Glu Glu Lys Ala Ala Asp Lys Ala Glu Gly Gly 885 890 895 Pro Phe Lys Asp Gly Glu Thr Leu Glu Gly Ser Asp Ala Glu Glu Ser 900 905 910 Leu Asp Lys Thr Ala Glu Ser Ser Leu Leu Glu Asp Glu Ile Ala Gln 915 920 925 Gly Glu Glu Leu Asp Ser Leu Asp Gly Gly Asp Glu Ile Glu Asn Asn 930 935 940 Glu Asn Asp Glu 945 <210> 5 <211> 5465 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (514)..(5379) <400> 5 aggcgctggc gtgctggggc cgcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg 60 gcggcggcgc gggggttgag tcgtggtggt gcggacgcgc tcgtgctcgg gaactatcgg 120 attaaacttg aatcgagtga aattacacaa aggagcgccg cggaggaggc ggcccgggga 180 cccggacacc ctgaaactca ccagagaccc gttcgccccc ggccaactcc gtgcccgtgg 240 attcagcccc ctggccgcag ctgccgagcc aactccggag cccgctctgc gttttgtttt 300 cccctcggca ctaggcagcg gaggagcccg accgacccgg acctatatcc agactttgcc 360 tgacactgca gggtccaaga gaattaaaga aatatggaat gacatgaaga agattagtta 420 aggattatag gctttgaggg caaacacctc agtgaagtga agcacaggca agctcctgag 480 ctgtggtttg gaggagccgt gtgttggaag aag atg gca gat cca gga atg atg 534 Met Ala Asp Pro Gly Met Met 1 5 agt ctt ttt ggc gag gat ggg aat att ttc agt gaa ggt ctt gaa ggc 582 Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly 10 15 20 ctc gga gaa tgt ggt tac ccg gaa aat cca gta aat cct atg ggt cag 630 Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn Pro Val Asn Pro Met Gly Gln 25 30 35 caa atg cca ata gac caa ggc ttt gcc tct tta cag cca tcc ctt cat 678 Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala Ser Leu Gln Pro Ser Leu His 40 45 50 55 cat cct tca act aat caa aat caa aca aag ctg aca cat ttt gat cac 726 His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr Lys Leu Thr His Phe Asp His 60 65 70 tat aat cag tat gaa caa caa aag atg cat ctg atg gat cag ccg aac 774 Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met His Leu Met Asp Gln Pro Asn 75 80 85 aga atg atg agc aac acc cct ggg aac gga ctc gcg tct ccg cac tcg 822 Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn Gly Leu Ala Ser Pro His Ser 90 95 100 cag tat cac acc cct ccc gtt cct cag gtg ccc cat ggt ggc agt ggt 870 Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln Val Pro His Gly Gly Ser Gly 105 110 115 ggc ggt cag atg ggt gtc tac cct ggc atg cag aat gag agg cat ggg 918 Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly Met Gln Asn Glu Arg His Gly 120 125 130 135 caa tcc ttt gtg gac agc agc tcc atg tgg ggc ccc agg gct gtt cag 966 Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln 140 145 150 gta cca gac cag ata cga gcc ccc tac cag cag cag cag cca cag ccg 1014 Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro 155 160 165 cag cca ccg cag ccg gct ccg tcg ggg ccc cct gca cag ggc cac cct 1062 Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly Pro Pro Ala Gln Gly His Pro 170 175 180 cag cac atg cag cag atg ggc agc tat atg gca cgt ggg gat ttt tcc 1110 Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser 185 190 195 atg cag cag cat ggt cag cca cag cag agg atg agc cag ttt tcc caa 1158 Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln 200 205 210 215 ggc caa gag ggc ctc aat cag gga aat cct ttt att gcc acc tca gga 1206 Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly 220 225 230 cct ggc cac ttg tcc cac gtg ccc cag cag agt ccc agc atg gca cct 1254 Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro 235 240 245 tcc ttg cgt cac tcg gtg cag cag ttc cat cac cac ccc tct act gct 1302 Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe His His His Pro Ser Thr Ala 250 255 260 ctc cat gga gaa tcc gtt gcc cac agt ccc aga ttc tcc ccg aat cct 1350 Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro 265 270 275 ccc caa caa ggg gct gtt agg ccg caa acc ctt aac ttt agt tct cgg 1398 Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg 280 285 290 295 agc cag aca gtc ccc tct cct act ata aac aac tca ggg cag tat tct 1446 Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser 300 305 310 cga tat cct tac agt aac cta aat cag gga tta gtt aac aat aca ggg 1494 Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly 315 320 325 atg aat caa aat tta ggc ctt aca aat aat act cca atg aat cag tcc 1542 Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser 330 335 340 gta cca aga tac ccc aat gct gta gga ttc cca tca aac agt ggt caa 1590 Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln 345 350 355 gga cta atg cac cag cag ccc atc cac ccc agt ggc tca ctt aac caa 1638 Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln 360 365 370 375 atg aac aca caa act atg cat cct tca cag cct cag gga act tat gcc 1686 Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala 380 385 390 tct cca cct ccc atg tca ccc atg aaa gca atg agt aat cca gca ggc 1734 Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly 395 400 405 act cct cct cca caa gtc agg ccg gga agt gct ggg ata cca atg gaa 1782 Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu 410 415 420 gtt ggc agt tat cca aat atg ccc cat cct cag cca tct cac cag ccc 1830 Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His Pro Gln Pro Ser His Gln Pro 425 430 435 cct ggt gcc atg gga atc gga cag agg aat atg ggc ccc aga aac atg 1878 Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg Asn Met Gly Pro Arg Asn Met 440 445 450 455 cag cag tct cgt cca ttt ata ggc atg tcc tcg gca cca agg gaa ttg 1926 Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu 460 465 470 act ggg cac atg agg cca aat ggt tgt cct ggt gtt ggc ctt gga gac 1974 Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp 475 480 485 cca caa gca atc cag gaa cga ctg ata cct ggc caa caa cat cct ggt 2022 Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile Pro Gly Gln Gln His Pro Gly 490 495 500 caa cag cca tct ttt cag cag ttg cca acc tgt cct cca ctg cag cct 2070 Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro 505 510 515 cac ccg ggc ttg cac cac cag tct tca cct cca cac cct cat cac cag 2118 His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser Pro Pro His Pro His His Gln 520 525 530 535 cct tgg gca cag ctc cac cca tca ccc cag aac acc ccg cag aaa gtg 2166 Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val 540 545 550 cct gtg cat cag cat tcc ccg tcg gag ccc ttt cta gag aaa cca gtg 2214 Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val 555 560 565 ccg gat atg act cag gtt agt gga ccg aat gct cag cta gtg aag agt 2262 Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser 570 575 580 gat gat tac ctg cca tca ata gaa cag cag cca caa caa aag aag aag 2310 Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys 585 590 595 aaa aag aaa aac aac cac att gta gca gag gat ccc agt aaa ggt ttt 2358 Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe 600 605 610 615 ggt aaa gat gac ttc cct ggt ggg gta gat aac caa gaa cta aat agg 2406 Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg 620 625 630 aac tca ctg gat ggg tcc caa gaa gaa aaa aag aaa aag aaa agg tca 2454 Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser 635 640 645 aag gca aaa aaa gac ccg aag gaa ccg aaa gaa ccc aag gag aaa aaa 2502 Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys 650 655 660 gag ccc aag gaa ccc aag acc ccg aaa gcc cct aag att ccc aaa gag 2550 Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu 665 670 675 cca aag gaa aag aaa gca aaa act gcc acg cca aaa ccc aaa tcc agc 2598 Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser 680 685 690 695 aaa aag tca agt aat aag aaa cct gac tca gaa gca agt gct ttg aag 2646 Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys 700 705 710 aaa aag gtc aac aag gga aaa aca gaa ggt tct gaa aat tca gac tta 2694 Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu 715 720 725 gac aaa aca ccc cca cca tct cct cct cct gaa gaa gat gag gac cca 2742 Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro 730 735 740 ggt gtt cag aag aga cgg tcc agc aga cag gtg aag aga aag cgc tac 2790 Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr 745 750 755 act gaa gac ctg gag ttc aag att tct gat gag gag gca gat gat gca 2838 Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala 760 765 770 775 gat gct gct ggg agg gat tcc ccc tcc aac acc tcc cag tca gaa cag 2886 Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln 780 785 790 cag gaa tct gtt gat gca gaa ggc cca gtg gta gaa aaa att atg agc 2934 Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro Val Val Glu Lys Ile Met Ser 795 800 805 agt cgt tca gta aaa aag cag aag gaa tct gga gag gag gta gaa att 2982 Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile 810 815 820 gag gaa ttc tat gtg aaa tac aaa aac ttc tct tat ctt cat tgt cag 3030 Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln 825 830 835 tgg gca tct ata gaa gat ctg gaa aaa gat aag aga att cag caa aaa 3078 Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys 840 845 850 855 att aaa cga ttt aag gca aag cag ggc cag aac aag ttc ctt tca gag 3126 Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu 860 865 870 att gag gat gag ctt ttt aat cca gat tat gtg gag gtt gac cgg ata 3174 Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile 875 880 885 atg gac ttt gca cgt agc aca gat gac cgg gga gag cct gtg act cac 3222 Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp Arg Gly Glu Pro Val Thr His 890 895 900 tat ctg gtg aag tgg tgt tca ctt cct tat gaa gac agc acg tgg gag 3270 Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu 905 910 915 cgg agg cag gac ata gat caa gca aag atc gag gag ttt gag aaa cta 3318 Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu 920 925 930 935 atg tcc agg gag ccg gaa aca gag cgt gtg gag cga cct cct gct gat 3366 Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp 940 945 950 gat tgg aag aaa tcg gag agt tcc agg gag tat aaa aac aat aac aaa 3414 Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys 955 960 965 ctc agg gaa tac cag ttg gag gga gta aac tgg cta ctt ttc aat tgg 3462 Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp 970 975 980 tac aac atg cga aac tgc att tta gca gat gaa atg ggt ttg gga aaa 3510 Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys 985 990 995 act atc cag tcc att aca ttt ctc tat gag ata tat ttg aaa gga 3555 Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr Glu Ile Tyr Leu Lys Gly 1000 1005 1010 atc cat ggc cct ttt tta gta att gcc cca ttg tcc aca atc ccc 3600 Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala Pro Leu Ser Thr Ile Pro 1015 1020 1025 aac tgg gaa agg gaa ttc cga acc tgg aca gag ttg aac gtg gtt 3645 Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp Thr Glu Leu Asn Val Val 1030 1035 1040 gtg tat cat ggg agt caa gct agt cgt cgg acc att cag ttg tat 3690 Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg Arg Thr Ile Gln Leu Tyr 1045 1050 1055 gaa atg tac ttc aaa gat ccc cag ggt cga gtg ata aag ggg tcc 3735 Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly Arg Val Ile Lys Gly Ser 1060 1065 1070 tat aag ttt cat gcc atc atc act aca ttt gag atg att ttg act 3780 Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr Phe Glu Met Ile Leu Thr 1075 1080 1085 gat tgt cct gag ctg cgg aat att cca tgg cgc tgt gta gtc att 3825 Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro Trp Arg Cys Val Val Ile 1090 1095 1100 gat gaa gcc cac agg ctg aag aac agg aac tgc aag ctg ttg gag 3870 Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg Asn Cys Lys Leu Leu Glu 1105 1110 1115 gga ctc aag atg atg gac ttg gaa cac aaa gtg ctg ctg acg gga 3915 Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His Lys Val Leu Leu Thr Gly 1120 1125 1130 acc cca ctc cag aac act gtg gaa gaa ctc ttc agc ttg ctt cat 3960 Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu Leu Phe Ser Leu Leu His 1135 1140 1145 ttc ttg gaa cca agt cgc ttc cct tca gaa acc aca ttt atg caa 4005 Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser Glu Thr Thr Phe Met Gln 1150 1155 1160 gaa ttt ggt gat cta aaa aca gaa gag cag gtg caa aaa ctt caa 4050 Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu Gln Val Gln Lys Leu Gln 1165 1170 1175 gct att cta aag cca atg atg ttg aga cgt ctc aaa gag gat gta 4095 Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg Arg Leu Lys Glu Asp Val 1180 1185 1190 gaa aag aac ttg gcc ccc aaa gaa gaa act att att gaa gtt gag 4140 Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu Thr Ile Ile Glu Val Glu 1195 1200 1205 cta aca aac att cag aag aaa tat tac cga gcc atc ctt gag aag 4185 Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr Arg Ala Ile Leu Glu Lys 1210 1215 1220 aat ttc aca ttt ctt tcc aaa ggc ggt ggt caa gct aac gta cct 4230 Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly Gly Gln Ala Asn Val Pro 1225 1230 1235 aac cta tta aac act atg atg gaa ttg cgg aag tgc tgc aat cat 4275 Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu Arg Lys Cys Cys Asn His 1240 1245 1250 ccg tac ctt atc aat ggt gct gaa gag aaa att ttg gaa gag ttt 4320 Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu Lys Ile Leu Glu Glu Phe 1255 1260 1265 aaa gaa aca cac aat gca gag tct cca gat ttt cag ctc cag gca 4365 Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro Asp Phe Gln Leu Gln Ala 1270 1275 1280 atg atc cag gct gct ggc aag cta gtg ctg att gac aag ctg ctg 4410 Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val Leu Ile Asp Lys Leu Leu 1285 1290 1295 cca aaa ctg aag gct ggt ggc cac agg gtg ctt atc ttt tcc cag 4455 Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg Val Leu Ile Phe Ser Gln 1300 1305 1310 atg gtg cgc tgc ttg gac ata ctg gaa gac tac ctc att caa aga 4500 Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu Asp Tyr Leu Ile Gln Arg 1315 1320 1325 cgg tac cca tat gaa agg atc gac ggc cga gta aga ggc aac ctc 4545 Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly Arg Val Arg Gly Asn Leu 1330 1335 1340 cgc cag gca gct atc gac aga ttc tcc aaa cct gat tct gat agg 4590 Arg Gln Ala Ala Ile Asp Arg Phe Ser Lys Pro Asp Ser Asp Arg 1345 1350 1355 ttt gtt ttc ctc ctg tgt aca agg gca gga ggt tta ggc att aac 4635 Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala Gly Gly Leu Gly Ile Asn 1360 1365 1370 ctc act gct gct gat acc tgc atc atc ttt gat tca gac tgg aat 4680 Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile Phe Asp Ser Asp Trp Asn 1375 1380 1385 ccc caa aat gac ctc cag gct cag gct aga tgt cat aga ata gga 4725 Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala Arg Cys His Arg Ile Gly 1390 1395 1400 cag agc aaa tct gtg aaa atc tac agg ctg att aca aga aat tcc 4770 Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg Leu Ile Thr Arg Asn Ser 1405 1410 1415 tat gaa agg gaa atg ttc gac aag gct agt ttg aaa ctg ggc ctg 4815 Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala Ser Leu Lys Leu Gly Leu 1420 1425 1430 gat aaa gct gtg cta cag tct atg agt gga aga gaa aat gct acc 4860 Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser Gly Arg Glu Asn Ala Thr 1435 1440 1445 aat ggg gta caa cag ctt tcc aag aaa gaa ata gag gat ctt cta 4905 Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu Leu 1450 1455 1460 cga aaa ggg gcc tat ggt gca ctc atg gat gag gag gat gaa ggg 4950 Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Glu Gly 1465 1470 1475 tct aaa ttc tgt gaa gaa gat att gat cag atc ctc cta cgt cga 4995 Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp Gln Ile Leu Leu Arg Arg 1480 1485 1490 acc cac acc att acc att gag tca gaa ggg aaa ggt tcc aca ttt 5040 Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu Gly Lys Gly Ser Thr Phe 1495 1500 1505 gct aag gcc agt ttt gtt gca tct gga aat agg aca gat att tcc 5085 Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly Asn Arg Thr Asp Ile Ser 1510 1515 1520 ttg gat gat cca aat ttc tgg caa aag tgg gct aag aag gct gaa 5130 Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys Trp Ala Lys Lys Ala Glu 1525 1530 1535 ttg gat att gat gcc tta aat ggg agg aac aac ctg gtt att gat 5175 Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Asn Leu Val Ile Asp 1540 1545 1550 act cca aga gtg aga aag cag acc agg ctc tac agt gca gtg aag 5220 Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg Leu Tyr Ser Ala Val Lys 1555 1560 1565 gaa gat gag ctg atg gag ttc tca gac ttg gaa agt gat tct gaa 5265 Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp Leu Glu Ser Asp Ser Glu 1570 1575 1580 gaa aag ccc tgt gca aag cca cgg cgt ccc cag gat aag tca cag 5310 Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg Pro Gln Asp Lys Ser Gln 1585 1590 1595 ggc tat gca agg agt gaa tgt ttc agg gtg gag aag aat ctg ctt 5355 Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg Val Glu Lys Asn Leu Leu 1600 1605 1610 gtc tat ggt gtg aat tgt tgc tag ttttgaccca ggatttccca 5399 Val Tyr Gly Val Asn Cys Cys 1615 1620 acgctggtac ctgacttaaa gtaaagccat aaatcaaaac tcacaggcac ctctgcatgc 5459 tggata 5465 <210> 6 <211> 1621 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Asp Pro Gly Met Met Ser Leu Phe Gly Glu Asp Gly Asn Ile 1 5 10 15 Phe Ser Glu Gly Leu Glu Gly Leu Gly Glu Cys Gly Tyr Pro Glu Asn 20 25 30 Pro Val Asn Pro Met Gly Gln Gln Met Pro Ile Asp Gln Gly Phe Ala 35 40 45 Ser Leu Gln Pro Ser Leu His His Pro Ser Thr Asn Gln Asn Gln Thr 50 55 60 Lys Leu Thr His Phe Asp His Tyr Asn Gln Tyr Glu Gln Gln Lys Met 65 70 75 80 His Leu Met Asp Gln Pro Asn Arg Met Met Ser Asn Thr Pro Gly Asn 85 90 95 Gly Leu Ala Ser Pro His Ser Gln Tyr His Thr Pro Pro Val Pro Gln 100 105 110 Val Pro His Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gln Met Gly Val Tyr Pro Gly 115 120 125 Met Gln Asn Glu Arg His Gly Gln Ser Phe Val Asp Ser Ser Ser Met 130 135 140 Trp Gly Pro Arg Ala Val Gln Val Pro Asp Gln Ile Arg Ala Pro Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Gln Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Gly 165 170 175 Pro Pro Ala Gln Gly His Pro Gln His Met Gln Gln Met Gly Ser Tyr 180 185 190 Met Ala Arg Gly Asp Phe Ser Met Gln Gln His Gly Gln Pro Gln Gln 195 200 205 Arg Met Ser Gln Phe Ser Gln Gly Gln Glu Gly Leu Asn Gln Gly Asn 210 215 220 Pro Phe Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly His Leu Ser His Val Pro Gln 225 230 235 240 Gln Ser Pro Ser Met Ala Pro Ser Leu Arg His Ser Val Gln Gln Phe 245 250 255 His His His Pro Ser Thr Ala Leu His Gly Glu Ser Val Ala His Ser 260 265 270 Pro Arg Phe Ser Pro Asn Pro Pro Gln Gln Gly Ala Val Arg Pro Gln 275 280 285 Thr Leu Asn Phe Ser Ser Arg Ser Gln Thr Val Pro Ser Pro Thr Ile 290 295 300 Asn Asn Ser Gly Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Tyr Ser Asn Leu Asn Gln 305 310 315 320 Gly Leu Val Asn Asn Thr Gly Met Asn Gln Asn Leu Gly Leu Thr Asn 325 330 335 Asn Thr Pro Met Asn Gln Ser Val Pro Arg Tyr Pro Asn Ala Val Gly 340 345 350 Phe Pro Ser Asn Ser Gly Gln Gly Leu Met His Gln Gln Pro Ile His 355 360 365 Pro Ser Gly Ser Leu Asn Gln Met Asn Thr Gln Thr Met His Pro Ser 370 375 380 Gln Pro Gln Gly Thr Tyr Ala Ser Pro Pro Pro Met Ser Pro Met Lys 385 390 395 400 Ala Met Ser Asn Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Gln Val Arg Pro Gly 405 410 415 Ser Ala Gly Ile Pro Met Glu Val Gly Ser Tyr Pro Asn Met Pro His 420 425 430 Pro Gln Pro Ser His Gln Pro Pro Gly Ala Met Gly Ile Gly Gln Arg 435 440 445 Asn Met Gly Pro Arg Asn Met Gln Gln Ser Arg Pro Phe Ile Gly Met 450 455 460 Ser Ser Ala Pro Arg Glu Leu Thr Gly His Met Arg Pro Asn Gly Cys 465 470 475 480 Pro Gly Val Gly Leu Gly Asp Pro Gln Ala Ile Gln Glu Arg Leu Ile 485 490 495 Pro Gly Gln Gln His Pro Gly Gln Gln Pro Ser Phe Gln Gln Leu Pro 500 505 510 Thr Cys Pro Pro Leu Gln Pro His Pro Gly Leu His His Gln Ser Ser 515 520 525 Pro Pro His Pro His His Gln Pro Trp Ala Gln Leu His Pro Ser Pro 530 535 540 Gln Asn Thr Pro Gln Lys Val Pro Val His Gln His Ser Pro Ser Glu 545 550 555 560 Pro Phe Leu Glu Lys Pro Val Pro Asp Met Thr Gln Val Ser Gly Pro 565 570 575 Asn Ala Gln Leu Val Lys Ser Asp Asp Tyr Leu Pro Ser Ile Glu Gln 580 585 590 Gln Pro Gln Gln Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asn Asn His Ile Val Ala 595 600 605 Glu Asp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Lys Asp Asp Phe Pro Gly Gly Val 610 615 620 Asp Asn Gln Glu Leu Asn Arg Asn Ser Leu Asp Gly Ser Gln Glu Glu 625 630 635 640 Lys Lys Lys Lys Lys Arg Ser Lys Ala Lys Lys Asp Pro Lys Glu Pro 645 650 655 Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Glu Pro Lys Glu Pro Lys Thr Pro Lys 660 665 670 Ala Pro Lys Ile Pro Lys Glu Pro Lys Glu Lys Lys Ala Lys Thr Ala 675 680 685 Thr Pro Lys Pro Lys Ser Ser Lys Lys Ser Ser Asn Lys Lys Pro Asp 690 695 700 Ser Glu Ala Ser Ala Leu Lys Lys Lys Val Asn Lys Gly Lys Thr Glu 705 710 715 720 Gly Ser Glu Asn Ser Asp Leu Asp Lys Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro 725 730 735 Pro Glu Glu Asp Glu Asp Pro Gly Val Gln Lys Arg Arg Ser Ser Arg 740 745 750 Gln Val Lys Arg Lys Arg Tyr Thr Glu Asp Leu Glu Phe Lys Ile Ser 755 760 765 Asp Glu Glu Ala Asp Asp Ala Asp Ala Ala Gly Arg Asp Ser Pro Ser 770 775 780 Asn Thr Ser Gln Ser Glu Gln Gln Glu Ser Val Asp Ala Glu Gly Pro 785 790 795 800 Val Val Glu Lys Ile Met Ser Ser Arg Ser Val Lys Lys Gln Lys Glu 805 810 815 Ser Gly Glu Glu Val Glu Ile Glu Glu Phe Tyr Val Lys Tyr Lys Asn 820 825 830 Phe Ser Tyr Leu His Cys Gln Trp Ala Ser Ile Glu Asp Leu Glu Lys 835 840 845 Asp Lys Arg Ile Gln Gln Lys Ile Lys Arg Phe Lys Ala Lys Gln Gly 850 855 860 Gln Asn Lys Phe Leu Ser Glu Ile Glu Asp Glu Leu Phe Asn Pro Asp 865 870 875 880 Tyr Val Glu Val Asp Arg Ile Met Asp Phe Ala Arg Ser Thr Asp Asp 885 890 895 Arg Gly Glu Pro Val Thr His Tyr Leu Val Lys Trp Cys Ser Leu Pro 900 905 910 Tyr Glu Asp Ser Thr Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ile Asp Gln Ala Lys 915 920 925 Ile Glu Glu Phe Glu Lys Leu Met Ser Arg Glu Pro Glu Thr Glu Arg 930 935 940 Val Glu Arg Pro Pro Ala Asp Asp Trp Lys Lys Ser Glu Ser Ser Arg 945 950 955 960 Glu Tyr Lys Asn Asn Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Leu Glu Gly Val 965 970 975 Asn Trp Leu Leu Phe Asn Trp Tyr Asn Met Arg Asn Cys Ile Leu Ala 980 985 990 Asp Glu Met Gly Leu Gly Lys Thr Ile Gln Ser Ile Thr Phe Leu Tyr 995 1000 1005 Glu Ile Tyr Leu Lys Gly Ile His Gly Pro Phe Leu Val Ile Ala 1010 1015 1020 Pro Leu Ser Thr Ile Pro Asn Trp Glu Arg Glu Phe Arg Thr Trp 1025 1030 1035 Thr Glu Leu Asn Val Val Val Tyr His Gly Ser Gln Ala Ser Arg 1040 1045 1050 Arg Thr Ile Gln Leu Tyr Glu Met Tyr Phe Lys Asp Pro Gln Gly 1055 1060 1065 Arg Val Ile Lys Gly Ser Tyr Lys Phe His Ala Ile Ile Thr Thr 1070 1075 1080 Phe Glu Met Ile Leu Thr Asp Cys Pro Glu Leu Arg Asn Ile Pro 1085 1090 1095 Trp Arg Cys Val Val Ile Asp Glu Ala His Arg Leu Lys Asn Arg 1100 1105 1110 Asn Cys Lys Leu Leu Glu Gly Leu Lys Met Met Asp Leu Glu His 1115 1120 1125 Lys Val Leu Leu Thr Gly Thr Pro Leu Gln Asn Thr Val Glu Glu 1130 1135 1140 Leu Phe Ser Leu Leu His Phe Leu Glu Pro Ser Arg Phe Pro Ser 1145 1150 1155 Glu Thr Thr Phe Met Gln Glu Phe Gly Asp Leu Lys Thr Glu Glu 1160 1165 1170 Gln Val Gln Lys Leu Gln Ala Ile Leu Lys Pro Met Met Leu Arg 1175 1180 1185 Arg Leu Lys Glu Asp Val Glu Lys Asn Leu Ala Pro Lys Glu Glu 1190 1195 1200 Thr Ile Ile Glu Val Glu Leu Thr Asn Ile Gln Lys Lys Tyr Tyr 1205 1210 1215 Arg Ala Ile Leu Glu Lys Asn Phe Thr Phe Leu Ser Lys Gly Gly 1220 1225 1230 Gly Gln Ala Asn Val Pro Asn Leu Leu Asn Thr Met Met Glu Leu 1235 1240 1245 Arg Lys Cys Cys Asn His Pro Tyr Leu Ile Asn Gly Ala Glu Glu 1250 1255 1260 Lys Ile Leu Glu Glu Phe Lys Glu Thr His Asn Ala Glu Ser Pro 1265 1270 1275 Asp Phe Gln Leu Gln Ala Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Leu Val 1280 1285 1290 Leu Ile Asp Lys Leu Leu Pro Lys Leu Lys Ala Gly Gly His Arg 1295 1300 1305 Val Leu Ile Phe Ser Gln Met Val Arg Cys Leu Asp Ile Leu Glu 1310 1315 1320 Asp Tyr Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Pro Tyr Glu Arg Ile Asp Gly 1325 1330 1335 Arg Val Arg Gly Asn Leu Arg Gln Ala Ala Ile Asp Arg Phe Ser 1340 1345 1350 Lys Pro Asp Ser Asp Arg Phe Val Phe Leu Leu Cys Thr Arg Ala 1355 1360 1365 Gly Gly Leu Gly Ile Asn Leu Thr Ala Ala Asp Thr Cys Ile Ile 1370 1375 1380 Phe Asp Ser Asp Trp Asn Pro Gln Asn Asp Leu Gln Ala Gln Ala 1385 1390 1395 Arg Cys His Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ser Val Lys Ile Tyr Arg 1400 1405 1410 Leu Ile Thr Arg Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Met Phe Asp Lys Ala 1415 1420 1425 Ser Leu Lys Leu Gly Leu Asp Lys Ala Val Leu Gln Ser Met Ser 1430 1435 1440 Gly Arg Glu Asn Ala Thr Asn Gly Val Gln Gln Leu Ser Lys Lys 1445 1450 1455 Glu Ile Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gly Ala Tyr Gly Ala Leu Met 1460 1465 1470 Asp Glu Glu Asp Glu Gly Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asp Ile Asp 1475 1480 1485 Gln Ile Leu Leu Arg Arg Thr His Thr Ile Thr Ile Glu Ser Glu 1490 1495 1500 Gly Lys Gly Ser Thr Phe Ala Lys Ala Ser Phe Val Ala Ser Gly 1505 1510 1515 Asn Arg Thr Asp Ile Ser Leu Asp Asp Pro Asn Phe Trp Gln Lys 1520 1525 1530 Trp Ala Lys Lys Ala Glu Leu Asp Ile Asp Ala Leu Asn Gly Arg 1535 1540 1545 Asn Asn Leu Val Ile Asp Thr Pro Arg Val Arg Lys Gln Thr Arg 1550 1555 1560 Leu Tyr Ser Ala Val Lys Glu Asp Glu Leu Met Glu Phe Ser Asp 1565 1570 1575 Leu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Lys Pro Cys Ala Lys Pro Arg Arg 1580 1585 1590 Pro Gln Asp Lys Ser Gln Gly Tyr Ala Arg Ser Glu Cys Phe Arg 1595 1600 1605 Val Glu Lys Asn Leu Leu Val Tyr Gly Val Asn Cys Cys 1610 1615 1620 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaaacccaca ctgcagcaga 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcgcttgccc ttctggcg 18 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctcagctaca aacaggtgaa gac 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tccctggtgg taggaagagt aaa 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttgaatgtac agagtgcgga aga 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aacagccatc acagacgaat cc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ggttcccaca ctcgtgcata 20 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgcgcctcgg gacaga 16 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cccatgaaag caatgagtaa tcc 23 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tccattggta tcccagcact tc 22 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgatggactt ggaacacaaa gtg 23 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgaagggaag cgacttggtt 20 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caaacatggc tatgagaagt acaactc 27 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccgactcgtt ccagaaagca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccactcctcc acctttgacg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 atgaggtcca ccaccctgtt 20 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 25 tatgactcag aaaccgaaac agaaacgaca 30 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gccctttcta gagaaaccag tg 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 aggcaccctt tcttctcctg 20 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 28 cacggacgct ataaacgcca actcactg 28 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gaatctgctt gtctatggtt ggg 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 aggatggttc tgcagatggt 20

Claims (15)

  1. 인간 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포의 분화 가능성(differential potential)의 예측 방법.
  2. 제1항에 있어서, 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상인 CHD7의 발현 수준을 갖는 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
  6. 만능 줄기 세포의 CHD7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 만능 줄기 세포용 배지의 평가 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 시험 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 1500 카피 이상인 경우, 상기 시험 배지가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내기 위해 인간 만능 줄기 세포를 유지할 수 있는 것으로 평가되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 5ng의 총 RNA에서 2710 카피 이상인, 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포인, 방법.
  11. CHD7의 발현을 검출할 수 있는 물질을 포함하는, 인간 만능 줄기 세포의 분화 가능성을 예측하고/하거나 인간 만능 줄기 세포용 배지를 평가하기 위한 시약(reagent) 또는 키트(kit).
  12. CHD7을 코딩하는 핵산을 포함하는 인간 만능 줄기 세포용 분화 유도제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 분화 내성을 나타내는 인간 만능 줄기 세포의 CHD7 단백질 수준의 2배 이상의 단백질 수준일 때, 상기 인간 만능 줄기 세포가 분화 자극에 반응하여 분화 가능성을 나타내는 것으로 예측되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CHD7의 발현 수준이 필수 8 배지 또는 Stem-Partner(등록 상표) 인간 iPS/ES 세포 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포의 발현 수준인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 분화 내성을 나타내는 상기 인간 만능 줄기 세포가 ReproFF2 배지로 5회 이상 계대 배양된 인간 만능 줄기 세포인, 방법.
KR1020207000609A 2017-06-19 2018-06-04 만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약 KR102422175B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2017-120024 2017-06-19
JP2017120024 2017-06-19
JPJP-P-2017-237420 2017-12-12
JP2017237420 2017-12-12
PCT/JP2018/021430 WO2018235583A1 (ja) 2017-06-19 2018-06-04 多能性幹細胞の分化能の予測方法及びそのための試薬

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200015731A true KR20200015731A (ko) 2020-02-12
KR102422175B1 KR102422175B1 (ko) 2022-07-18

Family

ID=64737514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207000609A KR102422175B1 (ko) 2017-06-19 2018-06-04 만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20200172969A1 (ko)
EP (1) EP3643780A4 (ko)
JP (2) JP6736772B2 (ko)
KR (1) KR102422175B1 (ko)
CN (1) CN111164209A (ko)
SG (1) SG11201912436PA (ko)
WO (1) WO2018235583A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111164209A (zh) * 2017-06-19 2020-05-15 公益财团法人神户医疗产业都市推进机构 多能干细胞的分化能力的预测方法和用于该预测方法的试剂
JP7489377B2 (ja) 2019-03-29 2024-05-23 株式会社カネカ 多能性幹細胞を含む細胞集団及びその製造方法
EP4043864A4 (en) * 2019-10-28 2022-11-30 FUJIFILM Corporation METHOD FOR SORTING PLURIPOTENT STEM CELLS, METHOD FOR PREDICTING RESULTS OF INDUCTION OF DIFFERENTIATION, AND METHOD FOR MANUFACTURING CELLULAR PRODUCT
WO2021095798A1 (ja) * 2019-11-15 2021-05-20 公立大学法人横浜市立大学 未分化マーカー遺伝子高感度検出法
EP4148139A4 (en) * 2020-06-19 2023-11-08 FUJIFILM Corporation METHOD FOR IDENTIFYING BIOMARKERS AND METHOD FOR PRODUCING CELLS
WO2023223447A1 (ja) * 2022-05-18 2023-11-23 株式会社日立製作所 予測装置、自動培養装置システム、予測方法およびキット

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017025061A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 Peking University Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US9453219B2 (en) 2003-05-15 2016-09-27 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. Cosmetic designs and products using intronic RNA
JP4314372B2 (ja) 2004-03-30 2009-08-12 国立大学法人京都大学 精巣細胞由来多能性幹細胞の製造方法
AU2006325975B2 (en) 2005-12-13 2011-12-08 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
KR101516833B1 (ko) 2007-03-23 2015-05-07 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 체세포 재프로그래밍
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
EP3078738B1 (en) 2007-08-31 2020-05-20 Whitehead Institute for Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
AU2008286249B2 (en) 2007-12-10 2013-10-10 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
EP2242838A1 (en) 2007-12-17 2010-10-27 GliaMed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
EP2090649A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
US20110014164A1 (en) 2008-02-15 2011-01-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
AU2009225665B9 (en) 2008-03-17 2015-01-15 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
AU2009233845A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
CA2695590C (en) 2008-06-27 2018-01-09 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
JP2011527905A (ja) 2008-07-14 2011-11-10 オクラホマ・メディカル・リサーチ・ファウンデーション Ｂｒｉｇｈｔ／ａｒｉｄ３ａ機能の阻害による多能性細胞の作製方法
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
US20120021519A1 (en) 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
US20110059526A1 (en) 2008-11-12 2011-03-10 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
EP2376626A4 (en) 2008-12-13 2012-10-17 Dna Microarray MICRO-ENVIRONMENTAL NICHE ASSAY FOR SCREENING OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS (CIPS)
CA2753845C (en) 2009-02-27 2019-10-29 Kyoto University Nuclear reprogramming substance comprising glis1
US20120122212A1 (en) 2009-03-06 2012-05-17 Marica Grskovic Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
US20120076762A1 (en) 2009-03-25 2012-03-29 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
US8871504B2 (en) * 2009-09-02 2014-10-28 Kyoto University Method of selecting safe pluripotent stem cells
JP6273842B2 (ja) * 2011-02-25 2018-02-07 学校法人慶應義塾 ｉＰＳ細胞クローンの選択方法、及びその選択方法に用いる遺伝子の選択方法
EP2737064B1 (en) * 2011-07-25 2017-12-06 Kyoto University Method for screening induced pluripotent stem cells
US20140329704A1 (en) * 2013-03-28 2014-11-06 President And Fellows Of Harvard College Markers for mature beta-cells and methods of using the same
US20160264934A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The General Hospital Corporation METHODS FOR MODULATING AND ASSAYING m6A IN STEM CELL POPULATIONS
KR20170050916A (ko) * 2015-11-02 2017-05-11 연세대학교 산학협력단 유전자 구조 내 CpG 섬의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법
JP2017120024A (ja) 2015-12-29 2017-07-06 肇 山口 道路上方設置型災害避難設備
CN111164209A (zh) * 2017-06-19 2020-05-15 公益财团法人神户医疗产业都市推进机构 多能干细胞的分化能力的预测方法和用于该预测方法的试剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017025061A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 Peking University Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature Communications, (20167.03.20), DOI: 10.1038/ncomms14758. 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3643780A1 (en) 2020-04-29
KR102422175B1 (ko) 2022-07-18
JP7237890B2 (ja) 2023-03-13
JPWO2018235583A1 (ja) 2020-04-16
WO2018235583A1 (ja) 2018-12-27
JP2020185000A (ja) 2020-11-19
US20200172969A1 (en) 2020-06-04
CN111164209A (zh) 2020-05-15
EP3643780A4 (en) 2021-04-07
SG11201912436PA (en) 2020-01-30
JP6736772B2 (ja) 2020-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102422175B1 (ko) 만능 줄기 세포의 분화능의 예측 방법 및 이를 위한 시약
Marchand et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model
Sebastiano et al. Oct1 regulates trophoblast development during early mouse embryogenesis
Dhaliwal et al. KLF4 nuclear export requires ERK activation and initiates exit from naive pluripotency
Noaksson et al. Monitoring differentiation of human embryonic stem cells using real‐time PCR
US7153650B2 (en) Marker system for preparing and characterizing high-quality human embryonic stem cells
Theodorou et al. A high throughput embryonic stem cell screen identifies Oct-2 as a bifunctional regulator of neuronal differentiation
EP3299450A1 (en) Induced syncytiotrophoblast and preparation method for progenitor cell thereof
Jang et al. A novel Fbxo25 acts as an E3 ligase for destructing cardiac specific transcription factors
JP2008511321A (ja) 幹細胞／前駆細胞の多分化能の維持方法
JP6780197B2 (ja) 新規成熟心筋細胞マーカー
Ohgushi et al. A RHO small GTPase regulator ABR secures mitotic fidelity in human embryonic stem cells
JP2009529899A (ja) 分化したトリ細胞および多能性の維持に関与する遺伝子の調製方法。
Matsuda et al. Modeling the human segmentation clock with pluripotent stem cells
Tan et al. Regulation of both transcription and RNA turnover contribute to germline specification
Xu et al. Identification of novel Taz isoforms and functional comparison in pluripotency maintenance of mouse embryonic stem cells
Kotini et al. Connexin43 controls N-cadherin transcription during collective cell migration
US20240101957A1 (en) Methods and compositions for generating embryos in vitro from pluripotent stem cells
WO2019150891A1 (ja) 未分化細胞の状態を評価する方法及びその利用
Cheng et al. Comparative expression analysis of TEADs and their splice variants in mouse embryonic stem cells
Garbutt et al. Derivation of stable embryonic stem cell-like, but transcriptionally heterogenous, induced pluripotent stem cells from non-permissive mouse strains
Phillips Analysis of TBP-Associated Factor (Taf5, 12, And 13) Early Lethal Phenotypes in the Mouse
大橋文哉 CXCL4/PF4 is a predictive biomarker of cardiac
Pillai et al. Transforming growth factor-β1 induced activation of Rho-kinase pathways regulate bovine trophoblast differentiation
WO2008055361A1 (en) E3 UBIQUITM LIGASE MKRNL AS A MARKER FOR MAMMALIAN STEM CELL PLUπPOTENCY AND METHODS AND USES THEREOF

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant