KR20170050916A - 유전자 구조 내 CpG 섬의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법 - Google Patents

유전자 구조 내 CpG 섬의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 조절을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝하는 방법 및 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 관한 것이다.

Description

유전자 구조 내 CpG 섬의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법{METHOD FOR CONTROLLING DIFFERENTIATIN OF STEM CELL BY EPIGENETIC MODIFICATION OF INTRAGENIC CPG ISLAND}
본 발명은 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준의 조절을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝하는 방법 및 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 관한 것이다.
배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)는 처음으로 마우스 배반포 (blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)로부터 분리하여 배양에 성공한 이후 발생, 노화, 재생 및 세포의 분화와 재프로그램 등과 같은 여러 가지 생명현상을 연구하는데 있어서 중요한 단서들을 제공하고 있을 뿐만 아니라, 임상적으로도 활용될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 자가 증식 능력과 전분화능은 배아줄기세포의 중요한 두 가지 특징으로 배아줄기세포의 고유한 특성 유지와 다른 세포로 분화될 수 있는 잠재성을 유지하면서 특정 시기나 환경에서는 다른 여러 가지 세포로 분화가 일어나도록 하는 데는 후성 유전학적 조절이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
후성 유전학적(epigenetic) 조절은 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현 조절을 통해 여러 가지 세포의 기능을 조절할 수 있는 여러 가지 기작들을 포함하며, 특히 다음 세대로 전달되는 특징을 갖는다. 이러한 후성 유전학적 조절 기작에는 히스톤 변형(Histone modification), DNA 메틸화(DNA methylation), 크로마틴 리모델링, 비번역 RNA(non-coding RNA) 등이 관여하고 있다. 배아줄기세포가 다른 세포로 분화하는 과정에서 광범위한 유전자 발현이 신속하고 정확하게 조절되어 최종적으로는 배아줄기세포 특이적인 전분화능 유전자들은 억제되고, 분화 세포 특이적인 조절 유전자들이 활성화되어야 하는데 이러한 과정에서 후성 유전학적 조절이 필수적으로 작용하고 있다. 또한 배아줄기세포의 고유한 특징은 히스톤 변형, DNA 메틸화, miRNA, 크로마틴 리모델링, 전사조절인자 및 기타 외부요인 등에 의하여 복합적으로 조절, 유지된다.
배아줄기세포에서 서로 다른 유전자 그룹은 히스톤 변형의 조합에 의해 발현이 조절되고 있다. 배아줄기세포의 전분화능 및 자가재생 관련 유전자의 프로모터 지역은 TrxG(Trithorax) 그룹에 의해 조절되는 H3K4me3 또는 히스톤 아세틸화 효소에 의해 조절되는 H3K9ac 등과 같은 열린(open) 크로마틴 구조로 되어 있어 유전자 발현이 활성화된다. 반면, 분화된 세포에서 발현되는 유전자들의 경우에는 배아줄기세포에서 발현이 억제되어야 하는데, 이는 폴리콤 그룹 (Polycomb group) 단백질에 의해 조절된다. 이 폴리콤 그룹 단백질은 두 가지 억제 복합체를 이루는데, 폴리콤 억제 복합체1(PRC1)과 복합체2(PRC2)가 그것이다. 상기 폴리콤 억제 복합체2는 H3K27me3 변형을 일으키고 분화 관련 유전자 억제를 유도하며, 폴리콤 억제 복합체1이 결합할 수 있도록 결합자리를 제공하여 분화 관련 유전자의 억제 상태를 안정화 시키는 역할을 하기도 한다. 흥미롭게도 배아줄기세포에는 유전자 활성 마커인 H3K4me3과 억제 마커인 H3K27me3이 함께 위치하는 이가(bivalent) 프로모터 지역이 상당수 존재한다. 이러한 이가(bivalent) 프로모터 지역은 주로 분화 조절 유전자에서 나타나며, 배아줄기세포에서는 발현을 억제하고 있다가 분화가 시작될 때 빠르게 발현을 활성화 시키는 “유전자 발현 준비상태”를 유지하는 역할을 한다고 알려져 있다. 예를 들면, 배아줄기세포에서 신경세포 계통으로의 분화를 유도하는 전사조절인자의 프로모터 부위에서는 이가(bivalent) 프로모터 상태를 유지하다가 신경세포로 분화가 시작되면서 억제 히스톤 변형 마커가 사라지고 활성 마커만 남게 되면서 이 전사조절인자의 발현이 활성화된다. 반면, 다른 계통으로 분화가 될 때는 이 이가(bivalent) 프로모터에서 활성 마커가 감소하고 억제 마커는 계속 유지되면서 신경세포 특이적 전사조절인자의 전사가 일어나지 않게 된다.
한편, DNA 메틸화는 포유동물에서는 대부분 CpG(cytosine-phosphate-guanine) 염기서열의 시토신에서 일어난다. 포유동물의 유전체에서 CpG 염기서열이 높은 빈도로 존재하는 CpG 섬(CGI)이 존재하는데, 이는 주로 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 프로모터나 조직-특이적 유전자(tissue-specific gene)의 프로모터에서 쉽게 볼 수 있으며, 여기에 위치한 CpG는 일반적으로 메틸화가 일어나지 않은 것으로 알려져 있다. CGI의 메틸화가 유전자 발현을 억제하는 기작은 아직 명확하게 밝혀지지 않았지만, 메틸 시토신에 MeCP2와 같은 메틸 DNA 결합 단백질이 붙고, 여기에 HDAC(histone deacethylase) 등을 내포한 단백 복합체가 동원되어 히스톤을 탈아세틸화시켜, 크로마틴을 밀집화된 폐쇄(closed) 구조로 변화시키는 것으로 알려져 있다. 폐쇄적인 구조를 갖게 된 프로모터에는 전사인자가 붙을 수 없고 결과적으로 유전자 발현이 억제되는 것이다. 침묵 프로모터의 메틸화된 시토신은 HDAC를 포함하는 복합형으로 MBD(methyl-CpG-binding domain protein)이라는 억제 단백질의 특정 그룹과 결합한다. HDAC는 히스톤의 N-말단에서 아미노산으로부터 아세틸 그룹을 제거할 수 있다. 이러한 과정에서 헤테로크로마틴의 폐쇄된 구조가 관여한다. 반대로, 메틸화되지 않은 시토신을 가진 전사가 활발한 프로모터는 HAT(histone acetyltransferase)에 의하여 아세틸화되고, 이것은 전사 인자와 전사 활성 조인자 단백질로 이루어진 전사 활성 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 이렇듯, 프로모터의 CGI의 메틸화가 활성 전사에 관여하는 것과 달리 유전자 구조 내 CGI의 일반적인 기작은 잘 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 유전자 구조 내의 세포 특이적 유전자 발현 조절 기작에 대하여 연구하던 중, 유전자 구조 내 CpG 섬이 후성 유전학적 변형과 연관성이 있음을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 유전자 구조 내의 CpG 섬의 DNA 메틸화가 프로모터 지역에서의 경향성과는 반대로 분화 과정에서 유전자 발현을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 이에 본 발명자들은 유전자 구조 내 CpG 섬을 가지는 유전자들의 이가(bivalent) 상태와 DNA 메틸화 상태 변화를 기반으로 하는 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포(stem cell)”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전 단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가 증식능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 다분화능을 가진 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “배아줄기세포(embryonic stem cell)”는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성 (totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid body)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며，배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “다능성(pluripotent)”은 다른 조건 하에 3개 모든 배엽(내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 세포형으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 용어 “다능성(pluripotentency)” 또는 “다능성 상태(pluripotent state)”는 3개의 모든 배아성 배엽, 즉 내배엽(장관 조직), 중배엽(혈액, 근육, 및 혈관), 및 외배엽(피부 및 신경)으로의 분화능을 가지는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “전능성(totipotency)”은 성체 및 태반을 포함하는 배아외 조직의 세포를 만들 수 있는 능력을 설명하는 분화의 정도를 갖는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “분화(differentiation)”는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 배아줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예를 들면，외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예를 들면，혈관모세포 등), 그 다음 특정 조직(예를 들면, 혈관 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예를 들면，혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등)로 분화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “메틸화”는 유전자 조절 영역의 CpG 디뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드 염기 시토신의 C5-위치에서의 메틸기의 공유결합을 의미한다. “메틸화 상태”는 DNA 염기서열 내에서의 하나 이상의 CpG 디뉴클레오타이드의 5-메틸-시토신의 존재 또는 비존재를 의미한다. “메틸화 수준”은 예를 들면 모든 게놈 영역 및 일부 비-게놈 영역 내의 표적 DNA 메틸화 유전자의 DNA 염기서열에 존재하는 메틸화의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 “유전자 프로파일”은 줄기세포 샘플의 유전자 또는 유전자 세트의 유전자 발현 수준을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어 “발현”은 RNA 및 단백질의 생산, 필요에 따라 단백질의 분비, 예를 들면, 전사, 번역, 폴딩, 변형 및 가공 등에 관여하는 세포 프로세스를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “계통(lineage)”은 공통의 조상을 가지는 세포 또는 공통의 발생적 운명을 가지는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “기능적 분석법(functional assay)”는 특정 상황에서 세포의 성장 또는 생존능을 평가하여 세포의 유전자 발현 또는 발달 상태와 같은, 세포의 특성을 평가하기 위한 실험을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “질환 모델링”은 사람 질환 또는 질병과 관련된 새로운 정보를 얻기 위하여 실험적 세포 배양 또는 동물 연구를 이용하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “약물 스크리닝”은 특정 기능을 가진 약물을 확인하기 위하여 실험실에서 세포 또는 조직을 이용하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “마커”는 세포의 특징 및/또는 표현형을 나타내기 위해 사용된다. 마커는 관심 대상의 특징을 포함하는 세포를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 마커는 즉 특정 세포형을 갖는 세포 또는 그 세포형에 의해 발현되는 분자의 형태학적, 기능적, 또는 생화학적(효소적) 특징을 가진다.
제1구현예에 따르면,
유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 DNA 메틸화 조절을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법이 개시된다. 예를 들면, 상기 줄기세포의 분화는 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준을 증가시키는 것에 의해 촉진되거나, 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준을 감소시키는 것에 의해 억제될 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 유전자는 세포 계통 전사 인자를 포함하는 중요한 발생 조절인자일 수 있다. 상기 발생 조절인자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch 및 WNT로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 하기의 표 1에 나타낸 신경계 발생, 심장 발생, 골격계 발생, 폐 발생, 신장 발생 또는 흉선 비장 발생에 관여하는 전사 조절 인자의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준을 증가시켜 각각 신경 세포, 심장 세포, 골격 세포, 폐 세포, 신장 세포 또는 흉선 비장 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.
발생 과정 전사 조절 인자
신경계 발생 ARHGAP35, ARID1B, ARX, BARHL1, DLX5, DPF1, E2F1, ERBB2, FEZF2, FGFR1, GLI3, HDAC4, HHEX, HOXA1, IKZF1, KDM2B, LMX1A, LMX1B, MAFK, MYT1, MYT1L, NCOR2, NFIB, PAX5, PAX6, PHOX2A, PITX3, RAX, RFX4, SIM1, SIM2, SMARCA2, SMARCA4, SOX11, SOX4, TBR1, TBX4, TCF7L2, TP73, VAX1, VAX2, ZBTB7A, ZEB2, ZFP41, ZIC1, ZIC2, ZNF423, ZNF521, ZNF74
심장 발생 BCOR, CHD7, ERBB2, FOXP4, GLI2, GLI3, HAND2, ID3, MEF2BNB-MEF2B, NCOR2, NKX2-5, NKX2-6, OSR1, RXRA, SMARCA4, SMARCD3, SOX4, T, TBX1, TBX2, TBX3, TCF25, WT1, ZFPM1
골격계 발생 AEBP1, ALX4, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP8A, CHD7, DLX5, FGFR1, GLI2, GLI3, HDAC4, HIVEP, HMG20B, HOXA3, HOXA7, HOXB3, HOXB4, HOXB8, HOXC4, HOXD3, HOXD9, HOXD11, NR4A1, PAX5, PHOX2B, PITX1, RB1, RUNX1, RUNX2, SOX11, SOX4, SOX8, SOX9, TBX3, TBX15, TP53INP2, WDR5, ZBTB16, VAX1, ZNF689
폐 발생 BMP4, CUX1, FGFR1, FOXA1, FOXF1, FOXJ1, FOXP4, GATA4, GATA6, GLI2, GLI3, HOXB3, HOXB4, NFIB, SIM2, SOX9, SOX11, TBX2, TBX4, TBX5, TCF21, ZIC3
신장 발생 ARID5B, BMP4, BMP6, BMP7, CUX1, GATA3, GLI2, GLI3, HHEX, OSR1, PAX2, PAX8, SIX2, SOX4, SOX11, TCF21, TP73, WT1, ZBTB16
흉선, 비장 발생 BCL3, BCL11B, BMP4, CDKN2A, CDKN2B, GATA3, GLI2, GLI3, HAND2, HOXA3, HOXB4, IKZF1, JARID2, MAFB, NFKB2, VKX2-3, ONECUT1, PBX1, PITX2, TBX1, TCF21
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI의 후성 유전학적 변형은 진화적으로 보존되어 세포-특이적 방법으로 달라질 수 있다. 예를 들면, 세포 계통 마커의 유전자 구조 내 CGI는 이러한 전사 인자들을 통상적으로 발현하는 세포에서만 과메틸화될 수 있다. 상기 세포 계통 마커는 PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI는 DNA 메틸화를 분비 요소(releasing key)로 이용하여 이가(bivalent) 크로마틴을 조절(lock)할 수 있다. 예를 들면, DNMT 넉아웃 세포에서의 DNA 저메틸화는 유전자 구조 내 CGI에서 H3K27me3 및 H3K4me3를 재출현시켜 유전자 침묵을 초래할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부할 수 있다. 예를 들면, 세포 특이적 전사 인자는 유전자 구조 내 CGI에 결합하여 표적 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 발생 조절 전사 인자는 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI는 메틸화-매개 조절에 최적화된 다른 염기서열 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 유전자 구조 내 CGI에서 전사 활성은 pol II를 연장하는 C-말단 도메인에 결합하는, SETD2(SET domain-containing 2)에 의한 H3K36의 메틸화를 촉진시킬 수 있다. DNMT3A의 PWWP 도메인이 H3K36me3 마커를 인식하기 위해 나타나기 때문에, 유전자 구조 내 CGI에서 H3K36me3가 증가하는 경우 DNA 메틸화가 촉진될 수 있다. DNA 메틸화의 손실은 유전자 구조 내 CGI와, H3K36 축적을 억제할 수 있는 H3K36 데메틸라제 KDM2A 및 NO66의 결합을 촉진시킬 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있다.
제2구현예에 따르면,
1) 실험군으로서 줄기세포 및 대조군으로서 표준 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 DNA 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 측정된 실험군의 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준을 대조군의 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 단계 2)이후에 3) 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준이 대조군의 DNA 메틸화 수준 보다 높으면 분화능력이 대조군에 비해 높은 것으로 판단하거나 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준이 대조군의 DNA 메틸화 수준 보다 낮으면 분화능력이 대조군에 비해 늦은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 DNA 메틸화 수준은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화능력 탐지 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있다.
제3구현예에 따르면,
1) 특정 세포 계통에 따라 줄기세포의 분화를 야기하는 단계;
2) 상기 줄기세포를 약물과 접촉시키는 단계;
3) 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 DNA 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
4) 상기 측정된 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준을 표준 줄기세포의 유전자 구조 내 CGI의 DNA 메틸화 수준과 비교하여 약물의 효과를 결정하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법이 개시된다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법에 있어서, 상기 약물은 유기분자, 무기분자, 다당류, 펩타이드, 단백질, 핵산, 세균, 및 식물, 진균, 동물세포 또는 동물 조직으로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법에분화능있어서, 상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있다.
제4구현예에 따르면,
줄기 세포의 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 메틸화 수준을 측정하기 위한 시약;
상기 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 시약; 및
상기 줄기세포의 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로의 분화능을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 줄기세포의 분화 탐지용 키트가 개시된다. 상기 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 있어서, 상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 분화 탐지용 키트에 있어서, 상기 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있다.
줄기 세포를 활용한 치료기술의 개발은 질병을 치료할 수 있는 새로운 대안으로 제시되어 왔다. 배아줄기세포 및 유도 만능 줄기세포의 사용이 환자의 생명의 개선에 유효하게 이용될 경우, 본 발명에 따른 유전자 구조 내 CGI의 후성 유전학적 변형을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법은 신약 개발, 독성 평가뿐만 아니라 특정 질병의 치료시 줄기세포의 선택을 능률적이고 최적화하는데 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 CGI의 두가지 다른 후성 유전학적 변형 패턴을 나타낸다. 도 1(a)의 밀도 산점도(density scatter plot)는 인간 H1 ES 세포의 CGI에서의 H3K4me3(X축, log2(RPKM+1)) 및 DNA 메틸화 수준(Y축, 메틸화 비율 0 - 1.0) 의 분포 패턴을 나타낸다. 오른쪽에 삼각형으로 기준색을 나타낸 바와 같이, 낮은 밀도는 청색으로 높은 밀도는 적색으로 나타내었다. 도 1(b)의 밀도 산점도는 인간 H1 ES 세포에서 CGI의 서열 특징(X축, 각 CGI의 GC ratio의 백분위 수, CpG frequency, CGG/C percentage, CGT/A percentage, 및 CGI의 length)과 DNA 메틸화 수준(Y축, 메틸화 비율 0-1.0)을 기반으로 한 CGI의 분포를 나타낸다. 가장 오른쪽 패널의 x축은 전사 개시 및 종료 부위의 CGI의 상대적인 위치를 나타낸다. 밀도 색상 코드는 도 1(a)와 같다. 도 1(c)의 히스토그램은 (CGG/C) 대 (CGT/A)의 ratio((CGT/A)에 대한 (CGG/C)의 ratio)에 따른 프로모터(왼쪽), 유전자 구조 내 영역(오른쪽)에서의 CGI의 분포를 나타낸다. 빨간 수직선은 비율의 중간 값을 나타낸다. 도 1(d)의 산점도는 프로모터(왼쪽 패널) 및 유전자 구조 내(오른쪽 패널) CGI의 length(x축, 염기쌍)과 (CGG/C) 대 (CGT/A)의 ratio (Y축) 분포를 나타낸다. 각 패널의 오른쪽에 색상바를 나타낸 바와 같이, 각 점의 색상은 CGI의 DNA 메틸화 정도를 나타낸다. (청색(0), 0%, 적색(1), 100%). 도 1(e)의 후성 유전학적 인자의 enrichment는 kCGI(상단 패널) 및 mCGI(하단 패널)의 2kb 플랭킹 부위(flanking region)에서 상단에 표시하였다. 더 높은 수준의 H3K4me3(kCGI) 또는 DNA 메틸화 비율(mCGI)이 높은 순서대로 위에서부터 아래로 CGI를 배치하였다. RPKM값과 메틸화 백분율을 각각 ChIP-seq과 bisulfite-sequencing 데이터에 사용하였다. 적색 강도는 enrichment 수준을 나타낸다.
도 2는 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 유전자 및 그들의 발현 수준의 후성학적 변형 지형을 나타낸다. 도 2(a)의 후성 유전학적 인자들의 평균 신호 강도는 인간 H1 ES 세포에서 CGI 프로모터를 포함하는 유전자의 길이에 따라 각 패널의 왼쪽에 나타내었다. MLL2, CXXC1, RING1B 데이터는 마우스 ES 세포에서의 결과이다. 유전자영역(전사개시부위(TSS)의 상류(upstream) -1kb부터 전사종료부위(TxEnd))을 4 영역으로 구분하였다: 프로모터(회색 영역), 유전자 내조 내 CGI, 유전자 구조 내 CGI와 프로모터 또는 TxEnd 사이의 부위. 프로모터와 유전자 구조 내 CGI의 경계는 수직 점선으로 표시하였다. 유전자를 포함하는 CGI 프로모터는 3 그룹으로 분류하였다; 유전자 구조 내 CGI가 없는 경우 (No, 회색 점선), 유전자 내 kCGI가 있는 경우(+kCGI, 청색선), 유전자 구조 내 CGI가 는 경우 (+mCGI, 적색선). y축은 ChiP-seq signal을 위한 RPKM 값 또는 bisulfite sequencing data에서 얻은 DNA 메틸화 비율을 나타낸다. 도 2(b)의 3D(왼쪽 패널)과 그것의 관련한 2D 산점도는 인간 ES 세포에서 유전자 구조내 CGI에서의 3가지 후성 유전학적 마커(H3K27me3, H3K4me3, DNA 메틸화)의 수준을 나타낸다. 각 spot은 모든 유전자의 발현에 관련된 유전자의 백분위수에 따른 색-코드이다. 상대 순위는 각 패널의 오른쪽에 색상바로 나타내었다 (청색, 0; 적색, 1). RPKM 값은 H3K4me3과 H3K27me3 ChiP-seq signal에 사용되었고 bisulfite sequencing data에서 얻은 메틸화 비율(0-1)은 DNA 메틸화를 나타낸다.
도 3은 ESC 분화 동안 유전자 구조 내 CGI의 후성 유전학적 변형 변화를 나타낸다. 도 3(a)의 3D 산점도는 인간 H1 ES 세포(hESC), 신경전구세포(hNPC), IMR90의 유전자 구조 내 CGI에서의 DNA 메틸화, H3K4me3 및 H3K27me3의 수준을 나타낸다. 각 유전자 구조 내 CGI의 상대적 위치를 더욱 간단하게 시각화하기 위하여, 유전자 구조 내 CGI의 3개의 다른 클러스트를 오른쪽 패널에 각각의 3D 산점도로 나타내었다. 상단 패널은 hESC에서 이가 변형된(bivalently modified) CGI(a-1 패널은 <0.4 DNA 메틸화 및 >1 H3K27me3 수준을 가지는 CGI를 포함), H3K4me3 변형된 CGI(a-2 패널은 <0.4 DNA 메틸화 및 <1 H3K27me3 수준을 가지는 CGI를 나타냄), 및 DNA 메틸화된(a-3 패널은 >0.4 DNA 메틸화 수준을 가짐) CGI의 분포를 나타낸다. 중간과 하단 패널은 분화된 세포(hNPC와 IMR90)에서 관찰되는 CGI 클러스터의 바뀐 분포 패턴을 나타낸다. 각 spot은 수직 색상바에 나타낸 바와 같이(청색, 0; 적색, 1) 모든 유전자의 발현에 관련 있는 유전자의 백분위수에 따른 색-코드이다. 각 축은 DNA 메틸화 비율 또는 H3K4me3와 H3K27me3의 log2(RPKM+1) 값을 나타낸다. 도 3(b)는 hESC에서의 발현과 비교한 hNPC에서 다르게 발현된(백분위수 차이 > 30%) 651개의 유전자와 관련된 1,369개의 유전자 구조 내 CGI 에서의 DNA 메틸화, H3K4me3 및 H3K27me3의 변화를 나타낸다. DNA 메틸화 비율과 각 유전자 구조 내 CGI의 H3K4me3와 H3K27me3의 log2(RPKM+1)의 차이 값은 2D 산점도(hNPC-hESC)로 나타내었다. 각 spot은 수직 색상바에서 나타낸 바와 같이(청색, -1: 적색 +1) 발현시 그들의 관련 유전자의 백분위 차이 값에 따른 색 코드이다.
도 4는 유전자 구조 내 CGI의 메틸화에 따른 CGI 상호작용의 방해를 나타낸다. 도 4(a)의 히스토그램은 마우스 ES 세포(GSE44067)에서 RNA polymerase II를 이용하여 ChIA-PET 상호작용을 수행한 다른 유형의 CGI 및 이중 프로모터(Bivalent_P)의 enrichment를 나타낸다. y축은 ChIA-PET signal의 RPKM 값을 나타낸다. 도 4(b)의 도넛형 차트는 유전자 구조 내 kCGI-상호작용 영역의 상대적인 유전자 분포를 나타낸다. 도 4(c)의 Genome browser view는 Insr 위치에서의 ChIA-PET interaction signal, Pol II, H3K4me3, H3K27me3의 enrichment를 나타낸다. 프로모터-관련 CGI와 유전자 구조 내 CGI의 위치는 하늘색으로 표시하였다. 상호작용 부위는 적색 점선으로 표시하였고 상단에 P value를 나타내었다. 도 4(d)의 Heatmap은 IMR90 세포에서 관련 유전자 구조 내 CGI의 과메틸화에 의해 활성화된 유전자에 대한 다양한 후성 유전학적 마커의 enrichment를 나타낸다. 40% 이상의 유전자 구조 내 CGI 메틸화의 증가를 나타내는 66개의 유전자를 나타내었다. 패널의 상부 두 행은 가장 왼쪽 패널에서 나타낸 CGI의 상대적 위치에 따라 표시된 후성 유전학적 마커의 수준을 나타낸다. 유전자는 그들의 유전자 바디에서 CGI의 유전자 구조 내 위치에 따라 상부에서 하부로 배열하였다. 적색은 H1 ES 세포 또는 IMR90세포에서 변형(또는 DNA 메틸화 비율)의 RPKM 값을 나타낸다. 하부 두 행의 heatmap은 hESC에서의 후성 유전학적 마커 발현 수준과 비교하여 IMR90에서의 후성 유전학적 마커의 다른 수준(IMR90-hESC) 또는 IMR90에서의 후성 유전학적 마커 발현 수준과 비교한 iPSC에서의 후성 유전학적 마커의 다른 발현 수준(iPSC-IMR90)을 나타낸다.
도 5는 유전자 구조 내 CGI에서의 DNA 메틸화의 세포 유형-특이적 조절을 나타낸다. 도 5(a)의 Heatmap은 ESC와 표시된 체세포(GM12878; 림프아구성(lymphoblastoid), IMR90; 섬유아세포(fibroblast), 또는 NPC; 신경전구세포) 간의 유전자 구조 내 CGI에서 DNA 메틸화 차이에 대한 계층적 클러스터링(hierachical clustering)을 나타낸다. 4 개의 클러스터가 생성되었다(클러스터1, common; 클러스터2, GM12878-특이적; 클러스터3, 섬유아세포-특이적; 클러스터4, NPC-특이적). 각 클러스터의 대표적인 전사인자를 왼쪽에 나타내었다. 메틸화 차이에 대한 색상 스케일을 표시하였다. 도 5(b)는 GM12878, IMR90 및 NPC의 각 클러스터와 관련된 유전자의 발현 수준을 나타낸다. Box-whisker plot은 각 세포의 mRNA-seq 데이터에서 얻은 유전자의 FPKM 값을 나타낸다.
도 6은 유전자 구조 내 CGI에서의 구별되는 전사인자결합모티브 enrichment의 유형을 나타낸다. 도 6(a)의 전사인자(TF) 결합 모티프의 enrichment는 Homer 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. Heatmap은 도 5에서 정의한 유전자 구조 내 CGI의 각각의 클러스터(클러스터1, common; 클러스터2, GM12878-특이적; 클러스터3, 섬유아세포-특이적; 클러스터4, NPC-특이적)에서 많이 존재하는 TF 모티프의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 검은색 그라데이션은 유전자 구조 내 CGI에서의 모티프의 enrichment(minus log P-value)와 최소 한 개의 클러스터에서 3보다 더 큰 Cut-off minus log-P value를 가진 모티프를 나타낸다. 도 6(b)의 Heat map은 인간 ES 세포에서 활성화된 프로모터 CGI(1), 이중 프로모터 CGI(2), 유전자 구조 내 kCGI(3), 유전자 구조 내 mCGI(4)에 대한 TF 모티프 enrichment의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 최소 한 개의 부위에서 Cut-off minus log P-values 4를 가진 88 모티브의 Enrichment(minus log P-values)를 나타내었다. 각 카테고리에서 특이적으로 많이 존재하는 전사인자는 다른 색으로 나타내었다. 이중 프로모터 CGI의 염기서열은 Li et al.(2013)에서 정의한 이중 유전자로부터 얻었다. 활성화된 프로모터 CGI는 유전자 구조 내 CGI가 없는 h3k4me3-마크된 프로모터를 포함하는 유전자로부터 유래하였다. 도 6(c)의 활성 CGI 프로모터 CGI(1), 이중 프로모터 CGI(2), 유전자 구조 내 kCGI(3), 유전자 구조 내 mCGI(4)에 결합부위를 가지는 TF의 발현 수준(FPKM)은 인간 ES 세포의 RNA-seq 데이터에서 획득하였다. 수평선은 중간값을 나타낸다. 도 6(d)의 (상단 패널)밀도 플롯(density plot)은 그들의 조직 특이성 점수에 따른 TF의 분포를 유전자 구조 내 CGI를 가지는 경우 검정선, 가지지 않는 경우 회색선으로 나타내었다. (하단 패널) 그들의 조직 특이성 점수에 따른 유전자 구조 내 CGI를 포함하는 TF의 밀도 플롯이다. 상기 밀도 플롯은 유전자 구조 내 kCGI를 가지는 경우 검정선, mCGI를 가지는 경우 회색선으로 나타내었다. 상기 조직 특이성 점수는 Ravasi et al.(2010)에서 얻었다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시 예를 제시한다. 하기 실시 예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. Public data set
GSE11431, GSE12241, GSE16256, GSE16368, GSE18927, GSE27584, GSE30202, GSE30434, GSE39610, GSE40832, GSE41009, GSE43070, GSE44067, GSE48122, GSE49294, GSE52071, Human ENCODE, mouse ENCODE.
2. Sequencing 및 Data processing
(1) Mapping
모든 인간 염기서열 데이터는 UCSC 인간 표준 게놈(hg19)에 mapping하였다. 일관된 분석을 위해, 모든 마우스 데이터는 UCSC 마우스 표준 게놈(mm9)에 mapping하였다. 인간과 마우스 데이터는 Bowtie(version 2.1.0)를 이용하여 표준 게놈에 mapping하였다. 상기 mapping을 위해 default 파라미터를 설정하였다.
(2) ChIP-seq Data Analysis
히스톤 변형 신호의 enrichment를 분석하기 위해, SAM output을 BED 파일로 변환하고, 게놈의 염기서열에 따라 50bp 해상도로 읽고, 50bp 해상도의 염기서열을 RPKM(Read Per Kilobase per million reads)으로 계산하였다. 실험 편차를 최소화하기 위하여, 동일한 샘플에서 RPKM을 측정하고 평균값을 구하였다.
(3) WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequencing) Data Analysis
바이설파이트 시퀀싱 데이터를 얻기 위해, Trim-galore를 이용하여 raw 염기서열을 trimming하여 낮은 품질 데이터를 제거하고, 3' 말단으로부터 어댑터 염기서열을 trimming하였다. 그 다음, 업계에 공지된 방법을 통해 표준 게놈으로 Bismark게놈을 만들고 Bowtie 2 aligner와 함께 Bismark를 이용하여 정렬(align)하였다. 불일치 값이 0인 20bp의 멀티 시드 길이(multi seed length)를 갖는 표준 정렬 파라미터를 사용하였다. 그 다음, Bismark 메틸화 추출기를 사용하여 Bedgraph data format의 모든 메틸화 염기에서 메틸화 백분율을 추출하였다.
(4) RNA-Seq Data Analysis
RNA-SEQ 데이터는 Tophat2(version 2.0.10)을 이용하여 표준 게놈에 mapping하였다. 그 다음, Cufflinks packages(version 2.1.1)를 이용하여 정렬된 BAM 파일을 어셈블리하고 그들의 FPKM 값을 추출하여 비교하였다. 추출된 데이터를 labeling하기 위하여, NCBI mRNA 표준 염기서열(RefSeq) 번호를 각 유전자 이름에 주석으로 표시하였다. 여러 이성체를 갖는 유전자의 평균 발현 값을 구하였다. 샘플 간 전체 발현 값의 편차를 최소화하기 위하여, Cuffnorm(Cufflinks package에 포함)를 사용하여 상대 비교를 위해 샘플간 리드 카운트(read count)를 표준화(normalization)하였다.
(5) CGI, 프로모터 및 전사체의 유전자 위치
모든 CGI와 전사체의 유전자 위치는 UCSC 게놈 브라우저로부터 다운로드 받았다(마우스 - mm9, 인간 - hg19). NCBI mRNA 표준 염기서열(RefSeq)과 UCSC KG(Known Genes)를 전사개시부위와 유전자 영역을 정의하기 위해 사용하였다. 프로모터의 경우, 전사 개시 부위의 1kb 상류지점(upstream)에서부터 1kb 하류지점(downstream) 부위까지 사용하였다. 유전자 구조 내 영역의 경우, 전사개시부위의 하류지점 1kb에서부터 전사 종료 부분까지 사용하였다. CGI를 유전자 위치에 따라, 프로모터, 유전자 구조 내(intragenic), 유전자 간(intergenic)으로 나누어 분류하였다. 연관 CGI는 프로모터 또는 유전자간 영역과 적어도 1bp가 직접적으로 중복되는 부위로 정의하였다. 프로모터와 다른 유전자 바디에 모두 중복되는 CGI를 프로모터-연관된(promoter-associated) 것으로 간주하였다.
(6) 각 요소들에 대한 DNA methylation 및 ChIP-seq signal (RPKM)의 계산
CGI와 프로모터에서 ChIP-seq 신호는 각 요소와 중복되는 RPKM(게놈의 염기서열에서 50bp 간격)의 평균값으로 계산하였다. 메틸화 비율은 bisulfite sequencing으로 생성된 중복(overlapping) mCG/(mCG+CG)비율로 계산하였다. BEDTools 유틸리티를 사용하여 특징들을 교차 또는 중복하였다.
(7) CGI Sequence Analysis
CGI는 50% 이상의 GC 함량, 200bp 이상의 길이, 0.6 이상의 실제 CpG/예상 CpG 비율로 정의하였다. 15,991개의 마우스 CGI와 27,718개의 인간 염기서열은 각각 hg19와 mm9 표준 게놈으로부터 추출하였다. CpG 디뉴클레오티드의 백분율은 CpG의 개수/CGI의 길이(bp)*100*2로 계산하였다. CpGG/C/T/A 트리뉴클레오티드의 백분율은 CpGN의 개수/CGI의 길이(bp)*100*3으로 계산하였고, CpGG 및 CpGC 또는 CpGT 및 CpGA의 백분율에 대한 평균값을 계산하였다. 0으로 나누기(division-by-zero) 오차로 인해, 0.01을 더한 후 (CGT/A+0.01)에 대한 (CGG/C+0.01)의 비율을 계산하였다. 모든 CGI 중에서 각 CGI의 값에 대하여 백분위 순위를 사용하여 이를 도 1b에 나타내었다. 평활밀도색상(smoothened density color) 표현으로 나타낸 scatterplot는 R로 smooth Scatter를 사용하여 생성하였다. ColorRampPalette는 scatterplot에 대한 색상을 생성하였다("흰색", "#00007F", "청색", "#007FFF", "시안", "# 1 7FFF7F", "노란색", "#FF7F00", "적색", "#7F0000").
(8) ES 세포에서 kCGI 및 mCGI로의 CGI의 분류
인간 ES 세포에서 528개의 CGI는 WGBS data(GSM 429321)에 포함되지 않았다. 따라서, 이러한 CGI 없이, CGI를 DNA 메틸화 비율과 H3K4me3의 log2(RPKM+1)값에 따라 K-값 클러스터링을 이용하여 두 개의 그룹(N=2)으로 나누었다. 인간 ES 세포에서 19,104개의 CGI가 kCGI로 확인되었고, 8,086개가 mCGI로 확인되었다. ES 세포에서(GSM 74876) 45,004개의 CGI가 kCGI로 확인되었고, 987개가 mCGI로 확인되었다.
(9) 이가(bivalent) 프로모터, 인핸서 및 사일렌서
BGDB(http://dailab.sysu.edu.cn/bgdb/)로부터 인간 ES 세포 내의 3,913개 및 마우스 내의 2,984개의 이가(bivalent) 유전자들을 다운로드 받았다. 인간 ES세포 내의 H3K4me1 및 H3K4me3의 패턴으로부터 28,807개의 인핸서가 예상되었다. 인간 ES 세포 내의 FANTOM 인핸서를 CAGE-seq을 이용하여 양방향 메신저 RNA 생산방법으로 확인하였다. NRSF를 타겟 유전자의 조절 영역(사일렌서)에 결합시키고 리프레서(repressor) 복합체를 유인(recruit)하였다. 2,172개의 NRSF-enriched 영역을 Satoh et al.(2013)에서 확인하였다.
(10) 기능적 주석 분석(Functional annotation analysis)
DAVID Functional Annotation Clustering tool (http://david.abcc.ncifcrf.gov) 및 InnateDB(http://www.innatedb.com)을 선별된 유전자 목록의 기능 주석 및 신호경로분석(signaling pathway analysis)에 사용하였다. 초기하(hypergenometric) 분석 알고리즘 및 Benjanimi Hochberg 방법을 이용하여 InnateDB에서 P 값을 조정하였다.
(11) 색상이 코드된 2-D 및 3-D 산점도(scatter plot)
매트랩(MALTAB)에서 PLOTCLR 기능을 이용하여 2-D 산점도를 플롯팅하였다. 상기에서 변형수준을 나타내는 값을 벡터 X와 Y로 지정하고, 색상으로 코딩된 발현값을 V값으로 나타내었다. V는 모든 유전자에서 유전자 구조내 CGI와 관련된 각 유전자 발현(또는 CGI의 DNA 메틸화 비율)의 RPKM값에 대한 백분위 순위이다. 매트랩에서 PLOT3C 함수를 사용하여 3-D 산점도를 나타내었다. V값에 대한 벡터 X(DNA met), Y(H3K4me3) 및 Z(H3K27me3)를 나타내었다. 이는 모든 유전자에 대해 각각의 유전자 발현의 RPKM 값에 대한 백분위 순위를 나타낸다. 각 spot은 V값에 따라 색상으로 코딩되었다. 인간 ES 세포와 체세포 간의 CGI의 상대적 변형 상태를 비교하기 위하여, 체세포의 H3K4me3 또는 H3K27me3에 대한 표준화된 RPKM값을 이용하였다(도 3a). 그러나 차이값은 raw RPKM 값을 사용하여 측정하였다(도 3b).
(12) ChIA-PET Data Analysis
마우스 ES 세포에서 RNA Pol II의 저인산화 형태(hypophosphorylated form)에 대한 항체를 사용하여 ChIA-PET 분석을 수행하였다. 상기 데이터베이스로부터 마우스 ES 세포에서 16,573개의 상호작용을 분석하였다. 중요한 상호작용을 하기의 기준에 따라 식별하였다: 동일한 염색체 상의 상호작용 영역 간의 거리 > 8kb, FDR 컷오프 0.05, 노이즈 정도(random shuffling simulations) < 10 %. Zhang et al.이 발표한 초기하 모델을 사용하여 P값을 계산하였다. 유전자 구조내 kCGI와 상호작용하는 중복 영역을 선정하고 상호작용하는 영역의 유전자 주석을 확인하였다. GSE44067으로부터 매핑된 리드를 RPKM값으로 변환하고 이를 UCSC 게놈 브라우저로 나타내었다(도 4c). CGI 및 이가(bivalent) 프로모터에서의 ChIA-PET 신호를 중복된 각 요소의 RPKM 값(50bp 간격의 게놈 염기서열)으로 계산하였다(도 4c). BGDB(http://dailab.sysu.edu.cn/bgdb/)에서 2,984개의 마우스 이가(bivalent) 유전자를 사용하였다.
(13) DNA 메틸화 프로파일의 클러스터링
Gene Cluster 3.0을 사용하여 계층(city-block 거리) 분석을 수행하고, 그 결과를 TreeView로 시각화하였다. 적어도 하나의 체세포 유형(ES 세포에서 메틸화되지 않은 것(<40%))에서 과메틸화(증가 > 40%)된, 355개의 유전자 구조 내 CGI를 선별하였다(도 5a). 체세포와 ES 세포(체세포-ES 세포) 간의 유전자 구조내 CGI에 대한 메틸화 차이를 클러스터링을 위한 입력(input) 값으로 사용하였다.
(14) Motif Analysis
HOMER 프로그램을 사용하여 특정 영역(CGI 또는 프로모터)에서의 enriched 모티브를 확인하였다. 퇴화 임계값(degeneracy thresholds)에 최적화된 공개 데이터로부터 "알려진 모티브" 결과를 분석하였다.
(15) enrichment motif의 클러스터링
11,710개의 활성 프로모터-관련 CGI, 3,288개의 이가(bivalent) 프로모터-관련 CGI, 2,107개의 유전자 구조 내 kCGI, 및 4,799개의 유전자 구조내 mCGI에서 모티브의 enrichment score(마이너스 로그 P 값)를 Homer 소프트웨어를 이용하여 계산하고 적어도 하나의 영역에서 마이너스 로그 P 값이 4를 초과(>4)하는 컷오프 값을 갖는 모티프를 선별하였다(도 6b). 선별한 모티프의 enrichment score를 입력 값으로서 각 TF 내의 모든 값들을 곱하여 scale factor S(각 행의 값들의 제곱의 합은 1)로 표준화하였다. Gene Cluster 3.0을 이용하여 계층(city-block 거리) 분석을 수행하고 TreeView로 시각화하였다.
(16) TF의 tissue specificity score
Ravasi et al.을 참고하여 1,988개의 인간 TF를 목록화하고 1,326개의 TF의 조직 특이성 점수(tissue specificity score)를 계산하였다. 조직 특이성 점수는 34개의 인간 조직의 qRT-PCR에서 얻은 mRNA 프로파일을 이용하여 null distribution(귀무분포)(모든 조직에 걸쳐 나타난 균일한 발현)로부터 유래한 TF 발현 패턴에 상대적인 엔트로피로 계산된 것이다. 조직 특이성 점수 1 이상인 TF를 조직 지정자(tissue specifiers)로 분류하였다. 유전자 구조 내 CGI-함유 TF 각각에 대한 조직 특이성 점수를 부여하였다(도 6d). 연관된 조직 유형에 기반하여, 기능적 주석 결과와 연결시켜 다른 세포 운명에서의 그들의 역할에 따라 TF를 분류하였다.
< 실험예 >
실험예 1. CGI의 선택적 변형이 관련 염기서열 요소에 의해 영향 받음을 확인
CGI가 DNA 및 히스톤 변형에서 주요 부위로 작용하기 때문에, 복합 유전자 발현에 중요한 후성 유전학적 상호작용을 매개할 수도 있을 것이다. 따라서, 본 발명자들은 CGI에서 다른 후성 유전학적 변형 간의 조절적 상호작용의 역할을 이해하기 위하여, 인간 배아줄기세포 데이터(GSE16256)를 분석하였다. 2개의 기본적인 CGI 관련 마커로서 DNA 메틸화 및 H3K4me3를 이용하여 CGI 변형을 2D density plot으로 관찰한 결과, H3K4me3마커가 존재하는 kCGI와 DNA 메틸화 마커가 존재하는 mCGI 만이 확인되었다(도 1a).
CGI의 다른 변형에 영향을 미치는 인자들에 대해서는 명확하게 알려지지는 않았으나, CGI 변형이 CG ratio 및 CpG frequency에 의해 영향을 받을 수 있다는 것이 제시된 바 있다. 따라서, 본 발명자들은 CGI의 두 변형이 염기서열-관련 인자들에 의해 야기되는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 염기서열 요소, 예를 들면, 각 CGI 에서 CpG density, CGI length 및 4개의 CGN frequency를 비교한 결과, CpG density가 높고 CGI length가 긴 경우, 높은 H3K4me3 및 낮은 DNA 메틸화 경향을 나타내었으며(도 1b), CGG/C frequency(또는 높은 CGA/T frequency)가 낮은 경우, CGI 변형이 고 DNA 메틸화 경향으로 변경되었으나, GC ratio 간에는 별다른 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 1b). 또한, 유전자 구조 내 CGI에서의 (CGG/C)/(CGT/A)는 프로모터-관련 CGI에 비해 DMA 메틸화 경향으로 낮은 분포도를 나타내었다(도 1c). 이로써, 프로모터 및 유전자 바디에서의 CGI 변형이 다르게 나타낸다는 것이 확인되었으나, 유사한 염기서열 특성을 갖는 유전자 구조 내 CGI가 프로모터-관련 CGI 보다 메틸화가 잘 일어나고 있음에 비추어 볼 때(도 1d), 추가적인 인자들이 CGI 변형에 영향을 미치고 있는 것으로 보인다.
실험예 2. 각각의 CGI는 구별된 후성 유전학적 조절 플랫폼을 제공함을 확인
본 발명자들은 CGI 변형의 염기서열-의존적 이중 분포도 패턴을 바탕으로, 인간 배아줄기세포 데이터(GSE16256, GSE16368, GSE18927)를 이용하여 각 CGI의 후성 유전학적 특성을 평가하였다. 그 결과, H3K4me3-변형된 kCGI는 열린(open) 크로마틴 구조를 가지며, RNA polymerase II(pol II)가 많이 존재하였다(도 1e). 흥미롭게도, 대부분의 kCGI에는 폴리콤-복합체 성분(polycomb-complex component)과 함께 억제 H3K27me3 마커도 많이 존재하는 것으로 확인되었다. 이러한 이가(bivalent) 크로마틴 마커들은 활성화 준비상태(poised) pol II를 이용하여 발생 유전자들을 침묵시키는 것으로 알려져 있으며, 실제 상기 이가 (bivalent) 크로마틴 마커의 분포도는 전사 연장 마크의 분포와는 상반되는 것으로 확인되었다(도 1e).
반면, 고메틸화된 mCGI는 전사 활성과 관련있는, H3K36me3을 제외한 대부분의 후성 유전학적 마커 없이 폐쇄된(closed) 크로마틴 구조를 나타내어 DNase I이 접근불가능한 것으로 확인되었다. 그러나, 일부 mCGI는 크로마틴 응집 마크인 H3K9me3를 포함하는 것으로 나타냈다. 따라서, 두 종류의 CGI는 추가적인 히스톤 변형 마크의 존재 여부에 따라 활성 요소로 작용할 수도 있고 억제 요소로도 작용할 수 있음이 확인되었다. 한편, 마우스 ES 세포 크로마틴 면역침강 시퀀싱(ChIP-seq) 데이터(GSE52071, GSE39610)에 따르면, 비메틸화된 CpG 에 결합하는 단백질(CXXC1 및 MLL2)은 kCGI에 많이 존재하는 반면 메틸화된 CpG 결합 단백질(MBD1A, MBD2A, MBD4, MECP2)은 mCGI에만 존재하는 것으로 확인되었다.
실험예 3. 유전자 구조 내 CGI는 발생 유전자의 새로운 조절자임을 확인
프로모터-관련 CGI의 후성 유전학적 역할은 잘 정의되어 있는 반면, 유전자 구조 내 CGI의 기능은 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 발명자들은 유전자 구조 내 CGI가 종래 알려진 조절 인자, 예를 들면 인핸서(enhancer), 사일렌서(silencer) 또는 선택적 프로모터와 부합하는지 여부를 평가하였다. 그 결과, 유전자 구조 내 CGI의 고 H3K4me3 변형(kCGI) 또는 DNA 메틸화(mCGI) 패턴은 종래 알려진 인핸서 또는 사일렌서의 signature와는 상당히 차이가 있었다. 인간 배아줄기세포의 polyA+/-RNA에 대한 CAGE-seq 분석 결과, 유전자 구조 내 CGI로부터 발생된 5?apped RNA가 확인되지 않음으로써, 프로모터 또는 인핸서로서 유전자 구조 내 CGI를 배제하였다. 또한, CGI-함유 유전자의 유전자 리스트와 종래 알려진 인핸서 및 사일렌서 간에 중복되는 영역이 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 유전자 구조 내 CGI는 종래 확인된 조절 요소들과는 구별되는 새로운 요소로 역할을 할 수 있음이 규명되었다.
한편, 유전자 GO(Gene ontology) 분석 결과에 따르면, 하우스키핑 유전자에서는 유전자 구조 내 CGI가 거의 발견되지 않았으나, Hedgehog, Notch, 및 Wnt signaling pathway와 같은 협동 발생 과정(coordinating development process)에 관여하는 유전자에서는 많이 존재하는 것으로 확인되었다. 특히, 유전자 구조 내 CGI는 인간 전사 인자들을 암호화하는 유전자에서 약 20%의 빈도로 발견되었으며, 이러한 인자들은 매우 강한 세포-특이적 발현 패턴을 나타낸다. 실제, 특이적 기관 발생 및 계통 결정(lineage determination)과 관련된 주요 전사 인자들은 모두 유전자 구조 내 CGI를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 유전자 구조 내 CGI는 조직 특이적 전사를 제어하는 시스-액팅(cis-acting) 인자로서 기능을 할 수도 있다.
실험예 4. 비메틸화된 유전자 구조 내 CGI는 배아줄기세포에서 강한 이가 (bivalent) 크로마틴을 유도할 수 있음을 확인
유전자 조절에서의 유전자 구조 내 CGI의 역할을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 유전자 구조 내 CGI가 그들과 관련된 유전자의 후성 유전학적 지형(landscape)에 미치는 영향을 알아보았다. 비슷한 구조와 발현 잠재력을 갖는 유전자들을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 CGI 프로모터를 갖는 유전자들(유전자 구조 내 CGI가 없는, 12,153개의 유전자; 유전자 구조 내 kCGI가 존재하는 1,498개의 유전자; 유전자 구조 내 mCGI가 존재하는, 2,548개의 유전자)을 비교하였다. 유전자 바디-관련 CGI가 결핍된 유전자의 프로모터들은 근접하게 위치하였으며, H3K4me3, pol II, CXXC1 및 MLL2가 많이 존재하였다(도. 2a). 유전자 서열 내의 추가적인 kCGI의 존재는 pol II 및 H3K4me3가 유전자 구조 내 kCGI 중심으로 유인됨에 따라, 추가로 접근 가능한 영역과 관련이 있는 것으로 확인되었다. 무엇보다도, 프로모터를 포함하는 전체 유전자 영역에 걸쳐 H3K27me3가 급격하게 증가하였으며, 이러한 증가는 프로모터뿐만 아니라 유전자 구조 내 kCGI에서 MLL2 및 폴리콥 복합체 성분들의 강한 결합에 의해 동반되었고, 이로써 전체 유전자에 걸쳐 강한 이가(bivalent) 크로마틴 구조가 형성되었다. 실제, 프로모터 CGI의 히스톤 변형 패턴은 관련 유전자 구조 내 kCGI의 패턴과 매우 관계가 있었으며, 심지어 높은 수준의 H3K27me3를 나타내었다. 또한 유전자 구조 내 kCGI 함유 유전자는 전사 연장 마크인 H3K79me2가 감소함에 따라 발현이 감소하였다(도 2a). 따라서, 유전자 구조 내 kCGI는 강한 이가(bivalent) 크로마틴-유도 활성을 가지는 것으로 나타남에 따라, 인간뿐만 아니라 마우스 배아줄기세포에서의 이가(bivalent) 변형에 의해 조절되는 추가 유전자를 확인하였다.
매틸화된 프로모터-관련 CGI와 달리, 유전자 구조 내 mCGI는 억제 H3K9me3 마커가 적었으며, H3K36me3가 증가하여 유전자 영역에 걸쳐 높은 전사율을 나타내었음에도 불구하고, 관련 유전자들의 후성 유전학적 패턴에 메틸화가 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 2a). 이에 따라, 그들의 프로모터들은 활성 H3K4me3 변형 패턴을 가지는 것으로 확인되었다. 이러한 유전자 구조 내 CGI-의존적 후성 유전학적 패턴은 비-CGI 프로모터를 갖는 유전자에서도 관찰되었다. 이로써 유전자 구조 내 CGI의 후성 유전학적 성질의 일반론이 입증되었다. 놀랍게도, 히스톤 변이 형태 H2A.B는 프로모터 관련 CGI 보다는 유전자 구조 내 CGI와 관련 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 유전자 구조 내 CGI와 히스톤 변형 형태의 결합은 그들의 메틸화 상태에 의존적이지 않았으며, kCGI뿐만 아니라 mCGI에서도 많이 존재하였다. 이러한 결과는 유전자 구조 내 CGI의 다른 염기서열 및 환경적 특징이 프로모터-관련 CGI와 달리 후성 유전학적 구조 및 기능을 유도할 수 있음을 입증한다.
각 유전자 수준에서 상기 상호관련성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 3D scatter plot을 이용하여 인간 배아줄기세포 내의 유전자 구조 내 CGI 변형을 플롯팅하였다(X; DNA 메틸화, Y; H3k4me3, Z; H3K27me3)(도 2b). DNA 메틸화 수준이 낮은 경우, 유전자 구조 내 kCGI는 2개의 형태; 침묵 상태의 유전자에서는 이가 변형(bivalently modified) CGI 및 활성 발현 유전자에서는 H3K4me3-변형된 CGI로 존재하였다. 반대로 대부분의 유전자 구조 내 mCGI는 고발현된 유전자와 관계가 있었으며, 이러한 CGI 변형 패턴은 마우스 ES 세포 에서도 관찰되었다. 이로써, 평균적인 후성 유전학적 패턴이 관련 유전자들의 발현에 영향을 미치는 유전자 구조 내 CGI의 성질에 의한 것임이 확인되었다.
실험예 5. 유전자 구조 내 CGI 변형의 변경을 통해 분화 동안 발생 유전자 발현을 조절할 수 있음을 확인
관련 유전자들의 발현 수준에 영향을 미치는 유전자 구조 내 CGI의 두 구별된 후성 유전학적 상태는 그들의 변형 상태의 변경을 통해 유전자 발현을 제어할 수 있음을 암시한다. 따라서, 본 발명자들은 ES 세포 분화 동안 이러한 가능성을 평가하기 위하여, 인간 ES 세포(hESC)를 다른 발현과 관련된 유전자 구조 내 CGI의 세포-특이적 변형을 위한 분화 세포인 신경 전구 세포(hNPC, GSE16368) 및 섬유아세포 IMR90(GSE16256)와 비교하였다(도 3).
일반적으로, ES 세포에서 관찰되는 변형 패턴과 발현 수준 간의 상호관련성이 분화된 세포에서도 나타났다. 그러나, 유전자 구조 내 CGI 변형의 극적인 변경이 분화에 의해 유도된 유전자 발현 변경과 매우 상관관계가 있음이 확인되었다(도 3a). 우선, 분화 세포 내의 상당한 CGI(kCGI 및mCGI)가 H3K27me3가 증가함에 따라 침묵되었다. 둘째, 상당한 수의 이가 변형된 CGI가 분화 세포에서는 존재하지 않았다. 셋째, 상당한 kCGI가 메틸화된 CGI로 바뀌었으며, 이에 따라 유전자 발현이 활성화되었다(도 3a). 유전자 구조 내 CGI의 다른 변경에 대한 Scatter plot analysis 결과에 따르면, 과메틸화는 전사 활성을 강하게 하고 H3K4me3뿐만 아니라 H3K27me3 마커를 감소시키는 반면, 저메틸화는 전사 활성을 손실시키고 H3K27me3 변경을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 3b). 따라서, 유전자 구조 내 CGI는 준비상태(poised) 발생 유전자에서 이가 변형을 DNA 메틸화로의 전환시키거나 불필요한 유전자를 더욱 침묵시키기 위한 H3K27me3 마크를 증가시킴으로써 유전자 발현을 조절할 수 있음이 확인되었다.
실험예 6. 유전자 구조 내 CGI의 메틸화는 억제 크로마틴 어샘블리에 요구되는 프로모터와 그들의 작용을 방해할 수 있음을 확인
유전자 구조 내 CGI와 그들의 관련 프로모터들의 활성의 상호 관련된 변경은 상기 두 인자 간의 물리적 작용의 가능성을 증가시켰다. 유전자 구조 내 CGI 기능이 포유동물에서 보존되기 때문에, 본 발명자들은 마우스 ES 세포 데이터를 이용하여 이를 시험하였다. pol II-관련 DNA의 paired end-tag sequencing(ChIA-PET)에 의한 ES 세포의 크로마틴 상호작용 분석을 이용하여, 결합 파트너와 크로마틴 상호작용의 핫 스팟(hot spot)을 확인하였다. 그 결과, 예상한 바와 같이, 활성 프로모터는 높은 상호작용 빈도를 특징으로 하였다. 게다가, 유전자 구조 내 kCGI 뿐만 아니라 이가 침묵된(bivalently silenced) 프로모터는 높은 수준의 상호작용을 나타내었으나, 모든 이러한 상호작용은 메틸화된 CGI에서는 없어지는 것으로 확인되었다(도 4a). 프로모터 및 유전자 구조 내 kCG에서 ChIA-PET signal의 특이적 enrichment는 이들 상호작용이 두 CGI 인자에 의해 매개됨을 암시한다(도 4b). 실제, 유전자 구조 내 kCGI가 높은 빈도로 상호작용하는 영역은 프로모터로 확인되었다(도 4). 그러나, 이러한 상호작용은 후자와 관련된 높은 전사 활성에도 불구하고, 메틸화된 유전자 구조 내 CGI에서는 존재하지 않은 것으로 확인되었다.
유전자 구조 내 CGI에서의 DNA 메틸화의 변경이 ES 세포 분화 동안 유전자 발현에 영향을 미치는지 여부를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 유전자 구조 내 CGI의 고메틸화에 의해 영향을 받는 후성 유전학적 패턴을 분화된 IMR90 및 역분화에 의한 섬유아세포로부터의 유도-만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 이용하여 전체 지형에 대해 평가하였다. 유전자 구조 내 CGI의 고메틸화에 의해 유전자 구조 내 CGI로부터의 이가 이가(bivalent) 히스톤 마커가 손실되었다. 그러나, H3K27me3의 손실은 유전자 구조 내 CGI에 제한되지 않고, 프로모터를 포함하는 전체 유전자 영역에 걸쳐 관찰되었다(도 4d). 반대로, 프로모터 및 유전자 영역에는 유전자 바디에 H3K36me3와 함께 상당한 양의 H3K4me3 및 H3K27ace가 존재하였으며, GROseq(global run-on sequencing)으로 측정한 결과 높은 전사 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 게다가, 프로모터와 유전자 구조 내 CGI에서 정지되어 있는(stall) pol II가 유전자 영역으로 방출되어, ES 세포에 비해 분화된 IMR90 세포에서 연장 효율이 증가하였다. 따라서, 유전자 구조 내 CGI의 메틸화는 프로모터뿐만 아니라 유전자 구조 내 kCGI에 영향을 미치는 억제(repressive) 후성 유전학적 패턴을 방해하여 프로모터가 활성 후성 유전학적 변형을 갖도록 한다는 것이 확인되었다. 또한, 섬유아세포의 iPSC로의 역분화는 유전자 발현을 침묵시키고 반대 방향으로 크로마틴 변형 패턴을 전환시킨다는 것이 확인되었다. 이로써, 유전자 구조 내 CGI의 크로마틴 구조의 가역적인(reversible) 변경이 ES 세포 유지 및 분화 동안 발생 유전자 발현을 조절하는데 매우 중요한 역할을 하는 것임이 입증되었다.
실험예 7. 세포-특이적 유전자는 유전자 구조 내 CGI의 다른 메틸화에 의해 활성화됨을 확인
이가(bivalent) 크로마틴을 제어할 수 있는 새로운 기작이 확인됨에 따라, 상기 기작이 분화 동안 광범위하게 사용될 수 있는지 여부를 평가하였다. 따라서, 본 발명자들은 3개의 다른 체세포(GM12878, IMR90, 및 NPC)의 ES 세포의 이가 변형(bivalently modified) 유전자 구조 내 CGI에서 DNA 메틸화 변경을 관찰하였다. 본 발명자들은 1개 이상의 체세포에서 상당히 과메틸화된 355개의 유전자 구조 내 CGI를 확인하였다(>40%)(도 5a). 상당한 유전자 구조 내 CGI(cluster 1)가 분화된 세포 모두에서 메틸화되었으나, 유전자 구조 내 CGI의 3개의 다른 그룹은 각각의 세포 유형에 따라 특이적으로 과메틸화되어, 상응하는 세포 유형으로 관련 유전자의 특이적 활성을 초래하였다(도 5b). 이러한 세포 특이적 활성 유전자는 동종친화적(homophilic) 세포 부착인자(혈구-세포 특이적 클러스터 1), 형태발생(morphogenic) 전사 인자(섬유아세포-특이적 클러스터 2), 및 뇌-발생-관련 유전자(신경세포-특이적 클러스터 3)에 많이 존재하여, 세포 특이적 분화에서 유전자 구조 내 CGI의 중요성이 확인되었다. 더욱이, 다르게 조절된 유전자 구조 내 CGI-함유 유전자의 대부분은 상응하는 세포 유형에서 특이적으로 발현하는 호메오박스(homeobox) 단백질이다(도 5a). 특히, BAI1, LHX2, ZIC1, PAX6, MEIS1, 및 ONECUT1를 포함하는 주요 전사 인자들이 그들의 유전자 구조 내 CGI의 과메틸화에 의해 NPC에서 특이적으로 활성화됨으로써, 신경 분화시 유전자 구조 내 CGI-매개 전사 조절의 필수적 역할이 입증되었다.
실험예 8. 세포 특이적 전사 인자 결합 부위는 유전자 구조 내 CGI에 풍부함을 확인
특정 후성 유전학적 변경은 일반적으로 세포-특이적 전사 인자에 의해 유도된다. 유전자 구조 내 CGI의 세포 특이적 메틸화가 조직-특이적 전사 인자에 의해 유발되는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 Homer software를 이용하여 다르게 메틸화된 유전자 구조 내 CGI 클러스터 내의 전사 인자 결합 부위를 분석하였다. 실제, 유전자 구조 내 CGI 클러스터는, 그들의 프로모터-관련 CGI 보다는, 상응하는 세포 유형에서 작용하는 것으로 알려진 발생 전사 인자의 다른 세트에 대한 결합 부위가 풍부하였다(도 6a). 이러한 세포-특이적 전사 인자는 그들의 유도 이후에 이가 변형된(bivalently modified) 유전자 구조 내 CGI에 결합할 수 있으므로, 유전자 구조 내 CGI 과메틸화 및 전사 활성화를 초래한다.
이러한 현상의 일반론을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 프로모터-관련 및 유전자 구조 내 CGI의 전체 세트에서 전사 인자 결합 부위의 enrichment를 분석하였다. 전사 인자들을 다른 CGI 인자에 결합하는 그들의 계산된 가능성에 따라 분류한 결과, 주여진 CGI 인자에서 특이적으로 풍부한 4개의 전사 인자를 나타내었다(도 6b). 따라서, 각 CGI 유형은 전사 인자의 다른 세트에 의해 조절됨이 확인되었다. 활성 프로모터의 CGI를 인식하는 전사 인자는 SP1, NFY, 및 YY1(오렌지)를 포함하는 많은 풍부한 전사 인자를 포함하는 반면, NRSF 및 TBP (그린)는 이가 변형된(bivalently modified) 프로모터 CGI에서 특이적으로 많이 존재하였다(도 6b). 그들의 히스톤 변형 패턴이 이가 프로모터의 패턴과 유사함에도 불구하고, 유전자 구조 내 kCGI는 고유의 발생 전사 인자를 위한 결합 부위가 많이 존재함에 따라(청색), 이가 프로모터 관련 CGI 것과는 상당히 차이가 존재하였다.
유전자 구조 내 CGI를 인식하는 이러한 고유의 전사 인자들은 세포 특이적 방법으로 발현됨에 따라, ES 세포에서는 매우 낮은 수준에서 발현된다(도 6c). ES 세포에서 그들이 부재함에 따라, 대부분의 그들의 표적 유전자 구조 내 CGI는 이가 변형 상태(bivalently modified state)로 관찰되었으며, 상응하는 전사 인자들을 특이적으로 발현하는 분화된 유도체에서 다르게 메틸화되었다. 놀랍게도, 많은 이러한 세포-특이적 전사 인자들은 유전자 구조 내 CGI를 포함하고, 유사한 방법으로 조절되었다. 반면, ES 세포의 유전자 구조 내 mCGI는 MYC 및 MAX와 같은 ES 세포 내에 존재하는 풍부한 전사 인자들을 위한 결합 부위를 가지고 있었다(도 6b 및 6c). 이러한 결과는 유전자 구조 내 CGI 결합 전사 인자의 이용가능성이 유전자 구조 내 CGI의 다른 변형에서 주요한 결정 요인으로 존재할 수 있음을 나타낸다. 이에 따라, 유전자 구조 내 kCGI를 포함하는 전사 인자 유전자들은 특이적 발생 시작신호(queue)를 기다리며 침묵된 상태로 존재하고, 유전자 구조 내 mCGI를 포함하는 전자 인자 유전자들에 비해 상당히 높은 세포 특이적 스코어를 가지는 것으로 확인되었다(도 6d). 이러한 결과는 전사 인자뿐만 아니라 그들의 표적의 세포 특이적 발현이 ES 세포로부터 분화된 계통을 발생시키기 위한 유전자 구조 내 CGI의 후성 유전학적 변형의 이점을 가질 수 있음을 제시한다. 즉, 유전자 구조 내 CGI는 세포-특이적 전사 인자에 의해 전사되는 준비상태(poised) 발생 유전자의 중요한 조절 인자임이 입증되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (17)

  1. 유전자 구조 내 CpG 섬(intragenic CGI)의 DNA 메틸화 수준의 조절을 통한 줄기세포의 분화 조절 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포의 분화는 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 증가시키는 것에 의해 촉진되거나, 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 감소시키는 것에 의해 억제되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 조절 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬을 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch 및 WNT로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절인자인 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 조절 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬을 포함하는 유전자는 PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포 계통 마커인 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 조절 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부한 것인, 줄기세포의 분화 조절 방법.
  6. 1) 실험군으로서 줄기세포 및 대조군으로서 표준 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 측정된 실험군의 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 대조군의 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 2)이후에 3) 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준이 대조군의 DNA 메틸화 수준 보다 높으면 분화능력이 대조군에 비해 높은 것으로 판단하거나 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준이 대조군의 DNA 메틸화 수준 보다 낮으면 분화능력이 대조군에 비해 늦은 것으로 판단하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 DNA 메틸화 수준은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, DNA 칩, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬을 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부한 것인, 줄기세포의 분화능력 탐지 방법.
  11. 1) 특정 세포 계통에 따라 줄기세포의 분화를 야기하는 단계;
    2) 상기 줄기세포를 약물과 접촉시키는 단계;
    3) 상기 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    4) 상기 측정된 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 표준 줄기세포의 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준과 비교하여 약물의 효과를 결정하는 단계;
    를 포함하는, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약물은 유기분자, 무기분자, 다당류, 펩타이드, 단백질, 핵산, 세균, 및 식물, 진균, 동물세포 또는 동물 조직으로부터의 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬을 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부한 것인, 줄기세포의 분화 조절을 위한 약물을 스크리닝 하는 방법.
  15. 유전자 구조 내 CpG 섬의 DNA 메틸화 수준을 측정하기 위한 시약;
    상기 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 시약; 및
    상기 줄기세포의 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통으로의 분화능을 측정하기 위한 시약을 포함하는, 줄기세포의 분화 탐지용 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬을 포함하는 유전자는 BMP, HOX, PAX, GATA, Notch, WNT, PAX5, RARA, LHX2 및 MEIS1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인, 줄기세포의 분화 탐지용 키트.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 유전자 구조 내 CpG 섬은 LHX2, SCL, HOXD13, GATA3, PR(progesterone receptor), GR(glucocorticoid receptor), NR5A2 및 CTCF로 이루어진 군으로부터 선택되는 발생 조절 전사 인자를 위한 결합 부위가 풍부한 것인, 줄기세포의 분화 탐지용 키트.
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